toxicidade subcrônica inalação

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TOXICIDADE SUBCRÔNICA INALAÇÃO: 90 DIAS DE ESTUDOS RESUMO Este teste revista Guideline 413 (TG 413) foi projetado para caracterizar completamente artigo toxicidade teste por inalação por um período subcrônica (90 dias), e para fornecer dados robustos para avaliações quantitativas de risco de inalação. Grupos de 10 do sexo masculino e 10 do sexo feminino roedores são expostos 6 horas por dia durante um período de 90 dias (13 semanas) para a) o artigo de teste em três ou mais níveis de concentração, b) o ar filtrado (controlo negativo), e / ou c) o veículo (veículo de controlo). Os animais são expostos geralmente 5 dias por semana, mas a exposição durante 7 dias por semana, também é permitido. Os machos e as fêmeas são sempre testados, mas eles podem ser expostos a diferentes níveis de concentração que se saiba que um dos sexos é mais susceptível a um determinado artigo de teste. Essa diretriz permite que o diretor de estudo a flexibilidade para incluir grupos satélite (reversibilidade), sacrificar, lavado bronco-alveolar (BAL), os testes neurológicos e patologia clínica adicional e avaliações histopatológicas, a fim de melhor caracterizar a toxicidade de um artigo de teste. INTRODUÇÃO 1. Bem-estar animal 1. Diretrizes da OCDE são revistos periodicamente à luz do progresso científico considerações e evolução das necessidades de regulamentação. O Test Guideline inalação subcrônica originais 413 (TG 413) foi aprovada em 1981 (1). TG 413 foi revisto para refletir o estado da ciência e atender às necessidades regulatórias atuais e futuras. 2. Os estudos de toxicidade por inalação subcrônicos são usados principalmente para obter concentrações de regulamentação para avaliar o risco do trabalhador em ambientes de ocupação. Eles também são utilizados para avaliar residencial humano, transporte, e risco ambiental. Esta orientação permite a caracterização de efeitos adversos

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Toxicidade subcrônica Inalação - Teste de 90 dias.Toxicologia

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Page 1: Toxicidade subcrônica Inalação

TOXICIDADE SUBCRÔNICA INALAÇÃO: 90 DIAS DE ESTUDOS

RESUMO

Este teste revista Guideline 413 (TG 413) foi projetado para caracterizar completamente artigo toxicidade teste por inalação por um período subcrônica (90 dias), e para fornecer dados robustos para avaliações quantitativas de risco de inalação. Grupos de 10 do sexo masculino e 10 do sexo feminino roedores são expostos 6 horas por dia durante um período de 90 dias (13 semanas) para a) o artigo de teste em três ou mais níveis de concentração, b) o ar filtrado (controlo negativo), e / ou c) o veículo (veículo de controlo). Os animais são expostos geralmente 5 dias por semana, mas a exposição durante 7 dias por semana, também é permitido. Os machos e as fêmeas são sempre testados, mas eles podem ser expostos a diferentes níveis de concentração que se saiba que um dos sexos é mais susceptível a um determinado artigo de teste. Essa diretriz permite que o diretor de estudo a flexibilidade para incluir grupos satélite (reversibilidade), sacrificar, lavado bronco-alveolar (BAL), os testes neurológicos e patologia clínica adicional e avaliações histopatológicas, a fim de melhor caracterizar a toxicidade de um artigo de teste.

INTRODUÇÃO

1. Bem-estar animal 1. Diretrizes da OCDE são revistos periodicamente à luz do

progresso científico considerações e evolução das necessidades de

regulamentação. O Test Guideline inalação subcrônica originais 413 (TG 413) foi

aprovada em 1981 (1). TG 413 foi revisto para refletir o estado da ciência e atender

às necessidades regulatórias atuais e futuras.

2. Os estudos de toxicidade por inalação subcrônicos são usados principalmente

para obter concentrações de regulamentação para avaliar o risco do trabalhador em

ambientes de ocupação. Eles também são utilizados para avaliar residencial

humano, transporte, e risco ambiental. Esta orientação permite a caracterização de

efeitos adversos sequência de exposições repetidas inalação diária para um artigo

de teste durante 90 dias aproximadamente 10% do tempo de vida de um rato). Os

dados obtidos a partir de estudos de toxicidade por inalação subcrônicos pode ser

utilizado para avaliações de risco quantitativas e para a seleção das concentrações

em estudos crônicos. Este teste Orientação não se destina especificamente para o

teste de nanomateriais. Definições utilizadas no contexto deste método de ensaio

podem ser encontradas no Documento de Orientação 39 (2).

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Page 2: Toxicidade subcrônica Inalação

3. Todas as informações disponíveis sobre o artigo de teste deve ser considerado

pelo laboratório de ensaio antes da condução do estudo, a fim de melhorar a

qualidade do trabalho e minimizar o uso de animais. A informação que irá auxiliar na

seleção das concentrações adequadas podem incluir o de identidade, a estrutura

química e propriedades físico-químicas do artigo de teste; resultados de qualquer in

vitro ou em testes de toxicidade in vivo; utilização prevista (s) e potencial de

exposição humana; dados disponíveis (Q) SAR e os dados toxicológicos de

substâncias estruturalmente relacionadas; e dados derivados a partir de outros

repetidos estudos de exposição. Se a neurotoxicidade é esperado ou se observa no

decurso do estudo, o estudo diretor pode optar por incluir avaliações adequadas,

como uma bateria funcional observacional (FOB) e medição da atividade motora.

Embora o calendário de exposições em relação aos exames específicos podem ser

críticos, o desempenho dessas atividades adicionais não devem interferir com o

projeto básico estudo.

