desenvolvimento e validaÇÃo de mÉtodos para...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

BRUNO MOLERO DA SILVA

“DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS PARA

DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM CEVADA

EMPREGANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA ALTA

EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS

SEQUENCIAL”

CAMPINAS 2017

BRUNO MOLERO DA SILVA

“DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM CEVADA EMPREGANDO

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL”

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de

Química da Universidade Estadual de Campinas como

parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de

Doutor em Ciências.

Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Carla Beatriz Grespan Bottoli

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO BRUNO MOLERO DA SILVA, E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI.

CAMPINAS

2017

Dedico este trabalho...

Aos meus pais, Ataides e Marinês que me deram oportunidade e incentivo para realizar meus estudos. Vocês me deram o presente que dinheiro nenhum pode comprar nesse mundo material; que foi a educação e os exemplos de dignidade e honestidade que tive desde criança. Tenho muito orgulho de vocês! Também dedico este trabalho à minha querida avó Matilde Toral Ortega pelo carinho e ensinamentos deixados, que me deram força para seguir nos momentos mais difíceis (in memorium).

“Nada na vida deve ser temido, somente compreendido. Agora é hora de compreender mais para temer menos!”

Marie Curie

AGRADECIMENTOS

À Deus pelo amor incondicional e aos protetores de luz pela oportunidade desta conquista em minha vida. À Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli pela orientação, liberdade de trabalho, ensinamentos e otimismo na rotina diária. Agradeço pelo voto de confiança e por permitir o desenvolvimento desta pesquisa juntamente com o meu trabalho. À minha família: meus pais Ataides e Marinês pela compreensão e apoio em todos os momentos da minha vida. À minha irmã Laíze e meu cunhado Rudnei que sempre torceram por mim. Ao meu querido sobrinho Rafael que é a alegria da nossa família. À minha amada noiva Gabriela pelo incomparável carinho, compreensão e paciência comigo. Você é a mulher da minha vida! Te amo!! Aos meus familiares, tios, tias e primos (especialmente ao Fábio por enviar as amostras de cevada comercializadas em Belo Horizonte) pelo carinho e amizade. Em especial ao meu tio Dorival que sempre me inspirou e incentivou pela sua forma racional de encarar a vida mesmo quando surgem inesperados desafios. Aos colegas de laboratório do LabCrom: Jordana, Carla Grazielli, Fabiana, Camila, Mariana, Cláudio, Luana, Karen, Julie e Mariane pela amizade e bons momentos compartilhados. Obrigado galera! Aos colegas do laboratório de Cromatografia Gasosa: Mayra, Soraia, Jadson, Paloma, Leandro, Bruna e Sandra. Em especial às guerreiras no trabalho Gabriela Salazar e Paula Lima pela verdadeira amizade e companheirismo. À Ms. Lucília responsável pelo LabCrom pela amizade e por ser uma pessoa tão solícita. À Priscila que é responsável técnica do laboratório de Espectrometria de Massas pelo treinamento no equipamento, disponibilidade, experiência e amizade. Aos grandes amigos de Palmital que sempre estiveram do meu lado. Agradecimento especial ao Bruno Orlandi, Bruno Ireno, Tunico e Tugu.

Ao meu amigo Everson Biazon que enviou as amostras de Curitiba pela disposição em ajudar-me.

À Daiane Cobianchi por enviar as amostras de cevada de Florianópolis meu sincero agradecimento.

Ao amigo Fabricio Ferreira, aluno de Doutorado do IQ-Unicamp pela disponibilidade de discussão de temas relevantes em Química Analítica.

À Dra. Fernanda Oliveira Lima pelos ensinamentos e treinamento no equipamento de Eletroforese Capilar. Aos funcionários do Restaurante Universitário da Unicamp que tanto me ajudaram com as refeições durante esses anos. Ao Professor Dr. Ronaldo Pilli por permitir o uso do rotaevaporador de seu laboratório. Aos meus alunos da rede pública estadual das escolas por onde passei e em especial à E.E. Professor Celso Henrique Tozzi de Jaguariúna-SP. Aos amigos do SKK de Palmital-SP pela amizade de longos anos e pela alegria de sempre!! Aos secretários da CPG do IQ, Isabela, Miguel e Bel pela constante disposição em ajudar-me. Aos pais da Gabi, Inês e Nelson, pela amizade e finais de semana descontraídos em Mogi Guaçu. Aos Professores do IQ- Unicamp pelas disciplinas que cursei e em especial à Profa. Dra Isabel Jardim pela atenção e ensinamentos. À todos aqueles que, de maneira direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.

RESUMO

A cevada é um cereal com alto valor nutricional e baixo custo que pode servir como

uma excelente fonte de antioxidantes. Para quantificar os compostos fenólicos em

cevada é necessária a escolha de técnicas de preparo de amostras adequadas,

principalmente por se tratar de uma matriz complexa. Neste trabalho, vários extratos

de cevada foram preparados usando diferentes técnicas de extração como refluxo,

agitação com aquecimento, com e sem atmosfera inerte, avaliação da hidrólise ácida

ou básica e o método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged e Safe).

Os parâmetros de extração dos extratos etanólicos realizados com agitação sob

atmosfera inerte e em refluxo foram otimizados a partir de um planejamento fatorial

completo e os fatores avaliados foram técnica de extração, temperatura e tempo de

extração. As respostas foram obtidas pela caracterização dos extratos por ionização

por eletrospray no modo negativo (ESI(-)-MS/MS), a partir da intensidade do sinal

analítico e o número de compostos fenólicos identificados. A quantificação dos

compostos fenólicos em grãos de cevada foi realizada empregando os métodos por

refluxo e QuEChERSe a técnica de cromatografia líquida de ultra alta eficiência

acoplada à espectrometria de massas sequencial (UHPLC-MS/MS). Os métodos

foram validados de acordo com as recomendações da Agência Brasileira de

Vigilância Sanitária (ANVISA) e na avaliação de algumas amostras comerciais de

grãos de cevada, notou-se que as concentrações dos compostos fenólicos catequina

e epicatequina foram as mais elevadas. Já os ácidos cafeico e protocatecóico

tiveram as concentrações mais baixas. Estas diferenças podem ocorrer devido à

variação sazonal, assim como as condições de armazenamento dos grãos na

comercialização.

ABSTRACT

Barley is a cereal with high nutritional value and low cost that can serve as an

excellent source of antioxidants. In order to quantify phenolic compounds in barley, it

is necessary to choose suitable sample preparation techniques, mainly because it is

a complex matrix. In this work, several barley extracts were prepared using different

extraction techniques such as reflux, heating with stirring, with and without an inert

atmosphere, evaluation of acid or basic hydrolysis and the QuEChERS (Quick, Easy,

Cheap, Effective, Rugged and Safe) method. The extraction parameters of the

ethanolic extracts carried out under agitation using an inert atmosphere and at reflux

were optimized from a complete factorial design. The factors evaluated were

extraction technique, temperature and extraction time. The responses were obtained

by the characterization of the extractions by electrospray MS in the negative mode

[ESI (-) - MS / MS], based on the intensity of the analytical signal and the number of

phenolic compounds identified. Quantification of phenolic compounds in barley grains

was performed using the reflux and QuEChERS methods, followed by ultra high

efficiency liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry (UHPLC-

MS / MS). The methods were validated according to the recommendations of the

Brazillian Health Regulatory Agency (ANVISA). When some commercial samples of

barley grains were evaluated, the concentrations of the phenolic compounds catechin

and epicatechin were the highest. Caffeic and protocatecoic acids had the lowest

concentrations. These differences can occur due to the seasonal variation, as well as

the storage conditions of the grains during the commercialization.

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura do grão de cevada...................................................................22

Figura 2: Algumas fontes de EROs e mecanismos de defesa...............................24

Figura 3: Esqueleto de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem

vegetal são derivados.............................................................................................25

Figura 4: Representação das etapas das principais versões do método QuEChERS

a) original; b) acetato; e c) citrato.............................................................................36

Figura 5: Esquema ilustrativo de um equipamento de eletroforese capilar onde R1 e

R2, e1 e e2 são os reservatórios e eletrodos, respectivamente. F representa a fonte

de alta tensão, D é o detector, C é o computador para obtenção dos dados e EOF

representa o fluxo eletrosmótico, que é gerado após ser aplicado o

potencial..................................................................................................................42

Figura 6: Esquema de um analisador triplo quadrupolo operando no modo SRM

onde Q1 e Q3 são quadrupolos de transmissão e Q2 um quadrupolo onde ocorre a

fragmentação dos íons...........................................................................................48

Figura 7: Mecanismo da evaporação do íon e da explosão coulômbica...............51

Figura 8: Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo......................62

Figura 9: Fluxograma referente ao procedimento do método QuEChERS...........67

Figura 10: Fragmentação do padrão do ácido ferúlico no modo negativo

empregando infusão direta.....................................................................................73

Figura 11: Fragmentação do padrão do ácido p-cumárico no modo negativo


Figura 12: Fragmentação do padrão da catequina no modo negativo empregando

infusão direta..........................................................................................................74

Figura 13: Fragmentação do padrão de epicatequina no modo negativo empregando

infusão direta..........................................................................................................74

Figura 14: Fragmentação do padrão do ácido cafeico no modo negativo


Figura 15: Fragmentação do padrão sintético de rutina no modo negativo


Figura 16: Fragmentação do padrão sintético do ácido vanílico no modo negativo

empregando infusão direta.........................................................................................76

Figura 17: Fragmentação do pico de razão m/z 193 (ácido ferúlico) na fração do

extrato A no modo negativo empregando infusão direta........................................77


extrato C1 no modo negativo empregando infusão direta.........................................79


extrato C2 no modo negativo empregando infusão direta......................................79

Figura 20: Fragmentação do pico de razão m/z 163 (ácido p-cumárico) na fração do




Figura 22: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (catequina) na fração do extrato

C1 no modo negativo empregando infusão direta.....................................................81


C2 no modo negativo empregando infusão direta..................................................81

Figura 24: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (epicatequina) na fração do




Figura 26: Fragmentação do pico de razão m/z 179 (ácido cafeico) na fração do


Figura 27: Fragmentação do pico de razão m/z 179 (ácido cafeico) na fração do














Figura 34: Fragmentação do pico de razão m/z 609 (rutina) na fração do extrato C4

no modo negativo empregando infusão direta........................................................88

Figura 35: Fragmentação do pico de razão m/z 167 (ácido vanílico) na fração do

extrato C4...............................................................................................................88

Figura 36: ESI no modo positivo dos íons precursores da mistura contendo 11

padrões de compostos fenólicos com voltagens do cone avaliadas em (A) 60, (B) 45,

(C) 30, (D) 20, (E) 10 V...........................................................................................91

Figura 37: ESI no modo negativo da mistura contendo 11 padrões de compostos

fenólicos com voltagem do cone avaliada em 30 V................................................92

Figura 38: Cromatograma da mistura contendo 11 padrões a 3 µg mL-1 com ESI no

modo negativo. Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18

1.7 μm (50 × 2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O(0,1% ácido fórmico) e B= ACN

(0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40%

em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-

(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2

μL. Detecção: espectrômetro de massas com analisador

triploquadrupolar.....................................................................................................95

Figura 39: Cromatograma da mistura contendo 11 padrões a 3 µg mL-1 com ESI no

modo negativo com adição de NH4OH 0,025%. Condições cromatográficas: coluna

Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (50 × 2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O

(0,025% NH4OH) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a

15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1.

Modo de Ionização: ESI-(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV).

Volume de injeção: 2 μL. Detecção: espectrômetro de massas com analisador

triploquadrupolar.....................................................................................................96

Figura 40: Cromatograma de íons totais dos compostos fenólicos presentes numa

solução de 50 µg mL-1 em metanol e determinação por UHPLC-MS/MS em 11

canais de aquisição, no modo SRM. Identificação dos picos: A e B: Catequina e

Epicatequina; C: ácido clorogênico; D: ácido vanílico; E: ácido cafeico; F: ácido p-

cumárico; G: ácido ferúlico; H: ácido sinápico; I: rutina; J: ácido protocatecóico e L:

miricetina.................................................................................................................98

Figura 41: Cromatogramadeidentificação do ácido ferúlico no extrato A. Condições

cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (50 × 2,1 mm d.i.);

Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico).

Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3%

em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-(ionização por

eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL. Detecção:

espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolar.....................................99

Figura 42: Cromatograma deidentificação de ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico;

catequina e epicatequina obtidos para o extrato C1. Condições cromatográficas da

Figura 41....................................................................................................................99

Figura 43: Cromatograma deidentificação dos ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico;

catequina e epicatequina no extrato C2. Condições cromatográficas da Figura

41..............................................................................................................................100

Figura 44: Cromatograma deidentificação de ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico;

catequina e epicatequina no extrato C3. Condições cromatográficas da Figura

41..............................................................................................................................101

Figura 45: Cromatograma do extrato C4 otimizado com ESI no modo negativo.

Condições cromatográficas da Figura 41.................................................................102

Figura 46: Superfície de resposta dos fatores A: tempo de extração ×

temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração ×

tempo para a epicatequina......................................................................................104



tempo para a catequina...........................................................................................106



tempo para o ácido cafeico......................................................................................108



tempo para o ácido ferúlico.....................................................................................110



tempo para o ácido p-cumárico...............................................................................112

Figura 51: Cromatogramas obtidos por UHPLC-MS/MS para separação da mistura

de compostos fenólicos do extrato C4 fortificado (3 µg mL-1).Condições

cromatográficas da Figura 41..................................................................................114

Figura 52: Curvas analíticas para os ácidos clorogênico, sinápico, ferúlico e vanílico,

cafeico, p-cumárico e protocatecóico além de rutina, catequina, epicatequina e

miricetina preparadas em solvente e na matriz pelo método de extração em

refluxo.......................................................................................................................117

Figura 53: Efeito matriz (%) para os compostos fenólicos em cevada usando

UHPLC-MS/MS. (1) catequina; (2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido

vanílico; (5) ácido cafeico; (6) ácido p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico;

(9) rutina; (10) ácido protocatecóico; (11) miricetina................................................118

Figura 54: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos

analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz...........121

Figura 55: Cromatogramas do extrato fortificado com 3 µg mL-1 obtidos pelo método

QuEChERS..............................................................................................................126

Figura 56: Curvas analíticas para os ácidos clorogênico, sinápico, ferúlico e vanílico,

cafeico, p-cumárico e protocatecóico além de rutina, catequina, epicatequina e

miricetina preparadas em solvente e na matriz pelo método

QuEChERS..............................................................................................................129

Figura 57: Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS acetato para

extração dos compostos fenólicos em cevada usando UHPLC-MS/MS. (1) catequina;

(2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido vanílico; (5) ácidocafeico; (6) ácido

p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico; (9) rutina; (10) ácido

protocatecóico; (11) miricetina.................................................................................130

Figura 58: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos

analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz pelo

método QuEChERS.................................................................................................132

Figura 59: Cromatogramas adquiridos no modo SRM do extrato de cevada por

QuEChERS e análise por UHPLC-MS/MS para amostra A6..................................139

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Produção de cevada em 2005: área de colheita e produção..................21

Tabela 2: Ensaios para um planejamento fatorial 23 para otimização da extração de

compostos fenólicos em cevada..............................................................................69

Tabela 3:Presença de compostos fenólicos em diferentes extratos.......................89

Tabela 4: Compostos fenólicos analisados com ionização no modo positivo.......92

Tabela 5: Melhores condições de operação do espectrômetro de massas para a

análise dos compostos fenólicos.............................................................................93

Tabela 6: Parâmetros do espectrômetro de massas para a análise dos compostos

fenólicos..................................................................................................................93

Tabela 7: Figuras de mérito para a validação do método de extração otimizado.

LQm: Limite de quantificação do método. LQi: Limite de quantificação do

instrumento...........................................................................................................122

Tabela 8: Concentração dos compostos fenólicos na amostra de cevada BRS lagoa

225........................................................................................................................123

Tabela 9: Eficiência de extraçãodos compostos fenólicos no método por

refluxo...................................................................................................................124

Tabela 10: Figuras de mérito da validação referente ao método QuEChERS. LOQm:

Limite de quantificação do método. LOQi: Limite de quantificação do

instrumento...........................................................................................................133

Tabela 11: Concentração dos compostos fenólicos na amostra de cevada.......134

Tabela 12: Eficiência de extraçãodos compostos fenólicos no

métodoQuEChERS...............................................................................................135

Tabela 13: Comparação entre as técnicas de preparo de amostras

empregadas..........................................................................................................135

Tabela 14: Concentração de compostos fenólicos em grãos de cevada avaliada pelo

método por refluxo e pelo método QuEChERS.....................................................137

Tabela 15: Comparação entre a diferença nas médias do método por refluxo e

método QuEChERS...............................................................................................138

Tabela 16: Concentração de compostos fenólicos em amostras comerciais de grãos

cevada provenientes de diferentes regiões do Brasil............................................140

LISTA DE ACRÔNIMOS E ABREVIATURAS ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

CE- Eletroforese capilar, do inglês “Capillary electrophoresis”.

CV- Coeficiente de variação.

C18- Octadecil

GC- Cromatografia Gasosa

ERO- Espécies reativas de oxigênio

ESI- Ionização por eletrospray, do inglês “Electrospray ionization”.

FM- Fase móvel.

GCB- Carbono grafitizado, do inglês, “Graphitized Carbon Black”.

HPLC- Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês “High Performance Liquid

Cromatography”.

LD- Limite de detecção.

LQ- Limite de quantificação.

MS- Espectrometria de massas, do inglês “Mass Spectrometry”.

MS/MS- Espectrometria de massas sequencial.

m/z- razão massa/carga.

n- número de replicatas.

PSA- amina primária secundária, do inglês, Primary Secondary Amine.

PTFE- politetrafluoretileno.

QuEChERS: rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro, do inglês, “Quick, Easy,

Cheap, Effective, Robust and Safe”.

SRM- Monitoramento de reações selecionadas, do inglês “Selected reaction

monitoring”.

TOF- Analisador por tempo de voo, do inglês “Time of flight”.

UHPLC- Cromatografia líquida de ultra alta eficiência, do inglês “Ultra High

Performance Liquid Chromatography”.

UHPLC-MS/MS- Cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à

espectrometria de massas sequencial, do inglês “Ultra High Performance Liquid

Chromatography with tandem mass spectrometry”.

20

1.INTRODUÇÃO

1.1. Cevada

A cevada (Hordeum vulgare L.) é um cereal muito antigo, sendo alguns

fragmentos deste grão foram encontrados no Irã em aproximadamente 7900 a.C,

antes mesmo do trigo.

A composição da cevada inclui proteínas, vitaminas, minerais e fibras,

sendo um cereal bastante consumido no mundo [1]. É o cereal que melhor se adapta

a baixas temperaturas e cresce em terras expostas à luz, bem escoadas e porosas e

se adaptam melhor em solos com pH acima de 6,0, pois o pH baixo retarda o

crescimento da sua raiz [2]. O grão pode ser plantado no solo sem arar e por esta

razão pode ser cultivado em lotes minúsculos.

A cevada tem sido cultivada no Brasil desde a década de 1930 e, como

consequência dos esforços do melhoramento genético e do desenvolvimento de

técnicas de manejo, a cultura foi difundida pelo sul do Brasil, onde se localizam as

áreas com locais mais adequados, em termos de clima e solo, para o plantio deste

cereal [3].

A cevada tem sidoo quarto cereal mais consumido no mundo de acordo

com a Organização das Nações Unidas para alimentação e Agricultura[4].

No entanto, apenas cerca de 2% do total tem sido usado para

alimentação humana com o consumo do cereal e, o restante é direcionado para

alimentação animal e para a indústria de cerveja [5]. Nos últimos anos, no Brasil,

houve um grande interesse da sua utilização na alimentação humana, devido ao seu

alto valor nutricional e também ao seu baixo custo. Mesmo assim, mais de 95% da

cevada ainda é cultivada para fins cervejeiros [6].

O grão de cevada é constituído por casca, aleurona, endosperma,

escutelo e embrião. A casca é formada pela palha, que é eliminada por uma fina

camada, a aleurona, que recobre o endosperma, e o embrião, que corresponde a

apenas 7% do grão. O endosperma é constituído basicamente de amido e proteína,

sendo responsável pela formação de enzimas durante a malteação, enquanto que o

embrião é o local das atividades vitais do grão [7].

21

A Tabela 1 mostra a produção de cevada em 2005 e relaciona a área de

colheita e produção [4]. Dados mais recentes não foram encontrados na literatura.

Tabela 1: Produção de cevada em 2005: área de colheita e produção.

Área Geográfica Hectares Colhidos (× 1000)

Toneladas métricas (× 1000)

Europa 28.841 (51,0)a 83.202 (60,3)a

Ásia 12.056 (21,3)a 21.302 (15,4)a

América do Norte 5.203 (9,2)a 16.746 (12,1)a

Canadá 3.880 (74,6)b 12.133 (72,5)b

Estados Unidos Oceania África América do Sul Total

1.323 (25,4)b

4.789 (8,5)c

4.897 (8,7)a

811 (1,4)a

56.597

4.613 (27,5)b

10.269 (7,4) c

4.517 (3,3)a

1.897 (1,4)a

137.933

aValores em parênteses correspondem à porcentagem total.

bPorcentagens de produção na América do Norte.

cAustrália e Nova Zelândia em relação à porcentagem total.

Um embrião de gramínea, quando totalmente formado, possui um

cotilédone maciço, o escutelo, estreitamente aderente ao endosperma, conforme a

Figura 1. A casca tem a função de proteção e contém fibras, antioxidantes, minerais

e vitaminas. A principal diferença da cevada para outros grãos se deve ao fato de

que a fibra alimentar está distribuída em todo o grão e não apenas na camada

externa [8]. Um produto processado a partir da camada externa do grão de cevada,

como o farelo, contribui nutricionalmente com os teores de fibra e de antioxidantes.

