Espectrometria de Massas

Profa. Dra. Débora de Almeida Azevedo

MSc e DSc em Química Orgânica – DQO/IQ/UFRJ

Pós-doutorado em Química Ambiental – CSIC/Barcelona-Espanha

Professora Adjunta do DQO/IQ/UFRJ desde Fev/1996

LABEM – Laboratório de Espectrometria de Massas

Departamento de Química Orgânica

Instituto de Química

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Fevereiro/2004

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INTERESSES

Técnica analítica poderosa utilizada para identificar compostos desconhecidos,

quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades químicas e estruturais de

moléculas; pode ser realizada com quantidades bem pequenas (ao nível do picograma) e a

concentrações bem baixas em misturas quimicamente complexas (ppt); gera informações

valiosas a um grande número de profissionais físicos, engenheiros de controle de processos,

químicos, astronautas, biólogos etc.

USOS

• identificar estruturas de biomoléculas (carboidratos, ácidos nucleicos, esteróides);

• seqüenciar biopolímeros como proteínas e oligossacarídeos;

• determinar como as drogas são utilizadas pelo organismo;

• realizar análises como a confirmação e quantificação de abuso de drogas;

• análise de poluentes ambientais;

• determinar a idade e origens de espécies em geoquímica e arqueologia;

• identificar e quantificar componentes de misturas orgânicas complexas.

INSTRUMENTAÇÃO

Grande variedade, diferentes princípios físicos, separação de íons pela razão massa/carga:

I. dispersão em um setor magnético ou em um campo elétrico radial;

II. movimento em um campo elétrico com radiofrequência;

III. tempo de vôo, após aceleração através de um potencial fixo;

IV. freqüência ciclotron em um campo magnético.

A primeira etapa na maioria dos experimentos após a ionização é a aceleração dos íons para

fora da fonte em direção ao analisador de massas.

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Os Componentesde um

Espectrômetro de Massas

Fonte Analisador Detector

Manipulaçãodosdados

Introduçãoda

Amostra

Espectrode

Massas

Separação dos íons

Figura 1: Esquema dos principais componentes de um espectrômetro de massas.

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Amostra - sólida, líquida ou vapor

Íons - fase gasosa

Condições de alto vácuo

Detector - íons geram um sinal elétrico que é proporcional ao número de íons.

FONTE IÔNICA

� Geração de íons (mais comum): bombardeamento de moléculas gasosas com um feixe de

elétrons.

� Impacto de elétrons (70 eV): mistura de íons positivos e negativos e espécies neutras.

� Íons positivos: direcionados para o analisador pela aplicação de voltagem positiva no

repeller. Focalização pela voltagem aplicada nas lentes.

� Íons negativos e elétrons: atraídos para um catodo positivo.

� Moléculas e fragmentos neutros não ionizados: bombeados para fora do sistema.

� No processo de ionização por impacto de elétrons (IE), a energia dos elétrons é geralmente

muito maior do que a energia das ligações químicas das moléculas;

� Quando elétrons de alta energia interagem com moléculas, ocorre a ionização; ligações são

rompidas e fragmentos formados. Esta a razão porque não só íons da molécula intacta

aparecem nos espectros de massas;

� Embora íons positivos e negativos sejam gerados na fonte ao mesmo tempo, uma

polaridade é escolhida, e o espectro de massas consiste de íons positivos ou íons negativos.

� Partículas neutras não são detectadas;

� Espectro de massas de íons positivos são normalmente os mais utilizados.

- + + +

Esquema:

4

Figura 2: Esquema de uma fonte de íons com ionização por impacto de electrons.

PRODUÇÃO DE ÍONS

É de fundamental importância a geração de um feixe intenso, contando íons característicos

das moléculas não dissociadas e dos processos de fragmentação relacionado à estrutura:

� Impacto de elétrons (IE)

� Ionização química (IQ)

� Ionização por dessorção química (DCI)

� Ionização por campo/dessorção por campo (FI/FD)

� Espectrometria de massas de íons secundários (SIMS)

� Bombardeamento por átomos rápidos (FAB)

� Dessorção por plasma (PD)

� Dessorção por laser (LD)

� Termospray (TSI)

� Electronspray (ESI)

� Ionização à pressão atmosférica (API)

� Espectrometria de massas por neutralização - reionização (NRMS)

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SETOR MAGNÉTICO

• elemento de foco direcional pois íons monoenergéticos, que deixam a fonte em um feixe

divergente, são atraídos ao foco do coletor,

• um íon acelerado em um campo magnético de força B segue trajetória circular de raio r ;

• mv/z = rB

• razão massa/carga: m/z = B2r2 /2v ;

• os parâmetros B e v são variáveis para modificar a massa do íon que segue uma

determinada trajetória;

• dispersa os íons de acordo com a razão momento/carga;

• íons de massas diferentes mas com a mesma energia cinética emanados do mesmo ponto,

seguem trajetórias diferentes através do raio central do setor magnético

Figura 3: Esquema de um espectrômetro de massas com analisador de massas utilizando

campo magnético.

Fonte Iônica

Para o vácuo

Magneto

Feixe de ions separados

Coletor de ions

Tubo do analizador

Saída dos ions

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SETOR ELÉTRICO

� setor elétrico cilíndrico;

� dispersa os íons com a razão energia cinética/carga;

� elemento de foco direcional;

� íon positivo em um campo elétrico está sujeito a uma força na direção do campo e o

percurso do íon no campo é curvo;

� o raio da curvatura (rc), da trajetória do íon depende da energia do íon e da força do campo

elétrico;

� analisador de energias - serve para limitar a faixa de energias do feixe iônico;

� faixa de energias - fator de limitação da resolução dos analisadores de deflexão magnética.

� Somente íons de energia Ve segue a trajetória de raio r; íons com energias maiores ou

menores seguem trajetórias de raios maiores ou menores. r = 2V/E

INSTRUMENTOS DE SETORES

• combinação dos setores eletrostáticos e magnéticos;

• configuração usual é a geometria Nier-Johnson;

• íons de massas grandes apresentam trajetórias de raios maiores do que íons de massas

pequenas;

• íons de diferentes razões massa/carga são focalizados para o detector variando a força do

campo magnético;

• a combinação da focalização por energia e por momento, acoplando dos analisadores

eletrostáticos e magnéticos (focalização dupla) gera alta resolução, obtendo-se massa

precisa;

• pode-se obter uma resolução tão alta que a massa de uma partícula é medida com três ou

quatro casas decimais;

• resolve-se íons de mesma massa nominal mas com fórmulas químicas diferentes como N2

e CO a m/z 28.

