tÉcnicas 2010 espectrometria de massas1
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Espectrometria de massaTRANSCRIPT
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Pesquisador(es) ano contribuio
J. J. Thompson 1912 Primeiro espectrmetro de Massas
Dempster 1918 Desenvolvimento de ionizao
eletrnica e focalizao magntica
Aston 1919 Massa atmica usando MS
Stephens 1946 anlise por Tempo de vo
Nier-Johnson 1952 Instrumentos de duplo-foco
Paul, Steinwedel, Raether, 1953- Analisadores quadrupolo
Reinhard, von Zahn 1958
Willey e McLaren 1955 Desenvolvimento de analisador
tempo de vo avanado
Gohlke e McLafferty 1956 Cromatografia gasosa acoplado a
Espectrometria de Massas (CG-EM)
Beynon 1956 Espectro de Massas alta resoluo
Biemann, Seibl e Gapp 1959 Sequenciamento de Peptdeos
Hipple, Sommer e Wabschall 1965 ressonncia ciclotrnica de ons
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Investigador(es) Ano contribuio
Munson 1966 Ionizao Qumica
McLafferty 1967 Espectrometria de Massas
Tandem
Dole, Mack, Hines e
Alice 1968 Ionizao Eletrospray
McLafferty 1973 Cromatografia Lquida acoplada a
espectrometria de Massas (LC-MS)
Yamashita e Fenn,
Aleksandrov. 1984 Aplicao de Ionizao Eletrospray
Gall, Krasnov, Dokl, Baram, a anlise de macromolculas
Pavlenko, Nikolaev,
Sckurov, e Garacher
Karas, Tanaka, Bachmann 1987-
Matriz assistida por Dessoro de
laser
Hillenkamp, Waki, Ido, 1988 MALDI-MS
e Yoshida
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Espectrometria de Massas
Ilustrao do processo de anlise de massa e do espectro de massas
de cis- 9, lO-octadecenoamida.
A espcie original tem massa m = 281. A Ionizao adiciona um prton, formando
um on positivo com razo massa/carga m/z = 282, o qual aparece como o pico
principal do espectro. Os outros ons so fragmentos do on original.
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Espectrmetro de massas
Um espectrmetro de massas um equipamento analtico que determina a massa molecular de compostos qumicos, e de seus fragmentos, separando os ons moleculares de acordo com suas razes massa-carga (m/z). Os ons so gerados por induo seja por ganho ou perda de carga (e.x., ejeo do eltron, protonao ou desprotonao).
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Figura 1.2 Analogia entre anlise de massa e disperso da luz.
Fonte de ons
Fonte luminosa
Analisador de massas
Prisma
Detector de luz
Detector de massas
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Figura 1.3 Componentes de um espectrmetro de
massas.
Sistema de dados (computador)
Detector
Analisador de massa Fonte de ionizao
Introduo da amostra
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Fontes de on e insero de
amostra A injetor de amostras a interface
entre a amostra e o espectrmetro de massas (Figura 1.1). Para se analisar por espectrometria de massas, uma amostra a presso atmosfrica deve ser injetada no instrumento ao qual se encontra sob vcuo. Uma amostra pode ser injetada de muitas maneiras, as mais comuns so a insero direta , ou por infuso atravs de uma coluna capilar (cromatografia gasosa ou cromatografia lquida).
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Ionizao da amostra
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Insero direta
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Coluna capilar
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LC-MS cromatografia lquida acoplada a
espectrometria de massas
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Ionizao de eltrons (EI) foi a primeira fonte de ionizao para anlises de massa at 1980, limitando a qumica a molculas pequenas bem abaixo das massas de compostos bioorgnicos comuns. Esta limitao motivou cientistas como John B. Fenn, Franz Hillenkamp, Michael Karas e Michael Barber a desenvolver tcnicas para anlise de biomolculas que so comumente conhecidas como bombardeamento de tomos rpidos (FAB), Ionizao por dessoro a Laser assistida por matriz (MALDI), e Ionizao por eletrospray (ESI).
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Mtodos de ionizao para compostos bioinorgnicos
Tcnica de ionizao Sigla Modo de Ionizao
Ionizao de Eltron
EI Transferncia de eltron
Bombardeamento de tomos rpidos
FAB Transferncia de prton
Desoro a laser assistida por matriz
MALDI Transferncia de prton
Eletrospray ESI Evaporao de partculas carregadas
Tabela 1
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Ionizao de eltrons (Electron
Ionization- EI )
Importante na rotina de anlise de
molculas pequenas.