A cevada é conhecida pelo seu alto conteúdo de fibra alimentar solúvel

(β-glucanas), a qual diminui o colesterol plasmático e índice glicêmico, além de

reduzir o risco de câncer de cólon [9-11]. A propriedade de redução do colesterol em

frangos com consumo de cevada foi mostrada inicialmente por Fisher e Griminger

[12] (1967) e depois confirmada por Bengtsson et al. [13] (1990).

22

Figura 1: Estrutura do grão de cevada. Adaptado de [9]

Em 1975, Trowell et al. [14] fomentaram a hipótese de que a dieta rica em

fibras pode ter um papel importante no controle do colesterol, no entanto, essas

investigações foram centradas na fibra de trigo. Em 1996, Rimm et al. [15]

conduziram um estudo com mais de 50.000 profissionais de saúde e concluíram que

havia uma relação inversa entre ingestão de fibras e infarto do miocárdio. Dentre os

três principais alimentos que contribuem para o total de fibras, estão: vegetais, frutas

e cereais. A fibra de cereais foi a mais fortemente associada com a prevenção de

doenças do coração.

1.2. Antioxidantes

Antioxidantes são compostos que reagem com substâncias reativas como

os radicais livres presentes, por exemplo, no corpo humano. Eles atuam em

diferentes níveis na proteção dos organismos com mecanismo de defesa contra os

radicais livres, além de impedir a sua formação, principalmente pela inibição das

reações em cadeia com ferro e o cobre.

Estudos comprovam que os grãos de cereais contêm compostos

antioxidantes [16, 17].

23

Os antioxidantes em alimentos são caracterizados como compostos que

podem retardar ou inibir as reações de oxidação provocadas pelas espécies reativas

de oxigênio (ERO), as quais são compostos químicos resultantes da ativação ou

redução do oxigênio molecular. Dentre as principais espécies reativas de oxigênio

estão o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical peroxila, o

radical hidroxila, o oxigênio singlete e o radical peroxinitrito [18].

De modo geral, as reações de oxidação são de natureza radicalar com

propagação em cadeia envolvendo o oxigênio e outras substâncias, normalmente

envolvendo os lipídios e proteínas, que levam à formação dos radicais livres. As

reações ocorrem em três estágios, iniciação, propagação e terminação.

O radical livre pode ceder o elétron desemparelhado, oxidando-se, ou

receber um elétron, reduzindo-se. Na tentativa de se estabilizar quimicamente, os

radicais livres propiciam reações em cadeia que terminam alterando a conformação,

a estrutura e as funções de diversos componentes celulares [19].

O estresse oxidativo, resultante da formação e ação das espécies reativas

de oxigênio, está relacionado com o envelhecimento celular, desenvolvimento de

câncer, doenças neurológicas, doenças cardiovasculares e diabetes [20]. Além

disso, a exposição a alguns agentes agressores externos, como a poluição

ambiental, o fumo do tabaco, toxinas, entre outros, podem propiciar a acumulação

de radicais livres no organismo. Os radicais livres podem ser originados através de

fontes endógenas e exógenas e esses são metabolizados no organismo pelo

sistema de antioxidantes enzimáticos (por ação das enzimas superóxido dismutase

(SOD), glutationa peroxidase (GPx e catalase) ou, também, podem ser neutralizados

através de substâncias antioxidantes não enzimáticas (como tocoferóis, ácido

ascórbico, carotenos, entre outros) [21, 22]. Verificam-se algumas fontes de

espécies reativas de oxigênio (EROs) na Figura 2.

24

Figura 2: Algumas fontes de EROs e mecanismos de defesa [23].

Os antioxidantes atuam em diferentes níveis na proteção dos organismos

como no mecanismo de defesa contra os radicais livres, cuja função é impedir a sua

formação, principalmente pela inibição das reações em cadeia com ferro e cobre. Os

antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres gerados pelo

metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os lipídios,

os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poli-insaturados e

as bases do DNA, evitando a formação de lesões e perda da integridade celular [24].

1.2.1. Compostos Fenólicos

Dentre as diversas classes de antioxidantes de ocorrência natural, os

compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos. Esses

compostos englobam uma vasta gama de substâncias, as quais possuem pelo

menos um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos. Os

intermediários formados pela ação dos compostos fenólicos são relativamente

estáveis, devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura dessas

25

substâncias [25]. O número de hidroxilas presentes nos compostos fenólicos, assim

como a sua localização, têm influência na sua ação como antioxidante [26].

A ação desses compostos como antioxidante ocorre devido ao

mecanismo de doação de hidrogênio e/ ou transferência de elétrons para o radical

livre, sendo assim chamados de sequestradores de radicais livres. Portanto, os

compostos fenólicos podem ser definidos como moléculas capazes de diminuir ou

previnir a oxidação de outras moléculas, podendo atuar em alimentos ou em

sistemas biológicos [18].

Os compostos fenólicos se enquadram em diversas categorias como

fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados dos ácidos benzóico e cinâmico),

cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e

ligninas [27]. A Figura 3 representa as estruturas gerais dos compostos fenólicos.

Figura 3: Esqueleto de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem vegetal são derivados. Adaptado de Stalikas [28].

26

Figura 3: Esqueleto de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem vegetal são derivados. Adaptado de Stalikas (continuação) [28].

Os principais grupos de compostos fenólicos encontrados nos cereais são

os flavanóides e derivados hidroxicinâmicos [29].

Nos cereais, os compostos fenólicos podem ser encontrados na forma

livre, solúvel ou conjugados, tanto no endosperma, como no gérmen e nas frações

de farelo [30]. A maior parte destes compostos encontra-se na forma conjugada,

esterificada aos polissacarídeos das paredes celulares [31].

Os compostos fenólicos solúveis encontram-se compartimentalizados

dentro dos vacúolos celulares [32] e estão na forma livre (aglicona) ou conjugada,

enquanto os fenólicos insolúveis encontram-se ligados à estruturas da parede

celular, esterificados com arabinose ou resíduos de galactose dos componentes

pécticos ou hemicelulósicos [33]. Os ácidos fenólicos livres representam a menor

parte dos compostos fenólicos e são solúveis em soluções aquosas-orgânicas, tais

como metanol, etanol ou acetona [34]. Os compostos fenólicos conjugados

frequentemente estão sob a forma de ésteres e amidas, raramente ocorrendo como

glicosídeos. Eles incluem compostos de baixa massa molar, solúveis em água,

presentes no citosol, ou formas lipossolúveis, associadas às ceras da superfície dos

cereais [35].

27

De forma geral, os compostos fenólicos são abundantes nos cereais e

entre eles incluem-se: ácido ferúlico, ácido p- cumárico, ácido cafeico, ácido vanílico

e ácido protocatecóico, presentes comumente nas camadas mais externas dos

grãos [36].

Vários efeitos benéficos à saúde têm sido atribuídos aos compostos

fenólicos presentes nos alimentos. Estes compostos estão presentes em uma

grande variedade de gêneros alimentícios e bebidas, incluindo frutas, chás, café e

vinho tinto [37]. Estudos realizados correlacionam aos mesmos propriedades

antioxidantes, anti-inflamatórias, anti-microbiana, anti-carcinogênica e atividade

antiviral, principalmente contra vírus envelopados, além de agirem melhorando a

permeabilidade capilar, podendo auxiliar no tratamento de alguns distúrbios

circulatórios [38,39].

1.3. Técnicas de preparo de amostras para determinação de

compostos fenólicos

Vários métodos de preparação de amostras têm sido desenvolvidos para

determinar compostos fenólicos em uma grande variedade de amostras, desde a

filtração em membrana de 0,45 µm de espessura [28,40,41] até procedimentos mais

elaborados como extração acelerada por solvente, do inglês Accelerated Solvent

Extraction (ASE) [17]. As técnicas de preparo de amostras mais difundidas para

determinação de compostos fenólicos são: extração sólido-líquido [9,42], extração

em fase sólida, do inglês Solid Phase Extraction (SPE) [19,43], microextração em

fase sólida, do inglês Solid Phase Micro Extraction (SPME) [44], sonicação, entre

outras [17, 28].

Por causa da grande diversidade de compostos fenólicos com diferenças

de polaridade, acidez, número de grupos hidroxilas, anéis aromáticos e níveis de

concentração, diversos procedimentos de tratamentos das amostras podem ser

empregados para identificar e quantificar compostos fenólicos.

Para avaliação de matrizes complexas como cereais, a presença de

interferentes pode encobrir o sinal analítico dos compostos em estudo e, portanto

um tratamento prévio neste tipo de amostras é fundamental para fazer a limpeza

28

(clean-up) para redução dos materiais co-extraídos da amostra e para reduzir o

limite de detecção do método e evitar resultados imprecisos e inexatos [45].

De modo geral, as amostras de cereais são inicialmente trituradas,

passando pelo processo de maceração, aumentando a superfície de contato quando

um solvente for adicionado à amostra. Vários fatores são considerados relevantes

no processo de extração, dentre eles: a natureza do solvente, a dissolução das

substâncias extraíveis, a temperatura, o pH e o tempo de extração.

Os compostos fenólicos raramente estão presentes nos vegetais em sua

forma livre, mas comumente, apresentam-se em sua forma glicosilada [46]. Assim,

para extração de compostos fenólicos em grãos, pode-se optar pela escolha de

solventes orgânicos como etanol, metanol, acetona e acetato de etila em mistura

com água para extração de compostos fenólicos solúveis (CFS).

Para determinadas sementes ou matérias primas onde os compostos

fenólicos encontram-se na forma glicosilada (ligados a carboidratos), torna-se

necessário uma etapa adicional com o uso de ácidos para promover a hidrólise[18].

No caso da cevada, dentre os diversos métodos utilizados no preparo de

amostras para identificação e/ou determinação de compostos fenólicos, destacam-

se a extração por refluxo [39], agitação mecânica [47], ultrassom, [27, 16, 48],

hidrólise ácida ou hidrólise básica [40, 41, 49, 50] e extração assistida por micro-

ondas [51].

Um tratamento por explosão a vapor tem sido proposto como um dos

métodos mais promissores para separar os principais constituintes dos materiais

lignocelulósicos, seguido de extração com metanol, e foi aplicado para extração de

compostos fenólicos em cevada. O pré-tratamento com explosão a vapor atua tanto

química como fisicamente na estrutura do material lignocelulósico e está baseado no

contato direto da biomassa com vapor saturado à alta pressão por um determinado

tempo de residência no reator, seguido de descompressão rápida à condição

atmosférica (explosão) [52]. Ao longo deste processo, as ligações químicas que

mantêm os componentes macromoleculares da fitobiomassa fortemente associados

são em parte quebradas, de forma que, no momento da descompressão, o material

é desfibrado com facilidade e assim reduzido a partículas menores. Gong et al. [52]

empregaram este processo em diferentes temperaturas variando entre 210 a 250°C

durante 30 s para avaliação dos compostos fenólicos em cevada. A técnica de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), do inglês, High Performance Liquid

29

Cromatography com detecção por UV foi usada para avaliar o teor de ácido p-

cumárico e ácido ferúlico antes e depois da explosão com vapor. Os resultados

mostraram que o total de compostos fenólicos solúveis e a capacidade antioxidante

total aumentaram com a utilização da explosão a vapor com maiores tempos de

extração [52].

Uma metodologia baseada na liofilização das amostras de sementes,

folhas e caules de cevada coletadas em diferentes regiões de Portugal passou por

um processo de maceração à temperatura ambiente, seguida de extração com água

em banho de ultra-som e centrifugação durante 10 min para posterior análise em

HPLC/UV. Foram determinados uma grande diversidade de compostos fenólicos,

incluindo flavonóides como isoorientina, isovitexina, seus glicosídeos eácido ferúlico

[16]. Destaca-se neste trabalho a concentração de 2150,8 mg kg-1 para isorientina

nas folhas de cevada.

Diferentes tipos de solventes extratores foram avaliados por sonicação

durante 1 h em 3 variedades de cevada chinesa para avaliar o efeito da mistura de

solventes na atividade antioxidante, capacidade de extração e seletividade de

compostos fenólicos em cevada através da análise individual e do teor de

compostos fenólicos totais. Os extratos com 80% de acetona mostraram a maior

capacidade de extração para catequina e ácidos ferúlico, cafeico, vanílico, p-

cumárico, 80% de metanol para epicatequina e ácido siríngico e 100% de água para

os ácidos protocatecóico e gálico. Os autores concluíram que a extração com 80%

de acetona é a mais recomendada para determinação de compostos fenólicos livres

em cevada [48]. Embora neste trabalho os autores tenham ressaltado o uso da

acetona, sabe-se que o etanol também é um poderoso solvente extrator de

compostos fenólicos [39, 42].

Dvorakova et al. [47] testaram duas proporções de misturas de solventes,

metanol/água ou acetona/água na razão 70:30 v/v, usando agitador mecânico a 250

rpm para a extração de compostos fenólicos. Em seguida, os extratos foram

centrifugados durante 5 min. O sobrenadante foi coletado e evaporado até a secura.

Posteriormente, a amostra foi extraída com acetato de etila e concentrada por

evaporação para posterior análise por HPLC acoplada à Espectrometria de Massas

com ionização por eletrospray (HPLC-ESI-MS). Catequina e prodelfinidina B3 foram

os principais compostos encontrados e a acetona: água 70:30 v/v mostrou maior

capacidade de extração dos compostos fenólicos.

30

Bonoli et al. [53] avaliaram a eficiência para recuperar compostos

fenólicos em cevada pela extração com solventes pressurizados, empregando a

técnica de Extração Acelerada por Solvente, usando diferentes misturas como

etanol-água 4:1 (v/v); metanol-água 4:1 (v/v); acetona-água 4:1 (v/v) e posterior

hidrólise ácida ou básica. As recuperações das extrações foram avaliadas após a

hidrólise ácida ou hidrólise alcalina e determinadas pela técnica de Eletroforese

Capilar, do inglês, Capillary Electrophoresis (CE) e análises espectrofotométricas.

Acetona aquosa e etanol aquoso extraíram elevadas concentrações de catequinas e

taninos hidrolisados. O aumento na extração dos compostos fenólicos,

especialmente ácidos hidroxicinâmicos, ocorreu quando o tempo de digestão por

hidrólise básica foi prolongado. O estudo concluiu que compostos fenólicos livres

podem ser perdidos no processo de desengorduramento numa etapa prévia à

hidrólise.

Gallegos-Infanteet al. [54] reportaram um estudo no qual os grãos de

cevada foram processados e submetidos à remoção de gordura com hexano

seguido de extração dos compostos fenólicos com acetona/água 70:30 v/v, num

agitador mecânico à temperatura ambiente. O teor de compostos fenólicos totais foi

avaliado pelo método de Folin-Ciocalteau e pelo método de 2,2-difenil-1-picrilidrazil

(DPPH). Os resultados mostraram que o aquecimento dos extratos e a torrefação da

cevada aumentou o teor de compostos fenólicos em comparação com os extratos

sem o processamento, mas a germinação reduziu o teor de compostos fenólicos

[54]. Os autores reportaram que o aumento na concentração de compostos fenólicos

apóso aquecimento dos extratos e torrefação pode ser associado à liberação dos

mesmos a partir da decomposição dos constituintes celulares em função do

tratamento térmico. Similarmente, Siddhuraju & Becker [55] também observaram a

diminuição do teor de compostos fenólicos após a germinação e o aumento após o

cozimento ou ao assar o grão de feijão.

Entre os vários solventes extratores relatados na literatura para a

extração de compostos fenólicos em cevada, vale ressaltar a eficiência do etanol

como solvente extrator para este tipo de análise. A variabilidade na capacidade

antioxidantefoi determinada por diferentes métodos independentes para a avaliação

da atividade antioxidante, incluindo os testes de DPPH,

Ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e análise térmica diferencial, do inglês

Differential thermal analysis (DTA) após extração com etanol 65 %, sob aquecimento

31

a 80 °C. Destaca-se que a DTA é uma técnica rápida para investigação da

capacidade antioxidante nos cereais e foi utilizada para a determinação da

estabilidade à oxidação das culturas selecionadas como trigo, cevada e milho [42].

Em pesquisa recente, compostos fenólicos como a rutina, ácidos cafeico

e ferúlico foram identificados e quantificados em diferentes cultivares de cevada

brasileira em extração com mistura de solvente hidroetanólico 80:20 v/v e banho

ultra-sônico para avaliar os fatores climáticos no conteúdo de compostos fenólicos

[56]. Os autores concluíram que uma menor incidência solar, maior índice

pluviométrico e uma menor temperatura média foram considerados fatores

favoráveis no aumento do conteúdo de fenólicos totais e de rutina nas cultivares de

cevada de diferentes safras.

Em outro trabalho, os compostos fenólicos foram extraídos da casca de

cevada utilizando a extração com fluido pressurizado, usando etanol ou o líquido

iônico 2-metil-hidroxietil acetato de amônio. Os melhores resultados para extração

de compostos fenólicos (189,1 ± 3,1 mg/g de casca) foram obtidos com o líquido

iônico pressurizado. Já para extração de carboidratos (450,3 ± 7,8 mg/g de casca),

os melhores resultados foram com o etanol pressurizado [57]. Concluiu-se que

dentre as variáveis avaliadas para otimizar a extração usando fluido pressurizado

para determinação de carboidratos e compostos fenólicos, a temperatura foi

considerada a variável mais significativa quando comparada com a razão do fluxo e

concentração do etanol, parâmetros avaliados na etapa de otimização [57].

Um procedimento muito comum na determinação de compostos fenólicos

em cevada é a hidrólise. A hidrólise alcalina e a hidrólise ácida são bastante citadas

nos procedimentos de preparo de amostras de compostos fenólicos em alimentos

[17, 28]. A hidrólise ácida e a saponificação são os meios mais comuns de liberar os

ácidos fenólicos, ainda que possam se decompor sob estas condições. O método de

hidrólise ácida envolve o tratamento do extrato, como por exemplo com o ácido

clorídrico em refluxo [28]. Já a hidrólise básica consiste no tratamento da amostra

com solução contendo um álcali, normalmente hidróxido de sódio. As principais

variáveis investigadas na hidrólise química são a concentração do ácido/base,

tempo de hidrólise e temperatura. Neste contexto, alguns trabalhos são citados na

literatura destacando a importância desse tipo de procedimento na determinação de

compostos fenólicos.

32

Após a hidrólise alcalina do extrato metanólico de cevada, 7 compostos

fenólicos foram separados por HPLC/UV. Para isso, 1 g de cevada foi hidrolisado

com 50 mL de NaOH 2 mol L-1 sob atmosfera de nitrogênio, por 4 h. A mistura foi

acidificada com HCl 2 mol L-1 até pH 1 e extraída 3 vezes com acetato de etila. Três

compostos, o ácido trans-ferúlico, o ácido trans-cumárico e o ácido cis-ferúlico,

foram quantificados [58].

Em 2008, outro trabalho realizado por Kvasnicka et al. [59] relataram que

submetendo as amostras de cevada pulverizadas dispersas em solução alcalina de

NaOH ou solução ácida de HCl, foi possível hidrolisar seus compostos fenólicos,

facilitando a separação da matriz heterogênea que compõe seus grãos. Após a

hidrólise, uma extração fazendo uso de um solvente como metanol auxiliado por

ultrassom pôde ser eficaz para posterior análise por CE e HPLC. Foi possível a

determinação da concentração do ácido ferúlico de 43,4 mg 100 g-1 em uma das

amostras de cevada por CE e 43,0 mg 100 g-1 por HPLC.

Com duas etapas de hidrólises alcalinas e outra com extração

hidroetanólica, seguidos por análise por cromatografia líquida e detecção por

espectrometria de massas com ionização por eletrospray e analisadores por tempo

de voo e quadrupolo, foi possível identificar o ácido p-cumárico, ácido gálico e

isoquercitrina nos grãos de cevada. A extração com etanol 50% atingiu o maior

conteúdo fenólico livre em comparação com água e etanol absoluto. Notou-se

também que a elevação da temperatura até 80 °C aumentou os teores fenólicos [41].

Diferentes solventes extratores foram avaliados para obter a composição

de compostos fenólicos por métodos espectrofotométricos com absorção em 280,

320 e 370 nm pelo método de Folin-Ciocalteu. Foram utilizados o metanol, etanol e

acetona misturados com água na proporção de 4:1 (v/v) para extração de compostos

fenólicos livres. A mistura etanólica forneceu a maior recuperação dos compostos

fenólicos. Também foi realizada a comparação entre a hidrólise alcalina e a hidrólise

ácida. Notou-se que a concentração de ácidos fenólicos tais como cinâmico, ferúlico

e cumárico aumentou quando o tempo de digestão na hidrólise alcalina foi

prolongado, sendo que o ácido ferúlico foi o mais abundante nas amostras de

cevada. Houve um decréscimo na concentração de compostos fenólicos quando a

hidrólise ácida foi utilizada [53].

Em outro trabalho, algumas amostras de cevada foram submetidas à

hidrólise com solução de 3% de H2SO4 por 15 min a 130°C na razão líquido/ sólido

33

de 8:1 g/g. Os sólidos foram separados por filtração, lavados com água, secos com

ar e a remoção das ligninas foi feita com acetato de etila. O fracionamento dos

extratos foi realizado com diferentes razões de metanol:água. O processo de

fracionamento usado permitiu a obtenção de extratos com diferentes atividades

antioxidantes [60].

Em 2006, Freitas [61] observou o aumento do efeito antioxidante de forma

proporcional ao aumento da concentração de polifenóis totais em diferentes tipos de

cerveja. Para determinar os polifenóis totais foi utilizado o método de Folin-

Ciocalteu. Os conteúdos fenólicos nas cervejas analisadas variaram de 249,73 a

808,58 mg/L. A cerveja escura de trigo apresentou os maiores valores de polifenóis

totais, seguida das cervejas escuras de cevada, as cervejas claras de trigo e as

cervejas claras de cevada.

