Caracterização Química e Avaliação de Toxicidadede Extratos Aquosos de Subprodutos de

Castanheiro .

Paula Alexandra Pinto

2

SUB-PRODUTOS EM AGRO-INDÚSTRIAS

Subprodutos castanha

Caracterização compostos

fenólicosActividade Antimicrobiana

• FT

• Orto difenóis

• HPLC**

• ABTS

• DPPH

• FRAP

•Germinação

•Atividade Microbiana (Vibrio fischerii)

•Microcrustáceos (Daphnia magna)

•Organismos Vertebrados (Zebrafish)

•Leveduras

•Bactérias

Actividade Antioxidante

É possível a dimuição teor fenólico total com tratamento biológico?

Que bioactividades podem ser majoradas? Que fracções existem?

Toxicidade Biorremediaçao

•∆Toxicidade

•∆ Compostos fenólicos

Como são afectados os parâmetros em estudo?

Quais podem ser extraídas de forma economicamente viavel ?

**-Análise HPLC-DAD só pode ser feita para um dos fungosTrametes versicolor

1. Bioremediação : variação no teor fenólico, actividade antioxidante e perfil cromatográfico

Objectivos Gerais:

Caracterização de extatos

aquosos dos subprodutos

• Teor de compostos fenólicos (FT)

• Actividade Antioxidante

• Perfil cromatográfico

PRÉ PÓS

FERMENTAÇÃO

LÍQUIDA

Indirectamente

Avaliação da

capacidade dos

fungos em usar

os compostos

fenólicos como

fonte de carbono

Análises Preliminares aos Subprodutos

• Estudo do efeito das variáveis:

• tempo: 75min; 3h; 3 dias

• temperatura: 45º+/-5ªC; tamb (22º +/-5ºC)

• tipo de agitação (magneto; shaker)

• solvente : água: metanol (100% e 50%) 0.2g/10 ml solvente

B- Conteúdo Orto-difenóis (complexação com molibdato de sódio) e Teor Actividade Antioxidante

%AA dos Ouriços (O) e Inflorescências (F)

A- Conteúdo Fenóis Totais em diferentes tipos de extração (Ouriços)

•Análise comparativa

C- Análise de Toxicidade : Índice de Germinação (IG) +Índice de Toxicidade Fenólica (ITF) (Zucconi et al. (1981);

Komilis et al. (2005).

•Agrião ”Lepidium sativum”

•Alface “Lactuca sativa”

(Ouriços)

0

10

20

30

40

50

60

70

H2O+3h mag

45º

H2O+3d

shaker25º

H2O+75 min

mag 45º

M50+3h mag

45º

M5O+3d

shaker25º

M5O+75 min

mag 45º

To

tal p

he

no

lic c

on

ten

t (

mg g

allic

acid

eq

./g d

ry w

eig

ht)

)

Extraction

TF

Uma vez .....

que os resultados dos extratos aquosos se revelaram semelhantes aos metanólicos

Resultados

Foram Usados os extratos aquosos

na Biorremediaçao

Mimetizam a possível lixiviação

In situ

A- Conteúdo Fenóis Totais em diferentes tipos de

extração (Ouriços)

Ambos extratos aquosos apresentaram elevada atividade antioxidante e muito

semelhante entre si.

Resultados

O teor de O-2-Fenóis das inflorescências é superior ao dos

ouriços

B- Conteúdo Orto-difenóis e Teor Actividade

Antioxidante %AA dos Ouriços e Inflorescências

%AA

Orto-difenóis

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

100,000

120,000

140,000

160,000

O F

O-2-F

O-2-F= Orto-diphenols (mg eq Gallic ac. /g DM)

0

20

40

60

80

100

O F

%AA

Resultados

Alface:

• revelou-se mais sensível

• Extrato puro 18 % IG

C- Análise de Toxicidade : Índice de Germinação (IG) Índice de

Toxicidade Fenólica (ITF)

IG (%) ITF

Extrato puro41 1.29

AgriãoExtrato dil50%

114 -0.29

Controlo100 0.00

AlfaceExtrato puro

18 1.78

Extrato dil50%80 0.43

Controlo100 0.00

FT=46mg EAG/g DM

IG maior Controlo

ITF=(100-IG)/[fenóis totais]

devido ao aumento médio das raízes

Agrião:

• extrato puro reduziu IG -> 41 %:

Metodologia:

• Para o tratamento

• 2 fungos filamentosos (Trametes versicolor+ isolado ainda não identificado-Lem)

• meio de crescimento líquido (meio Eggert) sem glucose teor extrato ouriço 10% (v/v)

