espectrometria de massas

Workshop: Avanços na Engenharia de Proteínas e Peptídeos

13h às 17h

* Estratégias e aplicações da Espectrometria de Massas

Dra. Lucilene Delazari dos Santos

UNESP, Campus Rio Claro, SP.

[email protected]

História da Espectrometria de Massas

1886- Descoberta do Íon- Goldstein

1910- Primeiro Espectro de Massas – JJ Thomson- Ne

1918- Primeiro Espectrômetro de Massas- Dempster

1960- MALDI e ESI- Hillenkamp e Fenn (Prêmio Nobel)

• Uma poderosa técnica analítica:

– Medir massa molecular de compostos

– Identificar compostos desconhecidos

– Quantificar compostos

– Revelar a estrutura de moléculas

– Determinar modificações pós traducionais em

proteínas

O que é Espectrometria de Massas?

• Detectar e identificar substâncias proibidas em atletas;

• Monitorar pacientes durante uma cirurgia;

• Determinar a composição de espécies encontradas no espaço;

• Localizar depósitos de petróleo;

• Monitorar processos de fermentação;

• Detecção de dioxinas em peixes;

• Determinar danos em genes;

• Estabelecer composição elementar de material semi condutor.

Alguns Usos…

• Informação de massa molecular – Com precisão

• Identificação de proteínas usando massa molecular de

peptídeos trípticos

• Informação Estrutural

• Sequenciamento de peptídeos

• Identificar modificações pós-traducionais (fosforilação,

glicosilação e pontes de sulfeto)

Análise de Biomoléculas –

Por que espectrometria de massas?

• Uma pequena quantidade de amostra é vaporizada e

injetada no espectrômetro de massa;

• A amostra é então ionizada;

• Os íons formados podem ser positivos ou negativos;

• Fragmentos neutros não são detectados;

• Os íons são então separados de acordo com sua razão

m/z;

– m = massa; z = carga

• Os íons são então detectados.

Como um espectrômetro de massas trabalha?

• Requer métodos para:

– Obter amostras na fase gasosa;

– Formar íons;

– Separar os íons de acordo com sua

razão m/z

– Detectar os íons formados

Espectrômetro de Massas

Como um espectrômetro de massas trabalha?

Inlet

Ionização

Analyzer

Separação

Ion Detection

Detecção

Análise dos dados

Source

+

133013301330 134013401340 135013501350

100100100

757575

505050

252525

000

Introdução da amostra

• Sólida• Liquida• Gasosa

Ions detectadosFormação de íons

Espectro de massas

• Cromatografia Líquida

– LC/MS - termicamente instáveis, compostos de alto PM

– LC/MS adequado para proteínas e peptídeos

– Técnica “on-line”

• Sondas de inserção direta

– Amostras colocadas em uma sonda e inseridas

– Amostras podem misturadas a uma matriz

• Cromatografia Gasosa

– Amostras precisam ser voláteis

Técnicas de Introdução de Amostras

Métodos suaves de ionização

Fonte de íons

Ionização por elétron

(EI)

Ionizaçãoquímica

(CI)

MALDI

Métodos agressivos de ionização

(fragmentos podem nao ser detectados)

Eletronspray(ESI)

Fonte de íons

Ionização por elétron

(EI)

Ionizaçãoquímica

(CI)

MALDIEletronspray(ESI)

Métodos suaves de ionização

Métodos agressivos de ionização

(fragmentos podem nao ser detectados)

Métodos de ionização

•A matriz absorve energia do laser o que causa sua

volatilização junto com a volatilização da amostra


•A amostra é misturada com uma matriz que

absorva UV

•As moléculas da matriz ionizada transferem

prótons para a amostra

I - ác ido -4-hydrox i -c yano c innam ic o I I - ác ido Sinapic o

CH CH COOHH3CO

HO

OCH3

CH CCOOH

HO

CN

II I

Matrizes para MALDI


Ácido cinâmico

Preparação da amostra


Pulsed Laser Beam

Strong electric field

(5-20 kv)