1.3.1. QuEChERS

Em 2003, Anastassiades e colaboradores relataram um atraente método

para preparo de amostras denominado QuEChERS (rápido, fácil, barato, efetivo,

robusto e seguro, do inglês, quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) com o

objetivo de superar as limitações práticas das técnicas de preparo de amostra de

multirresíduos de agrotóxicos disponíveis, introduzindo um novo procedimento de

preparo de amostras para explorar as possibilidades oferecidas pela instrumentação

analítica moderna [62]. Este método cobre um grande escopo de analitos, incluindo

analitos polares, moderadamente polares e apolares em várias matrizes. O

procedimento envolve uma etapa única de extração da amostra com acetonitrila,

seguido de um particionamento líquido-líquido pela adição de sulfato de magnésio

anidro e cloreto de sódio. A remoção de água e a purificação são realizadas

simultaneamente com extração em fase sólida dispersiva (d-SPE, do inglês

Dispersive Solid Phase Extraction), usando sulfato de magnésio e um sorvente de

amina primária secundária (PSA, do inglês Primary Secundary Amine).

A utilização de acetonitrila como solvente possibilita a extração de uma

menor quantidade de co-extrativos lipofílicos provenientes da amostra, como por

exemplo, ceras, gorduras e pigmentos. Por outro lado, a acetonitrila possibilita uma

ampla faixa de extração de compostos com diferentes polaridades e, quando

34

acidificada permite eficazes recuperações de agrotóxicos que geralmente

apresentam problemas de estabilidade [62]. Além disso, a acetonitrila é mais

adequada para LC-MS/MS do que acetona e acetato de etila.

Na etapa de partição, a adição de sais para promover o efeito salting out

proporciona melhores percentuais de recuperação para os analitos polares, uma vez

que os sais diminuem a solubilidade destes compostos na fase aquosa, bem como a

quantidade de água na fase orgânica e vice-versa [63]. A escolha do MgSO4 no

desenvolvimento do método QuEChERS foi devido à maior capacidade de remover

água quando comparado com outros sais. Além disso, sua hidratação se trata de

uma reação exotérmica, tendo como resultado o aquecimento entre 40 e 45 °C da

amostra, favorecendo a extração, especialmente dos compostos apolares [63].

O procedimento de agitação manual ou com auxílio do agitador tipo vórtex

possui várias vantagens em relação à agitação mecânica, tais como possibilidade de

realizar a extração a campo; a extração ocorre em um único frasco fechado; rapidez,

uma vez que não há necessidade de lavagem do homogeneizador no intervalo entre

as extrações. Portanto, no método QuEChERS, a agitação pode ser manual ou

utilizando vórtex [62].

A etapa de limpeza ou clean-up é fundamental para aumentar a

confiabilidade dos resultados e promover robustez ao sistema cromatográfico.

A d-SPE proposta por Anastassiades et al. [64] está relacionada com um

procedimento muito simples para ser empregado na limpeza de diferentes extratos

destinado à análise cromatográfica. Na proposta original agita-se o extrato (1 mL)

com pequena quantidade de sorvente PSA (25 mg). A função deste sorvente é de

remover açúcares, ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos [65]. A agitação tem

como objetivo a distribuição uniforme do sorvente e tende a favorecer a etapa de

limpeza do extrato. Após a centrifugação, uma alíquota do extrato final é retirada

para análise. Assim, o sorvente atua como um filtro químico, retendo os coextrativos

da matriz. A d-SPE busca alcançar um extrato final com menor quantidade de

interferentes, aliada a um menor custo quando comparada com outras técnicas

convencionais [63, 66].

O método QuEChERS apresenta algumas vantagens sobre os métodos

tradicionais de preparo de amostras para determinação de resíduos de agrotóxicos,

dentre eles podem-se citar: altos porcentuais de recuperação (> 85%) para um

grande número de compostos de diferentes polaridades e volatilidades.

35

A desvantagem do método QuEChERS está na relação massa de

amostra/volume de extrato final que é de 1 g por 1 mL. Este valor é baixo quando

comparado com os obtidos por outros métodos que utilizam uma etapa de

concentração, apresentando relação amostra/ extrato final de 2 a 5 g por 1 mL [63] .

Portanto, se a matriz não é uma fonte de ruídos nas análises isto pode conduzir, no

método QuEChERS, a valores de limite de quantificação (LQ) mais elevados, para o

mesmo volume de injeção. No entanto, considerando a alta detectabilidade das

técnicas cromatográficas disponíveis atualmente como Cromatografia Gasosa

acoplada à espectrometria de massas sequencial (GC-MS/MS) e Cromatografia

Líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS), o método

QuEChERS é adequado e constitui o estado da arte para determinação de

agrotóxicos.

1.3.2. Diferentes versões do método QuEChERS

Mesmo com a versão original do método que forneceu excelentes

resultados para diferentes tipos de amostras, algumas aplicações mostraram que

certas substâncias químicas apresentavam problemas de estabilidade e/ ou

recuperação dependendo do pH da matriz [66]. Em 2005, de acordo com Lehotay et

al. [67], a adição de uma etapa de tamponamento foi a primeira modificação no

método QuEChERS, com o objetivo de obter recuperação entre 70 e 120%.

O método QuEChERS e suas várias versões modificadas têm sido

utilizado com sucesso para a extração de agrotóxicos de uma variedade de frutas e

vegetais. Anastassiades e Lehotay [64] e Lehotay et al. [67] modificaram o método

QuEChERS original, não tamponado, passando a utilizar um tampão acetato e

citrato, respectivamente, para evitar a degradação de certos agrotóxicos sob

condições alcalinas. Na Figura 4 é possível diferenciar as três diferentes versões

deste método.

36

Figura 4: Representação das etapas das principais versões do método QuEChERS a) original; b) acetato; e c) citrato [62].

Em 2005, Lehotay et al. [67] desenvolveram o método QuEChERS

acetato, no qual o efeito tamponante é decorrente da adição de acetato de sódio.

No método QuEChERS acetato, a extração é efetuada com acetonitrila contendo 1%

(v/v) de ácido acético (HAc) e efeito tamponante (pH=4,8) é decorrente da adição de

acetato de sódio.

Em 2007 este método foi adotado como método oficial da Association of

Official Analytical Chemists (AOAC) para a determinação de resíduos de agrotóxicos

em alimentos [68].

Em 2007, Anastassiades et al. propuseram o desenvolvimento do método

QuEChERS citrato, que utiliza uma mistura de citrato de sódio di-hidratado e sesqui-

hidratado como responsáveis pelo efeito tamponante (pH=5,0-5,5) [69]. A partir

disso, o Comité Européen Committee de Normalisation (CEN), oficializou o método

“QuEChERS citrato” como método de referência na União Européia [70].

Outra modificação muito relevante na etapa de limpeza foi o uso de uma

maior quantidade de PSA na etapa de d-SPE em amostras de cereais com o

objetivo de remover, de forma mais eficiente, os ácidos graxos co-extraídos,

37

açúcares e pigmentos [71]. Além do uso de PSA, o carbono grafitizado também

pode ser usado na etapa de limpeza para redução do teor de pigmentos nos extrato

provenientes de amostras vegetais a partir da adição de uma pequena quantidade

de carvão ativado ou carbono grafitizado. Este possui uma grande área superficial e

contém grupos altamente polares na superfície com alto potencial para formação de

ligações de hidrogênio.

Aplicações diversas do método QuEChERS são citadas na literatura. Em

2012, Hackbart et al. usaram o método QuEChERS nas versões original e acetato

para determinação de ocratoxina e citrinina em arroz e farelo de arroz [72]. As

condições otimizadas ocorreram quando foi utilizada a maior quantidade de água (20

mL) e menor quantidade de terra diatomácea (200 mg).

Em 2005, a partir dos excelentes resultados obtidos para frutas e legumes

com o método QuEChERS, levou Lehotay et al. [67] a fazer a avaliação da

determinação de resíduos de agrotóxicos em matrizes que contivessem até 20% de

gordura (leites e ovos). Eles concluíram que alimentos que contêm de 2 a 20% de

gordura também podem conter resíduos de agrotóxicos tanto lipofílicos como

hidrofílicos, e portanto, seria fundamental desenvolver métodos analíticos capazes

de determinar analitos com uma ampla faixa de polaridade. Dentre os alimentos

incluem o leite, ovos, nozes, milho, soja, trigo, cevada entre outros grãos, peixes,

aves, carne de porco, carne bovina e abacate.

Assim, a eficiência da limpeza dos extratos de matrizes gordurosas como

leite, carnes, leite e abacate usando o método QuEChERS foi avaliada empregando

sorventes como PSA, carbono grafitizado, do inglês, graphitized carbon black (GCB)

e ciclo(hetero)alquenila (B38) na etapa de d-SPE [73].

Uma modificação bastante importante na etapa d-SPE foi a adição do

sorvente octadecilsilano (C18) para propiciar uma limpeza mais efetiva de amostras

com elevados teores de gordura [66].

Alguns trabalhos realizados com amostras com elevado teor de gordura,

como o leite bovino, empregaram C18 e PSA na etapa de limpeza [73]. Neste estudo

foram avaliados diferentes sorventes na etapa de limpeza por d-SPE como C18 e

PSA em combinação com MgSO4 anidro. Esta combinação de sorventes também foi

aplicada com sucesso na determinação de agrotóxicos em carne e gordura bovina

por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Os

percentuais de recuperação obtidos para os agrotóxicos em carne e gordura bovina

38

em diferentes concentrações variaram de 70 a 129%, com estimativa de desvio

padrão ≤ 27%. Em 2009, Prestes et al. determinaram 19 agrotóxicos em amostras

de leite, abacate e ovos [74].

O elevado número de trabalhos que aplica este tipo de preparo de

amostra na determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos demonstra

claramente as vantagens desta técnica que é rápida, fácil, econômica, efetiva,

robusta e segura, como seu próprio nome afirma.

Embora o método QuEChERS seja muito explorado para análise de

agrotóxicos em diversos tipos de matrizes, ainda há pouco relatos na literatura sobre

seu uso na determinação de compostos fenólicos.

Recentemente, Fontana & Bottini [75] determinaram 9 compostos

fenólicos em vinhos produzidos na Argentina empregando o método QuEChERS. A

partir das condições otimizadas, as amostras contendo 5 mL de vinho (previamente

acidificado com 1% de ácido fórmico) foram extraídas usando 2,5 mL de acetonitrila.

Para etapa de separação 1,5 g de NaCl e 4 g de MgSO4 foram adicionados. Em

seguida, 1 mL do sobrenadante da etapa de partição foi submetido à etapa de

limpeza utilizando d-SPE com uma combinação de 150 mg de CaCl2, 50 mg de PSA

e 50 mg de C18 como sorventes. Uma alíquota do extrato foi analisada por

HPLC/UV. Os resultados encontrados para as figuras de mérito foram satisfatórios e

o método proporcionou limites de quantificação variando de 0,03 a 0,26 µg mL-1

entre os analitos. A precisão intermediária ficou abaixo de 12% para todos os

analitos em amostras de vinho tinto e branco.

1.4. Planejamento experimental no preparo de amostras

A quimiometria é a ciência que aplica estatística por meio de

planejamentos de experimentos (fatoriais, de misturas ou mistos) e tem sido

frequentemente utilizada como uma ferramenta no auxílio das otimizações em

química. Assim, muitas vezes, facilitam o entendimento das variáveis relevantes e

consequentemente, reduz o tempo e os custos das análises. Isso também favorece

a análise de dados de uma forma mais rápida, criteriosa e sistemática [76].

39

De forma geral, na aplicação da quimiometria, ressalta-se o potencial do

uso de planejamentos de experimentos como ferramenta auxiliar de otimização em

investigações envolvendo o preparo de amostras [66].

As técnicas de superfície de resposta são ferramentas matemáticas muito

úteis quando se está interessado na otimização de um processo em que se tem a

influência de vários fatores em uma variável resposta, ou seja, os modelos de

superfície de resposta podem ser explorados para determinar condições ótimas para

se trabalhar ou a sensibilidade da variável resposta a mudanças dos níveis dos

fatores de interesse. Para a fase de otimização, é importante ressaltar que a

visualização gráfica da superfície de resposta é possível quando se tem até 2

fatores.

A metodologia de superfícies de respostas é uma técnica de otimização

de sistemas que é baseada em planejamentos fatoriais. Possui duas etapas

distintas, a modelagem e o deslocamento. A primeira é feita ajustando-se modelos

simples às respostas obtidas com planejamentos fatoriais. A segunda trata-se do

deslocamento ao longo do caminho de máxima inclinação de um determinado

modelo, que é a trajetória na qual a resposta varia de forma mais pronunciada [76].

Os resultados obtidos a partir das superfícies de resposta contribuem

para encontrar as variáveis significativas, assim como as condições ótimas dos

fatores.

Alguns trabalhos são citados na literatura destacando a importância do

planejamento experimental para otimização dos procedimentos de extração.

Uma superfície de resposta foi obtida na otimização das condições de

extração em amostras de cevada: porcentagem de solventes orgânicos, temperatura

e tempo. A capacidade antioxidante aumentou ao utilizar 80,2% de metanol e 60,5°C

por 38,36 min, parâmetros obtidos através da superfície de resposta. Compostos

fenólicos de 6 amostras de cevada foram extraídos para obter a superfície de

resposta depois do desengorduramento com hexano e, subsequentemente, os

extratos foram avaliados quanto à sua atividade antioxidante. O teor de compostos

fenólicos totais medido de acordo com o método Folin-Ciocalteau, variou de 13,58 a

22,93 mg de ácido ferúlico por grama de amostra [77].

A determinação de compostos fenólicos foi otimizada por micro-ondas em

grãos de cevada torrada [51]. As melhores condições para obtenção da cevada

torrada com maior atividade antioxidante foi a potência de 600 W para micro-ondas,

40

tempo de aquecimento de 8,5 min e 65,5 g de grãos. A extração com acetona teve a

maior inibição da peroxidação lipídica. Foram avaliadas 3 variáveis independentes

no planejamento experimental tais como potência do micro-ondas, tempo e

quantidade de grãos de cevada com 3 níveis para cada variável, enquanto que as

variáveis dependentes foram atividade antioxidante com a % de inibição usando o

método DPPH e conteúdo de fenólicos totais. As superfícies de respostas

mostraram que mantendo o tempo e a quantidade de cevada constante, houve um

aumento significativo na atividade antioxidante com a elevação da potência das

micro-ondas. No entanto, as superfícies de respostas também mostraram uma

diminuição na concentração de compostos fenólicos devido à degradação, quando

elevadas potências do micro-ondas foram utilizadas. A atividade antioxidante

inicialmente aumentou e depois diminuiu com o tempo de aquecimento e quantidade

de grãos.

Com o objetivo de determinar compostos fenólicos em cascas de cevada,

após a auto-hidrólise com água líquida quente e a partir do fracionamento usando

coluna Sephadex LH-20, constatou-se que dentre os solventes testados, o acetato

de etila permitiu a maior extração de compostos fenólicos. As maiores

concentrações de compostos isolados foram para o ácido benzóico e o ácido

cinâmico. A partir da elaboração de um planejamento experimental de 23 com a

realização de 16 experimentos, considerando 3 variáveis independentes, tais como

pH, T°C e % de etanol. Foi possível concluir que a diminuição na concentração de

etanol diminuiu a concentração de compostos fenólicos para valores mais baixos de

pH. Já outra variável dependente evidenciou, a partir da superfície de resposta, o

aumento da atividade antioxidante com a maior concentração de etanol [78].

1.5.Técnicas de separação para determinação de compostos

fenólicos

As técnicas analíticas mais usadas para a determinação de compostos

fenólicos em cevada incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) [16,

48, 58] e a eletroforese capilar (CE) [53, 79]. Mais recentemente, a cromatografia

líquida de ultra alta eficiência, do inglês, Ultra High Performance Liquid

Cromatography (UHPLC) [80] têm sido usada para análise de compostos fenólicos.

41

1.5.1. Eletroforese Capilar

A eletroforese capilar (CE) é uma técnica analítica de separação baseada

na migração diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis em um campo elétrico.

Esta técnica que é aplicável na determinação de uma grande variedade

de analitos em amostras diversas possui uma série de vantagens como rapidez,

versatilidade, baixo custo das análises, alto poder de resolução e pouco consumo de

amostras, reagentes e solventes. Por outro lado, esta técnica oferece algumas

limitações como a sua baixa detectabilidade [81].

O equipamento é composto por uma fonte de alta tensão conectada por

dois eletrodos de platina a dois reservatórios contendo uma solução de eletrólitos,

além de um capilar com passagem por um centro óptico de um sistema de detecção,

conectado a um receptor de dados, e a um sistema de introdução da amostra que é

controlado por um computador [82]. A Figura 5 representa um esquema ilustrativo de

um equipamento de Eletroforese Capilar.

A utilização de capilares de sílica fundida na execução da técnica

introduziu a geração do chamado fluxo eletrosmótico (EOF). Este fluxo é a

consequência de uma interação entre a solução e as paredes do capilar. A sílica

fundida é quimicamente caracterizada pela presença de vários tipos de grupo silanol

(SiOH), os quais apresentam caráter ácido. Em contato com a solução aquosa,

alguns desses grupos são dissociados e por este motivo a superfície do capilar

torna-se negativamente carregada, gerando um saldo positivo de espécies

carregadas positivamente na solução. Quando um campo elétrico é aplicado à

superfície, forças elétricas causam um movimento unilateral de íons em direção ao

eletrodo de carga oposta [83].

42

Figura 5: Esquema ilustrativo de um equipamento de eletroforese capilar onde R1 e R2, e1 e e2 são os reservatórios e eletrodos, respectivamente. F representa a fonte de alta tensão, D é o detector, C é o computador para obtenção dos dados e EOF representa o fluxo eletrosmótico, que é gerado após ser aplicado o potencial. Adaptado de Pinheiro [82].

Assim como o EOF é influenciado pelo pH devido a dupla camada elétrica

que se desenvolve na interface entre a sílica e a solução, a migração eletroforética

também depende do pH do eletrólito de corrida, uma vez que a ionização das

moléculas depende do equilíbrio ácido-base. A completa ionização é alcançada

quando o pH do eletrólito estiver duas unidades de pH acima ou abaixo do valor de

pKa, para compostos ácidos e básicos, respectivamente. Assim, a escolha do pH é

uma ferramenta importante para a separação dos analitos [81].

Bonoli et al. [53] empregaram a técnica de CE e fizeram um estudo no

qual compostos fenólicos foram analisadosem 5,5 min, usando um tampão 20 mmol

L-1de tetraborato de sódio, 10 mmol L-1 de dodecil sulfato de sódio e 5 mmol L-1 de

KH2PO4 (pH 9), num capilar de 40 cm × 50 µm de diâmetro interno, 30 kV e 30 °C,

com detecção UV a 200 nm. A seletividade do método de extração para recuperação

dos compostos fenólicos foi avaliada tanto por CE como por espectrofotometria [53].

Os autores concluíram que as amostras de cevada continham principalmente

catequina e proantocianidinas como compostos fenólicos livres e ácidos

hidroxicinâmicos e seus derivados, como compostos fenólicos conjugados.

Verardo et al. [79], com o objetivo de prosseguirem os estudos de Bonoli

et al., compararam diferentes técnicas de separações para compostos fenólicos em

cevada usando UHPLC no modo fase reversa, cromatografia eletrocinética micelar,

43

do inglês, micellar electrokinetic chromatography (MECK) e espectrofotometria [79].

A quantificação por MEKC foi feita utilizando detecção UV, enquanto que no

cromatógrafo a líquido com ionização por eletrospray acoplado ao espectrometro de

massas (HPLC-ESI/MS), as análises foram realizadas apenas para coletar

informações estruturais. Os dois métodos determinaram elevadas concentrações de

flavono-3-ol. Em particular, a quantidade destes compostos encontrada por MECK e

HPLC estavam na razão de 126,9-163,7 mg 100 g-1 e 138,0-172,1 mg 100 g-1. Os

resultados encontrados na validação analítica tiveram semelhanças em termos de

precisão e exatidão para ambos os métodos.

Em 2008, Kavasnika et al. [59] fizeram a detecção de ácidos fenólicos em

cevada empregando a técnica de eletroforese capilar de zona, do inglês, Capillary

Zone Electrophoresis (CZE) com polaridade invertida. No entanto, apenas o ácido

ferúlico foi determinado em concentração máxima de 43,4 mg 100 g-1. Destaca-se o

menor tempo de análise por CE quando comparado com o método por HPLC, 15 e

25 min, respectivamente; melhor separação; melhor resolução; método

ambientalmente correto, com consumo de baixos volumes de eletrólitos. Por outro

lado, CZE tem menor detectabilidade do que HPLC e o tempo de migração é mais

variável do que o tempo de retenção por HPLC [59].

1.5.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma das técnicas

cromatográficas mais empregadas na atualidade. Apresenta muitas vantagens para

as análises de combinações orgânicas. Amostras não voláteis e termolábeis são

preferencialmente analisadas por HPLC devido à sua rapidez na análise,

sensibilidade e precisão nas medições realizadas pelo equipamento, que apesar de

sofisticado e de alto custo, possui aplicação em diversos tipos de matrizes [84,85].

A técnica de HPLC é a mais usada e estabelecida para a determinação

de compostos fenólicos em cevada devido ao seu grande poder de separação e

possibilidade de acoplamento com diferentes detectores [84].

Zhao et al. [48] avaliaram o efeito de uma mistura de solventes na

atividade antioxidante, capacidade de extração e seletividade de compostos

fenólicos em cevada. A análise individual de compostos fenólicos foi realizada por

44

HPLC/UV. A separação dos compostos fenólicos foi alcançada usando

cromatografia no modo fase reversa com eluição por gradiente empregando fase

móvel A (água com 0,1% de ácido acético) e fase móvel B (metanol com 0,1% de

ácido acético) durante 60 min de análise [48]. Foram identificados e quantificados 9

compostos fenólicos tais como catequina, epicatequina, ácidos siringico, ferúlico,

protocatecóico, cafeico, vanílico, gálico e cumárico em diferentes solventes

extratores (etanol, metanol e água) e em 3 variedades de cevada. Os autores

determinaram 56,15µg g-1 para catequina; 12,45 µg g-1 para epicatequina; 10,29 µg

g-1 para o ácido siringico; 12,05 µg g-1 para o ácido ferúlico; 7,88µg g-1 para o ácido

cafeico; 3,62 µg g-1 para o ácido vanílico; 2,71 µg g-1 para o ácido gálico e 1,78 µg g-

1 para o ácido p-cumárico em grãos de cevada.