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Figura 4: Esquema de um espectrômetro de massas de duplo foco, com analisador de íons por

campo elétrico e magnético. QUADRUPOLO

• analisador de massas;

• usa quatro polos elétricos (um “quadrupolo”) e nenhum campo magnético.

• íons são introduzidos no analisador com velocidades constante em uma direção

paralela aos polos (direção z) e então, passam a oscilar nas direções x e y.

• isto é obtido pela aplicação simultânea de uma voltagem de corrente contínua e de

uma voltagem de radiofreqüência aos polos;

• ocorre uma variação estável que permite ao íon passar de um extremo ao outro do

quadrupolo sem chocar-se com os polos;

• esta oscilação depende da razão massa/carga do íon;

• apenas íons com uma determinada razão m/z conseguirão atravessar o analisador;

• demais íons terão oscilações instáveis e chocar-se-ão com os polos.

• varredura de massas é feita variando-se a radiofreqüência e a voltagem da corrente

contínua, mantendo-se sua razão constante.

• polos adjacentes tem polaridades opostas. Idealmente, os polos do quadrupolo tem

forma hiperbólica.

• somente as massas dos íons e a carga são importantes na descrição das trajetórias.

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• instrumentos com setores operam tipicamente com voltagens de aceleração na faixa de

KeV, enquanto quadrupolos operam com energias cinéticas na faixa de 0-10 eV;

• filtro de massas tipo quadrupolo é o que utiliza um analisador de massas verdadeiro,

enquanto o setor magnético mede momento e o elétrico a energia;

• gera baixa resolução (unitária), mas é mais facilmente interfaceada aos vários sistemas

de introdução de amostra.

Figura 5: Esquema de analisadores de massas do tipo quadrupolo e por trapa iônica.

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Figura 6: Esquema representativo da interface analisador tipo quadrupolo e

eletromultiplicador utilizando blindagem para raios-X.

“ION TRAP” – TRAPA IÔNICA

� Paul, 1956: aparelho que mantém íons gasosos em um volume pequeno utilizando somente

campos elétricos;

� são três eletrodos: dois eletrodos de tampas terminais (“end-cap eletrodes”) e um eletrodo

central em anel, cada um com uma seção de corte hiperbólica, forma uma câmara dentro da

qual íons podem ser confinados;

� aplicação de uma voltagem de radiofreqüência (rf) ao eletrodo em anel estabelece um

campo elétrico quadrupolar;

� íons de razão massa/carga apropriada tem trajetórias estáveis dentro da câmara e são

confinados por vários segundos.

� 1984: primeiro “ion trap quadrupolar” comercial.

� pode ser classificado na mesma categoria de filtro de massas como o quadrupolo;

� é um quadrupolo tri-dimensional, e equação semelhante do íon é aplicada.

� método novo de ejetar seletivamente da câmara íons de razão m/z cada vez maiores;

� para se obter o espectro de massas, a amplitude da voltagem rf é aumentada, fazendo com

que íons de razão m/z cada vez maiores se tornem instáveis;

� são ejetados em seqüência de massas, do aparelho através do orifício no “end-cap”.

� a seqüência de operação no ITMS começa com a injeção de um pulso de elétrons para

dentro da câmara para ionizar a amostra gasosa. O eletrodo de anel é mantido a baixa

amplitude de rf para manter confinados todos os íons formados durante o pulso de

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ionização. A amplitude rf é aumentada, e íons de massas cada vez maiores são

seqüencialmente ejetados da câmara e detectados por um multiplicador de elétrons.

� parâmetro importante na operação do ion trap é a pressão do gás de fundo. Hélio é

adicionado como um banho de gás - colisões dos íons com o gás inibe a trajetória dos íons

em direção ao centro do ion trap (controle da trajetória), gerando melhor resolução e

sensibilidade.

CARACTERÍSTICAS ÚNICAS DO ÍON TRAP

� alta sensibilidade;

� faixa de massa grande, excede a 70KDa;

� resolução ultra alta (106);

� limite de detecção atomol : 10-18 mol;

� espectrometria de massas de estágios múltiplos, (EM)n n < 13; podendo utilizar métodos

diferentes de decomposição de íons (colisão com gás, irradiação com fóton, interação com

superfície);

� determinação inequívoca do caminho de fragmentação real;

� geração de íons na câmara por ionização por impacto de elétrons, ionização química,

injeção efetiva dos íons gerados de outras fontes por APCI, ESI, MALDI;

� manipulação fácil;

� efetivo para reações íon-molécula;

� avaliação da polaridade de íons gasosos.

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Corte esquemático do ITMSCorte esquemático do ITMS

“end-cap”

Detector

Voltagem rfsuplementar

“end-cap”

Filamento

Voltagem rf fundamental

Anel eletrodo

TEMPO DE VÔO

• tipo mais simples de análise de partículas carregadas;

• único campo envolvido é a aceleração;

• utiliza uma voltagem de aceleração constante; todos os íons de massas diferentes

apresentam uma velocidade diferente;

• cada íon atravessa uma distância fixa em diferentes tempos;

• tempo de vôo de um íon por uma distância L é dado por:

• t = L/v ; mv2/2 = zv ; t = Lm1/2 /(2zv)1/2

• ideal para análise de íons gerados por dessorção por plasma ou laser (pulsada), pois o

processo de ionização é espacialmente e temporalmente confinado;

• método capaz de gerar uma análise de massas completa para cada evento de ionização

discreto (alta velocidade de varredura).

• baseado na medida de uma diferença de tempo entre um sinal de partida e outro de

chegada;

• o registro de um espectro de massas necessita de um sinal de partida proveniente de

uma sonda primária e de um sinal de término correspondente a chegada de um íon

secundário;

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• os íons dessorvidos são acelerados por uma diferença de potencial aplicada entre o

suporte e a grade extrativa. Os íons acelerados percorrem um espaço livre até o

detector. Sendo a energia de aceleração a mesma, os íons de massas diferentes se

separam no espaço livre e chegam em tempos diferentes ao detector.

• a fonte de 252Cf é colocada pouco atrás do suporte. O processo de fissão nuclear

libera simultaneamente dois fragmentos a 180o um do outro, enquanto um produz a

ionização da amostra, o outro é detectado e gera uma marcação de tempo eletrônico.

• os produtos de fissão atravessa o substrato e provoca a dessorção do depósito sobre o

suporte.