4. As diluições de artigos de teste corrosivos ou irritantes podem ser testadas em

concentrações que produzam o grau desejado de toxicidade [veja-se GD 39 (2)]. Ao

expor os animais a esses materiais, a concentração-alvo deve ser suficientemente

baixa para não causar dor e desconforto acentuado, no entanto suficiente para

estender a curva de concentração-resposta para níveis que atingem o objetivo

regulamentar e científico do teste. Estas concentrações devem ser selecionados em

uma base caso-a-caso, de preferência com base em um estudo para determinação

da gama projetado adequadamente que fornece informações sobre o desfecho

crítico, qualquer limiar de irritação, e do tempo de início (ver pontos 11-13). Deve ser

fornecida A justificativa para a concentração.

5. Os animais moribundos ou animais, obviamente, com dor ou mostrando sinais de

sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor. Os animais

moribundos são considerados da mesma forma que os animais que morrem durante

o ensaio. Critérios para tomar a decisão de sacrificar animais moribundos ou em

sofrimento, e orientações sobre o reconhecimento de morte previsível ou iminente,

são objeto de um documento da OCDE Orientação sobre Humane Endpoints (3).

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Seleção das espécies animais

Page 3: Toxicidade subcrônica Inalação

6. Saudáveis roedores adultos jovens de estirpes laboratoriais comumente utilizados

devem ser empregadas. A espécie preferida é o rato. Justificação deve ser

fornecida, se forem utilizadas outras espécies.

Preparação dos Animais

7. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. No dia da randomização, os

animais devem ser jovens adultos de 7 a 9 semanas de idade. Os pesos corporais

deve ser dentro de ± 20% do peso médio de cada sexo. Os animais são escolhidos

ao acaso, marcados para identificação individual, e mantidos nas suas gaiolas

durante pelo menos 5 dias antes do início do teste para permitir a aclimatação às

condições do laboratório.

Criação de animais domésticos

8. Os animais devem ser identificados individualmente, de preferência com

transponders subcutâneas, para facilitar as observações e evitar confusões. A

temperatura da sala dos animais experimentais manutenção deve ser de 22 ± 3 ° C.

A humidade relativa deve idealmente ser mantida na gama de 30 a 70%, embora

isto possa não ser possível, quando utilizando a água como veículo. Antes e depois

da exposição, os animais geralmente devem ser enjaulados em grupos por sexo e

concentração, mas o número de animais em cada gaiola não deve interferir com a

observação clara de cada animal e deve minimizar as perdas devido ao canibalismo

e de luta. Quando os animais estão a ser expostos nariz-só, pode ser necessário

para que eles ser aclimatados aos tubos de retenção. Os tubos de contenção não

devem impor física indevida, térmica, ou stress imobilização dos animais. Contenção

podem afeta os resultados fisiológicos, tais como a temperatura do corpo

(hipertermia) e / ou do volume respiratório minuto. Se os dados genéricos estão

disponíveis para mostrar que não há tais mudanças ocorrem em qualquer medida

apreciável, em seguida, pré-adaptação aos tubos de contenção não é necessário.

Os animais expostos em todo o corpo a um aerossol devem ser alojados

individualmente durante a exposição para evitar que a filtragem do teste de aerossol

através da pele dos seus companheiros de gaiola. Dietas convencionais de

laboratório e certificados podem ser utilizadas, exceto durante a exposição,

acompanhada de um suprimento ilimitado de água potável municipal. A iluminação

deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz / 12 horas de escuridão.

Page 4: Toxicidade subcrônica Inalação

Inalação Chambers

9. A natureza do artigo de teste e o objeto do teste deve ser considerado na escolha

de uma câmara de inalação. O modo preferido de exposição é de nariz-only (termo

que inclui a cabeça-only, nariz-only, ou focinho-only). Exposição apenas do nariz-se

geralmente preferido para estudos de aerossóis líquidos ou sólidos e para os

vapores que podem condensar para formar aerossóis. Objetivos especiais do estudo

pode ser melhor alcançado através de um modo de corpo inteiro de exposição, mas

isso deve ser justificada no relatório do estudo. Para assegurar a estabilidade

atmosfera quando se utiliza uma câmara de todo o corpo, o volume total dos animais

de ensaio não deve exceder 5% do volume da câmara. Princípios do nariz apenas e

integrais técnicas de exposição do corpo e suas vantagens e desvantagens

específicas são abordadas no GD 39 (2).

OS ESTUDOS DE TOXICIDADE

Limitar as concentrações

10. Ao contrário dos estudos de toxicidade aguda, não há concentrações-limite

definidos em estudos de toxicidade por inalação subcrónicos. A concentração

máxima testada deve considerar: 1) a concentração máxima alcançável, 2) o "pior

caso" nível de exposição humana, 3) a necessidade de manter um suprimento

adequado de oxigênio e / ou 4) as considerações de bem-estar animal. Na ausência

de limites à base de dados, podem ser utilizados os limites agudas do sistema global

harmonizado de classificação e rotulagem de produtos químicos das Nações Unidas

(isto é, até uma concentração máxima de 5 mg / L para aerossóis, 20 mg / L para os

vapores e 20.000 ppm para gases); referem-se a GD 39 (2). Deverá ser

devidamente justificada se for necessário para ultrapassar esses limites ao testar

gases ou artigos de teste altamente voláteis (por exemplo, refrigerantes). A

concentração limite deve provocar toxicidade inequívoca, sem causar estresse

indevido aos animais ou que afetem a sua longevidade (3).