Bases de dados contendo espectro de massas de mais de 100.000 compostos so usadas e consultadas por milhares de qumicos.
Bases de dados possuem algorrtmos que permitem a rpida comparao com espectros de massas conhecidos, facilitando a determinao estrutural de molculas pequenas.
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EI Tcnica simples. A amostra deve chegar na forma de gs - um
processo normalmente realizado por dessoro trmica da amostra da sonda. O alto vcuo do espectrmetro de massas e o aquecimento, pode facilitar este processo. Uma vez na fase gasosa, a substncia passa para uma regio de ionizao de eltrons (Figura 1,4), onde ele interage com uma nuvem de eltrons resultando na ejeo de eltrons e algum grau de fragmentao.
Aplicabilidade da EI: diminui significativamente para os compostos acima da massa molecular de 400 Da.
Dificuldades: exige dessoro trmica da amostra na fonte, muitas vezes leva ionizao e decomposio antes da vaporizao. No volatilizao da amostra de grandes molculas e da decomposio trmica, e em muitos casos ocorre fragmentao excessiva.
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Vantagens e desvantagens da Ionizao de eltrons
Vantagens Desvantagens
Sensibilidade elevada (picomols (1X10-12)
Limitado a compostos com Massa molecular baixa devido
baixa volatilizao Uso das fragmentaes para comparao com base de dados de compostos obtendo informaes estruturais
Possvel decomposio da amostra por dessoro trmica.
Uso das fragmentaes para comparao com base de dados de compostos
Excesso de fragmentaes resultando na perda de informao do on molecular.
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Ionizao Qumica (CI)
Tcnica mais branda em relao a EI
Formao de espcies radicalares a partir de gases
Obteno de dados do on molecular
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Ionizao Qumica
Molculas da amostra misturadas com um fluxo de gs reagente ionizado.
Gases utilizados: metano, amnia, isobutano e metanol.
Reaes : Caderno
Grau de fragmentao : observar Afinidade protnica.
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:Ionizao Qumica
afinidade protnica Resultado
(kcal.mol-1)
H2 101 frag. significativa
CH4 132 menos frag. que H2
CH3OH 182 Branda, pequena frag.
Frag. : Fragmentao
Observar espectros do caderno
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Bombardeamento de tomos rpidos (FAB) tcnica de ionizao (Figura 1,5) normalmente requer o uso de uma sonda de insero direta para a introduo da amostra
feixe de alta energia de tomos de Xe, para chocar-se com a amostra e com a matriz.
A matriz : um solvente voltil no qual a amostra dissolvida. A matriz FAB reabastece constantemente a superfcie com uma nova amostra, como o feixe de ons incidente bombardeia essa superfcie.
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A matriz tambm serve para
minimizar os danos amostra do feixe
de partculas de alta energia,
absorvendo a maior parte da energia
facilitando o processo de ionizao.
Matrizes para FAB so lcool m-
nitrobenzlico e glicerol
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lcool meta-nitrobenzlico glicerol
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Parte da Figura 1.5
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Sequncia de aminocidos
Feixe de ons csio
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Vantagens e desvantagens da ionizao FAB
Vantagens Desvantagens
Prtico ampla massa de at 20.000 Da.
Queda da sensibilidade com altas massas
As anlises podem ser executadas rapidamente.
Resoluo baixa em relao a MALDI e Eletrosplay
A "ionizao suave". O on molecular obtido facilmente com
pouca fragmentao.
Pouca fragmentao portanto, apenas uma quantidade limitada de informaes podem ser obtidas.
Facilidade de adio de ctions na matriz levando ao on molecular com ctions (metais alcalinos adventcios) (por exemplo: (M+Na)+, (M+K)+ .
Anlise confusa, requer grande experincia com a tcnica e com os ons de fundo.
Facilidade de adaptao a instrumentao de alta resoluo, permitindo a medio da massa exata.
Requer solubilidade da amostra da matriz
Impacto com de glicerol, permite multiplicar ons carregados,mais adequada para biopolmeros de alta Massa Molecular.
Pouca utilidade para amostras apolares que no formam cargas
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MALDI
Permite a anlise de compostos de alto peso molecular com alta sensibilidade. um mtodo
que permite a ionizao e a transferncia de uma amostra de uma fase outra de uma forma similar a
FAB. A principal diferena entre MALDI e FAB que enquanto a FAB usa uma matriz lquida,
MALDI utiliza uma matriz slida, e o feixe de luz laser ionizante. A formao de ons em MALDI realizada por um feixe de laser pulsado em uma amostra suspensa ou dissolvida em uma matriz,
que absorve a energia e carrega a amostra. Matrizes: cidos nicotnico, picolnico, e cinmico.