• um modo de melhorar a resolução dos instrumentos com tempo de vôo é o espelho

eletrostático ou “reflectron” (“Reflecting electrical field”- campo elétrico refletor).

• todo espalhamento de velocidade, e conseqüentemente alargamento do tempo de vôo,

no feixe de íons é compensado refletindo o feixe em um campo eletrostático pois os

íons mais rápidos penetram mais e então tem um caminho de vôo total maior.

Fonte

Separador

DetectorGrade

SinalFinal

SinalPartida

Junção Fenômeno de desorção

Instrumento com Tempo de VôoInstrumento com Tempo de Vôo

Figura 7: Esquema de um espectrômetro de massas utilizando analisador de íons do tipo

tempo de vôo.

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DETECTORES

� corrente de íons é extremamente pequena, mas pode variar rapidamente em uma faixa bem

grande;

� a este baixos níveis, tipicamente na faixa de 10-14 a 10-11 A, ruído de fontes estranhas é um

fator muito significativo;

� o sinal tem que ser ampliado significativamente antes que o processamento usual dos sinais e a

manipulação das informações possam ser aplicados;

� amplificação é usualmente realizada com um elétron-multiplicador. Multiplicadores geram um

ganho de sinal na faixa de 104 a 106. A corrente que sai de um multiplicador é ainda bem

pequena e é usualmente novamente ampliada;

� uma performance bem alta de sinal/ruído é alcançada com um certo número de

multiplicadores: “box-and-grid”, “venetian blind” , multiplicadores de diodo contínuo

� “box-and-grid” : feixe de íons é acelerado na direção de uma rede fina (“grid”) que é mantido

a um potencial negativo bem alto. A maioria dos íons atravessa a rede para colidir com uma

superfície de Cu-Be, a qual é bem emissiva e irá projetar 3 a 4 elétrons para cada íon que

colide. A colisão dos elétrons em uma segunda superfície de Cu/Be leva a mais emissões de

elétrons, e o processo é repetido 12 a 16 vezes.

� “venetian blind” : semelhante ao “box-and-grid”.

Figura 8: Esquema de um multiplicador de elétrons to tipo veneziana (venetian blind).

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Multiplicadores com diodo contínuo: uma alta voltagem negativa, tipicamente 1800v é

aplicada através de uma trombeta de vidro cujo interior é coberto com óxido de titânio. A

cobertura serve como uma superfície de emissão.

• um gradiente de potencial é desenvolvido dentro do envelope. Um íon colide com a

superfície levando a emissão de vários elétrons ;

• estes irão descer a superfície levando a mais emissões de elétrons;

• um ganho de 105 a 106 é atingido com 1800 a 2000v;

• para prevenir a perda de elétrons pela entrada da trombeta e parra definir o potencial de

entrada, uma rede fina é fixada no topo do multiplicador;

• extremamente suscetível a contaminação da superfície. Não é sensível a contaminação por ar,

vapor d’água e a maioria dos gases reagentes da ionização química;

• íons positivos são atraídos fortemente para o multiplicador devido a alta voltagem negativa

em sua entrada. Os íons devem ser atraídos para uma área definida sem se chocarem com as

placas protetoras.

• para íons pesados, o gradiente mínimo de potencial necessário para contornar esta inércia dos

íons e atraí-los é maior do que para os íons de massa baixa. Isto fixa o limite mínimo

dependente da massa para a voltagem do multiplicador.

• tipicamente, o multiplicador deve ser operado acima de 1700v para um instrumento de 800u.

• a amplificação do sinal do íon torna possível a detecção de um simples íon que chega ao

coletor. Embora a eficiência de ionização e transmissão no espectrômetro de massas atinge

somente um íon no coletor para aproximadamente 105 moléculas da amostra introduzidas,

espectros de massas úteis podem ser obtidos ao nível do subnanograma.

• Raios-X: quando íons colidem com os polos de um sistema quadrupolo, raios-x brandos

podem ser gerados. Raios-x colidindo com multiplicadores pode levar a emissão de elétrons

da superfície pela ação fotoelétrica. A corrente devido ao raios-x pode mascarar

completamente o sinal de fluxo de íons, levando a um aumento no sinal e ruído

• a colisão íon-polo gera também um número significativo de moléculas neutras excitadas.

Também leva a um aumento no sinal de saída

• contornar : multiplicador deve ser montado atrás de uma placa protetora contra raios-x.

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DETECTORES

“Post acceleration”

“Microchannel plate”

“Photo diode array”

“Eletron multiplier”

com plano focal

• “Microchannel plate”: placa fina constituída de milhões de microcanais. Uma cobertura

metálica de Ni-Cr depositada nas duas faces da placa assegura contato e emissão. Os íons

incidentes colidem com as paredes internas do canal devido a sua inclinação e provocam a

emissão de elétrons secundários. Estes são acelerados por um campo elétrico entre as duas

faces das placas. Por choque contra a parede, os elétrons provocam uma avalanche de

elétrons, sendo recolhidos por um anodo.

• sistema de detecção com plano focal: coletam todos os íons por uma faixa de massa ao

mesmo tempo. Foi aplicado por vários anos utilizando foto-placas. Detectores com plano

focal têm se tornado disponível comercialmente. Aumenta a sensibilidade por um fator de

100.

3 0 0 v1 K v

Í o n s

e - e -

P C M 2 P C M 1

“ M i c r o c h a n n e l P l a t e ”“ M i c r o c h a n n e l P l a t e ”

Figura 9: Esquema de um detector do tipo Microchannel Plate.

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Figura 10: Figuras de bombas de vácuo: difusora e mecânica.

INTERPRETAÇÃO DE ESPECTROS DE MASSAS

� um espectro de massas apresenta a massa da molécula e as massas de pedaços da molécula;

� na forma barra-gráfico, a abscissa indica a massa (m/z, razão massa para número de cargas nos

íons) e a ordenada indica a intensidade relativa;

� apresentam picos adicionais devido ao ruído de fundo do instrumento. São devidos a

compostos que são dessorvidos das paredes do instrumento. Devem ser subtraídos dos

espectros de massas dos compostos;

� interpretação é baseada na química de íons gasosos;

� a massa e a abundância relativa do íon molecular indica o tamanho e a estabilidade da

molécula;

� o número de íons abundantes e sua distribuição na escala de massas são indicativos do tipo de

molécula e dos grupos funcionais presentes;

� uma molécula composta de subestruturas estáveis conectadas por ligações fracas gera um

espectro com poucos fragmentos proeminentes, como o espectro de massas da nicotina.