Range-Finding Estudo

11. Antes de começar com o estudo principal, geralmente é necessária a realização

de um estudo para determinação da gama. Um estudo para determinação da gama

é mais abrangente do que um estudo de observação, pois não se limita a seleção

Page 5: Toxicidade subcrônica Inalação

concentração. Conhecimento aprendido a partir de um estudo para determinação da

gama pode levar a um estudo principal de sucesso. Um estudo para determinação

da gama pode, por exemplo, fornecer informações técnicas sobre métodos de

análise, dimensionamento de partículas, a descoberta de mecanismos tóxicos,

patologia clínica e dados histopatológicos, e estimativas do que pode ser

concentrações NOAEL e MTC em um estudo principal. O director do estudo pode

optar por usar o estudo para determinação da gama de identificar o limiar de

irritação das vias respiratórias (por exemplo, com histopatologia do trato respiratório,

teste de função pulmonar, ou lavagem ronchoalveolar), a concentração superior, que

é tolerada sem esforço impróprio para os animais, e os parâmetros que melhor

caracterizam a toxicidade de um artigo de teste. 12. Um estudo de determinação de

gama pode ser constituída por um ou vários níveis de concentração. Dependendo

dos pontos de extremidade escolhidas, 05:57 machos e de três a seis do sexo

feminino deve ser exposta a cada nível de concentração. Um estudo para

determinação da gama deve durar um mínimo de 5 dias e geralmente não mais de

28 dias. A justificativa para a escolha das concentrações para o estudo principal

devem ser fornecidas no relatório do estudo. O objetivo principal do estudo é

demonstrar uma relação concentração-resposta com base no que está previsto para

ser o ponto de extremidade mais sensível. A baixa concentração deve ser

idealmente uma concentração efeito noobserved-adverso, enquanto a alta

concentração deve provocar toxicidade inequívoca, sem causar estresse indevido

aos animais ou que afetem a sua longevidade (3).

13. Ao selecionar níveis de concentração para o estudo de determinação de gama,

todas as informações disponíveis devem ser consideradas inclusive as relações

estrutura-atividade e os dados relativos a produtos químicos semelhantes (ver ponto

3). Um estudo gama-descoberta pode verificar / refutar o que são considerados os

pontos de extremidade baseados mecanicamente mais sensíveis, por exemplo,

inibição da colinesterase por organofosforados, formação de metahemoglobina por

agentes erythrocytotoxic, hormônios tireoidianos (T3, T4) para hyrotoxicants,

proteínas, HDL, ou neutrófilos no lavado bronco-alveolar de partículas pouco

solúveis inócuos ou aerossóis irritantes pulmonares.

Estudo Principal

Page 6: Toxicidade subcrônica Inalação

14. O principal estudo de toxicidade subcrônica geralmente consiste de três níveis

de concentração, e também negativo concorrente (ar) e / ou comandos do veículo,

conforme necessário (ver parágrafo 18). Todos os dados disponíveis devem ser

utilizados para ajudar a seleção dos níveis de exposição adequadas, incluindo os

resultados de estudos de toxicidade sistémica, metabolismo e cinética (ênfase

especial deve ser dada para evitar a alta os níveis de concentração que saturam

processos cinéticos). Cada grupo de teste contém 10 do sexo masculino e 10 do

sexo feminino roedores que são expostos ao artigo de teste para 6 horas por dia em

a 5 dias por cada semana por um período de 13 semanas (duração total de pelo

menos 90 dias). Os animais também podem ser expostos 7 dias por semana (v.g. ao

testar medicamentos inalatórios). Se um dos sexos é conhecido por ser mais

susceptíveis a um determinado artigo de teste, os sexos podem ser expostos a

diferentes níveis de concentração, a fim de optimizar a concentração-resposta, como

descrito no ponto 15. Se as espécies de roedores que não sejam os ratos são

expostos nariz-only, durações máximos de exposição pode ser ajustado para

minimizar o sofrimento específica da espécie. A lógica deve ser fornecida ao utilizar

um período de exposição inferior a 6 horas / dia, ou quando é necessário proceder a

uma longa duração (por exemplo, 22 horas / dia) de estudo exposição de todo o

organismo (referem-se a GD 39)

(2). Alimentação deve ser suspenso durante o período de exposição, a menos que a

exposição superior a 6 horas. A água pode ser fornecida ao longo de uma exposição

de todo o organismo.

15. As concentrações alvo selecionados devem identificar o órgão alvo (s) e

demonstrar uma concentração-resposta clara:

• O elevado nível de concentração deve resultar em efeitos tóxicos, mas não causar

sinais persistentes ou letalidade que impeçam uma avaliação pertinente.

• O nível de concentração intermediária (s) deve ser suficientemente espaçadas para

produzir uma gradação dos efeitos tóxicos que entre a concentração de baixa e alta.

• O nível de concentração mais baixa deve produzir pouca ou nenhuma evidência de

toxicidade.

Sacrifícios provisórias

Page 7: Toxicidade subcrônica Inalação

16. Se planear sacrificar, o número de animais em cada nível de exposição deve ser

aumentado pelo número de ser sacrificado antes da conclusão do estudo. Deve ser

apresentado o justificativa para o uso de sacrifícios intermédios, e as análises

estatísticas devem corretamente responsáveis por eles.

Satellite (reversibilidade) Estudo

17. Um estudo satélite (reversibilidade) pode ser usado para observar

reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de toxicidade por um período de

pós-tratamento de um comprimento adequado, mas não inferior a 14 dias. Grupos

(reversibilidade) Satélite composto por 10 machos e 10 fêmeas expostas

simultaneamente com

os animais experimentais no estudo principal. Satellite (reversibilidade) grupos de

estudo devem ser expostos ao produto em estudo ao nível de concentração mais

alta e deve haver controles de ar e / ou veículos simultâneos conforme necessário

(ver parágrafo 18).

Animais de controle

18. Simultâneas animais (ar) de controlo negativo devem ser manuseados de forma

idêntica para os animais do grupo de teste, exceto que eles estão expostos ao ar

filtrado em vez de artigo de teste. Quando a água ou uma outra substância é

utilizada para ajudar a gerar a atmosfera de ensaio, um grupo de controlo de veículo,

em vez de um negativo (ar) grupo de controlo, devem ser incluídos no estudo. A

água deve ser utilizada como o veículo sempre que possível. Quando a água é

utilizada como o veículo, os animais de controlo devem ser expostos ao ar com a

mesma humildade relativa que os grupos expostos. A escolha de um veículo

adequado deve basear-se numa pré-estudo conduzido apropriadamente ou dados

históricos. Se a toxicidade de um veículo não é bem conhecida, o diretor de estudo

pode optar por usar tanto uma (ar) controle negativo e um controle do veículo, mas

este é fortemente desencorajada. Se os dados históricos revelam que um veículo é

não tóxico, então não há necessidade de um (Ar) do grupo de controlo negativo e

um controlo de veículo só deve ser usado. Se um pré-estudo de um teste artigo

formulados em um veículo não revela qualquer toxicidade, segue-se que o veículo

não é tóxico na concentração testada e este controla com o veículo deve ser usado.