• tempo: 7;14;21; 28 dias

• Análises:

• fenóis totais (FT) Folin-Ciocalteau

• atividade antioxidante (AA%) redução radical ABTS•+

• perfil cromatográfico HPLC_DAD

1. Bioremediação e variação no teor fenólico, antioxidante e perfil cromatográfico

Ambos fungos:

↓ teor FT(relativa/ Controlo- D0)

• ↓ 78.1% T. versicolor

• ↓ 77.7% isolado Lem

Fenóis Totais Resultados

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Control D7-T D7-L D14-T D14-L D21-T D21-L D28-T D28-L

To

tal p

he

no

lic c

on

ten

t

(mg ga

llic

acid

eq

./g d

ry w

eig

ht

Days

Geral:

• variação negativa na %AA

No entanto:

• oscilações positivas: D14 e D21 isolado Lem

Resultados AA %

oxidações pelas polifenol

oxidases que resultam em

polimerizações

?????????

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

D7-T D7-Lem D14-T D14Lem D21-T D21-Lem D28-T D28-Lem

AA

% (

rela

tin

g D

0)

Days

Resultados

Perfil Cromatográfico **

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

0,0

2,0

4,1

6,1

8,1

10

,2

12

,2

14

,2

16

,3

18

,3

20

,3

22

,4

24

,4

26

,4

28

,5

30

,5

32

,5

34

,6

36

,6

38

,6

40

,7

42

,7

44

,7

46

,8

48

,8

50

,8

52

,9

54

,9

56

,9

59

,0

61

,0

63

,0

65

,1

67

,1

69

,1

71

,2

73

,2

mA

U

Time (min)

D0-D28-280

D28-280 D0-280

-50

0

50

100

150

200

0,0

2,0

4,0

5,9

7,9

9,9

11

,9

13

,8

15

,8

17

,8

19

,8

21

,7

23

,7

25

,7

27

,7

29

,6

31

,6

33

,6

35

,6

37

,5

39

,5

41

,5

43

,5

45

,4

47

,4

49

,4

51

,4

53

,3

55

,3

57

,3

59

,3

61

,2

63

,2

65

,2

67

,2

69

,1

71

,1

73

,1

mA

U

Time (min)

D0-D28-325

D0-325 D28-325

**-Análise HPLC-DAD só pode ser feita para um dos fungos

Remoçao GERAL maioria dos Compostos

Antes D0 Após D28

Actuação fungo

Resultados

Variações no perfil cromatográfico para λ=280nm

280nm

RT(min) Compound

D0(mAU)

D28(mAU)

4.325 C1 22.0 0.0

4.825 Gallic acid 330.0 62.3

8.108

3,4-dihydroxybenzoic acid

21.8 0.0

9.783 C3 9.8 0.0

8.167 C4 0.0 8.4

14.275 C5 13.8 16.0

16.883 C8 11.8 0.0

19.050 C10 13.3 0.0

24.342 Epicatechin?

0.0 13.5

33.058 Ellagic acid 68.3 28.0

7 dos 10 dos compostos mais significativos do

cromatograma sofreram decréscimo

durante o ensaio

Resultados

0

20

40

60

80

100

120

Re

mo

va

l (%

)

Compounds

% da Remoçao Compostos

Média de remoção dos compostos

originais

ronda os

91%

Conclusões

•-Extratos aquosos (ouriços) revelaram-se semelhantes aos metanólicos em termos

de FT diferença aprox. de 10-20 mg eq Ac gálico /g MS

•A análise comparativa de extratos aquosos de ouriços e inflorescências

apresentaram elevada atividade antioxidante e muito semelhante entre si

•A análise de toxicidade do extrato aquoso ouriço (50 %) no agrião indica a

posibilidade de haver algum tipo de indução no crescimento das raízes.

•O uso dos fungos Trametes versicolor e isolado Lem revelaram potencial na

biorremediação

•Os fungos conseguiram usar o extrato aquoso 10% (v/v) de ouriço como única

fonte de carbono

Trabalhos futuros

•-Caracterização aprofundada frações resultantes dos ensaios

Perceber

frações fenólicas resultantes da actividade fúngica

com interesse compostos bioativos,

Metabolismo dos fungos

Otimizar

potencial antioxidante e antimicrobiano.

Otimizar

Biorremediação.

Obrigada pela

Vossa Atenção

Barbosa, 2016

(nºsemGermAmostra/nºsemGermControl)*

(médiaCompRaízAmostra/médiaCompRaíz

Controlo)

IG %=

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

100,000

120,000

FT

O

F