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O Íon Molecular

� M+. - informação mais valiosa de um espectro de massa; sua massa e composição elementar

mostram os limites nos quais os fragmentos se situam.

� para determinados tipos de moléculas, o íon molecular não é suficientemente estável para ser

encontrado em quantidades apreciáveis no espectro por impacto de elétrons;

� deve ser o íon de maior massa no espectro;

� dever ser um íon com número ímpar de elétrons (OE+. : “odd-electron ion”);

� deve ser capaz de gerar íons importantes na região de massa alta do espectro pela perda lógica

de espécies neutras

� no espectro por IE, a amostra se ioniza pela perda de um elétron, deixando um elétron

desemparelhado, e o íon molecular se torna uma espécie radicalar. Tal íon, molecular ou

fragmento, com um elétron desemparelhado é denominado OE e é representado pelo símbolo

+.

� EE (‘even-electron’): íons nos quais os elétrons da camada externa se encontram

compartilhados. O símbolo + é utilizado (EE+);

� facilidade de ionização destes elétrons se encontra na ordem n > π > σ ;

� íons contendo somente elétrons emparelhados (EE+) são geralmente mais estáveis e

conseqüentemente são fragmentos mais abundantes nos espectros de IE;

Abundância do íon molecular X estrutura:

[M+.] - depende da sua estabilidade ;

[M+.] - é um indício da estrutura molecular;

[M+.] - usualmente aumenta com o aumento de insaturações e número de anéis;

[M+.] - usualmente diminui com o aumento do tamanho da cadeia de uma estrutura;

[M+.] - diminui com as ramificações

Em geral, a estabilidade da molécula se assemelha a estabilidade do íon M+., e é refletido na

abundância do M+. .

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Figura 11: Espectros de Massas de alcanos lineares e isoprenóide, salientando suas principais

posições de clivagem.

Ionização

� abrangem duas classes : enérgica e branda;

� ionização enérgica, com elétrons de 70eV, produz uma grande proporção de moléculas

ionizadas com energias internas tão altas que elas se fragmentam antes de saírem da fonte

iônica;

� as massas desses fragmentos são as informações básicas das subestruturas utilizadas na

interpretação;

� ionização branda minimiza tais fragmentações.

� ionização por elétrons: o feixe de elétrons de alta energia são gerados de um filamento

incandescente e atravessam a câmara de ionização em direção ao anodo do outro lado. O fluxo

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de moléculas da amostra vaporizada a uma pressão de ~10-3 Pa (10-5 Torr) entra na fonte e

interage com o feixe de elétrons formando uma grande variedade de produtos, incluindo íons

positivos;

� são empurrados para fora da fonte por um pequeno potencial (‘repeller’) e são acelerados para

o analisador de massas;

� maior parte das moléculas são removidas por bombas de vácuo na fonte iônica.

� a energia de 70 eV se encontra ~10eV acima da energia necessária para ionizar as moléculas.

A pressão da amostra na câmara de ionização é mantida bem baixa garantindo que colisões

secundárias dos íons com moléculas ou elétrons sejam negligenciáveis;

� o resultado inicial da interação do elétron com a molécula é a formação do íon molecular pela

ejeção de outro elétron (OE+. );

� parte ou todos os íons moleculares decompõe-se posteriormente, levando aos fragmentos.

� somente reações unimoleculares são importantes na fragmentação por IE; a pressão da amostra

é baixa o suficiente para evitar reações entre íons e moléculas.

� ionização branda: aumentando a pressão da câmara de ionização para ~100 Pa (0,75 Torr), se

garante que a molécula da amostra sofrerá centenas de colisões antes de sair.

� bombardeamento por elétrons no metano ou outros gases a tais pressões em uma fonte iônica

fechada (saída para o vácuo pequena) produz os íons ‘reagentes’ em abundância como o CH5+

.

� eles reagirão com a amostra através de reações íon-molécula; algumas serão bandas gerando

íons produtos estáveis representando moléculas não dissociadas.

� ionização branda leva ao íon molecular MH+ , mais estável, menor grau de fragmentação;

� para os métodos tradicionais de ionização (IE e IQ) a amostra deve ser vaporizada;

� introdução direta na fonte de íons é preferida para compostos de baixa volatilidade. A amostra

é introduzida via sonda na fonte de íons, onde é vaporizada por aquecimento.

INFORMAÇÕES SOBRE A ESTRUTURA MOLECULAR

São obtidas eficientemente na seguinte ordem:

• massa molecular, composição elementar, ligações duplas, anéis

• subestruturas;

• conectividades das subestruturas;

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• possíveis moléculas, comparando-se cada estrutura contra todas as informações

disponíveis

• Importância relativa dos picos

• maior intensidade

• maior massa no espectro

• maior massa no grupo de picos

Características da estrutura mais plausível

• listar todas as estruturas possíveis;

• predizer seus espectros a partir do mecanismo de dissociação apropriado e compare-o

com o obtido

• espectros de referência são importantes; deve-se obtê-los nas mesmas condições

instrumentais utilizadas para o composto em estudo. Valores de abundância pode variar

entre os instrumentos

PROPONDO A ESTRUTURA MOLECULAR

� Regra do Nitrogênio: “se um composto contém átomos de nitrogênio (ou um número par), seu

íon molecular será um número ímpar”;

� H2O : m/z 18 ; NH3 : m/z 17;

� Perdas neutras lógicas: há somente um certo número de fragmentos neutros de pequena massa

que são comumente perdidos na decomposição dos íons moleculares;

� a presença de um íon “importante” separado do íon de maior massa por uma massa anômala é

indicativo que o último não é o íon molecular;

� perda de fragmentos neutros a partir do íon molecular são aqueles comumente conectados por

ligações simples;

� íons importantes de massas (M - 1)+ , (M - 15)+ , (M - 18)+ e (M - 20)+ normalmente

representam a perda de H, Me, H2O e HF respectivamente a partir do íon molecular;

� tais picos de perdas de neutros pequenos são de grande significância na dedução da estrutura

molecular.

� íons característicos

� informação estrutural é difícil: há grande número de possibilidades. Entretanto para vários

valores específicos há somente alguns grupos estruturais característicos;

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� tais íons característicos são úteis na sugestão de fragmentos possíveis da molécula.

� m/z 30 - aminas;

� m/z 77 - fenil;

� m/z 105 - metilbenzil ou benzoil;

� m/z 149 - ftalato, embora muitos outros compostos possam também gerá-los;

� m/z 191 - terpanos

� m/z 217 - esteranos

� m/z 74 - ésteres metílicos

� m/z 58 - metil cetonas lineares

ESPECTROS DE MASSAS DE CLASSES DE COMPOSTOS COMUNS

Marcação isotópica e outras técnicas especiais têm sido utilizadas para se elucidar os

mecanismos de fragmentação.