Page 8: Toxicidade subcrônica Inalação

CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO

A administração de concentrações

19. Os animais são expostos para o artigo de teste como um gás, vapor, aerossol,

ou uma mistura dos mesmos. O estado físico para ser testado depende das

propriedades físico-químicas do produto em estudo, as concentrações selecionadas,

e / ou a forma física provavelmente presente durante o manuseamento e utilização

do teste artigo. Artigos de teste higroscópico e quimicamente reativos devem ser

testados em condições de ar seco. Cuidados devem ser tomados para evitar a

geração de concentrações explosivas. Materiais em partículas podem ser

submetidas a processos mecânicos para reduzir a dimensão das partículas. Outras

orientações são fornecidas no GD 39 (2).

Distribuição do Tamanho das Partículas

20. dimensionamento de partículas deve ser realizada em todos os aerossóis e para

os vapores que podem se condensam para formar aerossóis. Para permitir a

exposição de todas as regiões relevantes do tracto respiratório, os aerossóis com

diâmetros aerodinâmicos médios de massa (DAMM) que variam de 1 a 3 um com

um desvio padrão geométrico (σg) na gama de 1,5 a 3,0 são recomendadas (4).

Apesar de um esforço razoável deve ser feito para cumprir esta norma, o julgamento

de peritos deve ser fornecido, se não puder ser alcançado. Por exemplo, partículas

de fumos metálicos será menor do que esse padrão, e de partículas carregadas e

fibras podem ultrapassá-lo.

Artigo em teste num veículo Preparação

21. Idealmente, o artigo de teste devem ser testados sem um veículo. Se for

necessário utilizar um veículo para gerar uma concentração de artigo de teste e o

tamanho da partícula, deve ser dada preferência água apropriado. Sempre que um

produto de teste é dissolvida num veículo, a sua estabilidade deve ser demonstrada.

MONITORAMENTO DAS CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO

Câmara Airflow

Page 9: Toxicidade subcrônica Inalação

22. O fluxo de ar através da câmara de exposição deve ser cuidadosamente

controlados, monitorizados continuamente, e gravada pelo menos de hora em hora

durante cada exposição. A monitorização em tempo real da concentração atmosfera

de ensaio (ou estabilidade temporal) é uma medição integral de todos os parâmetros

dinâmicos e fornece um meio indirecto para controlar todos os parâmetros

relevantes para inalação dinâmicas. Se a concentração é monitorado em tempo real,

a frequência de medição de fluxos de ar pode ser reduzido a uma única medição por

exposição por dia. Uma atenção especial deve ser dada a evitar reinalação em

câmaras só de nariz. A concentração de oxigénio deve ser pelo menos 19% e a

concentração de dióxido de carbono não deve exceder 1%. Se houver razões para

crer que esta norma não pode ser cumprido, as concentrações de oxigênio e dióxido

de carbono devem ser medidos. Se as medições no primeiro dia de exposição

mostram que estes gases estão em níveis apropriados, não há outras medições

devem ser necessárias.

Câmara de Temperatura e Umidade Relativa

Temperatura 23. Câmara deve ser mantida a 22 ± 3 ° C. Umidade relativa do ar na

zona de respiração dos animais, tanto para o nariz apenas e de corpo inteiro

exposições, deve ser continuamente monitorado e gravado por hora durante cada

exposição, sempre que possível. A humidade relativa deve ser preferencialmente

mantida na gama de 30 a 70%, mas esta pode tanto ser inatingível (por exemplo, ao

testar as formulações à base de água) ou não mensurável devido à interferência de

artigo de teste com o método de ensaio.

Artigo de Teste: Concentração nominal

24. Sempre que possível, a concentração nominal câmara de exposição devem ser

calculados e registrados. A concentração nominal é a massa do artigo de teste

gerado dividido pelo volume total de ar que passa através do sistema de câmara de

inalação. A concentração nominal não é utilizado para caracterizar a exposição dos

animais, mas a comparação da concentração nominal e a concentração real dá uma

indicação da eficiência da geração do sistema de teste, e, portanto, pode ser

utilizado para descobrir problemas de geração.

Teste do artigo: Concentração Efetiva

Page 10: Toxicidade subcrônica Inalação

25. A concentração atual é a concentração artigo de teste como amostrado a zona

de respiração dos animais em uma câmara de inalação. Concentrações reais podem

ser obtidas através de métodos específicos (por exemplo, a amostragem direta,

adsorção ou métodos reativos químicos e caracterização analítica posterior) ou por

métodos não-específicas, tais como análise de filtro gravimétrico. O uso da análise

gravimétrica é aceitável apenas para aerossóis de pó único componente ou

aerossóis de líquidos de baixa volatilidade e deve ser apoiada por caracterizações

adequadas específicas de artigo de teste de pré-estudo. Concentração de aerossol

de pó multi-componente pode também ser determinada por análise gravimétrica. No

entanto, este requer dados analíticos que demonstram que a composição do

material transportado pelo ar é semelhante ao material de partida. Se esta

informação não estiver disponível, uma re-análise do material de teste (de

preferência, no seu estado no ar), a intervalos regulares durante o curso do estudo,

pode ser necessário. Para os agentes de aerossol que pode evaporar ou sublimar,

deve ser demonstrado que todas as fases foram recolhidas através do método

escolhido.

26. Um lote de artigo de teste deve ser usado durante todo o período de duração do

estudo, se possível, e a amostra de teste deve ser armazenado sob condições que

mantêm a sua pureza, homogeneidade e estabilidade. Antes do início do estudo,

deve haver uma caracterização do artigo de teste, incluindo a sua pureza e, se

tecnicamente possível, a identidade, e as quantidades de contaminantes

identificados e impurezas. Esta pode ser demonstrada por, mas não está limitado a,

os seguintes dados: tempo de retenção e área do pico relativo, o peso molecular a

partir de espectroscopia de massa ou por cromatografia de gás analisa, ou outras

estimativas.