++

+

+

++

++

++

+

+++

++ +

+

Accelerated charged particles


Características da Técnica MALDI-TOF MS

•Ionização suave – análise de biomoléculas intactas

•Extensa faixa de massa (> 400 kDa)

•Análise de misturas - sem purificação

•Alta sensibilidade

•Fácil interpretação dos dados

•Tampões e sais tem pouco efeito

•Rápida

•Fácil uso e manutenção

Aplicaçôes MALDI-TOF

Peptídeos

Medidas de massaConfirmar síntese

SequenciamentoSequenciamento químico e enzimáticoMS/MS

Análise ProteômicaUtilizar resultados para pesquisa em banco de dados

ProteinasMedidas de Massa

Confirmar PM de proteínas

Identificar modificações pós traducionais

Caracterizar proteínas

OligonucleotideosMedidas de massa

Confirmar síntese

SequenciamentoLadder sequência-exonucleases

Genespectrometria

Fonte de ionização



Evaporação no ESI

Equilíbrio de estados de cargas

M E H F R W G KH

H H 4+H

H

H

HH

4+

HH

H

3+

H

2+

H

1+

H


N-terminal amine

Espectro de Massas ESI de peptídeos

H

H

m/z = (Mr+4H)/4

HH

4+

HH

H

3+

H

2+

H

1+

H

m/z = (Mr+3H)/3

m/z = (Mr+2H)/2

m/z = (Mr+H)

1+

2+

3+

4+Re

l. In

ten

.

m/z

ES-MS


Espectro de Massas ESI de Proteínas


1) Apropriado para compostos carregados, polares e básicos;

2) Permite a detecção de compostos de alta massa

molecular maioria dos espectrômetros de massas;

3) Melhor métodos para análises de compostos

multicarregados;

4) Baixo ruído químico permite ótimos limites de detecção;

5) Permite o controle de fragmentações;

6) Compatível com métodos de MS/MS


Vantagens do ESI

MALDI-TOF ou Electrospray? Vantagens do MALDI-TOF

• Maior resolução e exatidão (comparado ao LC/MS com quadrupolos e ion-traps);

•Intervalo de massa de ~50 - >400,000 Daltons;

•Relativa tolerância à sais, tampões;

•Fácil interpretação dos dados;

•Possibilidade de analisar amostras difíceis (Glicoproteinas, oligonucleotideos,carbohidratos);

•De fácil uso e manutenção.

•Sistema dinâmico;

•Aplicado a moléculas pequenas, quantificação, (particularmente triplo quadrupolo);

•Opções de MS/MS

•Massa exata de proteínas intactas.

MALDI-TOF ou Electrospray? Vantagens do Electrospray

• Exatidão nas medidas de massa– Caracterização de amostras sintéticas, proteínas,

peptídeos...– Verificação de homogeneidade de amostras antes do

sequeciamento das proteínas, – Purificação de amostras “on line”– Mapeamento de peptídeos

• Caracterização estrutural da proteína usando CID/MS and MS/MS– Identificação de modificações pos traducionais;– Sequência primária de peptídeos;

• Software eficiente na análise dos dados– Rápida identificação da proteína utilizando pesquisas em

banco de dados.

Conclusões – Análise de Biomoléculas por MS

Resolução

R= m/ m

m= m/R

Análise de proteínas no ESI - BSA

1000 1700 2400 3100 3800 4500Mass (m/z)

3165

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sity

1954.345

2076.4942143.4331846.291

2214.9051748.868

2291.3451704.449

2373.148

2461.4941661.850

1620.9102556.378

2658.149

1510.337

2893.649

1453.913 3025.703 3909.4343690.9963164.460

3327.893 4153.774

% In

ten

sity

66000 66320 66640 66960 67280 67600

Mass (m/z)

0

3.9E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 66424

66533

66684

66805

Análise de proteínas no ESI - BSA

Resolução LC-MS-MS

691.5 692.5 693.5 694.5

m/z, amu

2.0e4

1.0e5

1.8e5In

ten

sity

, cp

s692.5

694.0

Baixa resolução (700)

692.429

692.934

693.439

High resolution gives you much more information & more accurate information about what is in a sample

Alta resolução~13000

Precisão ~2 ppm (internal cal.)