Os ácidos fenólicos que estão ligados às paredes celulares da cevada

germinada apresentam elevado potencial antioxidante na cerveja. Neste contexto, os

autores fizeram um estudo para determinar compostos fenólicos em cerveja. Depois

da hidrólise alcalina do extrato metanólico de cevada germinada (malte), 7

compostos fenólicos foram separados por HPLC/UV com coluna C18 e eluição por

gradiente usando fase móvel A (água com ácido ortofosfórico) e fase móvel B,

acetonitrila. Os 3 principais compostos, como ácidos trans-ferúlico, trans-cumárico e

cis-ferúlico (177,79; 78,50 e 47,15 µg g-1) respectivamente foram quantificados por

padronização externa. Os autores relataram que os ácidos fenólicos devem ser

protegidos antes do final do processo de malteação, que é um processo de

germinação controlada da cevada e que envolve a umidificação e a secagem, cujos

propósitos são amolecer os grãos para facilitar a moagem, além de introduzir cor e

aromas desejáveis à cerveja. Quando o processo de malteação não é controlado,

seus produtos de degradação, como por exemplo a descarboxilação do ácido

ferúlico podem ser responsáveis pela perda de sabor da cerveja [58].

Aleksenko et al. [86] identificaram vários compostos fenólicos por

HPLC/UV e ionização por eletrospray com espectrometria de massas sequencial

(ESI-MS/MS) em amostras de cevada. Os principais compostos encontrados foram

rutina, catequina, epicatequina, além de procianidinas B3 e C. A análise realizada

por HPLC/MS empregou analisador quadrupolo com ionização por ESI. A separação

foi alcançada a partir de uma coluna C18 com gradiente de eluição por gradiente

usando fase móvel contendo acetonitrila com 10 mmol L-1de ácido acético [86].

45

Um estudo realizado em 2010 por Li et al. [87] determinou 3 ácidos

fenólicos (ácido p-cumárico, ácido ferúlico e ácido sinápico) por HPLC/UV usando

coluna C18 e fase móvel com eluição por gradiente contendo água com 0,1% de

ácido acético no solvente A e acetronitrila com 0,1% de acetonitrila no solvente B em

5 amostras comerciais de cevada. O ácido ferúlico foi o composto fenólico

predominantemente encontrado na razão de 42 a 400 mg kg-1. Outros ácidos

fenólicos (cafeico, cumárico e sinápico) foram identificados por cromatografia líquida

de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) [87].

Dvorakova et al. [47] constataram que catequina e prodelfinidina B3 foram

os principais compostos encontrados na avaliação de 10 variedades de amostras de

cevada usando HPLC/UV e HPLC-ESI-MS. O estudo qualitativo de compostos

fenólicos foi realizado por HPLC-ESI-MS com coluna C18, usando fase móvel A

contendo 100% de metanol e fase móvel B com 0,1 % de ácido fórmico, com eluição

por gradiente, vazão de 0,2 mL min-1 e volume de injeção de 20 µL, além de

ionização no modo negativo. Já a análise quantitativa dos extratos de acetona:água

(70:30, v/v) foi feita por HPLC/UV, com detecção em 280 nm, nas mesmas

condições cromatográficas empregadas em HPLC-ESI-MS.

Verardo et al. [79] fizeram um estudo comparando dois métodos de

separação de compostos fenólicos, HPLC/UV-MS e MECK. O objetivo do estudo foi

produzir farelo de cevada com compostos fenólicos para obter ingredientes

naturalmente enriquecidos para a indústria alimentícia. A análise por HPLC/UV foi

realizada no modo fase reversa com coluna C18 e detecção em 280 nm. Os autores

concluíram que as amostras de cevada analisadas continham principalmente

catequina e proantocianidinas como fenólicos livres, ácidos hidróxicinâmicos e seus

derivados na faixa de 130,6 a 166,5 mg 100 g-1 nas amostras de cevada [79]. Os

dados de quantificação mostram que tanto a MECK como HPLC apresentaram

resultados semelhantes em termos de precisão e quantidade de compostos

fenólicos (mesma ordem de grandeza).

Em 2011, Hao e Beta [80] realizaram a análise qualitativa e quantitativa

de compostos fenólicos em cascas de cevada no modo fase reversa por HPLC-

MS/MS e HPLC/UV, na qual determinaram ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido

vanílico e vanilina nas concentrações de 2260,0; 1365,0; 58,6 e 157,2 mg kg-1

respectivamente. A análise por HPLC/UV com detecção em 280 nm foi realizada no

modo reverso com coluna C18, com fase móvel contendo água com 0,1% de ácido

46

acético no solvente A e acetronitrila com 0,1% de ácido acético no solvente B e

eluição por gradiente em 75 min. A identificação e caracterização dos compostos

fenólicos foi baseada na comparação do perfil dos espectros de UV e espectros de

MS/MS com os padrões. Os resultados quantitativos alcançados por HPLC/UV

mostraram que ácido ferúlico e ácido p-cumárico foram os compostos fenólicos

abundantes em cascas de cevada [80].

Um trabalho realizado para obtenção do perfil fitoquímico em cevada

negra constatou a predominância do ácido ferúlico e ácido p-cumárico por HPLC no

modo reverso com coluna C18 e eluição por gradiente usando 0,05% de ácido

trifluoracético em água (solvente A) e 0,05% ácido trifluoracético em acetonitrila

(solvente B). O comprimento de onda usado para detecção foi de 280 nm [88].

1.5.3. Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência

A cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC) utiliza os mesmos

princípios da técnica de HPLC, porém com a vantagem de trabalhar com fases

estacionárias de partículas menores que 2 µm [89]. O uso destas partículas,

juntamente com as altas velocidades lineares da FM, proporciona um aumento na

resolução e na detectabilidade, assim como a diminuição no tempo das análises.

As colunas empregadas em UHPLC são de tamanhos reduzidos, 5-10 cm

de comprimento e diâmetros internos de 1,0-2,1 mm, permitindo que maiores

velocidades lineares de fase móvel possam ser alcançadas. Para tanto é necessário

o uso de equipamentos mais adequados capazes de operar a pressões mais

elevadas (9000-15000 psi) que HPLC, o qual opera na faixa de 4000-5000 psi [89,

90].

De modo geral, a UHPLC já está bem estabelecida, tanto em termos de

fases estacionárias, como de instrumentação. É uma técnica que apresenta

facilidade na transferência de um método desenvolvido por HPLC para UHPLC, uma

grande variedade de colunas, equipamentos e detectores disponíveis

comercialmente e isso indica que num futuro próximo esta técnica talvez consiga

superar a HPLC nas análises de rotina, além de usar menores volumes de solventes

orgânicos, gerando menor quantidade de resíduos, de acordo com os princípios da

Química Verde [90, 91].

47

A aplicação da técnica de UHPLC na determinação de compostos

fenólicos pode ser vista no trabalho de Gruz et al. [92]. Os autores determinaram

dezessete ácidos fenólicos em diferentes bebidas, usando UHPLC acoplada a um

espectrômetro de massas sequencial (MS/MS). O método apresentou resultados

satisfatórios quanto às figuras de mérito, como limites de detecção na faixa de 0,15

a 15 pmol e a precisão calculada com desvio padrão relativo de 4,4%. O método foi

aplicado para a análise de sucos de uva, amostras de vinho branco e chá verde. A

análise foi realizada num tempo muito menor (10 min) quando comparada as

análises de rotina comumente usadas por HPLC que variam na faixa de 40 min.

Recentemente, foi desenvolvido e validado um método por UHPLC-

MS/MS para determinação de 8 compostos derivados da catequina em várias

amostras de chá verde, branco e preto em um tempo de 4 min para cada análise. O

método foi validado a partir dos parâmetros de precisão intra e inter-dias, exatidão,

efeito matriz, linearidade, LD e LQ. A proposta do trabalho foi desenvolver um

rápido, eficiente e robusto método por UHPLC-MS/MS com analisador triplo

quadrupolo. Com isso foi possível minimizar o risco de degradação dos analitos,

uma vez que os compostos fenólicos são fotossensíveis, contribuindo para a análise

de um maior número de amostras e reduzindo o consumo de solventes orgânicos e

custo das análises. A coluna C18 usada no sistema UHPLC foi recheada com

partículas de 1,7 µm que permitiram maiores vazões de fase móvel e maior rapidez

nas análises. As amostras foram separadas usando eluição por gradiente composta

por 0,1% de ácido fórmico em água (solvente A) e 0,1 % de ácido fórmico em

metanol (solvente B). A média dos valores de catequinas em chás verdes, brancos e

pretos foi de 76,7 mg g-1; 66,1 mg g-1 e 22,7 mg g-1, respectivamente. Os resultados

indicaram que diferentes marcas de chá e custo não desempenharam um papel

significativo na quantidade total de catequinas [93].

1.6. Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas pode ser compreendida como uma técnica

analítica que permite a identificação deuma amostra para um determinado composto

isolado, ou de diferentes substâncias em misturas complexas, através da

determinação de suas massas molares na forma iônica, (ou seja, com carga elétrica

líquida, positiva ou negativa), baseada na sua movimentação através de um campo

48

elétrico ou magnético. Esta movimentação é determinada pela razão entre a massa

de um determinado composto (analito) e sua carga líquida, representada por m/z

(razão massa/carga). Assim, conhecendo o valor de m/z de uma molécula é possível

deduzir sua composição química elementar, e com isso determinar sua estrutura

[94].

Dentre os principais componentes de um espectrômetro de massas estão

o sistema de introdução de amostras, uma fonte de ionização, onde são produzidos

íons na fase gasosa; um analisador de massas que identifica íons de acordo com

suas razões massa/carga (m/z); e um detector que geralmente é constituído por um

multiplicador de elétrons [95].

O desenvolvimento dos espectrômetros de massas de múltiplos estágios,

como os triplo e pentaquadrupolos, armadilha de íons (ion traps), setores elétricos e

magnéticos e equipamentos híbridos, do inglês, Time of Flight (QTOF, QTRAP)

permitiu o acesso a técnicas de espectrometria de massas sequencial (MS/MS ou

MSn) e, com isso, ocorreu um aumento significativo das potencialidades analíticas da

técnica.

O analisador de massas é responsável pela seleção e/ou separação de

acordo com a razão m/z dos íons.

O analisador triplo quadrupolo empregado em MS/MS é constituído por 3

quadruplos em série, sendo dois quadrupolos de transmissão (utilizados para

separar íons de mesma razão m/z) interligados por um quadrupolo que atua como

cela de colisão, no qual ocorre a fragmentação dos íons selecionados no primeiro

quadrupolo, geralmente por dissociação induzida por colisão (CID), e é empregado

como direcionador dos íons produzidos ao terceiro quadrupolo. A Figura 6 mostra

um analisador triplo quadrupolo empregado para análises de matrizes diversas [96].

Figura 6: Esquema de um analisador triplo quadrupolo operando no modo SRM onde Q1 e Q3 são quadrupolos de transmissão e Q2 um quadrupolo onde ocorre a fragmentação dos íons.

49

Na DIC, o íon precursor proveniente do primeiro quadrupolo é acelerado

por um potencial elétrico para uma região de alto vácuo no interior do segundo

quadrupolo, onde sofre repetidas colisões com um gás inerte de alta energia

(geralmente Ar ou He), induzindo um acréscimo na energia potencial do íon até

ocasionar sua fragmentação, com posterior formação de íons produto.

Assim, o fragmento de maior intensidade é empregado na quantificação

do analito, enquanto o segundo fragmento de maior intensidade é utilizado para

confirmação da autenticidade do analito.

As análises de íons pré-selecionados, formados através de processos de

dissociação ou reações íon/molécula, permitem a obtenção de informações mais

detalhadas quando comparadas àquelas obtidas através de espectros de massas

simples. Com técnicas de MSn obtém-se não somente a razão massa/carga (m/z)

dos íons, mas também, informações estruturais de cada um desses íons, permitindo,

portanto, a “reconstrução” da molécula precursora. A análise de misturas

diretamente por MSn também se tornou possível, já que os íons de cada um dos

seus constituintes podem ser individualmente separados e analisados. Desta forma,

é possível analisar misturas de compostos para as quais separações

cromatográficas não são indicadas [97].

A amostra a ser analisada é introduzida no espectrômetro de massas

através de um inlet (dispositivo para a introdução da amostra no espectrômetro) e

direcionada para a fonte de ionização. No início do desenvolvimento da técnica, a

amostra era introduzida pela vaporização direta; com o desenvolvimento das

técnicas cromatográficas, tornou-se bastante comum o uso de um cromatógrafo

como fonte de introdução da amostra no espectrômetro de massas [98]. Existe uma

grande variedade de técnicas de ionização, cuja escolha deve levar em conta as

propriedades físico-químicas do analito e a energia transferida durante o processo

de ionização.

Atualmente, para a análise de matrizes diversas, o modo mais empregado

é a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-

MS/MS), com ionização por eletrospray e analisador triplo quadrupolo, devido à sua

elevada seletividade, que possibilita um aumento na detectabilidade e diminuição da

influência do efeito matriz [99].

A ionização por eletrospray (ESI) é uma das principais técnicas de

ionização em pressão atmosférica e também uma das mais importantes na

50

determinação estrutural de diversas moléculas, consistindo em mais uma das

técnicas no conceito de ionização suave, permitindo a formação de íons a partir de

macromoléculas, superando sua propensão em fragmentar-se quando ionizadas.

O processo de ionização por ESI ocorre quando um solvente volátil

contendo os analitos é bombeado através de um fino capilar de aço inoxidável. Uma

alta tensão é aplicada na ponta deste capilar, e, como consequência deste forte

campo elétrico, a amostra que sai pelo capilar estará dispersa em um aerosol

composto por gotículas de solvente e analito altamente carregadas [100].

Este processo é auxiliado por um gás inerte (geralmente nitrogênio e

chamado de gás de nebulização) que é introduzido na fonte ESI, fluindo

externamente ao capilar. Este fluxo de gás está em temperaturas elevadas (150-200

º C) e auxilia na evaporação do excesso solvente e na formação do aerosol.

O cone começa a se formar quando as microgotas de um solvente

eletricamente condutivo são expostas a fortes campos elétricos, causando uma

deformação em sua superfície, que então surge como um cone com os lados

convexos e ponta arredondada. Conforme o campo elétrico aumenta excedendo a

tensão do solvente, o cone se inverte e um jato é lançado, formando um spray.

Neste momento ocorre a formação de minúsculas gotas de solvente contendo o

analito e repleto de cargas elétricas positivas ou negativas (de acordo com o modo

de análise) [101]. Como as microgotas de solvente sofrem ação de um fluxo de N2

aquecido, elas passam a evaporar, tendo seu diâmetro reduzido rapidamente. Com

isso as cargas ali contidas passam a ter maior proximidade, e, consequentemente,

maior repulsão eletrostática. Quando esta repulsão atinge uma força maior do que a

tensão do solvente ocorre um colapso, que promove ruptura da microgota com

consequente formação de outras gotas de solvente e analito menores ainda. Várias

explosões se iniciam até que são produzidos íons do analito a partir dessas gotas,

os quais são transferidos para dentro do espectrômetro de massas por uma série de

dispositivos de focalização [102]. A Figura 7 apresenta a esquematização da

ionização por eletrospray, operando no modo positivo.

51

Figura 7: Mecanismo da evaporação do íon e da explosão coulômbica [103].

Durante a ionização por eletrospray, três tipos de íons podem ser

gerados: íons moleculares (M+˙ ou M-˙), moléculas protonadas ou desprotonadas

([M+H]+ou [M-H]-e moléculas catiônicas ou adutos (por exemplo, ([M+Na]+ ou [M+Cl]-

), sendo M a massa do analito em questão. O modo de operação positivo ou

negativo é estabelecido pelos modificadores adicionados à FM, como exemplo de

um ácido (modo positivo), geralmente ácido fórmico, ou uma base (modo negativo).

Uma das vantagens do eletrospray é que a ionização ocorre em solução,

de forma branda, favorecendo que os compostos termolábeis possam ser ionizados

sem que ocorra degradação [104].

1.6.1. Efeito matriz em espectrometria de massas

O efeito matriz é atribuído à variação da eficiência de ionização que pode

causar alterações negativa ou positiva no sinal do detector, devido à supressão ou

acréscimo de ionização e, como consequência, a quantificação dos analitos deixa de

52

ser confiável, uma vez que ocorreram alterações causadas na precisão, exatidão e

detectabilidade do método. O mecanismo exato do efeito matriz ainda não é

conhecido, mais é comum assumir que os compostos coeluídos competem com os

analitos e a ionização será favorecida para as moléculas que são mais ionizáveis e

estão em maiores quantidades na amostra [105].

O efeito matriz pode causar um aumento ou a diminuição da resposta do

espectrômetro para um analito presente no extrato da amostra comparado ao

mesmo analito em solvente orgânico. O estudo do efeito matriz é relevante quando

se deseja trabalhar com uma curva analítica em solvente, ou seja, sem a presença

da matriz [106].

As dificuldades encontradas nas análises em decorrência do efeito matriz

não se limitam a métodos analíticos baseados em UHPLC-MS/MS. Eles também

podem estar nos outros métodos mais convencionais baseados, por exemplo, em

HPLC-UV e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência

(HPLC-FLU). Geralmente os métodos de preparo de amostras quando se utiliza

UHPLC ou HPLC-MS/MS são normalmente mais simplificados e muitas vezes, não

há uma preocupação com a separação cromatográfica devido à alta seletividade da

detecção por MS/MS. Nesse sentido, o efeito matriz tornou-se mais evidente e mais

preocupante nos métodos UHPLC ou LC-MS/MS em comparação com os métodos

convencionais, devido a simplificação do método de preparo de amostra [105].

Mesmo que os mecanismos de supressão ou ganho de sinal não estejam

bem estabelecidos, o efeito matriz é altamente dependente da natureza do analito e

da matriz de análise. Observa-se que a eficiência de ionização de compostos

polares é mais pronunciadamente afetada por componentes da matriz coeluídos do

que quando se trabalha com compostos menos polares [107].

A etapa de preparo de amostras é considerada muito relevante para

minimizar o efeito da matriz, provocado pelo aumento ou diminuição do sinal

analítico. Portanto, a etapa de clean-up é fundamental para eliminar compostos

provenientes da matriz presentes no extrato, os quais podem interferir no método

analítico.

Algumas equações são empregadas para o cálculo do efeito matriz tais

como:

53

onde a % do efeito matriz é referente ao aumento ou supressão de sinal, pela razão

entre o coeficiente angular da curva analítica construída na matriz e o coeficiente

angular da curva analítica construída em solvente [108].

O efeito matriz (Matrix Effect – ME) também pode ser avaliado pela razão

da resposta analítica do extrato final da amostra, que foi fortificado com a solução

dos padrões, pela solução dos padrões em solvente, na mesma concentração [107].

Os valores de efeito matriz negativos sugerem a ocorrência de supressão

do sinal analítico, enquanto que os valores positivos sugerem ganho no sinal,

decorrentes da interação do analito com a matriz da amostra em análise.

Quando as variações nas respostas do detector entre o extrato fortificado

e a solução dos padrões em solventes, ambos na mesma concentração forem < ±

20%, considera-se que há um leve efeito matriz. Valores superiores a ± 20%

apontam que o efeito matriz é significativo e ele pode ser causado por supressão de

ionização, conduzindo à perda de sinal, ou acréscimo de ionização, que resulta em

um ganho de sinal analítico [109].

Um fator que pode reduzir o efeito matriz é a diluição da amostra. Em

2009, Kruve et al. concluíram que a diluição da amostra pode minimizar o aumento

dosinal analítico ou a supressão iônica [108]. Entretanto, essa prática da diluição

pode ser comprometida pelo aumento do limite de detecção, dependendo da

natureza da amostra.

1.7. Validação de métodos analíticos

A validação é uma etapa que deve ser realizada após o desenvolvimento

do método analítico e antes das análises das amostras disponíveis comercialmente,

com o objetivo de gerar resultados com credibilidade, precisão e exatidão

54

adequados. Assim, a validação pode ser compreendida como um processo de

verificação para garantir que o método desenvolvido é capaz de assegurar

confiabilidade às medidas experimentais do método [110, 111].

De maneira geral, o processo de validação de um método tem como

objetivo fornecer evidências de que o método é adequado para realizar o que se

propõe com exatidão, reprodutibilidade e credibilidade [112].

O desenvolvimento de um novo método já validado, quando bem definido

e documentado, deve sempre fornecer evidências organizadas, claras e objetivas de

que o método e o sistema são adequados para o uso desejado.

Não há um consenso comum a respeito de quais parâmetros devem ser

validados, o que varia de uma área para outra. No entanto alguns órgãos e

instituições criaram guias de validação que são facilmente aceitos [110]. Dentre os

órgãos podem-se citar: USA-FDA, ANVISA E MAPA entre outros.

Os parâmetros para validação de métodos têm sido definidos em

diferentes grupos de trabalho de organizações nacionais e internacionais. Assim,

órgãos como ICH, IUPAC, ISO, ANVISA, INMETRO exigem o item validação de

métodos analíticos como um requisito fundamental no credenciamento para

qualidade assegurada e demonstração de competência técnica [111]. Alguns

parâmetros como especificidade/seletividade, faixa de trabalho e faixa linear de

trabalho, linearidade, sensibilidade, limite de detecção, limite de quantificação,

exatidão e precisão são comumente avaliados no processo de validação.

Vale ressaltar que estes órgãos são responsáveis por acompanhar e

credenciar a competência de laboratórios de ensaios, porém as diferentes

terminologias e até algumas características de desempenho do método podem ter

alterações de acordo com o órgão competente.

1.7.1. Seletividade

Um método analítico é considerado seletivo quando é capaz de produzir

respostas para vários analitos, mas também é capaz de distinguir a resposta de um

analito dos outros [113]. É a capacidade de um método em quantificar um analito

sem equívocos na presença da matriz que podem estar presentes as impurezas,

produtos de degradação, entre outros.