Embora não seja o de identificar amostra de teste de responsabilidade do laboratório

de teste, pode ser prudente para o laboratório de teste para confirmar a

caracterização da patrocinadora, pelo menos, de uma forma limitada (por exemplo,

cor, natureza física, etc.).

27. A atmosfera de exposição deve ser realizada o mais constantes possível. Um

dispositivo de monitorização em tempo real, tal como um fotómetro de aerossol para

aerossóis ou um analisador de hidrocarbonetos total de vapores, podem ser

utilizados para demonstrar a estabilidade das condições de exposição.

Concentração real câmara deve ser medido pelo menos 3 vezes durante cada dia de

Page 11: Toxicidade subcrônica Inalação

exposição para cada nível de exposição. Se não for possível devido a taxas de fluxo

de ar limitadas ou baixas concentrações, uma amostra por período de exposição é

aceitável. Idealmente, esta amostra deve, então, ser recolhidos ao longo de todo o

período de exposição. Amostras de concentração de câmara individuais devem

desviar-se da câmara de concentração média de não mais do que ± 10% para os

gases e vapores, e por não mais do que ± 20% para aerossóis líquidos ou sólidos.

Tempo para atingir o equilíbrio câmara (t95) devem ser calculados e comunicados. A

duração da exposição estende o tempo em que o artigo de teste é gerada. Isso leva

em conta os tempos necessários para atingir o equilíbrio câmara (t95) e decadência.

Orientação para estimar t95 pode ser encontrado em GD 39 (2).

28. Para misturas muito complexas consistindo de gases/vapores e aerossóis (por

exemplo, atmosferas de combustão e artigos de teste propulsionadas de produtos

de uso final com propósitos/dispositivos), cada fase pode se comportar de maneira

diferente em uma câmara de inalação. Por conseguinte, pelo menos uma substância

indicadora (analito), normalmente o princípio ativo na formulação do produto testado,

de cada uma das fases (gás / vapor e aerossol) deve ser selecionado. Quando o

artigo de teste é uma mistura (por exemplo, uma formulação), a concentração

analítica deve ser reportada para a formulação total, e não apenas para o

ingrediente ativo ou do componente (analito). Informações adicionais sobre as

concentrações reais podem ser encontrados em GD 39 (2).

Artigo de Teste: Distribuição de Tamanho de Partículas

29. A distribuição do tamanho das partículas dos aerossóis deve ser determinada

pelo menos semanalmente para cada nível de concentração usando um impacto em

cascata ou um instrumento alternativo, tal como um dimensionador de partícula

aerodinâmico (APS). Se equivalência dos resultados obtidos por um impacto em

cascata e a alternativa

instrumento pode ser mostrado, em seguida, o instrumento alternativo pode ser

usado durante todo o estudo.

30. Um segundo dispositivo tal como um filtro gravimétrico ou um borbulhador

impinger / gás, deve ser usado em paralelo com o instrumento principal para

Page 12: Toxicidade subcrônica Inalação

confirmar a eficiência de recolha do instrumento primário. A concentração de massa

obtida por análise de tamanho de partícula deve estar dentro dos limites razoáveis

da concentração em massa obtida por análise de filtro [ver GD 39 (2)]. Se

equivalência pode ser demonstrada em todas as concentrações testadas na fase

inicial do estudo, em seguida, ainda mais medições de confirmação podem ser

omitidas. Por uma questão de bem-estar animal, devem ser tomadas medidas para

minimizar os dados conclusivos que possam levar a uma necessidade de repetir um

estudo.

31. Partícula de dimensionamento deve ser realizada para os vapores se há

qualquer possibilidade de que a condensação do vapor pode resultar na formação

de um aerossol, ou se as partículas forem detectadas em uma atmosfera de vapor

com potencial de fases mistas.

OBSERVAÇÕES

32. Os animais devem ser clinicamente observados antes, durante e após o período

de exposição. Mais observações frequentes podem ser indicadas, dependendo da

resposta dos animais durante a exposição. Quando a observação de animais é

dificultada pelo uso de tubos de contenção do animal, câmaras de corpo inteiro com

pouca iluminação, ou atmosferas opacas, os animais devem ser cuidadosamente

observados após a exposição. Observações antes da exposição do dia seguinte

podem avaliar qualquer reversibilidade ou exacerbação de efeitos tóxicos.

33. Todas as observações são registradas com registros individuais sendo mantido

para cada animal. Quando os animais são mortos por razões humanitárias ou

encontrados morto, no momento da morte deve ser registrado com a maior precisão

possível.

34. Observações do lado da gaiola devem incluir alterações na pele e da pele, olhos

e mucosas; mudanças nos sistemas respiratório e circulatório; alterações do sistema

nervoso; e mudanças na atividade somatomotor e padrões de comportamento. A

atenção deve ser dirigida à observação de tremores, convulsões, salivação, diarreia,

letargia, sono e coma. A medição da temperatura retal pode fornecer evidência de

suporte da bradipneia reflexo ou hipo / hipertermia relacionados com o tratamento ou

confinamento. Avaliações adicionais podem ser incluídas no protocolo de estudo,

Page 13: Toxicidade subcrônica Inalação

tais como cinética, biocontrolo, a função pulmonar, a retenção de materiais

fracamente solúveis que se acumulam no tecido pulmonar e alterações

comportamentais.

OS PESOS CORPORAIS

35. pesos a cada animal devem ser registrados pouco antes da primeira exposição

(dia 0), duas vezes por semana depois (por exemplo: às sextas-feiras e segundas-

feiras para demonstrar a recuperação ao longo de um fim de semana livre de

exposição, ou em um intervalo de tempo para permitir a avaliação da toxicidade

sistêmica), e no momento da morte ou eutanásia. Se não há nenhum efeito nas

primeiras 4 semanas, os pesos corporais podem ser medidos semanalmente

durante o período restante do estudo. Satélite (reversibilidade) animais (se utilizado)

deverá continuar a ser pesados semanalmente durante o período de recuperação.