Hidrocarbonetos

• sofrem rearranjos randômicos, o qual é reduzido com ramificações e insaturações.

Hidrocarbonetos alifáticos saturados

• apresentam íon molecular pequeno;

• séries típicas de (CnH2n+1)+ ;

• ramificações levam a decréscimo na intensidade do M+. e a um aumento na abundância

de (CnH2n+1)+ e (CnH2n )+ . devido a quebra e retenção de carga no carbono

ramificado;

Hidrocarbonetos alifáticos insaturados

• aumenta [M+.] somente para compostos de baixo peso molecular;

• clivagem alílica;

• isomerizam com a migração da ligação dupla;

• ramificações interna induzem dissociações pelo rearranjo de hidrogênio (R > H);

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• método para localização de ligações duplas: introdução de grupos funcionais nas

ligações duplas induzindo fragmentações com clivagens específicas de ligações, ex.

ozonólize.

Hidrocarbonetos cíclicos saturados

• íons moleculares mais abundantes;

• decomposições do esqueleto do anel deve envolver clivagem de no mínimo duas

ligações;

• correlação espectral cuidadosa pode dar informações estruturais valiosas;

• Exemplo: 5-α-pregnano

• (M - CH3)+ advém da perda do grupo metila angular, principalmente C19 ;

• íon m/z 149 é composto principalmente dos anéis A e B via mecanismo complexo;

• estereoquímica dos anéis A/B tem efeito característico neste processo: isômero 5-β-(cis)

a razão [m/z 149]/[m/z 151] é menor do que no isômero 5-α.

Hidrocarbonetos cíclicos insaturados

• íon significante m/z 54 vem de reação tipo Retro Diels-Alder, reação gera um fragmento

dieno e monoeno e pode ser bem específica da ligação dupla, mesmo em moléculas como

os terpenos e alcalóides.

Hidrocarbonetos aromáticos

• pico do íon molecular é normalmente bem intenso;

• processos de clivagem do anel aromático necessita de alta energia;

• posição no anel de substituintes alquilas tem pouca influência no espectro;

• séries de íons homólogos dos fenilalcanos ocorrem a massas correspondendo a

C6H5(CH2)n+ (m/z 77, 91, 105, 119,...) ;

• íon mais característico desta série corresponde a ruptura da ligação benzílica com perda

do maior grupo alquila;

• íon benzílico é estabilizado por ressonância.

Álcoois alifáticos saturados

• íon molecular diminui;

23

• dehidrogenação e dehidratação catalítica ou térmica podem gerar íons como (M - 2)+. ;

(M - 18)+. e (M - 20)

+. , embora também possam advir da fragmentação por impacto de

elétrons.

Álcoois alifáticos cíclicos

• clivagem a é favorável na ligação do anel mais substituída;

• reações posteriores pela eliminação de CnH2n leva aos íons característicos OE+. a m/z 44,

58, 72, 86,...

• perda de água é um caminho principal de decomposição do M+. .

Fenóis

• o pico (M - CO)+. , usualmente acompanhado pelo (M - CHO)+ , é especialmente útil no

reconhecimento dessa funcionalidade;

• íons (M - 18 )+. - “efeito orto”

• pico (M - 1)+ - advém da perda de hidrogênio benzílico

Cetonas e aldeídos alifáticos

• íon molecular das cetonas é usualmente observado; de aldeídos alifáticos de cadeia

longa é normalmente pequeno, mas pode ser identificado pelos fragmentos característicos

(M - H2O)+. e (M - C2H4)+. .

• pico CHO+ (m/z 29) é proeminente para aldeídos pequenos;

• clivagem a gerando (M - H)+ é apreciável somente quando RCO+ for bem estabilizado;

• clivagem α é mais proeminente em cetonas alifáticas;

• íon acílio mais abundante é usualmente formado pela perda do maior grupo alquila,

enquanto o íon alquila mais abundante é o mais estável

• apresentam as séries características a m/z 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, devido a

CnH2n+1CO+ e CnH2n+1 .

• rearranjo de hidrogênio γ seguido de clivagem � gera o íon enol (m/z 72, 100, 58) e seu

íon alqueno complementar.

24

Ésteres

• íon molecular é observado;

• sofrem clivagem α;

• sofrem clivagem β com rearranjo de H;

• ramificações leva a mudanças características na série do íon CH3OCO(CH2)n+ , m/z 59,

(73), 87, 101, ... com maior abundância nos carbonos terciários.

MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO

Na espectrometria de massas convencional as reações são unimoleculares.

Fatores que influenciam a abundância de um íon:

• estabilidade do íon produto (estabilização do íon por compartilhamento de elétrons; por

ressonância);

• íons radicais distônicos: isômeros com sítios de carga e radical separados :

• CH3NH2+. e . CH2N+H3 podem ser mais estáveis que seus correspondentes clássicos.

Regra de Stevenson

• ruptura de uma ligação simples em um íon OE+. pode levar a dois grupos de produtos: íon e

radical . Íon fragmento é usualmente o mais estável, o mais abundante;

• perda do maior grupo alquila

• estabilidade do produto neutro: H2 , CH4, H2O, C2H4, CO, NO, CH3OH, H2S, HCl,

CH2=C=O, CO2 ;

• efeitos estéricos/entropia.

Alcanos lineares

• espectro resultante tem vários picos com abundância variando regularmente

• aumento regular na abundância com o decréscimo de tamanho dos íons alquila

• estruturas de tamanhos menores, como C3H7+ e C4H9

+ , são estruturas de íons carbênio

ramificados mais estáveis

• distribuição dos íons é maximizada na região C3 e C4 dos alcanos maiores;

25

• alcanos substituídos com grupos eletronegativos que não diminuem significantemente a

energia de ionização (ex. Cl, Br, NO2, CN) apresentam efeitos semelhantes nas abundâncias

dos íons CnH2n+1+ .

• séries de íons de massa baixa

• vários grupos de picos separados por 14 u (série separadas por grupos CH2); outros tem

separações menores, 12 ou 13u (série de íons separadas por CH e C);

• geram informações sobre as subestruturas (heteroátomos, anéis, ligações duplas);

• indicador da presença de uma cadeia alquila.