55

Na cromatografia líquida, a seletividade pode ser alcançada através da

otimização das etapas de extração e de separação dos analitos. Em relação à

extração, a seletividade do método depende do tipo de técnica de preparo de

amostra escolhida e de todas as variáveis envolvidas no seu procedimento, como

tipo de solventes, tempo de extração e temperatura. Já a seletividade na etapa de

separação cromatográfica pode variar de acordo com o tipo de fase estacionária da

coluna cromatográfica e composição da fase móvel. A seletividade de um método

analítico pode ser avaliada utilizando-se detectores como arranjo de diodos e

espectrômetro de massas que permitem comparar o espectro do pico obtido na

amostra com o espectro do padrão puro [111].

1.7.2. Linearidade

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer sinais

que sejam diretamente proporcionais à quantidade do analito em um determinado

intervalo de concentração. A correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico)

e a concentração da espécie, na maioria dos casos é definida por uma equação

matemática, que pode ser expressa como uma equação de reta chamada de curva

analítica.

A estimativa dos coeficientes de uma curva analítica usando um conjunto

de medições experimentais pode ser realizada através do método matemático

conhecido como regressão linear, determinado pelo método dos mínimos

quadrados, e é definida pela equação da reta [114].

y = a.x + b, onde:

y = resposta medida ou sinal analítico

x = concentração do analito, variável independente

a = inclinação da curva analítica

b = intersecção da curva com a ordenada, quando x=0 (coeficiente linear).

A escolha da regressão pelo modelo linear e a verificação do ajuste em

função dos valores experimentais da curva podem ser avaliados pela análise da

variância. Calcula-se a porcentagem máxima de variação explicável para os dados

experimentais e a porcentagem de variação explicada (r2) [115].

56

1.7.3. Limite de detecção

É definido como a menor quantidade de um analito que pode ser

detectada, porém não necessariamente quantificada como um valor exato.

O limite de detecção (LD) pode ser expresso como:

Onde;

s = estimativa do desvio padrão da resposta

S = inclinação (coeficiente angular) da curva analítica

O “s” é a estimativa do desvio padrão da resposta, que pode ser a

estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do

coeficiente linear da equação e S é a inclinação (tangente) ou coeficiente angular da

curva analítica [114].

1.7.4. Limite de quantificação

Limite de quantificação (LQ) é considerado como a menor concentração

do analito que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento

experimental. O LQ segue o mesmo princípio do LD, porém com a relação

sinal/ruído de 10:1, ou seja:

Onde;

s = estimativa do desvio padrão da resposta

S = inclinação (coeficiente angular) da curva analítica

Na maioria das vezes, o LQ é determinado como sendo o ponto de menor

concentração da curva analítica, excluindo-se o branco [114].

57

Para as técnicas cromatográficas, a melhor condição para determinação

de LD e LQ é o baseado nos parâmetros da curva analítica, pois este é

estatisticamente mais confiável que os demais, uma vez que os valores destes

limites podem variar dependendo-se do tipo e tempo de uso da coluna

cromatográfica, das condições cromatográficas e até da sensibilidade dos analitos. A

curva analítica deve conter a concentração correspondente ao LQ [111].

1.7.5. Precisão

A precisão representa a dispersão de resultados entre ensaios

independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou

padrões, sob condições definidas. Normalmente, a precisão é avaliada em termos

de desvio-padrão (DP) e desvio padrão relativo (DPR), conhecida como coeficiente

de variação (CV) e expressa pela equação 5:

= média aritmética das medições;

s = desvio padrão das medições;

A taxa de aceitação de DPR nos processos de validação de métodos

analíticos é de até 20%, dependendo da complexidade da amostra. Assim, a

precisão em validação de métodos analíticos é considerada em três níveis

diferentes: repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade [111].

A repetitividade representa a concordância entre os resultados de

medições sucessivas de um mesmo método, sob as mesmas condições de medição:

mesmo procedimento, mesmo analista, mesmo local, mesmo instrumento usado sob

as mesmas condições e repetições em curto espaço de tempo.

A precisão intermediária representa a precisão sobre a mesma amostra

quando um método é aplicado várias vezes pelo mesmo laboratório, porém variando

condições como analistas, equipamentos e tempos diferentes [113].

A reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados de

medições de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (mudança de

operador, local, equipamentos, etc...[113].

58

1.7.6. Exatidão

Consiste no grau de aproximação entre o resultado de um experimento e

o valor de referência aceito como verdadeiro [113].

A recuperação é definida como a proporção da quantidade da substância

de interesse, presente ou adicionada na proporção analítica do material teste que é

extraída e passível de ser quantificada. Segundo a ICH e a ANVISA é necessário um

mínimo de 9 determinações, envolvendo um mínimo de 3 níveis de concentração

para a determinação da exatidão.

Os processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são:

materiais de referência; comparação de métodos; ensaios de recuperação e adição

padrão.

Os materiais de referência são acompanhados de um certificado que

possui o valor de concentração de uma dada substância, ou outra grandeza para

cada parâmetro e uma incerteza associada [111]. Já na comparação de métodos,

emprega-se o método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através de

um método de referência, avaliando o grau de proximidade entre os resultados

obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão do método. Nos ensaios de

recuperação, tem-se a proporção da quantidade da substância de interesse,

presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e

passível de ser quantificada. Na avaliação da exatidão usando o método adição

padrão, cabe o uso quando for difícil ou impossível preparar um branco da matriz

sem a substância de interesse [111]. No método de adição padrão, quantidades

conhecidas da substância são adicionadas em diferentes níveis numa matriz da

amostra, antes do procedimento de preparo da amostra, que já contenha

quantidades (desconhecidas) da substância a fim de recuperá-las no término da

análise.

59

2.OBJETIVOS

2.1. Objetivos gerais

O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação de diferentes métodos de

preparo de amostras buscando a investigação (qualitativa e quantitativa) dos

compostos fenólicos presentes na cevada.

Após o desenvolvimento dos métodos de extração, fez-se a validação

usando a técnica de cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à

espectrometria de massas sequencial (UHPLC-MS/MS) e a aplicação de um dos

métodos em diferentes amostras de cevada de diferentes locais.

2.2. Objetivos específicos

� Avaliação de técnicas clássicas de extração e caracterização dos extratos por

ESI(-)-MS/MS e UHPLC-MS/MS, de modo a se detectarem os possíveis

compostos fenólicos ou derivados presentes na cevada.

� Otimização das variáveis de extração das técnicas clássicas por meio de um

planejamento experimental.

� Avaliação do método QuEChERS para extração de compostos fenólicos em

cevada.

� Validação dos métodos por UHPLC-MS/MS para a quantificação dos

compostos fenólicos nos extratos de cevada.

� Identificação e quantificação dos compostos fenólicos em diferentes amostras

de cevada de diferentes locais.

60

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Reagentes

Os padrões catequina, epicatequina, rutina, miricetina, ácido sinápico,

ácido vanílico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido clorogênico e

ácido protocatecóico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Diadema, Brasil). Todos os

padrões foram de grau analítico (≥ 98%) e usados sem purificação adicional.

Água ultrapura foi obtida a partir de um sistema Milli-Q UV Synergy da

Millipore (Molsheim, França). Também foram usados papel de filtro qualitativo

Whatman com espessura de 55 mm, filtro Millex de 0,22 µm de porosidade da

Millipore e tubos de polipropileno para centrífuga tipo Falcon Nest (Xangai, China)

com volume de 50 mL e vials com capacidade de 2 mL da Agilent.

Foram empregados os reagentes etanol e dimetilsulfóxido (DMSO) grau

HPLC, Panreac (Barcelona, Espanha); hidróxido de amônio e ácido clorídrico, ácido

acético glacial e ácido fórmico, todos Synth (Diadema, Brasil); hexano grau HPLC e

acetonitrila grau HPLC, Tedia (Fairfield, EUA) e metanol grau HPLC, Merck (Madri,

Espanha). O óleo de silicone usado para o controle da temperatura na extração em

sistema de refluxo foi obtido da Synth (Diadema, Brasil).

Também foram utilizados os reagentes sólidos sulfato de magnésio, P.A,

Vetec (Rio de Janeiro, Brasil), acetato de sódio P.A, Sigma-Aldrich (Missouri, EUA),

sorvente de extração de sílica recoberta com grupos C-18, com tamanho de

partícula de 40µm, Agilent Technologies (Santa Clara, EUA) e amina primária-

secundária (PSA), Varian (São Francisco, EUA).

As soluções estoque dos padrões de concentração 1000 mg L-1 foram

preparadas dissolvendo-se a quantidade adequada dos padrõesapós pesagem

cuidadosa da respectiva massa, em metanol grau cromatográfico, filtrado em

membrana porosa e desgaseificado em ultrassom), e subsequente homogeneização

das soluções, as quais foram armazenadas em frascos âmbar fechados em

geladeira a 5 °C. As soluções de trabalho dos compostos fenólicos foram

preparadas pela diluição, em metanol, das soluções estoque.

61

3.2. Compostos fenólicos estudados

Massa molar: 180 g/mol Massa molar: 194 g/mol

ÁCIDO p-CUMÁRICO (pKa1-2= 4,1; 10,2)

Massa molar: 164 g/mol


CATEQUINA EPICATEQUINA (pKa1-2= 8,7; 9,7) (pka1-2= 8,9; 9,9) Massa molar: 290 g/molMassa molar: 290 g/mol

62

ÁCIDO PROTOCATECÓICO ÁCIDO CLOROGÊNICO

(Ácido 5-cafeoilquínico) Massa molar: 182 g/mol Massa molar: 354 g/mol

MIRICETINA ÁCIDO VANÍLICO

Massa molar: 318 g/mol Massa molar: 168 g/mol

ÁCIDO SINÁPICO


Figura 8: Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo.

63

3.3. Equipamentos

Na análise cromatográfica foi utilizado o UHPLC-MS/MS Acquity,

acoplado ao espectrômetro de massas Waters, modelo Micromass Quatro Micro TMAPI, com o analisador de massas do tipo triplo quadrupolo (QqQ) e fonte de

ionização por electrospray (ESI) no modo negativo, da Waters (Milford, EUA). O

sistema de aquisição de dados foi controlado pelo software Mass Lynx versão 4.1. A

coluna era Acquity UHPLC BEH C-18 1,7 µm (2,1 × 50 mm d.i.) da Waters.

As análises de infusão direta também foram realizadas por espectrometria

de massas sequencial (MS/MS), modelo Micromass Quatro Micro TMAPI, da Waters

(Milford, EUA) com uma fonte de ESI. Argônio ultra puro foi utilizado como gás de

colisão e nitrogênio (N2) de elevada pureza como gás de nebulização.

Outros equipamentos utilizados foram: agitador magnético, modelo 752,

Fisatom; agitador Vórtex, modelo AP 56, Phoenix; balança analítica com precisão de

0,1 mg, modelo A-250, Fischer Scientific; balança analítica com precisão de 0,01

mg, modelo CP225D, Sartorius ; banho de ultrassom, modelos T14 e T50, Thornton;

Centrífuga de alimentos modelo CF-02, Juicer Mondial; rotaevaporador modelo

LS541, Sinc; micropipetas de 0,5-10; 10-100; 100-1000; 500-5000 µL, Eppendorf

Research; pHmetro, 827 pH Lab da Metrohm e moinho Quadrumat Senior da

Brabender (Duisburg, Alemanha).

3.4. Amostras de cevada

Os grãos de cevada foram fornecidos pelo Centro de Pesquisa da

Embrapa Trigo de Passo Fundo e cultivados no município de Ibiaçá, Rio Grande do

Sul. Foram utilizadas as cultivares BRS Lagoa 225 e BRS Lagoa 26612 do ano de

2010. Os grãos foram previamente secos em estufa a 55°C e moídos em micro-

moinho, a fim de se obter tamanho de partículas <1 mm.

64

3.5. Métodos de Extração

3.5.1. Método A – com hidrólise ácida

Foi pesado 1,0 g de grãos moídos de cevada em um frasco com tampa de

rosca. Adicionaram-se 10 mL de acetonitrila e agitaram-se os frascos

vigorosamente. Adicionaram-se 6 mL de água deionizada e as amostras foram

colocadas em banho de ultrassom por um período de 2 h, aquecidas à temperatura

de 50°C. Após esta etapa, as amostras foram resfriadas até temperatura ambiente e

foram adicionados 4 mL de água deionizada para obter um volume total de líquido

de 20 mL. Esta amostra líquida foi tampada e guardada em geladeira a 4°C por 15 h

antes da hidrólise ácida.

Para a hidrólise, 4 mL do extrato líquido foram colocados em um tubo de

ensaio com tampa rosqueável com 1 mL de HCl 37% (v/v) e o tubo de ensaio foi

aquecido em um banho termostático a 80°C por um período de 2 h.

Após a hidrólise, o tubo foi resfriado e 2 mL de uma solução de NH4OH

30% v/v: ácido acético glacial: DMSO 50:5:45 (v/v/v) foram adicionados. O pH da

solução final foi ajustado para se obter um meio neutro com solução de NH4OH 30%

v/v. Esta solução final foi filtrada em membrana de 0,22 µm e colocada num vial.

Este método foi adaptado de Ribani [117].

3.5.2. Métodos B1, B2 e B3–com hidrólise básica

Foi pesado 1 g dos grãos moídos de cevada que foram pesados em um

béquer e adicionados 5 mL de hexano sob agitação por 60 min para remoção da

gordura. A solução contendo hexano e gordura foi descartada com o uso da pipeta

de Pasteur e à porção restante foram adicionados10 mL de água (método B1) ou 10

mL de etanol 50 % (v/v) (método B2) ou 10 mL de etanol P.A (método B3) e

deixados sob agitação com barra magnética por 20 min, à temperatura ambiente e

na presença de gás nitrogênio. Cada extrato foi centrifugado por 10 minutos e

filtrado em papel de filtro qualitativo e em membrana de 0,22 µm.

Os resíduos sólidos das extrações foram hidrolisados com 20 mL de

NaOH 2 mol/L por 1 h, em agitação com barra magnética, à temperatura ambiente e

65

na presença de gás nitrogênio. Os extratos alcalinos foram acidificados até pH 2

com 20 mL de HCl 2 mol/L e centrifugados a 5148 G por 10 minutos. Após a filtração

em papel de filtro qualitativo e em membrana de 0,22 µm os filtrados foram

colocados em vials para serem analisados por ESI(-)-MS/MS. Este método foi

adaptado de Inglett [41].

3.5.3. Método C1, C2, C3 e C4 - Extração hidroetanólica

Foram pesados 3 g de grãos moídos de cevada em um béquer e

adicionados 15 mL de hexano sob agitação por 60 min para remoção da gordura. A

solução contendo hexano e gordura foi descartada com o uso da pipeta de Pasteur e

na porção restante foram adicionados 45 mL de solução hidroetanólica 50% (v/v) no

método C1 ou 80% (v/v) etanol/água no método C2 com agitação magnética a 80 ºC

por 90 min, em chapa de aquecimento, seguido de filtração em papel de filtro

qualitativo. Já para o método C3, foram adicionados 45 mL de solução

hidroetanólica 80% (v/v) e deixada sob agitação magnética em manta de

aquecimento a 80 ºC por 90 min, em um balão de fundo redondo sob atmosfera

inerte (gás nitrogênio), seguido de filtração em filtro qualitativo. Para o método C4

adicionaram-se 45 mL de solução etanol/água (80% v/v), deixando em sistema de

refluxo por 90 min a 80 ºC, seguido de filtração em papel de filtro qualitativo.

Em seguida, o filtrado foi evaporado em rotaevaporador até a secagem e

ressuspendido em 2 mL de solução hidroetanólica 50% (v/v) ou etanol/água 80%

(v/v). Esta solução final foi filtrada em membrana de 0,22 µm e colocada num vial.

Este método foi adaptado de Brindzová [42].

3.5.4. Métodos D1, D2 e D3- Extração hidroetanólica com variação

da temperatura

Amostras de 100 mg de cevada foram extraídas com 10 mL de

água:etanol 50 (% v/v) em agitação por 30 s em um vórtex, seguido do controle de

temperatura a 25°C (método D1), aquecimento a 50°C (método D2) ou a 100°C

66

(método D3) por 5 min. Os extratos foram centrifugados por 10 minutos a 5148 G.

Após a filtração em papel de filtro qualitativo e em membrana de 0,22 µm, os

filtrados foram colocados em vials e analisados por ESI(-)-MS/MS. Este método foi

adaptado de Inglett [41].

3.5.5. Método QuEChERS adaptado (versão acetato)

Preparou-se um slurry a partir de 10 g de cevada e 15 mL de água.

Adicionou-se gelo seco finamente moído em 10 g de slurry e 10 mL de acetonitrila

contendo ácido acético 1% (v/v). Homogeneizou-se em vórtex por 1 min.

Adicionaram-se, em seguida, 4 g de sulfato de magnésio com 1,7 g de acetato de

sódio. Centrifugou-se a 5148 G, por 8 min.

Retirou-se do sobrenadante (fase superior) uma alíquota de 8 mL e

transferiu-se para outro frasco. Colocou-se o frasco durante 5 min no gelo seco.

Adicionaram-se 500 mg de C18, 100 mg de PSA e 600 mg de sulfato de magnésio.

Agitou-se, por 1 min, em vórtex.

Centrifugou-se a 5148 G, por 8 min. Retirou-se do sobrenadante uma

alíquota de 4 mL, filtrou-se em filtro tipo seringa com 0,22 µm de espessura e

transferiu-se diretamente para um vial. Este método foi adaptado de Lehotay et al.;

Prestes, Bandeira e Núñez [67, 71, 73, 118]. Na Figura 9 encontram-se as etapas do

procedimento correspondentes ao método QuEChERS.

67

Figura 9: Fluxograma referente ao procedimento do método QuEChERS.

3.6. Caracterização dos extratos

3.6.1. Espectrometria de Massas - Infusão direta

Procedeu-se a análise dos diferentes extratos por meio da infusão direta

de soluções contendo 10 µL da amostra filtrada em 1 mL de ACN:H2O:ácido fórmico

80:19,9:0,1 (v/v/v) no espectrômetro de massas Waters, modelo Quattro Micro-API,

em uma vazão de 100 µL min-1. A caracterização foi realizada com ionização por

eletrospray no modo negativo (ESI(-)-MS), com voltagens de capilar e cone de 4,5

kV e 30 V respectivamente, utilizando N2 como gás de dessolvatação, a 400 °C, em

uma vazão de 800 L h-1 e no modo full scan, com varredura do espectro entre 150 e

1000 unidades de massa. Os picos de razão massa/ carga (m/z) de interesse foram

fragmentados a uma energia de colisão de 20 eV, utilizando-se argônio a 120 L h-1

68

como gás de colisão. Os dados foram analisados usando o software MassLynx

versão 4.1.

3.6.2. Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência acoplada à

Espectrometria de Massas Sequencial (UHPLC-MS/MS)

A otimização da análise cromatográfica empregando UHPLC-MS/MS foi

iniciada utilizando o monitoramento de íons no modofull scan, para localizar as

massasmolares dos compostos de interesse. Para a identificação e construção das

curvas analíticas foi empregado o modo SRM (do inglês, “selected reaction

monitoring”) e para a confirmação da presença dos compostos fenólicos na amostra,

foram monitoradas as transições m/z dos íons precursores e íons produtos.

A coluna cromatográfica empregada foi a Acquity UHPLC BEH C18 com

1,7 µm (50 × 2,1 mm d.i.) da Waters. As condições de análise otimizadas foram:

volume de injeção: 2 µL; vazão da fase móvel: 0,35 mL min-1; temperatura do forno

de 40 °C, eluição por gradiente: fase móvel A= H2O 0,1 % (v/v) ácido fórmico e B=

ACN 0,1% (v/v) ácido fórmico. Gradiente: 3% B por 1 min; 15% B em 4 min; 40% B

em 3 min; 3% B em 1 min. Adaptado de André [43]. A fase móvel foi utilizada em

uma vazão de 100 µL min-1. As análises foram realizadas com ionização por

eletrospray no modo negativo (ESI(-)-MS), com voltagens de capilar e cone de 4,5

kV e 30 V, respectivamente, utilizando N2 como gás de dessolvatação, a 400 °C, em

uma vazão de 800 L h-1 e varrendo-se (full scan) o espectro entre 150 e 1000

unidades de massa. Os picos de razão massa/ carga (m/z) de interesse foram

fragmentados a uma energia de colisão de 20 eV, utilizando-se argônio a 120 L h-1

como gás de colisão. Modo de Ionização: ESI(-) (ionização por eletrospray no modo

negativo, 30 kV).

3.7. Planejamento Experimental

Após verificar quais os métodos de extração clássicos (entre A e D) que

resultaram em maior quantidade de compostos fenólicos extraídos, foi feito um

69

planejamento experimental, a fim de otimizar as condições de extração. Para isso,

foi aplicado um planejamento fatorial completo com 3 fatores (Tabela 2) para os

métodos C3 (agitação magnética sob nitrogênio) e C4 (refluxo). Os fatores avaliados

foram modo de extração (agitação ou refluxo), temperatura (25 °C e 80 °C) e tempo

(10 e 90 min). Os valores de mínimo e máximo para os fatores temperatura e tempo

de extração foram escolhidos de acordo com a literatura sobre extração de

compostos fenólicos [17, 28]. O tratamento dos dados foi realizado no programa

Statistica 7.0.

Tabela 2: Ensaios para um planejamento fatorial 23 para otimização da extração de compostos fenólicos em cevada.

Ensaio* Temperatura (°C)

Tempo (min) Método

1 25 (-) 10 (-) agitação sob N2 2 80 (+) 10 (-) agitação sob N2 3 25 (-) 90 (+) agitação sob N2 4 80 (+) 90 (+) agitação sob N2 5 25 (-) 10 (-) refluxo 6 80 (+) 10 (-) refluxo 7 25 (-) 90 (+) refluxo 8 80 (+) 90 (+) refluxo

*Ensaios realizados em duplicata.