No final do estudo, todos os animais devem ser pesados, pouco antes de serem

sacrificados para permitir a um órgão de imparcial calculada para proporções de

peso corporal.

ALIMENTOS E ÁGUA CONSUMO

36. O consumo de alimentos deve ser medido semanalmente. O consumo de água

pode também ser medido.

PATOLOGIA CLÍNICA

37. Avaliações de patologia clínica deve ser feita para todos os animais, incluindo

controles e (reversibilidade) animais de satélite, quando eles são sacrificados. O

intervalo de tempo entre o final da exposição e de recolha de sangue deve ser

gravado, particularmente quando a reconstituição do ponto final abordado é rápida.

Amostragem após o final da exposição é indicado para esses parâmetros com uma

meia-hora plasma curto (por exemplo, COHb, CHE, e MetHb)

38. A Tabela 1 apresenta os parâmetros de patologia clínica que geralmente são

necessárias para que os estudos de toxicologia. O exame de urina não é necessário

numa base de rotina, mas pode ser realizada quando considerada útil com base na

toxicidade esperada ou observada. Os diretores do estudo podem optar por avaliar

Page 14: Toxicidade subcrônica Inalação

parâmetros adicionais, a fim de melhor caracterizar a toxicidade de um artigo de

teste (por exemplo, de colinesterase, lípidos, hormonas, equilíbrio ácido / base,

órgãos de meta-hemoglobina ou Heinz, creatina quinase, relação mielóide / eritróide,

troponina, gasometria arterial, lactato desidrogenase, sorbital desidrogenase,

glutamato desidrogenase, e gama glutamil transferase).

Tabela 1. Parâmetros padrão de Patologia Clínica

Hematologia

Contagem de eritrócito A contagem total de leucócitos

Hematócrito Contagem diferencial de leucócitos

Concentração de hemoglobina A contagem de plaquetas

Hemoglobina corpuscular média Potencial de coagulação (escolher um):

Volume corpuscular média O tempo de protrombina

Hemoglobina corpuscular média O tempo de coagulação

Concentração Tempo de tromboplastina parcial

Reticulócitos

Química Clínica

glicose * alanina aminotransferase

O colesterol total) aspartato aminotransferase

Triglicerídeos fosfatase alcalina

Uréia potássio

bilirrubina total Sódio

Creatinina Cálcio

A proteína total Fósforo

Albumina Cloreto

Globulina

O exame de urina (opcional)

Aspecto (cor e turbidez) A proteína total

Volume Glicose

Gravidade ou da pressão osmótica

especifica

As células do sangue / sangue

pH

* Porque um período de jejum prolongado pode introduzir viés em medições de glicose para o tratado versus animais controle, o diretor do estudo deve determinar

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se é apropriado para jejuar os animais. Se um período de jejum é usado, ele deve ser apropriado para as espécies utilizadas; para o rato pode ser de 16 h (de jejum durante a noite). Determinação da glicemia de jejum pode ser levada a cabo, após um jejum durante a última semana de exposição, ou após um jejum durante a noite antes da necropsia (neste último caso, em conjunto com todos os outros parâmetros de patologia clínica).

39. Quando há evidências de que o trato respiratório inferior (isto é, os alvéolos) é o

principal local de deposição e retenção, em seguida, a lavagem bronco alveolar

(LBA) pode ser a técnica escolhida para analisar quantitativamente parâmetros

dose-efeito baseada em hipóteses focando alveolite, inflamação pulmonar e

fosfolipidose. Isto permite uma dose-resposta e mudanças de curso de tempo de

lesão alveolar ser adequadamente sondadas. O LBA podem ser analisados para

contagem de leucócitos total e diferencial, proteína total, e lactado desidrogenase.

Outros parâmetros que podem ser considerados são os que indicativa de lesão

lisossomal, fosfolipidose, fibrose, e inflamação alérgica ou irritante, que pode incluir

a determinação de citoquinas pró-inflamatórias/quimiocinas. Medições LBA

geralmente complementar os resultados dos exames histopatológicos, mas não

podem substituí-los. Orientações sobre como realizar a lavagem pulmonar pode ser

encontrada em GD 39. (2)

EXAME OFTALMOLÓGICO

40. Usando um oftalmoscópio ou um dispositivo equivalente, exames oftalmológicos

do fundo de olho, meios de refração, íris e conjuntivas deve ser realizada para todos

os animais antes da administração do artigo de teste, e para todos de alta

concentração e grupos de controle na rescisão. Se forem detectadas alterações nos

olhos, todos os animais dos outros grupos devem ser examinados, incluindo o

(reversibilidade) grupo satélite.

PATOLOGIA E ÓRGÃO BRUTA PESOS

41. Todos os animais de teste, incluindo os que morreram durante o ensaio ou que

foram retirados do estudo por razões de bem-estar animal, devem ser submetidos a

completar exsanguination (se possível) e autópsia. O tempo entre o fim da última

exposição de cada animal e o seu sacrifício deve ser gravado. Se a necropsia não

pode ser realizada imediatamente após um animal morto é descoberto, o animal

deve ser refrigerado (não congelada), a uma temperatura suficientemente baixa para

Page 16: Toxicidade subcrônica Inalação

minimizar a autólise. Necropsias devem ser realizadas o mais rapidamente possível,

normalmente dentro de um dia ou dois. As alterações patológicas devem ser

registradas para cada animal, com especial atenção para as alterações nas vias

respiratórias.