INICIALIZAÇÃO DE REAÇÃO EM SÍTIOS RADICALARES OU DE CARGA

� predizer o caminho de decomposição preferida assume-se que as reações são iniciadas em

sítios favoráveis para os elétrons desemparelhados e para a carga positiva no íon em

decomposição.

� a dissociação resultante da inicialização por sítios radicalares e de carga são, respectivamente,

clivagens homolíticas e heterolíticas.

� facilidade de ionização: n >π > σ .

� o símbolo +. no final da molécula significa um íon com número ímpar de elétrons sem definir o

sítio do radical. Uso de . ou + na molécula , CH3+.CH3 , implica na localização do radical ou

carga.

26

27

28

MEDIDA DE MASSA EXATA (ALTA RESOLUÇÃO)

� medida da massa de um íon com acurácia suficiente gera uma identificação inequívoca de sua

composição elementar (e isotópica).

� técnica conhecida como espectrometria de massas de alta resolução;

� instrumentos de duplo foco ou FT/ICR são usualmente utilizados;

� elementos podem ser identificados desse modo pois os pesos atômicos monoisotópicos não são

números inteiros exatos;

� sendo 12C = 12,00000000, então 1H = 1,007825035, 14N= 14,00307400, 16O= 15,99491463.

� cada isótopo tem um único e característico “defeito de massa”, e a massa do íon, o qual mostra

o defeito de massa total, identifica sua composição isotópica e elementar.

� exemplo: íon com massa 43,0184 pode ser C2H3O+ e não pode ser C3H7+ (m = 43,0547) ou

C2H5N+ (m = 43,0421).

Mecanismos de Fragmentações de Classes de Compostos Orgânicos

29

Figura: Espectro de massas do 4-fenilcicloexeno e mecanismo de fragmentação do tipo retro-

Diels-Alder gerando seus principais fragmentos.

30

Figura: Espectro de massas do cicloexeno e do 3-metil-3-hexanol e mecanismos de fragmentação

de seus principais fragmentos.

31

Figura: Espectro de massas da 2-dodecanona e mecanismos de fragmentação, via Mecanismo de

McLafferty, de seus principais fragmentos.

32

Figura: Espectro de massas da 5-fenil-2-pentanona e mecanismos de fragmentação, via

Mecanismo de McLafferty, de seus principais fragmentos.

33

Figura: Espectro de massas do 3-metil-3-heptanol e mecanismos de fragmentação de seus

principais fragmentos.

34

Figura: Mecanismos de fragmentação tipo Mecanismo de McLafferty e mecanismo de perda de

molécula de água de álcoois lineares.

35

Figura: Espectro de massas da 2-metil-cicloexanol e mecanismos de fragmentação de seus

principais fragmentos.

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37

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40

41

42

IONIZAÇÕES BRANDAS IONIZAÇÃO QUÍMICA

Baseia-se na transferência de espécies carregadas entre um íon reagente e a molécula

alvo, produzindo um íon que pode ser analisado.Espécies formadas no modo positivo são

normalmente adutos entre a molécula alvo e íons pequenos como H+, H3O+ e NH4+ e, no modo

negativo, resulta da perda de prótons, captura de elétrons, dentre outros.

• espectros normalmente simples, com pouca ou nenhuma fragmentação;

• técnica bem sensível, pois a corrente de íons é concentrada em poucas espécies.

• realizada a altas pressões - relativa a utilizada no analisador de massas - e é extremamente

eficiente em se produzir íons.

Gás Afinidade por Próton, kcal/mol

Helio 42

Metano 127

Vapor de água 167

Isobutano 195

Amônia 207

• se molécula for ionizada com pouco acréscimo de energia, fragmentação será reduzida e o

íon molecular será mais abundante.

• impacto de elétrons de baixa energia aumenta o íon molecular mas há perda de sensibilidade.

• IQ - basicamente a molécula está rodeada pelos íons reagentes e a carga passa para a

molécula por uma interação química sem muita transferência de energia.

• prótons ou mesmo entidades grandes carregadas podem ser adicionadas a molécula sem

muita transferência de energia.

• gás reagente introduzido na fonte iônica (~0,5 - 1,0 Torr) a uma concentração de 104 :1 para

a amostra e é ionizada pelo bombardeamento de elétrons (~500V).

• maioria dos íons, o gás reagente é ionizado por IE.

• o íon R+. inicialmente formado pode reagir com outra molécula de R para formar espécies

iônicas reativas que depois ataca a molécula M da amostra.

R + e- → R+. + 2e-

43

R+. + R → RH+ + (R-H). ou RH. + (R-H)+

RH+ + M → R + MH+ (protonação)

(R-H)++ M → (R-2H) + MH+ (protonação)

(R-H)++ M → R + (M-H)+ (abstração de hidreto)

R+. + M → R + M+. (troca de carga)

• mais comum: protonação que é favorecida para moléculas com afinidade por próton maior

do que o reagente.

• abstração de hidreto: comum para moléculas com baixos valores da afinidade por próton

(alcanos).

• troca de carga: favorecido para reagentes de alta energia de ionização como hélio.

• energia interna da molécula ionizada resultante depende do reagente escolhido, temperatura

da fonte e pressão.

• Exemplo: acetado de lavanduila (PA = ~8.7 eV); CH4 (PA= 5.7eV); (i-C4H8 = 8.5eV);

(NH3 = 9.0eV)

• com metano: posterior fragmentação é quase completa para a espécie CH5+ altamente

exotérmica.

• com amônia: pouca reação (fragmentação unimolecular)

• metano pelo bombardeamento por elétrons gera: CH4+, CH3+ , CH2+, CH+, C+ , H2+ ,

H+ , algumas mais abundantes do que outras.

• íons mais proeminentes, 95% do total: CH5+ , C2H5 + , C3H5 + .

• CH4+ + CH4 → C2H5

+ + CH3

• C2H5+ + CH4 → C3H5

+ + H2

• São extremamente reativos, podem atacar a molécula, passando a carga para elas.

• pode-se gerar (M + 1)+ , (M + 29)+, (M + 41)+, normalmente apresentam maior estabilidade

do que o íon molecular por IE.

• Fonte iônica: aberturas são pequenas limitando o escapamento do gás para o vácuo. Alta

pressão na fonte também limita a passagem dos elétrons. É usual aumentar a voltagem de

energia dos elétrons.

44

• Metano: baixo valor de afinidade por próton e é mais provável de se observar o íon

molecular de um composto desconhecido do que utilizando-se isobutano ou amônia. É a

primeira escolha para uma ionização química de aspecto geral, especialmente para amostras

desconhecidas.

• desvantagem : alto grau de fragmentações.