3.8. Validação dos métodos

A validação dos métodos foi feita de acordo com as recomendações da

Agência Brasileira de Vigilância Sanitária (ANVISA) [119] por meio das figuras de

mérito: seletividade, faixa linear, limite de detecção (LD), limite de quantificação

(LQ), exatidão (recuperação), precisão (inter-dias; intra-dia).

A seletividade foi avaliada pela comparação dos tempos de retenção,

massa molar e transições m/z do íon precursor e íons produtos dos analitos nos

extratos com relação aos padrões, pelo perfil dos espectros de massa dos analitos

nos extratos com relação aos padrões e pela fortificação das amostras para

construção da curva analítica.

A faixa de trabalho foi avaliada empregando-se o método de adição

padrão na matriz, ou seja, diferentes concentrações dos padrões foram adicionados

70

no extrato e também pelo método do padrão externo dissolvendo os padrões dos

compostos fenólicos em solvente (metanol). Injetaram-se, no sistema cromatográfico

2 µL das soluções, com concentrações variando entre 3-100 µg mL-1 e, 2 µL dos

extratos sem adição dos padrões. As injeções foram feitas em sete níveis de

concentrações e em triplicatas. A partir das áreas obtidas, foram construídas as

curvas analíticas. As linearidades dos métodos foram determinadas por meio da

regressão linear e obtiveram-se os coeficientes de regressão (a e b) e os

coeficientes de correlação. Também foram construídos os gráficos de resíduos para

verificar a qualidade da linearidade.

Os valores de limite de detecção (LDi) e limite de quantificação (LQi) do

instrumento foram alcançados a partir da transição dos íons de confirmação para

estimar a relação sinal/ruído (S/N), considerando 3 e 10 vezes, respectivamente, a

partir da adição dos padrões em solvente (metanol) O limite de quantificação do

método (LQm) foi determinado experimentalmente pela menor concentração do

extrato de cevada fortificado que alcançou recuperações entre 70 e 120% e com

RSD≤ 20%. A precisão foi avaliada em termos de repetitividade (precisão intra-dia) e

precisão intermediária (precisão inter-dia). A repetitividade foi expressa pelo

coeficiente de variação (CV) para 9 replicatas (3 níveis de fortificação, 3 repetições

cada um) realizados no mesmo dia. A precisão intermediária foi expressa pelo CV

para 9 replicatas (3 níveis de fortificação, 3 repetições cada um), realizados em dias

diferentes.

A avaliação da exatidão foi realizada pela obtenção da recuperação que

consiste na fortificação (spiking) da amostra antes da extração com concentração

conhecida do analito de interesse em três níveis distintos. A recuperação foi

calculada conforme a equação 6:

Cexperimental: é a concentração encontrada empregando a curva analítica

preparada com o extrato

Cteórica: é a concentração adicionada

71

Avaliou-se a eficiência de extração (EE) de acordo com Siqueira et al.

[120], realizando-se, em uma primeira etapa, a fortificação das amostras antes do

processo de extração e, em uma segunda etapa, a fortificação dos mesmos após o

processo de extração. A eficiência de extração foi calculada a partir da seguinte

equação:

O efeito matriz foi avaliado a partir do cálculo baseado na razão da

resposta analítica obtida no extrato final da amostra fortificada com solução

contendo os analitos de interesse, pela solução dos padrões sintéticos preparados

em solvente, na mesma concentração.

Avaliou-se o efeito matriz sobre o analito de acordo com a Equação 1.

3.9. Análise de amostras comerciais de cevada

Foram obtidas amostras de cevada de diferentes locais, comercializadas

nas seguintes cidades: A1: São Paulo, A2: Campinas, A3: Belo Horizonte, A4:

Florianópolis, A5: Curitiba, A6: Guarapuava e A7: Manaus.

Estas amostras de marcas diferentes foram analisadas empregando o

método QuEChERS.

72

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Avaliação das diferentes técnicas de extração

4.1.1.Identificação dos compostos fenólicos por ESI(-)-MS/MS

A avaliação dos diferentes métodos de extração para a identificação dos

compostos fenólicos em cevada foi realizada por meio da caracterização dos

extratos pela técnica de infusão direta no espectrômetro de massas, a qual teve

como objetivo a visualização dos perfis espectrométricos de composição de cada

extrato, buscando identificar possíveis flavonóides e ácidos fenólicos desprotonados

presentes nos mesmos, através das razões m/z [M-H]-, onde M representa a massa

da molécula avaliada. Mesmo na ausência da separação cromatográfica (como na

LC-MS/MS), esta análise permite a confirmação dos compostos fenólicos baseada

no perfil da fragmentação obtido para as moléculas a partir de seus padrões

comerciais. Inicialmente foram avaliados os modos de ionização positivo (ESI(+)-

MS/MS) e negativo (ESI(-)-MS/MS) utilizando a solução dos padrões dos compostos

fenólicos por meio da infusão direta. A ionização dos compostos fenólicos, em modo

negativo, apresentou melhor detectabilidade e, portanto, os espectros de massas

foram obtidos neste modo, produzindo uma molécula desprotonada [M-H]- [121]. Os

espectros de massasdos padrões de compostos fenólicos no modo negativo pode

ser visto nas Figuras de 10-16.

73

Figura 10: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z193 (ácido ferúlico) no padrão.

Figura 11: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p-cumárico) no padrão.

74

Figura 12: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289(catequina) no padrão.

Figura 13: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (epicatequina) no padrão.

75

Figura 14: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 179 (ácido cafeico) no padrão.

Figura 15: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 609 (rutina) no padrão.

76

Figura 16: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z167 (ácido vanílico) no padrão.

O perfil dos espectros de massas dos padrões foram comparados com os

espectros dos extratos, visando a identificação dos analitos presentes na cevada. A

identificação dos compostos fenólicos foi realizada no modo de monitoramento

seletivo de reações (SRM), que é um tipo de varredura que relaciona a

fragmentação de um íon precursor no triplo quadrupolo por MS1 aos seus

correspondentes íons produtos que passam por MS2.

Os extratos foram obtidos por diferentes métodos de extração a fim de

isolar os compostos fenólicos e, posteriormente, identificá-los. Diferentes

procedimentos foram avaliados para verificar quais condições seriam mais

adequadas para extrair os compostos fenólicos da cevada.

Um dos procedimentos avaliados foi a hidrólise ácida que envolve o

tratamento do extrato ou da matriz vegetal com soluções aquosas ou alcoólicas

contendo ácido, como HCl, submetidas à temperatura de 80°C, ou superior a esta

[28]. Para extração de compostos fenólicos em grãos, pode-se optar pelo

procedimento de hidrólise ácida ou hidrólise básica que é voltado para extração de

compostos fenólicos insolúveis (CFI). Os compostos fenólicos raramente estão

77

presentes nos vegetais em sua forma livre, mas comumente, apresentam-se em sua

forma glicosilada [46].

O método A utilizou hidrólise ácida no extrato de acetonitrila com adição

de ácido clorídrico 37% (v/v) e aquecimento a 80°C. A hidrólise ácida tem o objetivo

de quebrar a ligação entre o composto fenólico e a parte glicosídica transformando

todos os compostos fenólicos nas formas agliconas. Por outro lado, a hidrólise

básica pode quebrar as ligações do éster, removendo grupos ácidos que estão

ligados à parte glicosídica dos compostos fenólicos.

Em seguida o pH do extrato foi ajustado com NH4OH para que os

compostos fenólicos ficassem na forma desprotonada, favorável para análise dos

mesmos no modo negativo por meio da infusão direta. A Figura 18 mostra a

fragmentação obtida para o extrato A, indicando os fragmentos do ácido ferúlico.

Figura 17: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato A.

A molécula de ácido ferúlico (m/z 193) eliminou o dióxido de carbono (m/z

44) para formar íons de m/z 149. O fragmento m/z 178 corresponde à perda de um

grupo metila. Um dos picos mais abundante deste ácido (m/z 134) foi formado por

eliminação de dióxido de carbono (CO2) e um grupo metila.

Também foi avaliada a hidrólise básica no método B, consistindo no

tratamento dos resíduos da extração com solução de NaOH 2 mol L-1.

78

No entanto, não foram identificados compostos fenólicos nos resíduos

sólidos obtidos após extração com os métodos B1, B2 e B3. Provavelmente, os

compostos fenólicos foram extraídos antes da hidrólise, indicando que neste caso, a

extração com etanol, água ou a mistura etanólica são eficientes para a extração dos

compostos fenólicos. Outra possibilidade é que as condições de hidrólise

empregadas foram brandas.

Compostos fenólicos com alta polaridade, como alguns ácidos fenólicos

(ácido cafeico, ferúlico e clorogênico), podem não ser adequadamente extraídos

com solventes orgânicos puros, sendo que, normalmente, as soluções extratoras

consistem de solventes em diferentes frações aquosas [28, 122]. O solvente extrator

empregado no método C, etanol, já foi testado e avaliado como um dos mais

eficientes para a extração de compostos fenólicos em cevada [39, 42], sendo,

portanto, empregado neste trabalho, a mistura hidroetanólica 80%(v/v). Neste

procedimento foi avaliada a influência da atmosfera inerte durante o aquecimento,

uma vez que os compostos fenólicos podem ser degradados quando expostos ao

oxigênio do ambiente. Além da extração sob agitação, foi avaliada a extração

contínua pelo sistema de refluxo. Este tipo de extração foi testada por ser um

método eficiente e bem estabelecido na literatura para extração de compostos

fenólicos [117, 123]. Vale ressaltar que tanto nos métodos B quanto nos métodos C

foi adicionado hexano nos extratos, sob agitação magnética, para a remoção da

gordura para posterior etapa de extração com adição da mistura hidroetanólica. Esta

etapa de clean-up foi usada para minimizar os interferentes na análise

cromatográfica.

Para a identificação dos compostos fenólicos nos extratos, foram

avaliados os espectros de massas dos íons produto. Nos métodos C1 e C2 que

empregaram agitação magnética em chapa de aquecimento, foram identificados o

ácido ferúlico, ácido p-cumárico, catequina e epicatequina (Figuras 18- 24).

A molécula de ácido ferúlico (m/z 193) nos extratos C2 também eliminou o

dióxido de carbono (m/z 44) para formar íons de m/z 149. O fragmento m/z 178

corresponde à perda de um grupo metila. O pico mais abundante deste ácido (m/z

134) foi formado por eliminação de dióxido de carbono (CO2) e um grupo metila.

79

Figura 18: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato C1.

. Figura 19: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato C2.

80

O ácido p-cumárico se ioniza no modo negativo gerando os principais

fragmentos de m/z 119 e m/z 93 (Figura 20 e 21).

Figura 20: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p cumárico) no extrato C1.

Figura 21: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p cumárico) no extrato C2 .

81

Já a catequina produziu a molécula desprotonada [M-H]- (m/z 289) e

perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245), de acordo com Perez-Magarino et al.

[124].

Figura 22: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (catequina) no extrato C1.


82

A catequina e epicatequina são considerados isômeros, portanto

possuem a mesma massa molar. O que difere uma molécula de outra é o desvio da

luz polarizada na posição da hidroxila no sentido S, levógero (anti-horário) e no

sentido R, destrógiro (horário). Portanto, estes isômeros apresentam os mesmos

fragmentos.

A epicatequina também produziu a molécula desprotonada [M-H]- (m/z

289) e a perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245) [124].

Figura 24: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (epicatequina) no extrato C2.

Pelo método C3, o qual diferiu dos métodos C1 e C2 devido a utilização

de uma manta de aquecimento sob atmosfera inerte (gás nitrogênio), foram

identificados os mesmos compostos: ácido ferúlico, ácido p-cumárico, catequina e

epicatequina, e mais o ácido cafeico. Já no método C4 que utilizou sistema de

refluxo, foram identificados os ácidos cafeico, ácido p-cumárico, catequina,

epicatequina, além da rutina e ácido vanílico (Figuras 25-35).

Nas Figuras 25 a 35 são apresentados os espectros de identificação dos

extratos C3 e C4.

83

Figura 25: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato C3.

O espectro de massas do ácido cafeico (Figuras 26 e 27) desprotonado

(m/z 179) produziu um pico com m/z 135, devido à perda de CO2, mas sem outros

fragmentos abundantes.

Nas Figuras 28 e 29, a catequina produziu a molécula desprotonada [M-

H]- (m/z 289) e perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245), de acordo com Perez-

Margarino et al. [124].

84

Figura 26: Espectro de massasde ESI(-)-MS/MS do íon m/z 179 (ácido cafeico) no extrato C3.

Figura 27: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 179 (ácido cafeico) no do extrato C4.

85



86



A epicatequina também produziu a molécula desprotonada [M-H]- (m/z

289) e a perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245) (Figuras 30 e 31). O ácido p-

87

cumárico se ioniza no modo negativo gerando o principal fragmento de m/z 119. Os

espectros para os métodos C3 e C4 podem ser vistos nas Figuras 32 e 33.

Figura 32: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p-cumárico) no extrato C3.

Figura 33: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p-cumárico) no extrato C4.

Para flavonóis O-glicosilados, tais como rutina, o espectro gerado mostrou

a molécula desprotonada [M-H-] do glicosídeo e o íon correspondente à aglicona

desprotonada (a-H)-. Assim, para a rutina (Figura 34) foi observada a perda da

unidade de ramnose-glucose (m/z 301) [125].

88

Figura 34: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 609 (rutina) no extrato C4.

Figura 35: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 167 (ácido vanílico) no extrato C4.

Para o ácido vanílico são gerados os principais fragmentos m/z 152>m/z

108 conforme a Figura 35.

89

Na Tabela 3 são apresentados os compostos fenólicos identificados nos

diferentes extratos.

Tabela 3: Presença de compostos fenólicos em diferentes extratos.

A partir da quantidade de compostos fenólicos identificados nos extratos,

selecionaram-se os métodos C3 e C4 para otimização dos parâmetros de extração

uma vez que estes métodos indicaram um maior número de compostos

identificados.

4.1.2. Determinação das condições cromatográficas e

espectrométricas por UHPLC-MS/MS

Após a identificação dos compostos fenólicos pela técnica de ESI-MS/MS,

optou-se em fazer também a identificação e quantificação pela técnica de UHPLC-

MS/MS, devido à possibilidade de separação prévia dos compostos antes da

ionização no espectrômetro de massas.

Para isto, primeiramente fez-se a otimização das condições

cromatográficas e espectrométricas para os analitos ácido cafeico, ácido

clorogênico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido protocatecóico, ácido sinápico,

ácido vanílico, catequina, epicatequina, miricetina e rutina.

90

Inicialmente, foram otimizados os parâmetros da fonte de ionização do

espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo a fim de se conseguir o melhor

sinal (maior detectabilidade) do íon molecular e de dois íons produtos mais

abundantes de cada composto fenólico, através da infusão dos mesmos em solução,

diretamente no espectrômetro de massas. Neste tipo de analisador os íons

moleculares são fragmentados, obtendo-se as transições de quantificação e

confirmação, recomendadas para uma determinação analítica empregando

espectrometria de massas.

A infusão consistiu no bombeamento de soluções de compostos fenólicos

a 5 mg L-1 em metanol, na vazão de 50 µL min-1, combinada com os solventes

auxiliares acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (v/v) : água com ácido fórmico 0,1%

(v/v) (50:50) na vazão de 0,1 mL min-1.

Para o modo de ionização, foram avaliados o modo positivo e o modo

negativo. Os testes em ambos os modos de ionização consistiram em aplicar

diferentes voltagens do cone com o objetivo de obter o espectro com melhor

ionização e maior intensidade dos analitos. Foi realizada uma varredura da voltagem

do cone de 10 V a 60 V.

Com a utilização de ESI no modo positivo, apenas 4 analitos foram

capazes de sofrer ionização, obtendo as melhores intensidades de sinal com as

respectivas voltagens: ácido protocatecóico, 10 V; catequina ou epicatequina, 60 V;

miricetina e rutina, 60 V, conforme mostra a Figura 36.

91

Figura 36: ESI no modo positivo dos íons precursores da mistura contendo 11 padrões de compostos fenólicos com voltagens do cone avaliadas em (A) 60, (B) 45, (C) 30, (D) 20, (E) 10 V.

Os analitos investigados no modo de ionização positivo com suas

respectivas razões m/z estão apresentados na Tabela 4. Para tal investigação,

foram identificados apenas o ácido protocatecóico, catequina ou epicatequina,

miricetina e rutina.

A Figura 37 representa os espectros obtidos por ESI no modo negativo da

mistura de compostos fenólicos com voltagem do cone avaliada em 30 V. Foram

avaliadas todas as voltagens de 10 a 60 V, sendo que a melhor voltagem para

avaliação dos compostos fenólicos estudados foi fixada em 30 V.

92

Tabela 4: Compostos fenólicos analisados com ionização no modo positivo.

Substância [M+H]+

(m/z) Ácido cafeico 181

Ácido clorogênico 355 Ácido ferúlico 195

Ácido p-cumárico 165 Ácido protocatecóico 183

Ácido sinápico 225 Ácido vanílico 169

Catequina 291 Epicatequina 291

Miricetina 319 Rutina 611

Como os compostos fenólicos apresentam os grupos ácidos carboxílicos

em sua estrutura química, estes podem se dissociar de acordo com a variação nos

valores de pH da fase móvel [39, 43].

Figura 37: Espectro de massas obtido por ESI no modo negativo da mistura contendo 11 padrões de compostos fenólicos com voltagem do cone avaliada em 30 V.

A escolha pelo modo negativo de análise ocorreu pois os 11 analitos

investigados foram ionizados neste modo (Figura 37) enquanto que no modo

93

positivo apenas 4 analitos foram capazes de sofrer ionização (Figura 36).As

condições otimizadas da fonte do espectrômetro de massas podem ser verificadas

na Tabela 5.

Tabela 5: Melhores condições de operação do espectrômetro de massas para a análise dos compostos fenólicos.

Parâmetros Condição

Modo de ionização negativo

Capilar (kV) 4,5

Temperatura da Fonte (°C) 120

Temperatura de Dessolvatação (°C) 400

Vazão do gás no Cone (L h-1) 900

Vazão do gás de dessolvatação (L h-1) 30

Multiplier 650

Pressão na cela de Colisão (mbar) 2,43 × 10-3

Na Tabela 6 estão apresentados os íons precursores [M-H]– selecionados

para obtenção das transições SRM, os íons produto, a voltagem do cone e energia

de colisão (CE) para as análises dos compostos fenólicos utilizados neste trabalho.

Tabela 6: Parâmetros do espectrômetro de massas para a análise dos compostos fenólicos.

Substância Íon precursor (m/z)

Íons produto (m/z)

Voltagem do cone (V)

Energia de Colisão (eV)

Ácido cafeico 179 117 135

35 35 15

Ácido clorogênico 353 85 191

30 45 15

Ácido ferúlico 193 134 178

30 15 10

Ácido p-cumárico 163 52 119

30 35 15

Ácido protocatecóico

181 108 153

40 20 15

Ácido sinápico 223 149 164

30 20 15

Ácido vanílico 167 123 152

30 10 15

Catequina 289 123 245

35 30 15

Epicatequina 289 109 245

35 15 25

Miricetina 317 151 179

45 25 20

Rutina 609 271 300

60 50 40

* As transições em negrito referem-se aos íons de quantificação

Na etapa seguinte, após o estabelecimento das condições

espectrométricas, realizou-se a otimização da separação cromatográfica. No UHPLC

94

foram testados os tipos de eluição isocrático e gradiente, diferentes tipos de

solventes e proporções de fase móvel, como solventes orgânicos (metanol e

acetonitrila, tanto acidificados com 0,1 % (v/v) de ácido fórmico, como não

acidificados) e solventes aquosos (ácido fórmico 0,1% (v/v) e tampão formiato de

amônio ou NH4OH em 0,025% (v/v).

Foi avaliada também a fase móvel acetonitrila com ácido fórmico 0,1%

(v/v): água com hidróxido de amônio 0,1% (v/v) [50:50, v/v] na vazão de 0,1 mL min-1

onde foi observada uma pronunciada diminuição da intensidade do sinal dos

analitos, mostrando a inviabilidade do uso desse tipo de fase móvel comparado à

anterior que utilizou os solventes auxiliares acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (v/v)

: água com ácido fórmico 0,1% (v/v) (50:50) na vazão de 0,1 mL min-1.

Os testes de diferentes condições cromatográficas, utilizando diferentes

combinações de fase móvel, estão apresentados nas Figuras 38 e 39. Na Figura 38,

os cromatogramas foram obtidos com a ionização no modo negativo e os solventes

auxiliares acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (v/v): água com ácido fórmico 0,1%

(v/v); [50:50, v/v]. Já na Figura 39 foram utilizados os solventes aquosos com ácido

fórmico 0,1% (v/v) e tampão formiato de amônio ou NH4OH em 0,025% (v/v) como

fase móvel.

A separação dos analitos foi alcançada em fase reversa. Este tipo de

separação se deve principalmente a interações entre a parte apolar do soluto e a

fase estacionária, isto é, à repulsão desta parte do soluto pela fase móvel aquosa.

Assim, os compostos fenólicos são bem separados com fase móvel contendo

acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (v/v): água com ácido fórmico 0,1% (v/v); [50:50,

(v/v)]. Com o uso do meio ácido na fase móvel, os compostos fenólicos encontram-

se na sua forma protonada (molecular), que favorece a retenção dos mesmos em

fase reversa. Por outro lado, quando foi utilizada a fase móvel contendo solventes

aquosos com ácido fórmico 0,1% (v/v) e tampão formiato de amônio ou NH4OH em

0,025% (v/v), a retenção dos compostos foi praticamente nula, pois os mesmos

ficaram ionizados (desprotonados) em meio básico, minimizando a interação com a

fase estacionária do tipo C18.

95

Figura 38: Cromatogramas de íons totais no modo SRM da mistura contendo 11 padrões a 3 µg mL-1 usando ESI no modo negativo. Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 μm (50 ×2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O 0,1% (v/v) ácido fórmico e B= ACN 0,1% (v/v) ácido fórmico. Gradiente: 3% B por 1 min; 15% B em 4 min; 40% em 3 min; 3% B em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI(-)(ionização por eletrospray no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL.