Quadrupolo (depende decorrente elétrica)

Time of Flight (depende da massa)

Ion Trap (depende da corrente elétrica)

Setor Magnético (depende da voltagem)

Analisador de Massas

x

yz

• Consiste de 4 bastões de metal paralelos

• Os bastões opostos tem potential de mesmo sinal

•angular

Quadrupolo

•Voltagem aplicada aos eletrodos afeta a trajetória dos

íons com o valor de m/z de interesse, e eles viajam

dentro dos bastões

•Estes íons passam através do sistema de eletrodos

•Íons sem interesse mudam sua trajetória original e

chocam nas paredes dos quadrupolos;

•Desta maneira os íons de interesse são separado

•O espectro de massas é obtido variando a voltagem nos

bastões e monitorando quais íons passam pelo filtro

Quadrupolo

Em espectrometria de massas seqüencialNormalmente existem 2 analisadores de massa em série

O primeiro analisador (MS1) é usado para SELECIONAR o íon que se deseja fragmentar. O íon selecionado por MS1 é o íon pai que pode ser o íon molecular ou qualquer outro íon resultante de uma fragmentação primária. A DISSOCIAÇÃO ocorre na região de fragmentação. Os íons filhos são analisados no segundo analisador de massas e detectados no detector.

MS2MS1

MS1, seleção do íon pai.

Região de fragmentação, existe um gás neutro ( He, Ar, N2….) O íon selecionado interage com as moléculas de gás.A energia cinética dos íons é transformada em energia interna, o que permite a sua fragmentação

MS2, os íons formados são separados de acordo com sua razão m/a e detectados no detector.

MS

Ion Source

Q1 q2 Q3Detector

m/z

MS/MS

Ion Source

Q1 q2 Q3Detector

m/z

Ion Source

Q1 q2 Q3Detector

MS/MS

m/z

Aminoácidos são sub unidades da proteína

ALANI NA

side chain

Aminoácidos são ligados por ligações peptídicas e formam poli peptídeos

A polypeptide chain has two distinct ends (amino- or N-terminus and carboxyl- or C-terminus) and it is made up

of a regularly repeating backbone and distinctive side chains or residues (R1, R2, R3, R4, R5)

Íons formados na fragmentação de um Peptídeo

CID de um Peptídeo Tríptico

y1

b1

b2

b3

y2

y3

LF

K

G

G L

K

F

Re

lati

v e I

nte

nsi

ty

m/z

COOHH2N

COOHH2N++

y1b6

b5

COOHH2N+

y2

+

b4

COOHH2N+

y3

+

Nomenclatura dos fragmentos dos peptídeos


Tempo de Vôo

•Separa os íons beseando no tempo de vôo

•Os íons são acelerados por um campo elétrico

Laser

Detector

Signal processing


Tempo de Vôo

Laser

Spectrum

Detector

Signal processing


Tempo de Vôo

Laser

Detector

Signal processing

Spectrum


Tempo de Vôo

Reflectron TOF Z2


PULSED LASER BEAM

20 kV

ION-GATE

m/z 1m/z 2

m/z1 = m/z2

Signal processing

DETECTOR

Signal processing

DETECTOR

20 kV

ION-GATELASER

Signal processing

DETECTOR

20 kV

ION-GATELASER tx

Signal processing

DETECTOR

20 kV

ION-GATELASER

Signal processing

DETECTOR

20 kV

ION-GATELASER

m/z

Signal processing

DETECTOR

20 kV

ION-GATE

m/z

m/z

íons b

m/z

íons y

Ac-S P D M V M K/Q G I/L K/Q I/L

G T I/L I/L G I/L I/L K/Q S I/LN C

Detectores

Multiplicador de elétrons

Multiplica uma corrente eletrônica, por aceleração de elétrons na superfície de um eletrodo. A colisão libera um número de elétrons secundários maior que o número de elétrons incidentes Os elétrons secundários são acelerados também por um outro eletrodo que por sua vez libera outros elétrons secundários e assim por diante, resultando em uma amplificação do sinal.