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NO
OH
N
O
OHcido
nicotnico
OH
O
OH
N
cido ciano 4- hidroxicinmico
cido picolnico
Matrizes para MALDI - (LASER)
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MALDI
A matriz em fase gasosa facilita ionizao das molculas do analito.
Molculas carregadas so dirigidas por lentes eletrostticas da fonte de ionizao no analisador de massa. Molculas neutras muitas vezes reagem com as molculas de matriz ou de outras molculas produzindo espcies carregadas, sendo transferidas eletrostaticamente no analisador de massa.
Anlise: TOF (tempo de vo) Eficincia do processo permite a anlise de quantidades relativamente pequenas de amostra (faixa de picomol)
. A anlise de amostras heterogneas torna MALDI muito bom na anlise de massa de amostras biolgicas.
Amostras que podem ser analisadas por MALDI: oligonucleotdeos, oligossacardios, polipetdeos (maior que 30 aminocidos), anticorpos e pequenas protenas (peptdio com mais de 50 aminocidos).
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Feixe de ftons
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MALDI Vantagens
Prtico gama de massas de at 300.000 Da.
Espcie de massas muito maiores tm sido relatados.
Sensibilidade tpica da ordem menor que femtomol.
Ionizao branda com pouca ou nenhuma fragmentao observada.
Adequada para a anlise de misturas complexas.
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MALDI desvantagens
Baixa resoluo MALDI Alguns instrumentos so capazes de maior resoluo, no entanto, esta conseguida em escala de massa relativamente baixa e custa de sensibilidade.
Matriz de fundo, que pode ser problema para os compostos abaixo de uma massa de 1000 Da.
Possibilidade de fotodegradao por laser.
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Ionizao Eletrospray um mtodo que molculas ionizadas gasosas a partir de
uma soluo lquida. Isto feito atravs da criao de um fino spray de gotculas altamente carregadas na presena de um potencial de alta voltagem (4.000 V). So expulsas pequenas gotculas carregadas. Estas passam por um fluxo de nitrognio que evapora o solvente. A densidade de cargas aumentas e estas se dividem em menores partculas.
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Ionizao eletrospray propcio para aumentar a formao de molculas carregadas. Esta uma caracterstica importante uma vez que o espectrmetro de massa mede a relao massa/carga, tornando possvel observar molculas muito grandes com um instrumento com uma faixa de massa relativamente pequena.
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Eletrospray vantagens
Prtico gama de massas de at 200.000 Da.
Boa sensibilidade at fentomol (1x10-15).
Ionizao mais branda de todas com capacidade de observar interaes no covalentes de amostras biolgicas.
Facilmente adaptvel a Cromatografia lquida. Capaz de analisar diretamente eluentes de Cromatografia Lquida , com uma razo de um mL por minuto.
No h interferncia da matriz.
Mltiplas cargas com preciso melhor de massa atravs da mdia.
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Eletrospray desvantagens
Dificuldade de limpeza instrumento, devido alta sensibilidade para determinados compostos.
Baixa tolerncia para misturas. A pureza da amostra importante.
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ANALISADORES DE MASSA
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Quadrupolo Analisador
Quadrupolos so quatro barras metlicas precisamente alinhadas sob uma voltagem direta (DC) e um potencial de radiofrequncia (RF) (Figura 2.4).
O campo nos quadrupolos determina quais ons so permitidos a chegar ao detector.
Figura 2.4 - Analisador quadrupolo
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lon Trap = armadilha de ons
O analisador de massa ion trap foi desenvolvido na mesma poca do quadrupolo. A Fsica envolvida em ambos analisadores so muito similares; entretando, suas aplicabilidades para ionizao eletrospray ainda esto sendo desenvolvidas.
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Analyzer Time of-Flight (TOF) Tempo de vo Analisador TOF um dos mais simples analisadores de
massa e comumente utilizado com a ionizao MALDI. A anlise por TOF baseada em acelerar um conjunto de ons para o detetor com a mesma quantidade de energia. Devido ao fato dos ons terem a mesma energia, embora com diferentes massas, faz com que os on cheguem ao detetor em tempos diferentes. O processo anlogo a jogar uma bola de golfe e uma bola de basquete com a mesma energia. A bola de golfe chegar primeiro, o mesmo ocorre com os ons.