• Amônia: alto valor de afinidade por próton. Previne fragmentações. Gás de difícil

manipulação, pois é corrosivo.

• Isobutano: também tem aplicação geral. Tem maior afinidade por próton do que metano,

menor grau de fragmentação (se ocorrer a ionização).

• Ionização Seletiva: técnica poderosa para compostos desconhecidos. Com a escolha

adequada do gás reagente é possível ionizar seletivamente um composto em uma mistura

complexa. Leva a um aumento significativo no limite de detecção.

• pode contornar problemas associados com a detecção e identificação de estereoisômeros.

Diferença em isômeros é responsável por pouca diferença de energia.

• IQ: sensibilidade e especificidade podem ser aumentadas para muitos compostos. Massa

molecular pode ser identificado. Menor fragmentação, gerando espectros mais simples e

mais fáceis de serem entendidos. Isômeros químicos e estereoisômeros podem ser

distinguidos. Compostos podem ser seletivamente ionizados em misturas complexas.

Informação obtida é complementar a IE.

• em adição aos gases, vapores como metanol podem promover a IQ.

• CL/EM: a fase líquida entra na fonte de íons, é vaporizada e se torna o reagente da IQ.

• Alcanos: abundante [M - H]+

• Alcenos: duas séries de íons

• [CnH2n+1]+ , consistindo do íon [M+ H]+ e dos íons derivados deles;

• [CnH2n]+ , consistindo do íon [M -H ]+ e fragmentos de menor massa derivados dele.

• observa-se também o M+. .

45

Figura: Espectro de massas por impacto de elétrons e por ionização química.

46

Figura: Espectros de massas do acetato de lavanduila por ionização química utilizando metano isobutano e amônia, respectivamente, como gás reagente.

47

Figura: Espectros de massas da 1-deidrotestosterona por ionização química utilizando metano como gás reagente e por impacto de elétrons do TriMetilSilil-derivado.

48

Figura: Espectro de massas da Reserpina por impacto de elétrons e ionização química utilizando metano como gás reagente. ELECTROSPRAY

� nova e poderosa técnica de ionização, produzindo gotas altamente carregadas a partir de

soluções.

� método de se gerar gotas altamente carregadas das quais íons são ejetados pelo processo de

evaporação.

� Evaporação do íon: é um processo no qual íons são emitidos de gotas carregadas diretamente

para a fase gasosa.

� pulveriza-se um líquido contendo íons pré-formados na forma de gotas carregadas e emissão

subsequente dos íons das gotas para a fase gasosa.

� Electrospray e Ionspray: um campo elétrico é gerado na extremidade do pulverizador

aplicando-se uma alta voltagem diretamente no pulverizador (4kV), com o contra-eletrodo

(1kV) localizado a milímetros. Íons de uma determinada polaridade são preferencialmente

49

atraídos para as gotas pelo campo elétrico enquanto são separadas do líquido. A separação é

incompleta e cada gota contém íons de ambos os sinais. Somente o excesso de íons de um

sinal se encontra disponível para evaporação e somente uma fração deles é que realmente

evaporam.

� gera somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo elétrico.

� operado a pressão atmosférica e temperatura ambiente.

� limitada a baixo fluxo: 1-10 ml /min.

� gera íons altamente carregados de compostos que possuam vários sítios de carga (peptídeos,

oligonucleotídeos). Situação vantajosa para a observação de espécies de alto peso molecular

onde cargas múltiplas produzem íons com valores de razão m/z na faixa de massas de um

instrumento tipo quadrupolo, permitindo a determinação rotineira de pesos moleculares de

compostos na faixa de kilodalton.

� uma proteína de peso molecular de 15.000 adicionada de 15 prótons, por exemplo, tem uma

razão massa/carga de 1000, sendo facilmente detectada por um quadrupolo.

� Eleva a capacidade de se detectar e medir acuradamente o peso molecular de compostos que se

encontram bem além da faixa de massa normal de um quadrupolo.

� gotas altamente carregadas são dispersas em aerosol de um capilar em um forte campo elétrico

a pressão atmosférica. Gás quente e/ou seco é aplicado nas gotas para auxiliar na evaporação

do solvente. Íons multicarregados expelidos das gotas durante o processo de evaporação são

então direcionados para um orifício de entrada para a região de vácuo do espectrômetro.

50

� um espectro de massas por ESI de uma proteína é caracterizado por uma série de picos de íons

carregando números diferentes de cargas (diferentes valores de massa/carga).

� “Software” é disponível para converter a multiplicidade dos picos dos íons oriundo de cada

espécie em um único pico correspondendo ao peso molecular da molécula neutra.

� solventes típicos são Água/Metanol 50/50 ou Água/ Acetonitrila contendo 1-5% de ácido

acético ou fórmico ;

� concentração de proteína de 1-10pmol/ml.

� ESI tem demonstrado futuro promissor na verificação de estruturas simples à caracterização de

substâncias desconhecidas. Pode-se obter informações em detalhes estruturais de ordens

maiores, isto é, mudanças na conformação induzida por solventes, na desnaturação refletida no

grau de protonação, mudança hidrogênio/deutério e estabilidade CID.

� Processo de emissão: mecanismo pelo qual íons podem ser emitidos de um líquido para a fase

gasosa.

� proposto inicialmente por Irebane e colaboradores em 1976. Quando uma gota carregada

evapora no ar, um ponto crítico pode ser atingido no qual é cineticamente e energeticamente

possível para os íons na superfície do líquido evapora para o ar.

� Geração da gota: gotas podem ser formadas de vários modos, todos envolvendo o rompimento

da superfície do volume de líquido com uma fonte de energia suficiente para sobrepor a

energia da superfície. Em um nebulizador pneumático, uma velocidade alta do jato de ar forma

gotas a partir do fluxo de líquido. Aplicação de um campo elétrico na extremidade do

nebulizador auxilia na dispersão das gotas e gera uma carga líquida em cada gota.

� ESI, um alto campo elétrico na superfície do líquido cria um stress elétrico, que gera gotas

sem a necessidade de qualquer jato de gás.

51

Figura: Esquema de uma interface fonte iônica à pressão atmosférica-analisador de massas,

utilizando uma cortina de gás, para minimizar a formação de adutos.

Figura: Espectro de massas da anidrase carbônica bovina, massa molecular de aproximadamente

29000 Daltons, a uma concentração de 12,5 pmol. Fonte iônica tipo eletronspray.

52

Figura: Espectros de massas utilizando Eletronspray como fonte iônica, da apomioglobina de

cavalo (superior; com o espectro de massas deconvolucionado) e do dímero da albumina bovina

(inferior).