Detectores

Placa de Micros Canais (MCP)

Um arranjo de capilares de vidro - paredes internas - material condutor de energia elétrica - alta voltagem - íon que colidir na parede interna dos capilares criará uma avalanche de elétrons secundários

Detectores

Placa de Micros Canais (MCP)

Prof. Dr. Mario Sergio Palma

Pós-Doutorandos: Bibiana Monson de SouzaLucilene Delazari dos SantosLilian Mari Marcondes Cesas-Togneli

Doutorandos: Daniel SaidembergNicoli Baptista BaraoPaulo César GomesKeity Souza Santos

GRUPO LBEZ – www.rc.unesp.br/lbez

Mestrandos: Fernanda Pessoa de SalesAlessandra Vaso

I.C.: Virginia FerreiraJose Roberto dos SantosNathalia Dias

APLICAÇÕES

Espectrometria de Massas

APLICAAPLICAÇÇÕESÕES

Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas

Toxinas de venenos podem causar uma grande variedade de sintomas e apresentar vários mecanismos de ação em diferentes

tipos de células

Toxinas de Venenos podem ser usadas como uma importante ferramenta para estudos de bioatividade

Muitas destas toxinas tornam-se modelos estruturais para o desenvolvimento de novas drogas

As toxinas de venenos animais devem estudadas de acordo com sua natureza química:

Compostos de baixo peso molecular;

Peptídeos e

Proteínas

O tipo de toxina depende do tipo do veneno animal em investigação:

Aranhas

Escorpiões

Cobras

Anêmonas

Insetos

LMW + peptídeos

Peptídeos

Proteínas + peptídeos

LMW

Proteínas + peptídeos

Tetrahydro betacarbolinetoxins

Parawixia bistriata

NH

HO NH

NH 2NH

O

NH 2

NH

HO NH

NH 2

NH 2

NH

Bloqueadores de ReceptoresBenzodiazipina

OH

HO

NHNH

O

NHNH NH 2

CONH 2

O O

NH NH

O

NH

NH

O

NHNH

O

NHNH NH 2

CONH 2

O O

NH

NHHO

NH

O

NHNH

O

NHNH NH 2

CONH 2

O O

NH

Acylpolyamine Amide Toxins:72 estructuras elucidadas

Nephila clavipes

Non-Competitive Glutamate

Receptor Blockers

Nephila clavipes Web Insecto Toxins

HO CH3

N

NH

OH

CH2

CH2

CH3

O

CH3

NH

NH2

O.Fe

Inseticidas

5-hidroximetil-2-aminometil-N-carbonilamino-2-metilpropilfenona

Jelly Fish: Caribdea alata

Inflammatory factor:

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

O O

Aplicações

Structural Characterization of Novel Chemotactic and Mastoparan Peptides from the Venom of the Social Wasp Agelaia pallipes pallipes by HPLC-

ESI-MS/MS

Maria Anita Mendes, Bibiana Monson de Souza,

Lucilene Delazari dos Santos and Mario Sergio Palma

Cromatograma de massas do extrato de veneno bruto da vespa Agelaia pallipes pallipes

I/L-I/L-G-T-I/L-I/L-G-I/L-I/L-K/Q-G-I/L-NH2

Sequências dos peptídeos determinadas por ESI-MS/MS

I / L uso de íons fragmentos do tipo d e w

Q / K uso de reação de acetilação com anidrido acético

I/L-N-W-I/L-K/Q-I/L-G-K/Q-A-I/L-I/L-D-A-I/L-NH2

Distinguindo Ile e Leu

Íons “d” e “w”

Protonectina (MW 1207.8 Da)

I/L-L-G-T-I-L-G-L-L-K-G-I/L-NH2

Sequência dos peptídeos determinadas por espectrometria de massas

Agelaia MP (MW 1565,0)

I/L-N-W-L-K-L-G-K-A-I-I-D-A-I/L-NH2

Atividades Biológicas

Degranulação de Mastócitos


Hemólise


Quimiotaxia

Conclusões

Determinação de sequência primária de peptídeos;

Distinção de resíduos de amino ácido isobáricos;

-Caracterização de peptídeos envolvidos em processo inflamatórios.