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Equaes: Energia cintica (KE) igual a mv2 ou velocidade v = (2KE/m)1/2, ons que viajam a uma dada distncia, d, com tempo, t, onde t dependente de sua relao m/z.
O poder de resoluo do TOF baixo, mas tem a vantagem de no ter limitao de massa.
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Detectores de massa
Detector de massas composto de um contador que produz uma corrente proporcional ao nmero de ons que o atingem.
O detector utiliza multiplicadores de eltrons, que geram uma corrente, esta pode ser medida com alta preciso. Quando o on bate na superfcie do multiplicador de eltrons( vidro dopado com Pb e com revestimento de PbO) dois eltrons so ejetados. Existe no sistema um potencial de 2kV que repetindo o processo gera um grande nmero de eltrons. O sinal do detector enviado para um registrador, que produz o espectro de massas.
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Tcnicas de anlise
Regra do treze
Quando no se sabe a massa molecular.
1 passo gerar uma frmula base que contenha apena C e H. Para isto divide-se a massa molecular por 13.
Este clculo fornece um numerador (n) e um resto (r) .
A frmula torna-se CnHn+r
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Tcnicas de anlise
Regra do treze
O IDH ndice de deficincia de hidrognio pode ser calculado por:
IDH: (n-r+2)/2
Para compostos que tem outros tomos , devemos subtrair a massa correspondente de tomos de C e H. Por exemplo para a adio de 1 tomo de O, subtrair 1 C e 4H da frmula correspondente. Ao IDH adicionar 1 unidade
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Exemplos
Massa molecular (M.M) 94, 94/13=7 (n) com r=3 o que d frmula C7H10, para um composto com 1O subrair CH4 que d C6H6O adiciona-se ao IDH deste composto 1 unidade: 4
M.M 110, 110/13=8 (n) , r=6 , frmula C8H14 IDH=2. Para um composto com 2O C2H8 Fornecendo composto C6H6O2 com IDH =4
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Mtodos de anlise
M.M 148 : C11H16 (IDH 4) para um O subtrair CH4 e acrescentar 1O: C10H12O (IDH 5).
M.M 196 : 196/13=15 (n=15) r=1 : C15H16 IDH=(15-1+2)/2= 8. Para um composto com 2 O subtrair C2H8 resultando em C13H8O2 somar 2 ao IDH: como o n de H insuficiente usa-se o artifcio de subtrair 1 C e somar 12 H resultando em C12H20O2 e subtraindo-se 7 do IDH resultando em IDH 3
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Mtodos de Anlise
No caso de IDH der n fracionado deve-se suspeitar da presena de N.
Exemplo : M.M = 95 95/13 =7 r=4 C7H11 ( 7-4+2)/2= 5/2 (um composto improvvel) adicionar um N subtraindo CH2: C6H9N adicionar ao IDH=3.
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IDH
FRMULA GERAL:
IDH= n de C - n de H/2 - n de halognios/2 + (n de N, P ou tomo trivalente)/2 + 1
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Tcnicas de anlise Regra do nitrognio - Se um composto contm
um nmero par de tomos de nitrognio, o seu on molecular ter um nmero par de massa. Um composto com nmero mpar de N aparecer com um valor de massa mpar.
Neste caso, um composto neutro com um nmero par de nitrognios ter um nmero par de hidrognios. Um composto tendo nmero mpar de nitrognios normalmente ter um nmero mpar de hidrognios. Mesma regra para o Fsforo.
Halognios podem ser contados como hidrognios. Essa regra pode ser til para determinar a frmula molecular de um composto. Uma tabela com exemplos mostrada no prximo Slide.
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Composto Frmula Massa Molecular
Regra do Nitrognio
metano
metilamina
metanol
anilina
tioglicerol
peptdeo
carboidrato
oligonucleotdeo
fosfolipdeo
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Derivatizao
Alterao qumica de uma molcula para aumentar a volatilidade e estabilidade trmica, reduzindo as foras intermoleculares.
uma etapa preparatria para o processo de dessoro trmica de eltrons de ionizao, pois d a volatilidade e estabilidade trmica de molculas, facilitando a dessoro trmica.
Aumenta o peso molecular e reduz as foras intermoleculares, convertendo grupos polares em grupos de menor polaridade.
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Exemplo de derivatizao
A reduco das foras intermoleculares, como a ligao hidrognio, acompanhada
pela remoo de tomos de hidrognio ativos. Por exemplo cidos, amidas, ou
polilcools podem se metilados,acetilados ou silanizados.