96

Figura 39: Cromatogramas de íons totais no modo SRM da mistura contendo 11 padrões a 3 µg mL-1 com ESI no modo negativo com adição de NH4OH 0,025%(v/v).Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 μm (50 ×2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,025%NH4OH) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 15% B em 4 min; 40% B em 3 min; 3% B em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL.

97

Pela observação dos cromatogramas, os gradientes que proporcionaram

melhor linha de base dos picos cromatográficos e melhor separação foram aqueles

onde se utilizou como fase móvel água acidificada combinada com acetonitrila

acidificada.

Foram avaliados diferentes programas de gradiente e o mais promissor foi

o gradiente adaptado de Andre [43]. O gradiente de eluição foi composto por 3% B

por 1 min; 15% B em 4 min; 40% B em 3 min; 3% B em 1 min. Neste programa, foi

possível alcançar a separação da maioria dos compostos fenólicos estudados e a

identificação de todos analitos num tempo de retenção menor que 6 minutos.

Pela avaliação e comparação das Figuras 38 e 39, os cromatogramas

comprovam que a maior resolução para a maioria dos analitos foi alcançada com o

uso da fase móvel A contendo água com ácido fórmico 0,1% (v/v): fase móvel B

contendo acetonitrila com ácido fórmico 0,1% 50:50 (v/v), no modo de ionização

negativo.

Já a adição de NH4OH 0,025% (v/v) na fase móvel diminui a intensidade e

resolução dos analitos, além de prejudicar a linha de base dos mesmos e causar

coeluição de picos.

É importante destacar que devido à alta seletividade do espectrômetro do

tipo triplo quadrupolo, quando o mesmo é utilizado no modo de aquisição SRM, é

possível identificar os compostos fenólicos sem a necessidade de separá-los

completamente; os analitos podem coeluir sem causar problemas de interferência

pois os mesmos são identificados individualmente, em canais isolados.

Na Figura 40 pode ser visualizado o cromatograma de íons totais,

adquiridos em canais distintos de aquisição, no modo SRM, nas quais foram

analisadas as transições de quantificação e confirmação, de uma mistura contendo

todos os compostos fenólicos.

98

Figura 40: Cromatograma de íons totais da mistura padrão dos compostos fenólicos presentes numa solução de 50 µg mL-1 em metanol e determinação por UHPLC-MS/MS em 11 canais de aquisição, no modo SRM. Identificação dos picos: A e B: Catequina e Epicatequina; C: ácido clorogênico; D: ácido vanílico; E: ácido cafeico; F: ácido p-cumárico; G: ácido ferúlico; H: ácido sinápico; I: rutina; J: ácido protocatecóico e L: miricetina.

Portanto, para a avaliação dos diferentes extratos de cevada para fins de

identificação e quantificação utilizaram-se as condições otimizadas com fase móvel

A contendo água com ácido fórmico 0,1% (v/v): fase móvel B contendo acetonitrila

com ácido fórmico 0,1% 50:50 (v/v), no modo de ionização negativo.

4.1.3. Identificação dos diferentes extratos por UHPLC-MS/MS

Após a otimização das condições de análise por UHPLC-MS/MS, os

diferentes extratos de cevada foram analisados novamente para confirmação da

identificação dos compostos fenólicos. Na Figura 41 verifica-se a identificação do

ácido ferúlico no extrato A, que foi submetido à hidrólise ácida. Todos os demais

extratos foram analisados seguindo as condições cromatográficas descritas na

Figura 41.

99

Figura 41: Cromatogramadeidentificação do ácido ferúlico no extrato A. Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1,7 μm (50 × 2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,1% (v/v) ácido fórmico) e B= ACN (0,1% (v/v) ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 15% B em 4 min; 40% B em 3 min; 3% B em 1 min adiquiridos em canais de aquisição no modo SRM. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-(ionização por eletrospray no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL.

Nos resíduos dos extratos do método B que passaram pela hidrólise

básica também não foram encontrados compostos fenólicos pela técnica de UHPLC-

MS/MS, assim como por ESI(-)-MS/MS.

Na Figura 42 estão os cromatogramas de identificação dos ácidos

ferúlico, p-cumárico e cafeico, além de catequina e epicatequina obtidos do extrato

C1, que empregou agitação magnética em chapa de aquecimento. Ao empregar

ESI(-)-MS/MS foram identificados apenas os ácidos ferúlico, p-cumárico e catequina.

Figura 42: Cromatogramas dosácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico; catequina e epicatequina obtidos para o extrato C1. Condições cromatográficas idem asda Figura 41.

100

Nas Figuras 43 e 44 estão os cromatogramas de identificação dos extratos C2

e C3, respectivamente, sendo este último realizado em atmosfera de nitrogênio.

Foram identificados os ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico, catequina e

epicatequina. Todos os analitos dos extratos C2 e C3 também foram identificados

por ESI(-)-MS/MS, exceto o ácido cafeico no extrato C2.

Figura 43: Cromatogramas dos ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico; catequina e epicatequina no extrato C2. Condições cromatográficas idem asda Figura 41.

101

Figura 44: Cromatogramas dosácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico; catequina e epicatequina no extrato C3. Condições cromatográficas idem asda Figura 41.

Já os compostos identificados por UHPLC-MS/MS do extrato C4 sob

refluxo, são mostrados na Figura 45.

102

Figura 45: Cromatogramas do extrato C4 otimizado com ESI no modo negativo. Condições cromatográficas idem as da Figura 41.

Os mesmos compostos foram identificados nestes extratos na

carcterização por ESI(-)-MS/MS.

103

4.2. Otimização das extrações

Os métodos de extração que tiveram maior quantidade de compostos

fenólicos extraídos foram selecionados para otimizar as condições de extração. Foi

escolhido o método de extração que empregou agitação magnética em manta de

aquecimento sob nitrogênio (C3) e o método de extração sob refluxo (C4). Foi

aplicado um planejamento fatorial e as respostas eram as áreas dos picos obtidos

nos cromatogramas constituídos apenas pelos íons de interesse, que foram obtidos

pelo monitoramento dos íons selecionados, ajustando-se o espectrômetro de

massas para que fossem observados apenas os íons de razão m/z de interesse. As

variáveis escolhidas para otimização foram técnica de extração, temperatura e

tempo de extração.

As Figuras 46 e 47 mostram as superfícies de resposta obtidas para a

epicatequina e catequina para os seguintes fatores: tempo de extração ×

temperatura; técnica de extração × temperatura; técnica de extração × tempo.

Para os analitos catequina e epicatequina, a técnica de extração usando

agitação magnética sob nitrogênio mostrou maiores resultados de área, que a

extração sob refluxo, como pode ser visto nas Figuras 46B, 46C, 47B e 47C.

104

Figura 46: Superfícies de resposta para a epicatequina dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para a epicatequina.

106

Figura 47: Superfícies de resposta para a catequina dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para a catequina.

Para os analitos ácido cafeico e ácido ferúlico, a extração em sistema de

refluxo (método C4) mostrou maiores valores de área dos picos. As superfícies de

resposta indicaram que a variável 1 (temperatura de extração) é a mais significativa

quando comparada com as outras variáveis de acordo com as Figuras48 A e 48 B;

49 A e 49 B.

108

Figura 48: Superfícies de respostas para o ácido cafeico dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para o ácido cafeico.

Também foi possível concluir que a variável 2 (tempo) mais adequadofoi

de 90 min; no entanto, essa variável é pouco significativa quando comparada com a

variável 1 (Temperatura °C), como pode ser visto na Figura 49C.

110

Figura 49: Superfícies de respostas para o ácido ferúlico dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para o ácido ferúlico.

Para analitos como o ácido p-cumárico, a extração realizada em manta de

aquecimento ou por refluxo não sofreu alteração em termos de aumento nas áreas

dos picos assim como o tempo de extração, como pode ser observado na Figura

50B e Figura 50C, sendo considerada significativa apenas a variável 1 (Temperatura

°C), conforme a Figura 50A e Figura 50B.

112

Figura 50: Superfícies de respostas para o ácido p-cumárico dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para o ácido p-cumárico.

Para os analitos ácido protocatecóico, ácido clorogênico, ácido vanílico,

ácido sinápico, miricetina e rutina, não foram obtidas as superfícies de resposta, pois

os valores de área foram muito baixos.

Dentre as superfícies de respostas apresentadas, notou-se que a variável

1 (Temperatura) é a mais significativa quando comparada com as outras variáveis e

a temperatura ótima para extração dos compostos fenólicos foi de 80°C. A variável 2

(tempo) conforme visto nas Figuras 46, 48, 49 e 50 também foi significativa e a

condição mais favorável foi um período de extração de 90 min.

A partir da avaliação da superfície de resposta dos analitos foi possível

estabelecer as condições otimizadas de extração para determinação de compostos

fenólicos em cevada. Como a técnica de extração não foi significativa para a maioria

dos analitos avaliados, escolheu-se a extração em sistema de refluxo, por ser um

método comumente usado para extração deste tipo de compostos [9, 43, 39,123].

Assim, a temperatura escolhida foi de 80 °C e o tempo de extração foi de 90 min.

113

4.3. Quantificação dos compostos fenólicos pelo método otimizado

4.3.1. Validação do método otimizado

Após a otimização das condições de extração, o método foi validado

seguindo as figuras de mérito de acordo com os critérios descritos pela ANVISA [93].

A amostras de cevada utilizada nesta etapa foi da cultivar BRS Lagoa 225.

A seletividade do método foi avaliada para algumas amostras de cevada

(extratos de cevada com fortificação) que foram injetadas para monitorar, através

das janelas de aquisição, os cromatogramas dos analitos individualmente sem a

necessidade de separá-los completamente, pois os analitos podem coeluírem sem

causar problemas de interferência no modo de aquisição SRM, conforme visto na

Figura 40. Esse monitoramento foi realizado para verificar se nos tempos de

retenção correspondentes aos compostos fenólicos estudados havia a coeluição de

interferentes da matriz. Os cromatogramas do extrato fortificado a 3 µg mL-1 são

observados na Figura 51, que ilustra a seletividade do método, embora haja

coeluição de alguns picos no extrato fortificado.

Os resultados mostrados na Figura 51 mostram que mesmo na presença

da matriz, não foram encontrados sinal de falso positivo, ou seja, o sinal obtido é

gerado apenas pelos compostos fenólicos, e não por interferentes provenientes das

matrizes. Dessa forma, o método é considerado seletivo.

De acordo com a Tabela 6, foram selecionadas as transições entre o íon

precursor e o respectivo íon produto de maior intensidade dos compostos fenólicos

estudados, para que pudesse ser realizada a identificação e a quantificação destes

compostos fenólicos com base nestas transições. Todos os compostos fenólicos

estudados neste trabalho apresentaram íons precursores, assim como íons produtos

distintos uns dos outros, o que assegura seletividade ao método.

114

Figura 51: Cromatogramas obtidos por UHPLC-MS/MS para separação da mistura de compostos fenólicos do extrato C4 fortificado (3 µg mL-1).Condições cromatográficas idem as da Figura 41.

115

Outra forma de verificar se o método de análise com detecção por MS/MS

é seletivo, é analisando se os espectros de massas obtidos pela janela de retenção

de cada um dos compostos fenólicos estudados apresentam intensidade de 100%

para os íons produto monitorados, o que também comprovou a seletividade do

método [111].

O coeficiente de determinação (r2) e a faixa linear foram determinados

pela obtenção das curvas analíticas (0,3 até 50 µg mL-1) preparadas pelas soluções

dos compostos (padrões) em solvente (metanol) e também na matriz.

A curva analítica preparada com os compostos na matriz foi comparada

com as curvas preparadas em solvente. Avaliou-se a detectabilidade ou inclinação

da curva analítica obtida para os dois tipos de curvas.

Pela Figura 52, pode-se analisar os comportamentos dos compostos

fenólicos nos extratos e em solvente. Verificou-se três comportamentos distintos dos

compostos fenólicos encontrados em cevada. Alguns analitos, catequina e ácido

cafeico, apresentaram grande efeito matriz, uma vez que a curva preparada em

solvente puro mostrou sensibilidade bem menor em relação às curvas preparadas

no extrato (cevada). Outros compostos apresentaram pequeno efeito matriz, como o

ácido p-cumárico e ácido protocatecóico, uma vez que a curva preparada em

solvente puro e a preparada na matriz com fortificação tiveram comportamentos

muito semelhantes. O composto fenólico que praticamente não apresentou efeito

matriz foi a miricetina, pois as curvas analíticas tiveram comportamentos

semelhantes.

A avaliação do efeito matriz foi realizada comparando as áreas obtidas

em duas curvas analíticas nos mesmos pontos, uma no extrato de cevada e outra no

solvente, empregando a Equação 1.

A obtenção de valores negativos indicam a supressão de sinais da matriz,

enquanto que resultados positivos mostram o aumento do sinal devido à matriz [108,

126].

Quando as variações nas respostas do detector entre o extrato fortificado

e a solução dos padrões em solventes, ambos na mesma concentração, for < ±20%

considera-se que há um leve efeito matriz. As concentraçõesusadas nas

fortificações foram de 1 µg g-1, 3 µg g-1 e 6 µg g-1. Valores superiores a ± 20%

apontam que o efeito matriz é significativo e ele pode ser causado por supressão de

116

ionização, conduzindo à perda de sinal, ou acréscimo de ionização, que resulta em

um ganho de sinal analítico [108].

117

Figura 52: Curvas analíticas preparadas em solvente e na matriz pelo método de extração em refluxo. A: catequina, B: ácido cafeico, C: ácido p-cumárico, D: ácido protocatecóico, E: miricetina, F: ácido clorogênico, G: rutina, H: ácido sinápico, I: epicatequina, J: ácido ferúlico e K: ácido vanílico.

118

Pelo efeito matriz concluiu-se que a curva analítica não pode ser

construída somente no solvente, pois apresentou respostas do detector entre o

extrato fortificado e a solução dos padrões em solventes, ambos na mesma

concentração, com variação > ± 20%, considerando, portanto, que há um efeito

matriz relevante [109].Os valores do efeito matriz (%) para cada composto fenólico

estão representados na Figura 53.

Figura 53: Efeito matriz (%) para os compostos fenólicos em cevada usando UHPLC-MS/MS. (1) catequina; (2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido vanílico; (5) ácido cafeico; (6) ácido p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico; (9) rutina; (10) ácido protocatecóico; (11) miricetina.

Portanto, para garantir um comportamento semelhante entre a curva e as

amostras analisadas, optou-se pela construção da curva com os compostos

fenólicos fortificados no extrato. Destaca-se que para os analitos catequina e

epicatequinafoi feita uma diluição de 5 vezes nos extratos de cevada, após a etapa

da extração, para a construção das curvas analíticas com o objetivo de alcançar

respostas dentro de uma faixa linear.

Tão importante como avaliar o percentual do efeito matriz é examinar

cuidadosamente os resíduos deixados pelo modelo. Num modelo bem ajustado,

esses resíduos devem dar a impressão de terem sido produzidos por uma

distribuição normal, ou melhor, não devem apresentar nenhum indício de

anormalidade.

119

Osresíduos da regressão linear obtida para os analitos correspondentes à

curva analítica construída na matriz podem ser vistos na Figura 54.

Os resultados enquadram-se em três possibilidades. O primeiro caso

mostra a situação ideal, em que o modelo está bem ajustado: os resíduos estão

distribuídos aleatoriamente, e não há nada que indique que sua variância não é

constante. Esta situação ocorreu para os ácidos ferúlico, vanílico e sinápico.

Já nos ácidos p-cumárico, protocatecóico, clorogênico e para a miricetina

embora a distribuição continue aleatória, pode-se perceber que os resíduos crescem

com o aumento do valor da concentração. Para a rutina e epicatequina houve a

maior evidência do terceiro caso com o aparecimento de uma estrutura não

aleatória, de aspecto curvilíneo. Os resíduos são menores nas extremidades da

faixa de calibração, e maiores na região intermediária. A catequina foi uma exceção

aos modelos de resíduos apresentados com indício de anormalidade em

concentrações baixas.

Ácido p-cumárico


Ácido clorogênico

120

Ácido cafeico

Ácido ferúlico

Miricetina

Rutina

Ácido vanílico

121

Ácido sinápico

Catequina

Epicatequina

Figura 54: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz.

A exatidão foi avaliada experimentalmente pela recuperação através da

fortificação dos extratos em 1, 3 e 6 µg g-1 em quintuplicata, resultando num total de

15 determinações. A recuperação R (%) foi avaliada por meio da comparação do

sinal analítico dos compostos com o sinal analítico das soluções dos compostos

fenólicos antes da extração e todos os valores estiveram entre 70 e 120%. Esse

parâmetro foi obtido pelas injeções de cinco amostras, em três níveis de fortificação,

e os resultados estão na Tabela 6.

A precisão foi avaliada em termos de repetitividade e da precisão

intermediária. A repetitividade foi obtida pela média de três injeções feitas em três

níveis de fortificações e em quintuplicatas. A precisão intermediária foi avaliada

realizando-se ensaios em 3 dias consecutivos e variou entre 2,3 e 19,2 %, que estão

dentro dos valores estabelecidos pela ANVISA, que são abaixo de 20% [119].

122

Os parâmetros da validação estão na Tabela 7.

Tabela 7: Figuras de mérito para a validação do método de extração otimizado. LQm: Limite de quantificação do método. LQi: Limite de quantificação do instrumento.

Composto

Linearidade

(mg L-1)

LQm

(µg kg-1)

LQi (mg L-1)

r2

Precisão

intermediária CV (%)

Recuperação (% ± CV)

1 µg g-1

3 µg g-1

6 µg g-1

Ácido p-cumárico

0,3-10 0,3 0,01 0,9874 12,8 103±2 107± 3 115 ±2


0,3-10 27,6 0,2 0,9835 2,5 91 ± 4 97 ±1 102 ±7

Catequina

0,3-50 89,3 0,3 0,9944 4,2 87± 5 81± 6 92± 8

Ácido clorogênico

0,3-10 11,6 0,3 0,9942 13,7 94 ±6 101±2 102 ±6

Ácido cafeico

0,3-10 74,6 0,3 0,9979 3,2 111±8 91±3 112 ±2

Ácido ferúlico

0,3-10 29,9 0,3 0,9930 3,4 119± 8 111±6 103± 9

Miricetina

0,3-10 3,3 0,25 0,9893 16,9 101±2 106± 4 97± 4

Epicatequina

0,3-50 95,7 0,3 0,9905 2,3 92± 8 78± 7 82 ± 6

Rutina

0,3-10 2,9 0,1 0,9817 12,7 98±2 96±2 108±7

Ácido vanílico

0,3-10 127,6 0,3 0,9908 18,4 119±11 90±17 96±9

Ácido sinápico

0,3-10 48,2 0,25 0,9806 19,2 94±6 95±4 106±8

* n= 5 replicatas

4.3. 2. Quantificação dos compostos fenólicos

As concentrações dos analitos foram determinadas na amostra de cevada

e os resultados estão indicados na Tabela 8.

Alguns trabalhos na literatura têm citado a identificação dos ácidos

ferúlico, p-cumárico e vanílico em grãos de cevada, no entanto, o ácido ferúlico

normalmente é mais abundante e o ácido p-cumárico encontra-se num elevado nível

de concentração [122]. Maillard & Berset [58] encontraram 411,78 µg g-1para o ácido

ferúlico e 176,05 µg g-1 para o ácido p-cumárico em grãos de cevada. Hao & Beta

[49] determinaram 58,6µg g-1 de ácido vanílico, 2279 µg g-1 de ácido ferúlico e 1365

µg g-1 de ácido p-cumárico em cascas de cevada.

123

Tabela 8: Concentração dos compostos fenólicos na amostra de cevada BRS lagoa 225.

Substância Concentração

(µg g-1) ± CV(%)

Ácido p- cumárico 116,7 ± 5

Ácido protocatecóico n.d ±

Catequina 9170 ± 8

Ácido clorogênico n.d

Ácido cafeico 716,7 ± 13

Ácido ferúlico 649 ± 6

Miricetina n.d

Epicatequina 8163,3 ± 12

Rutina 143,3 ± 9

Ácido vanílico 650 ± 7

Ácido sinápico n.d

* n.d = não detectado

Zhao et al. [48] determinaram 56,15 µg g-1 para catequina, 12,45 µg g-1

para epicatequina, 12,05 µg g-1 para o ácido ferúlico e 1,78 µg g-1 para o ácido p-

cumárico em grãos de cevada.Bezerra [9] avaliou diferentes cultivares e destacou-se

a determinação de 334,5 µg g-1 para a rutina e 50,5 µg g-1 para o ácido cafeico.

Bezerra [39] também avaliou a quantificação de compostos fenólicos em diferentes

cultivares entre os anos 2008 até 2010. Os valores variaram de 1320,0 µg g-1 para

484,6 µg g-1 correspondentes ao ácido p-cumárico e de 260,8 µg g-1 para 316,5 µg g-

1 correspondentes ao ácido ferúlico nos respectivos anos. Com base na Tabela 7,

notou-se que as concentrações da catequina e epicatequina foram as mais elevadas

nas amostras avaliadas neste trabalho, dentre todos os analitos. Já os ácidos

protocatecóico e clorogênico tiveram as concentrações mais baixas. Os resultados

foram apresentados considerando a matéria seca para a determinação das

concentrações.

4.4. Eficiência de extração

Na Tabela 9 os valores de eficiência de extração variaram de 84,1 a 99,8%.

124

Tabela 9:Eficiência de extraçãodos compostos fenólicos no método por refluxo.

4.5. Método QuEChERS

O método QuEChERS foi empregado neste trabalho na tentativa de se

obterem extratos mais limpos, com boa recuperação para os compostos fenólicos e

para se avaliar a aplicabilidade do método para estes compostos, uma vez que

normalmente o método QuEChERS é empregado para extração de agrotóxicos.