Poder da técnica de espectrometria de massas

Rapid Commun Mass Spectrom 2004: 18, 639-642

MASS SPECTROMETRIC CHARACTERIZATION OF

TWO NOVELINFLAMATORY PEPTIDES FROM THE

VENOM OF THESOCIAL WASP Polybia paulista.

Bibiana Monson de Souza1, Mauricio Ribeiro Marques1,

Daniela Maria Tomazela2, Marcos Nogueira Eberlin2,

Maria Anita Mendes1Mario Sergio Palma1*,

Determinação Estrutural

Perfil Cromatográfico do veneno bruto da vespa Polybia paulista


Análise de massas do peptídeos purificados

A:

B1

B:B2



Tempo de retenção


Sequência do peptídeo

I N W L K L G K M V I D A L-NH2

(MW 1611.98 Da)

Rapid Commun Mass Spectrom. 2004: 18

Structural and Functional Characterization of N-Terminal Blocked Peptides Isolated from

The Venom of the Social Wasp Polybia Paulista

Susan Pereira Ribeiro1, Maria Anita Mendes1, Bibiana Monson de Souza1, Lucilene Delazari dos Santos, Maurício

Ribeiro Marques1, Walter Filgueira de Azevedo Jr2, Mario Sergio Palma1*

(1) Dept. Biology - CEIS / IBRC - UNESP - Rio Claro, SP, (2) CEP: 13506-900 – Brazil; (2) Dept. Physics,

(3) IBILCE-UNESP, S.J.Rio Preto, SP- Brazil

RESULTADOS

Perfil cromatográfico do extrato de veneno em gradiente de 5 to 60% (v/v) MeCN .

Fração 13 apresentou potente atividade de degranulação demastócitos.

RESULTADOS

Perfil cromatográfico da fração 13 em fase normal sob condições isocráticas [50% (v/v) MeCN ].

RESULTADOS

FR 13-1

FR 13-2

A:

B1

B:B2

Espectro de massas da Fração 13

Sequeciamento N-Terminal

Química Degradativa de Edman

Não houve reação de acoplamento entre os grupos a-amino de ambos peptídeos com o reagente de Edman (phenylisothiocyanate)

N-Terminal modificado

Espectro de Massas Sequencial (ESI-MS/MS)

Ac-S-A-D-L/I-V-K/Q-K/Q-L/I-W-D-N-P-A-L/I-NH2

Espectro de Massas Sequencial (ESI-MS/MS)

Ac-S-V-D-M-V-M-K/Q-G-I/L-K/Q-L/I-W-P-L/I-NH2

Distinção de resíduos de amino ácidos Isobáricos

Uso Combinado de MS com Química de Proteínas

I / L uso de íons fragmentos do tipo d e w

(com alta energia de colisão)

Q / K uso de reação de acetilação com anidrido acético

Sequência Completa dos Peptídeos

Polybine-I: Ac-S-A-D-L-V-K-K-I-W-D-N-P-A-L-NH2

Polybine-II: Ac-S-V-D-M-V-M-K-G-L-K-I-W-P-L-NH2

Síntese do peptídeos em fase sólida

Com e sem acetilação

Degranulação de Mastócitos;

Hemólise;

Quimiotaxia;

Antibiose.


Os peptídeos não apresentaram atividades antibióticas nem hemolíticas

Degranulação de Mastócitos

Quimiotaxia de células PMNL (Polybine I)

Quimiotaxia de células PMNL (Polybine II)

A acetilação dos grupos -amino dos resíduos N-terminal do Polybine-I e –II aumenta a atividade biologica para ambos peptídeos;

CONCLUSÕES

Podem prevenir a ação de algumas exoproteinases sobre os peptídeos;

Os peptídeos Polybines I e II constitutem uma nova família de peptídeos inflamatórios encontrados no veneno de vespas, apresentando em in vivo um bloqueio químico no resíduo N-terminal

APLICAÇÕES

Espectrometria de Massa x

Análise Proteômica

APLICAAPLICAÇÇÕESÕES

Espectrometria de Massa xEspectrometria de Massa x

AnAnáálise Proteômicalise Proteômica

“análise de PROTeínas expressas

por um genOMA”

separação sistemática

Identificação

quantificação

PROTEOMA

conjunto de Proteínas

1 amostra


por um genOMA”