Carboidrato
no derivatizado
Carboidrato
acetilado
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Interpretao dos espectros de
massa
Massa molecular : PM
Composio elementar: alta resoluo
Identificao do on molecular: o on de menor massa no conjunto de ons mais a direita do espectro
Fragmentaes lgicas
fragmentos
regio do on molecular
Intensidade
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Fragmentaes lgicas
ons fragmentos na faixa de [M-3] - [M-14] e [M-21] - [M-25] no so perdas lgicas.
Nenhum on fragmento pode conter um nmero maior de tomos de qualquer elemento do que o on molecular
Observar a perda de 14 unidades como perdas de impurezas homlogas
Por exemplo o metilbenzeno e dimetilbenzeno: massas 92 e 106
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Regio dos fragmentos
Mecanismos de fragmentao
Princpios gerais
A intensidade relativa dos fragmentos est relacionada a estabilidade dos ons.
CH3 CH2+ CH3
C+
CH3
CH3
mais estvel (ction tercirio)
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CH2
CH2NH2
CH2+
NH2CH2
+
N+
H
H
CH2
maior n de estruturas estvel+
fragmentao
Intensidade dos fragmentos no espectro de massas
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Aspectos gerais sobre os
mecanismos de fragmentao
CH3
CH2
CH2+
CH2
CH3
.
.
CH3
C
CH2
He-
CH3
C
CH2+
H
CH3
C+
CH2
Hou
Incio da reao
Promovido no stio radicalar ou de carga
Como localizar os stios
EI Impacto de eltron qual eltron retirado?
Sigma () saturada
Pi ()
No- ligante () NHH
e-N
+H
H
+ 2 e-
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Facilidade em perder eltrons
No- ligante () > Pi () > Sigma ()
Tipos principais de fragmentao
Dissociao - sigma
Clivagem - alfa
Clivagem indutiva
Rearranjo de hidrognio
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Dissociao sigma
CH3
CH2
OH+
CH3 CH2 O+
Hperda de 15 unidades m/z 31
m/z 46
CH3CH3.
.
CH3
CH2+
CH2 CH3
+e-
Clivagem alfa
movimento de um eltron
movimento de dois eltrons
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Clivagem indutiva
CH3CH3
O
e
CH3CH3
O+
-
-CH3
CH3
C
O+
.
clivagem alfa
clivagem indutiva
-CO
CH3+
m/z 15
m/z 43
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Processo de ionizao
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Qual o tipo de fragmentao?
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RESPOSTA: CLIVAGEM ALFA
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Retro- Diels-Alder
Anis insaturados podem sofrer clivagem atrves de reao Retro-Diels-Alder
A carga pode ficar no dieno ou dienfilo, o mais comum no dieno
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Rearranjos
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Quais seriam os fragmentos principais
do paraclorobenzofenona?
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Espectro de massas
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Fragmentos principais
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Istopos
Todo composto puro na realidade uma mistura de compostos isotopicamente diferentes
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Abundncia relativa dos istopos
de elementos comuns
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M + 1 , M+2 ...
S contribui com M+2 com aproximadamente 4,4 % , Si com 3,35 %, Cl com 33% e Br com 98%.
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IDH
IDH = C - ( H + X)/2 + N/2 + 1
Para molculas de Si vale a mesma frmula, mudando-se C por Si.
N pode ser contado como tomo trivalente, como P por exemplo
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Exerccios IDH
Interpretao dos resultados
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Alta resoluo
Calcular as massas moleculares dos compostos : CO, N2 e C2H4
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Qual a frmula molecular do composto abaixo?
Tentar chegar a sua estrutura , explicar fragmento.
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Determinar estrutura do composto
com espectro de massa abaixo :
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Qual a frmula molecular do composto abaixo?
Tentar chegar a sua estrutura , explicar fragmento.
3.1
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Fragmentos comuns
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Fragmentos comuns
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Fragmentos comuns
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Fragmentaes classes de compostos
Hidrocarbonetos
Tendncia a sofrer rearranjos ao acaso principalmente envolvendo Hs.
Principal sigma () fragmentos: m/z 15, 29 , 43 , 57....
C C
.
.
.
.
.
.
C C
.
.
.
.
.
.
e-+ C C
.
.
.
.
.
.
+ +
CH3 CH3
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Ramificaes Forma radical ou carboction mais
estvel
HC Insaturaes
Fragmentao no permite localizar a dupla ligao ons 27 41, 55, 69... para dupla e
15 , 29, 43 , 57 para parte saturada
CH3
CH3
CH3