42. A Tabela 2 lista os órgãos e tecidos que devem ser conservados em meio

adequado durante a autópsia para exame histopatológico. A preservação dos [entre

colchetes] órgãos e tecidos e de quaisquer outros órgãos e tecidos é a critério do

diretor do estudo. Os órgãos em negrito devem ser aparadas e pesava molhar o

mais rapidamente possível após a dissecação para evitar a secagem. A tireoide e

epidídimos só deve ser pesado, se necessário, porque o corte artefatos podem

dificultar a avaliação histopatológica. Tecidos e órgãos devem ser fixados em

formalina a 10% tamponada ou outro fixador adequado logo que necropsia é

realizada, e não menos do que 24-48 horas antes do corte de acordo com o fixador

para ser utilizado.

Tabela 2. Órgãos e tecidos conservados durante a necropsia GrossAdrenais

AortaA medula óssea (e / ou aspirado fresco)

Cérebro (incluindo secções de cérebro, cerebelo, e medula / pons)CecoCólonDuodeno[Epidídimos][Olhos (retina, nervo óptico) e pálpebras]Fêmur e sufocar conjuntaVesícula biliar (quando presente)[Harderian glândulas]CoraçãoÍleoJejunoRins[Glândulas lacrimais (extraorbital)]Laringe (3 níveis, incluindo a base da epiglote)FígadoPulmão (todos os lobos em um nível, incluindo brônquios principais)

Gânglios linfáticos da região hilar do pulmão,especialmente para o ensaio de partículas pouco solúvel materiais. Para mais nos exames de profundidade e / ou estudos com foco imunológica, linfa adicional nodos podem ser considerados, por exemplo, aqueles do mediastino, cervical / submandibular e / ou auricular regiões.Linfonodos (distais a partir da entrada portal-de-)

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Glândula mamária (feminino)Músculo (coxa)Tecidos nasofaríngeas (pelo menos 4 níveis; um nível para incluem o duto da nasofaringe e a nasal Associated Lymphoid Tissue (NALT))Esófago[Bulbo olfatório]OváriosPâncreasParatireóidesNervos periféricos (ciático ou tibial,de preferência perto do músculo)PituitárioPróstataRetoGlândulas salivaresVesículas seminaisPeleMedula espinhal (cervical, médio-torácico, e lombar)BaçoEsternoEstômagoTeethTestesThymusTireóides[Língua]Traquéia (pelo menos 2 níveis, incluindo uma secção longitudinal através do carina e uma seção transversal)[Ureter][Uretra]Bexiga urináriaÚteroOs órgãos-alvoTodas as lesões macroscópicas e massas

43. Os pulmões devem ser removidos intactos, pesados, e instilado com um fixador

adequado, a uma pressão de 20-30 cm de água para assegurar que é mantida a

estrutura do pulmão (5). Seções devem ser recolhidos para todos os lobos em um

nível, incluindo brônquios principais, mas se a lavagem pulmonar é realizada, o lobo

unlavaged deveria ser seccionada em três níveis (não cortes seriados).

44. Pelo menos quatro níveis de os tecidos da nasofaringe deve ser examinado,

uma das quais deverá incluir a conduta da nasofaringe (5) (6) (7) (8) (9) para permitir

o exame adequado do escamoso, de transição (não-ciliado respiratório),

respiratórias (respiratória ciliadas) e epitélio olfativo, eo tecido drenagem linfática

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(NALT) (10) (11). Três níveis da laringe devem ser examinados, e um destes níveis

deve incluir a base da epiglote (12). Pelo menos dois níveis de traqueia deve ser

examinado, incluindo uma secção longitudinal através da carina da bifurcação da

secção transversal e uma brônquios extrapulmonares.

HISTOPATOLOGIA

45. A avaliação histopatológica de todos os órgãos e tecidos listados na Tabela 2

deve ser realizada para os grupos de controle e de alta concentração, e para todos

os animais que morrem ou são sacrificados durante o estudo. Particular atenção

deve ser dada para o trato respiratório, os órgãos-alvo, e as lesões graves. Os

órgãos e tecidos que apresentam lesões no grupo de alta concentração devem ser

examinados em todos os grupos. O diretor do estudo podem optar por realizar

avaliações histopatológicas para grupos adicionais para demonstrar uma resposta

clara concentração. Quando um (reversibilidade) grupo satélite é usado, avaliação

histopatológica deve ser realizada em todos os tecidos e órgãos que apresentaram

efeitos identificados nos grupos tratados. Se houver mortes precoces excessivas ou

outros problemas do grupo de alta exposição que comprometem o significado dos

dados, a seguinte concentração mais baixa deve ser examinada

histopatologicamente. Deve ser feita uma tentativa de correlacionar observações

brutas com achados microscópicos.

Relatório

Dados

Devem ser fornecidos

46. Dados individuais dos animais em pesos corporais, o consumo de alimentos,

patologia clínica, patologia grave, peso dos órgãos, e histopatológica. Dados de

observação clínicos devem ser resumidos num quadro que indique, para cada

experiência, o número de animais utilizados, o número de animais que apresentam

sinais específicos de toxicidade, o número de animais encontrados mortos durante o

ensaio ou abatidos por intervenção humana, data da morte do indivíduo animais,

uma descrição e tempo de percurso de efeitos e reversibilidade tóxicos, e os

resultados da autópsia. Todos os resultados quantitativos e, ao fundo, devem ser

avaliados por um método estatístico apropriado. Qualquer método estatístico

Page 19: Toxicidade subcrônica Inalação

geralmente aceite pode ser usado e os métodos estatísticos devem ser selecionados

durante a concepção do estudo.

Relatório Do Teste

47. O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações, conforme o caso:

Animais de ensaio e pecuária - Descrição das condições de encarceramento,

incluindo: número (ou mudança no número) de animais por gaiola, material de cama,

temperatura ambiente e umidade relativa do ar, o foto período, e identificação de

dieta.

- Espécies / cepa utilizada e justificativa para o uso de outros que o rato

espécie. Fonte e dados históricos podem ser fornecidos, se forem para animais

expostos em condições de exposição, habitação e jejum semelhantes.

- Número, idade e sexo dos animais.

- Método de randomização.

- Descrição de qualquer pré-teste condicionado incluindo dieta, quarentena e

tratamento para a doença.