Os métodos QuEChERS original e modificado (versão acetato) foram

avaliados para determinação de compostos fenólicos em cevada. Os resultados

mostraram melhores recuperações dos analitos para o método QuEChERS

modificado (versão acetato), sendo este o escolhido para o processo de validação

analítica. O método QuEChERS versão acetato tem sido adequado para a extração

de agrotóxicos em matrizes gordurosas tais como o abacate, leite e carne bovina

[73]. Como a cevada trata-se de um cereal com um considerável teor de gordura

(6,4%), o método QuEChERS versão acetato foi escolhido na tentativa de alcançar

melhores resultados nas figuras de mérito do que os métodos de extração

convencionais.

A amostra de cevada utilizada nesta etapa foi da cultivar BRS lagoa

26612.

Composto

Eficiência de extração (%)

Ácido p-cumárico

86,7


99,8

Catequina 98,5 Ácido clorogênico

99,7

Ácido cafeico 98,8 Ácido ferúlico 84,1 Miricetina 96,5 Epicatequina 99,2 Rutina 93,1 Ácido vanílico 98,0 Ácido sinápico 84,1

125

4.5.1. Validação do Método QuEChERS

A seletividade do método foi avaliada para algumas amostras de cevada

(extratos de cevada com fortificação) que foram injetadas para monitorar, através

das janelas de aquisição, os cromatogramas dos analitos individualmente sem a

necessidade de separá-los completamente. Na Figura 55 estão os cromatogramas

do extrato obtido utilizando-se o método QuEChERS para a amostra fortificada. O

cromatograma de cada composto fenólico foi obtido no canal correspondente à sua

transição.

126

Figura 55: Cromatogramas do extrato fortificado com 3 µg mL-1 obtidos pelo método QuEChERS.

Neste método foi feita uma diluição de 5 vezes nos extratos de cevada

após a etapa de extração a fim de melhorar a resolução dos picos e diminuir o efeito

matriz. Pode-se notar que o fator de diluição nos extratos de cevada melhorou a

resolução dos picos cromatográficos quando comparados com os cromatogramas do

método de extração sob refluxo apresentado anteriormente (Figura 51).

O coeficiente de determinação (r2) e a faixa linear foram determinados

pela obtenção das curvas analíticas (0,3 até 100 µg mL-1) preparadas pelas soluções

dos compostos em solvente e na matriz. A Figura 56 mostra os comportamentos

distintos das curvas analíticas.

Foi possível observar que existe uma diferença significativa nos

coeficientes angulares para alguns compostos, indicando a presença do efeito matriz

pronunciado quando o espectrômetro de massas sequencial foi empregado.

129

Figura 56: Curvas analíticas preparadas em solvente e na matriz pelo método QuEChERS.A: catequina, B: ácido cafeico, C: ácido p-cumárico, D: ácido protocatecóico, E: ácido clorogênico, F: rutina, G: ácido sinápico, H: epicatequina, I: ácido ferúlico, J: ácido vanílico e K: miricetina.

Os analitos que apresentaram maiores efeito matriz foram a miricetina e o

ácido cafeico, sendo que para a miricetina, a curva preparada em solvente mostrou

sensibilidade bem maior em relação à curva preparada na matriz, enquanto que para

o ácido cafeico a curva preparada em solvente mostrou sensibilidade bem menor em

relação à curva preparada na matriz. Os compostos fenólicos que apresentaram um

médio efeito matriz foram o ácido p-cumárico e a catequina. O composto fenólico

que praticamente não apresentou efeito matriz foi o ácido protocatecóico, pois as

curvas analíticas tiveram comportamentos semelhantes.

Outros analitos que apresentaram grande influência do efeito matriz foram

os ácidos sinápico, ferúlico, vanílico e epicatequina. A epicatequina e o ácido ferúlico

apresentaram respostas cromatográficas (área dos picos) maiores quando estes se

encontravam na presença da matriz do que em solvente. Os ácidos sinápico e

vanílico apresentaram respostas cromatográficas (área dos picos) menores quando

estes se encontravam na presença da matriz do que em solvente (supressão iônica).

Já os compostos ácido clorogênico e rutina apresentaram um leve efeito matriz.

O efeito matriz também foi avaliado neste método. Os valores do efeito

matriz (%) para cada composto fenólico estão mostrados na Figura 57.

130

Figura 57: Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS acetato para extração dos compostos fenólicos em cevada usando UHPLC-MS/MS. (1) catequina; (2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido vanílico; (5) ácido cafeico; (6) ácido p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico; (9) rutina; (10) ácido protocatecóico; (11) miricetina.

Pode-se observar que alguns compostos como miricetina, ácido p-

cumárico, ácido sinápico e ácido vanílico apresentaram respostas cromatográficas

(área dos picos) menores quando estes se encontravam na presença da matriz do

que em solvente (supressão do sinal).

Concluiu-se que o efeito matriz é significativo para grande parte dos

compostos fenólicos estudados, sendo necessário o emprego na presença da matriz

para a quantificação dos compostos fenólicos, a fim de corrigir os efeitos da matriz

provocados por interferentes coextraídos.

Osresíduos da regressão linear obtida para os analitos correspondentes à

curva analítica construída na matriz podem ser vistos na Figura 58.

Os resíduos das curvas analíticas preparadas na matriz mostram a

situação ideal, em que o modelo está bem ajustado: os resíduos estão distribuídos

aleatoriamente, e não há nada que indique que sua variância não é constante.

Não houve nenhum analito no qual os resíduos cresceram com o

aumento do valor da concentração. Para o ácido p-cumárico, há maior evidência do

terceiro caso, com o aparecimento de uma estrutura não aleatória, de aspecto

curvilíneo. Os resíduos são menores nas extremidades da faixa de calibração e

maiores na região intermediária.

131

Ácido p-cumárico


Ácido clorogênico

Ácido cafeico

Ácido Ferúlico

Miricetina

132

Rutina

Ácido vanílico

Catequina

Sinápico

Epicatequina

Figura 58: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz pelo método QuEChERS.

Os valores das figuras de mérito referentes à validação analítica do

método QuEChERS são encontrados na Tabela 8.

133

A exatidão foi avaliada experimentalmente pela recuperação através da

fortificação dos extratos em 3, 6 e 30 µg g-1 e em cinco replicatas cada uma,

resultando num total de 15 determinações. Esse parâmetro foi obtido pelas injeções

de cinco amostras, em três níveis de fortificação.

Todos os compostos fenólicos estudados apresentaram valores de

recuperação satisfatórios, pois se encontram dentro do intervalo aceito da ANVISA,

uma vez que foram obtidas recuperações entre 71 e 120% para os três níveis de

concentrações avaliados.

A precisão foi avaliada em termos de repetitividade e precisão

intermediária, obtida pela média das três injeções feitas em três níveis de

fortificações e realizada em quintuplicata. A precisão intermediária variou de 3,8% a

18,2% e foi avaliada realizando-se ensaios em 3 dias consecutivos.

Os parâmetros da validação estão na Tabela 10.

Tabela 10: Figuras de mérito da validação referente ao método QuEChERS. LOQm: Limite de quantificação do método. LOQi : Limite de quantificação do instrumento.

Composto

Linearidade

(mg L-1)

LOQm

(µg kg-1)

LOQi

(mg L-1)

r2

Precisão

intermediária

(CV, %)

Recuperação

(% ± CV)

3 µg g-1

6 µg g-1

30 µg g-1

Ácido p-cumárico

0,5-100 61,2 0,01 0,9973 8,8 119 ±12 100 ±5 107 ±2


0,3-50 34,2 0,2 0,9947 16,4 119 ±1 116 ±2 119 ±1

Catequina

0,3-50 132,8 0,3 0,9912 13,6 99 ±10 110 ±15 86 ±7

Ácido clorogênico

0,3-50 21,3 0,3 0,9914 8,8 91 ±8 84 ±8 104 ±1

Ácido cafeico

0,5-100 15,8 0,3 0,9914 18,2 88 ±10 71 ± 12 90 ± 5

Ácido ferúlico

0,3-50 58,4 0,3 0,9938 11,3 96 ±7 89 ±8 106 ±1

Miricetina

0,5-100 30,2 0,25 0,9840 5,4 120 ±18 92 ±8 102 ± 2

Epicatequina

0,3-50 136,5 0,3 0,9836 5,2 73 ±15 87 ±5 91 ±3

Rutina

0,5-50 3,5 0,1 0,9945 12,1 119 ±19 88 ±1 82 ±17

Ácido vanílico

0,5-100 25,3 0,3 0,9911 3,8 96 ±5 93 ±6 101 ±1

Ácido sinápico

0,5-100 18,7 0,25 0,9924 4,7 106 ±2 97 ±3 100 ±1

* n= 5 replicatas

134

4.5.2. Quantificação dos compostos fenólicos pelo método

QuEChERS

Após a validação do método QuEChERS, as concentrações dos analitos

foram determinadas na amostra de cevada. É importante destacar que esta amostra

é diferente daquela usada no método de extração por refluxo e, os resultados são

mostrados na Tabela 11.

Notou-se que as concentrações da catequina e epicatequina também

foram as mais elevadas, dentre todos os analitos. Em seguida, ácido ferúlico foi o

analito mais abundante. Já os ácidos protocatecóico e clorogênico também tiveram

as concentrações baixas quando comparados ao método de extração por refluxo. No

entanto, o ácido p-cumárico teve a menor concentração dentre todos os analitos.

As diferentes concentrações de alguns analitos avaliados no método

QuEChERS quando comparados com o método de extração por refluxo podem ser

atribuídos à influência da sazonalidade dos diferentes lotes de amostragem.

Tabela 11: Concentração dos compostos fenólicos na amostra de cevada.

Substância Concentração

(µg g-1) ± CV(%)

Ácido p- cumárico 162,5 ± 7

Ácido protocatecóico 330 ± 9±

Catequina 15750 ± 5

Ácido clorogênico 262,5 ± 14

Ácido cafeico 5375 ± 8

Ácido ferúlico 12750 ± 9

Miricetina 412,5 ± 13

Epicatequina 16750 ±5

Rutina 487,5 ±6

Ácido vanílico 987,5 ±8

Ácido sinápico 512,5 ±12

135

4.5.3. Eficiência de extração

Na Tabela 12os valores de eficiência de extração variaram de 82,5 a 99,6%. Tabela 12: Eficiência de extraçãodos compostos fenólicos no métodoQuEChERS.

Composto

Eficiência de extração (%)

Ácido p-cumárico

87,8


84,9

Catequina 90,0 Ácido clorogênico

99,6

Ácido cafeico 97,8 Ácido ferúlico 93,1 Miricetina 98,2 Epicatequina 95,6 Rutina 92,7 Ácido vanílico 98,4 Ácido sinápico 82,5

4.6. Comparação entre as técnicas de preparo de amostra - método

de extração por refluxo × método QuEChERS

A Tabela 13 apresenta uma comparação entre as técnicas de preparo de

amostra estudadas, em termos de tempo de análise, custo, consumo de solventes

orgânicos, valores de recuperações obtidos e fator de diluição.

Tabela 13: Comparação entre as técnicas de preparo de amostras empregadas.

Preparo de

amostra*

Tempo

de

análise

(h)

Custo de

materiais e

reagentes

(R$)

Consumo

de

reagentes

(mL)

Recuperação

(%)

Fator de

diluição

Limite de Quantificação

(µg kg-1)

Método por

refluxo

13 14 310 78-119 0 0,3-127

Método

QuEChERS

8 58 50 71-120 5 3,5-136,5

* Referente à extração simultânea de 5 amostras

136

A técnica de preparo de amostra hidroetanólica sob refluxo mostrou-se

mais demorada e com várias etapas. O método por refluxo apresentou um tempo de

análise maior do que o método QuEChERS. Vale ressaltar que o consumo de

reagentes e a produção de resíduos foi consideravelmente maior na extração por

refluxo que o método QuEChERS.

O método QuEChERS foi realizado em um menor tempo de análise,

possivelmente por envolver um menor número de etapas, consumir menor volume

de solvente e, consequentemente, a produção de resíduos (solventes orgânicos) é

reduzida quando comparada com o método por refluxo. Obtiveram-se recuperações

satisfatórias para todos os analitos estudados e conseguiu-se atingir coeficientes de

variação menores. É importante destacar que não existem trabalhos citados na

literatura que utilizam o método QuEChERS para determinação de compostos

fenólicos em amostras de cevada, uma vez que esta técnica é muito bem

estabelecida para a análise de multirresíduos de agrotóxicos em alimentos.

Portanto, pode-se concluir que o método QuEChERS foi mais adequado

em termos de rapidez, consumo de solventes, resíduos gerados, atende os

princípios da Química Verde, eficiência e repetibilidade de extração.

Por outro lado, nota-se que para a realização das réplicas das 5 amostras

de cevada foi gasto um valor de aproximadamente R$ 58,00. Enquanto que para a

extração pelo método por refluxo foi gasto um valor de aproximadamente R$14,00.

Para avaliação dos diferentes métodos de preparo de amostras, o mesmo

lote de amostragem BRS 225, 026607 foi analisado tanto pelo método por refluxo

como pelo método QuEChERS.

Na Tabela 14 estão apresentados os valores obtidos para os compostos

fenólicos ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina, catequina e

epicatequina analisadas por UHPLC-MS/MS pelas técnicas por refluxo e pelo

método QuEChERS.

Dentre as amostras analisadas, para o método por refluxo, foram

encontrados os analitos ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido vanílico, ácido p-

cumárico, rutina, catequina e epicatequina em concentrações entre 208,8 e 11248,6

µg g-1.

Empregando o método QuEChERS, dentre as amostras analisadas,

foram detectados os ácidos cafeico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, além de

catequina e epicatequina em quantidades entre 172,5 e 16750 µg g-1. Isto significa

137

que o método QuEChERS permite maior detectabilidade quando comparado com o

método por refluxo em que as concentrações dos analitos variaram entre 208,8 e

11248,6 µg g-1.

As pequenas diferenças entre os 2 métodos de extração pode ser

justificada com base no uso de diferentes solventes extratores, nas proporções dos

volumes de solventes etanol/água e acetonitrila (45 e 10 mL). Embora as

quantidades de amostra entre os métodos C e QuEChERS sejam bem próximas, 3 e

4 g respectivamente, vale ressaltar que o método C foi concentrado previamente a

partir da secagem dos extratos em rotaevaporador e ressuspensão do mesmos em 2

mL de metanol antes das análises por UHPLC-MS/MS, enquanto que no método

QuEChERS foram realizadas as diluições com o objetivo de minimizar o efeito

matriz.

Tabela 14: Concentração de compostos fenólicos em grãos de cevada avaliada pelo método por refluxo e pelo método QuEChERS. Composto Método por Refluxo

Concentração (µg g-1)

Método QuEChERS

Concentração (µg g-1)

Ácido p-cumárico 208 ± 4 172 ± 8

Catequina 11248,6± 6 15750± 13

Ácido cafeico 7706,6± 9 5375± 5

Ácido ferúlico 9490± 11 12750± 9

Epicatequina 10155 ± 10 16750± 12

Rutina 454 ± 7 487 ± 7

Ácido Vanílico 1011 ± 8 987 ± 11

Assim, o maior volume da mistura extratora empregado no método C,

como a influência da temperatura podem ter colaborado para a pequena variação de

valores obtidos das concentrações dos analitos no método C quando comparados

com o método QuEChERS. Neste contexto, ambos os métodos apresentam

diferentes condições de extração, no entanto os analitos apresentaram

concentrações aproximadamente similares. Um teste estatístico foi realizado para

fins de comparação entre os dois métodos. O teste t para diferença nas médias foi

calculado conforme a Equação 9 e seus valores podem ser visualizados na Tabela

15.

138

O teste estatístico t foi determinado por:

Equação 9

Tabela 15: Comparação entre a diferença nas médias do método por refluxo e método QuEChERS.

Composto t calculado H°

Ácido p-cumárico 2,65 Aceita

Catequina 1,22 Aceita

Ácido cafeico 6,12 Rejeitada

Ácido ferúlico 7,23 Rejeitada

Epicatequina 1,83 Aceita

Rutina 1,85 Aceita

Ácido Vanílico 0,46 Aceita

* 95 % de confiança

A comparação foi feita com o t tabelado com N1+ N2 – 2 para alguns

graus de liberdade [84]. Considerando-se que t tabelado é 2,78 a 95 % de confiança

para 4 graus de liberdade foram rejeitadas as hipóteses nulas para o ácido cafeico e

ácido ferúlico, cujos valores encontrados não foram aceitáveis.

4.7. Avaliação de amostras comerciais de cevada

A fim de comparar a concentração de compostos fenólicos em amostras

de diferentes locais, algumas amostras comerciais foram adquiridas e avaliadas:

A1= São Paulo-SP, A2= Campinas-SP, A3= Belo Horizonte-MG, A4= Florianópolis-

SC, A5= Curitiba-PR, A6= Guarapuava-PR e A7= Manaus-AM.

139

Na Figura 59 encontra-se o cromatograma obtido para uma das amostras

analisadas (A6), para mostrar que as amostras coletadas no comércio das diferentes

regiões do país apresentam comportamento semelhante às amostras fortificadas.

Figura 59: Cromatogramas de íons totaisadquiridos no modo SRM do extrato de cevada extraído por QuEChERS e análise por UHPLC-MS/MS para amostra A6.

As concentrações de compostos fenólicos foram avaliadas em amostras

de diferentes regiões do país, conforme a Tabela 16.

140

Tabela 16: Concentração de compostos fenólicos em amostras comerciais de grãos cevada provenientes de diferentes regiões do Brasil.

Média de concentração (µg g-1) Composto Fenólico

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7

Ácido ferúlico

12.283± 6 9.851± 9 18.075± 10 5.735± 8 4.612± 12 22.199± 4 31.554± 9

Ácido cafeico

N.D. N.D. N.D. N.D. 9.466± 6 7.700± 5 <LQ

Ácido clorogênico

N.D. N.D. N.D. N.D. 91.010±10 N.D. N.D.


N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 2.913± 7 3.079± 11

Ácido p-cumárico

337± 3 <LQ 339± 6 327± 13 N.D. 956± 8 728± 13

Catequina

43.343± 12 47.208± 3 114.837±8 68.463± 3 76.192± 5 58.802± 6 52.039± 3

Epicatequina

45.137± 7 46.302± 9 108.524± 6 82.452± 4 62.121± 7 52.553± 4 56.141± 9

A1= amostra de São Paulo, A2= amostra de Campinas, A3= amostra de Belo Horizonte, A4=

amostra de Florianópolis, A5= amostra de Curitiba, A6= amostra de Guarapuava, A7= amostra de

Manaus. N.D. = não detectado, <LQ = abaixo do LQ.

Na avaliação das amostras comerciais, notou-se que as concentrações da

catequina e epicatequina foram as mais elevadas, dentre todos os analitos. Já os

ácidos cafeico e protocatecóico tiveram as concentrações mais baixas. Também

destaca-se a elevada concentração do ácido clorogênico em uma das amostras.

Vale ressaltar que a variação das concentrações de compostos fenólicos em cevada

de diferenteslocais deve-se, principalmente, à variação sazonal [56], assim como as

condições de armazenamento dos grãos na comercialização.

141

5. CONCLUSÕES

Para identificar e quantificar compostos fenólicos em cevada, foram

testadas diferentes técnicas de extração tais como refluxo, aquecimento com

agitação magnética, extração em atmosfera inerte e hidrólise, que foram avaliadas

utilizando-se ESI(-)-MS/MS e UHPLC-MS/MS.

Com a realização de testes de ESI no modo positivo, apenas 4 analitos foram

capazes de sofrer ionização. Portanto, fez-se a escolha pelo modo negativo de

ionização, sendo que este foi favorável para 11 analitos investigados. Para a maioria

dos compostos fenólicos, a melhor condição cromatográfica foi obtida com a mistura

binária de acetonitrila acidificada: água com ácido fórmico 0,1 % (v/v) e por gradiente

de eluição.

O desenvolvimento do método por UHPLC/MS-MS foi eficaz para

monitorar 11 analitos simultaneamente num tempo de 7 min de análise e 10 min

entre as replicatas das injeções. Destaca-se que o tempo de análise é menor

comparado com outros métodos de análise de compostos fenólicos em cevada

citados na literatura, como o HPLC.

A elaboração de um planejamento fatorial (23) foi importante para fornecer

dados para otimização do método por refluxo. Notou-se que a variável temperatura

foi a mais significativa quando comparada com as outras variáveis e a temperatura

ótima para extração dos compostos fenólicos foi de 80°C. A variável tempo também

foi significativa para obtenção de uma extração eficiente e a condição mais favorável

foi um período de extração de 90 min.

Os métodos de preparo de amostras validados foram capazes de

determinar compostos fenólicos solúveis em cevada com a mistura hidoetanólica no

método por refluxo e com acetonitrila pelo QuEChERS.

O método QuEChERS foi empregado neste trabalho na tentativa de se

obterem extratos mais limpos, com boa recuperação para os compostos fenólicos e

para avaliar a aplicabilidade do método para este tipo de composto, uma vez que

normalmente o método QuEChERS é empregado para extração de agrotóxicos.

A validação analítica mostrou que ambos os métodos respondem

adequadamente para analisar os compostos fenólicos em cevada.

Concluiu-se que a melhor técnica de preparo de amostra para

determinação de compostos fenólicos em cevada em termos de rapidez, consumo

142

de solventes, resíduos gerados, que atende os princípios da Química Verde,

eficiência e repetibilidade de extração é o QuEChERS.

Para avaliação dos diferentes métodos de preparo de amostras, o mesmo

lote de amostragem dos grãos de cevada foi analisado tanto pelo método por refluxo

como pelo método QuEChERS. Vale ressaltar que ambos os métodos podem ser

utilizados na análise de compostos fenólicos em cevada.

Conclui-se que os métodos de preparo de amostras validados podem ser

utilizados para controle de qualidade de cevada em cervejarias, uma vez que onze

compostos fenólicos foram estudados e as figuras de mérito comprovaram a

confiabilidade dos resultados em diferentes amostras.

A fim de comparar a concentração de compostos fenólicos em amostras

de diferentes locais, algumas amostras comerciais foram adquiridas e avaliadas,

indicando diferenças nas concentrações que podem ser decorrentes da variação

sazonal como diferentes climas, solos, temperaturas, durante cada estação do ano e

quantidade de chuva.

143

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