PROTEOMA

PROTEOMA


por um genOMA”

GENOMA PROTEOMA

Representa a soma de todos os genes de um organismo

Não é uma característica fixa no organismo

Há muito mais proteínas no proteoma que genes no genoma

O material genético pode ser expresso de várias maneiras

“Splicing” do RNAm

Modificações pós-traducionais

PROTEOMATodas as proteínas expressas por um genoma

Atualmente Metodologia que objetiva documentar a distribuição geral de proteínas de uma amostra, identificar e caracterizar proteínas individuais e principalmente elucidar as suas associações e funções

1995

Estudo comparativo de venenos:

A gravidade dos acidentes ofídicos causados por serpentes do gênero Bothrops atrox das

regiões de Manaus e da Fronteira Brasil-Colômbia são diferentes. O

mesmo ocorre com diferentes espécies de aranhas do gênero

Loxosceles.

identificação de proteínas de interesse biotecnológico e

farmacológico.

Espectrometria de massas e/ou Sequenciamento Automático (Química Degradativa de Edman)

SEQUENCIAMENTO PEPTSEQUENCIAMENTO PEPTÍÍDICODICO

Bancos de DadosProgramas de Busca

(Ferramentas de Bioinformática)

Dados oriundos da Espectrometria de Massas e

Eletroforese Bidimensional

BIOINFORMBIOINFORMÁÁTICA PROTEÔMICATICA PROTEÔMICA

130

Relatório de um Espectrômetro de Massas do tipo ToF-ToF

(Analyzer 4700 – Applied Biosystems)

Proteoma da geléia real e do veneno da abelha Apis mellifera

Proteoma do veneno de vespa Polybia paulista

PROTEOMA DESCRITIVO

Identificação das proteínas mais abundantes da amostra analisada, a fim de compreender

os mecanismos de ação

Veneno total 92 spots

Identificação das proteínas do veneno de abelhas Africanizadas (Apis mellifera L.) imunoreativas

ao soro antiveneno por abordagem proteômica

16 proteínas identificadas:

Fosfolipases

Metaloproteases

Proteínas imunoreativasProteínas não imunoreativas

Ácidas Básicas

210 spots 72 spots

111 spots

43 spots comuns

Total: 239 spots diferentes

Extratos específicos para diagnóstico e tratamento

Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 13 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 proteínas foram detectadas pela coloração com CBB.

IMUNODETECÇÃO

Soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa Polybia paulista x Veneno da vespa P. paulista16 proteínas imunoreativas

* 1º Relato: Identificação de antígenos clássicos e suas isoformas

Extratos específicos para diagnóstico e tratamento

Câncer de Cabeça e Pescoço

Tecido Sadio Tecido Doente

kDa

50

40

30

25

pI 3.0 10.0 pI 3.0 10.0

PROTEOMA DE EXPRESSÃO DIFERENCIAL

Tecido sadio e doente ou Células perturbadas por drogas ou outros estímulos

Softwares para Tratamento e Análise de Géis 2D

Tecido Doente Tecido Sadio

Planta Sadia Planta Doente kDa

50

40

30

25

pI 4.0 5.9 4.0 5.9

Expressão Protéica - Doença do Cancro Cítrico

PROTEOMA DE MAPEAMENTO

A identificação de proteínas e suas atividades em organelas, refletindo a atuação das

mesmas (funções), o qual promove a visualização das proteínas (distribuição espacial

celular) e se elas estão ativas.

Wu et al (2000) identificou várias

classes de proteínas envolvidas na

regulação da fusão de membranas e

secreção utilizando eletroforese 2D e


Obtenção de um screening

funcional entre estados

diferentes dos retículos

endoplasmáticos de glândulas

mamárias de ratos.

SHOT GUNSHOT GUN

MALDI IMAGINGMALDI IMAGING

This document was created with Win2PDF available at http://www.win2pdf.com.The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.This page will not be added after purchasing Win2PDF.

http://www.win2pdf.com

espectrometria de massas

Documents