Artigo de teste

- Natureza física, pureza e, onde as propriedades relevantes, físico-químicas

(incluindo isomerização).

- Dados de Identificação e Chemical Abstract Services (CAS) Número de registro, se

conhecido.

Veículo

- Justificação para a utilização do veículo e justificação para a escolha do veículo (se

diferente de água).

- Dados históricos ou concorrentes que demonstrem que o veículo não interferir com

o resultado do estudo.

Câmara de inalação

- Descrição pormenorizada da câmara de inalação, incluindo o volume e um

diagrama.

- Fonte e descrição do equipamento utilizado para a exposição de animais, bem

como a geração de atmosfera.

Page 20: Toxicidade subcrônica Inalação

- Equipamento para medição de temperatura, umidade, de tamanho de partículas, e

concentração real.

- Fonte de sistema de ar condicionado e usado para.

- Os métodos utilizados para a calibração de equipamentos para garantir uma

atmosfera de ensaio homogênea.

- Diferença de pressão (positiva ou negativa).

- Portas da exposição por câmara (nariz-only); localização dos animais na câmara

(de corpo inteiro).

- Estabilidade da atmosfera de ensaio.

- Localização dos sensores de temperatura e umidade e amostragem de ambiente

de teste no câmara.

- Tratamento de ar fornecido / extraída.

- As taxas de fluxo de ar, taxa de fluxo de ar / porto exposição (nariz-only), ou da

carga animal / câmara (Wholebody).

- Hora de equilíbrio câmara de inalação (t95).

- Número de mudanças de volume por hora.

- Dispositivos de medição (se aplicável).

Dados relativos à exposição

- Justificação para a seleção concentração alvo no estudo principal.

- Concentrações nominais (massa total de produto de teste gerados na câmara de

inalação dividido pelo volume de ar que passa através da câmara).

- Concentrações artigo de testes reais recolhidos por zona de respiração dos

animais; para misturas de teste que produzem formas físicas heterogêneas (gases,

vapores, aerossóis), cada um deles pode ser analisado separadamente.

- Todas as concentrações de ar devem ser comunicados em unidades de massa

(mg / L, mg / m3, etc.), e não em unidades de volume (ppm, ppb, etc.).

- Distribuição do tamanho das partículas, o diâmetro aerodinâmico médio de massa

(DAMM) e o desvio padrão geométrico (σg), incluindo os seus métodos de cálculo.

As análises granulométricas individuais devem ser notificadas.

As condições de teste

Page 21: Toxicidade subcrônica Inalação

- Detalhes da preparação do artigo de teste, incluindo os pormenores de quaisquer

procedimentos utilizados para reduzir o tamanho das partículas de materiais sólidos,

ou para preparar soluções do produto em estudo.

- Uma descrição (incluindo de preferência um diagrama) do equipamento utilizado

para produzir a atmosfera de ensaio e para expor os animais ao ambiente de teste.

- Detalhes do equipamento usado para monitorar a temperatura da câmara, umidade

e fluxo de ar câmara (ou seja, o desenvolvimento de uma curva de calibração).

- Detalhes do equipamento utilizado para coletar amostras para determinação da

câmara

Concentração e distribuição de tamanho de partícula.

- Os detalhes do método analítico químico usado e validação do método (incluindo a

eficiência de recuperação de produto de teste a partir do meio de amostragem).

- Método de randomização na atribuição de animais para testar e grupos de controle.

- Detalhes de alimentos e de qualidade da água (incluindo o tipo de dieta / fonte,

fonte de água).

- A justificativa para a escolha das concentrações.

Resultados

- Tabulação de temperatura da câmara, umidade e fluxo de ar.

- Tabulação de nominal de câmara e os dados reais de concentração.

- Tabulação de dados de tamanho de partículas, incluindo dados de amostra

analítica de coleta, distribuição de tamanho de partículas, e cálculos do DAMM e σg.

- Tabulação dos dados de resposta e nível de concentração para cada animal (ou

seja, animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade,

natureza, gravidade, tempo de início e duração dos efeitos).

- Tabulação de peso individual dos animais.

- Apuramento do consumo de alimentos

- Tabulação dos dados de patologia clínica

- Os achados de necropsia e resultados histopatológicos para cada animal, se

disponíveis.

Discussão e interpretação dos resultados

Page 22: Toxicidade subcrônica Inalação

- Ênfase especial deve ser feita para a descrição dos métodos utilizados para

cumprir os critérios do presente método de ensaio, por exemplo, a concentração

limite ou o tamanho das partículas.

- A respirabilidade de partículas em função dos resultados globais devem ser

abordados, especialmente se os critérios de tamanho de partícula não puderam ser

cumpridos.

- A consistência dos métodos utilizados para determinar as concentrações nominais

e reais, e a relação da concentração real de concentração nominal deve ser incluída

na avaliação global do estudo.

- A causa provável da morte e do modo predominante de ação (contra sistêmica

local) deve ser abordada.

- Uma explicação deve ser fornecida, se havia uma necessidade de sacrificar

humanamente animais em dor ou mostrando sinais de sofrimento intenso e

duradouro, com base nos critérios do Documento de Orientação da OCDE sobre

Humane Endpoints (3).

- O órgão (s) alvo deve ser identificado.

- O NOAEL e LOAEL devem ser determinadas.

REFERENCES

1) OECD (1981), Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.

2) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.

3) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signsas Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

4) Whalan, J.E. and Redden, J.C. (1994). Interim Policy for Particle Size and LimitConcentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.

5) Dungworth, D.L., Tyler, W.S., and Plopper, C.E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material , Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.

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6) Young J.T. (1981) Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1, 309-312.

7) Harkema J.R. (1990) Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85, 231-238.

8) Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A. van, Slootweg P.J. and Feron V.J. (1994) Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.

9) Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M. and Morgan K.T. (1994) Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22, 353-372.

10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C. and Sminia T. (1992) The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13, 219-224.

11) Kuper C.F., Arts J.H.E. and Feron V.J. (2003) Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141, 281-285.

12) Lewis D.J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3). 419-428.