IONSPRAY

Fonte de íons electronspray pneumaticamente assistido.

Características

� alta sensibilidade para compostos biológicos;

� íons moleculares sem degradação térmica;

� baixo consumo de amostra;

� compatível com uma variedade de métodos de separação (CL, CZE);

53

� determinação de peso molecular na faixa de massa do kilodalton.

Descrição

� nova técnica idealmente útil para a introdução de compostos polares e termolábeis em um

espectrômetro de massas;

� é uma fonte de íons a pressão atmosférica, na qual íons pré-formados em solução são emitidos

para a fase gasosa sem a aplicação de qualquer aquecimento.

� íons quase-moleculares podem ser gerados de compostos lábeis e de alto peso moleculares

sem degradação térmica;

� o líquido contido na amostra é bombeado através de um pulverizador, o qual é mantido a uma

alta voltagem de modo que uma neblina de gotas altamente carregadas são formadas;

� com a evaporação das gotas, íons são ejetados para a fase gasosa por um processo de baixa

energia, o qual não induz fragmentação;

� compostos com um ou mais sítios de carga são observados com íons mono ou multicarregados

como existiam na solução original

� pode ser conectado a sistemas de CL, gerando um sistema CL/EM e permite que

microvolumes de amostras sejam introduzidas a baixas velocidades de fluxo.

� a baixa velocidade de fluxo e alta sensibilidade o torna útil para novos métodos de separação

eletroforética como CZE, o qual vem se tornando altamente importante como técnica rotineira

de separação bioquímica. Análises completas podem ser realizadas com picomole, ou menores

quantidades de material, o que é útil quando somente se dispõe de pequena quantidade de

amostra.

� Geração de íons (mais comum): bombardeamento de moléculas gasosas com um feixe de

elétrons.

� Impacto de elétrons (70 eV) mistura de íons positivos e negativos e espécies neutras.

� Íons positivos são direcionados para o analisador pela aplicação de voltagem positiva no

repeller. Focalização pela voltagem aplicada nas lentes.

� Íons negativos e elétrons atraídos para um catodo positivo.

� Moléculas e fragmentos neutros não ionizados bombeados para fora do sistema.

54

+ - + - + - + - + + - + - + -+ + - +

+ - ++ - + - ++ -+ -+ + - + - ++ - +

+ -+ -+-+

++

++

+

O processo de emissãoO processo de emissão

Gota originalcontémíons de ambas aspolaridades sendouma predominante

Com a evaporaçãodo solvente, o campoelétrico aumentae os íons se movempara a superfície

A um campo elétricocrítico, íons sãoemitidos da gota

Resíduo involátilpermanececomo umapartícula seca

Figura: Esquema do processo de emissão que ocorre em uma fonte de íons tipo eletronspray.

Figura: Esquema representatio de uma interface CLAE/EM a pressão atmosférica do tipo

Ionzpray (Eletronspray).

TERMOSPRAY

� outro processo que cria gotas carregadas.

� Operado a baixa pressão e temperatura elevada, a qual é necessária para o processo de

pulverização e geração de carga, entretanto, leva a decomposição térmica de algumas espécies

sensíveis.

� Gera íons de ambas as polaridades.

� Não há aplicação de um campo elétrico externo, devido principalmente a pressão reduzida.

55

� O líquido é introduzido na fonte através de um tudo capilar, cuja extremidade é aquecida.

Controlando a temperatura consegue-se ejetar pequenas gotas da extremidade do nebulizador.

Figura: Esquema de uma espectrômetro de massas com fonte iônica do tipo Termospray.

� Termospray - Electrospray – Ionspray: como fontes de um espectrômetro de massas capaz de

gerar íons pseudo-moleculares de compostos iônicos e polares, as três técnicas diferem em

suas características. As diferenças se encontram principalmente em como as gotas são criadas

e carregadas e como os íons são amostrados, do que como os íons são realmente gerados.

� Electrospray e Ionspray: operados a pressão atmosférica e temperatura ambiente. Geram

somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo elétrico. Podem gerar

íons altamente carregados de compostos que possuem vários sítios de carga.

MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

• baseada na dessorção por laser de íons orgânicos, uma técnica inicialmente concebida no

início dos anos 70.

• técnica de dessorção por laser assistida por matriz introduzida por Hillenkamp e Karas

(1988)

• limitação de massa da dessorção por laser pode ser contornada colocando as amostras em

uma matriz sólida ou líquida que contenha substância que absorva na região ultravioleta.

56

• moléculas são dessorvidas e ionizadas com um pulso curto de fótons. Íons são gerados em

um ponto, em termos de espaço e tempo, o que torna MALDI altamente compatível com um

espectrômetro de massa com tempo de vôo.

• precedendo a análise, a amostra é misturada em um excesso molar de aproximadamente 1000

vezes com uma matriz apropriada de baixo peso molecular. Pequena quantidade é secada na

sonda.

• é importante que o comprimento de onda do laser coincida com o máximo de absorção do

composto da matriz. Este comprimento de onda não é absorvido pela molécula de interesse.

• matriz serve para absorver a energia do laser e prevenir a decomposição das espécies de

interesse; isolar as biomoléculas uma das outras para evitar agregação que deve interferir na

análise; aumentar a produção de íons.

• Matrizes: ácido nicotínico, ácido sinapínico (ácido trans-3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinâmico),

ácido ferrúlico (ácido trans-3-metoxi-4-hidroxicinâmico), ácido cinâmico, ácido

dihidroxibenzóico, dentre outros que possuem absorção intensa a 320-350nm.

• Laser: Nd-YAG (neódio-ítrio-alumínio-granada); nitrogênio; IR.

• a absorção da luz do laser leva a dessorção dos íons relacionados a matriz e a molécula

intacta.

• íons produzidos são predominantemente de cargas z =+1 e z =+2

• Aplicações: a espectrometria de massas com ionização/dessorção a laser assistida por uma

matriz tem emergido como um método de determinação do peso molecular de peptídeos e

proteínas.

• oligonucleotídeos, oligossacarídeos, glicoconjugados, ligninas e polímeros sintéticos.

• característica fascinante: faixa de massa prática extensa.

• útil na análise de proteínas simples como as conjugadas. Proteínas consistindo de

subunidades ligadas não covalentemente podem ser desorvidas como se fossem uma só

unidade:

• Exemplo: glicose isomerase: 4 subunidades idênticas.

• o espectro de massas utilizando ácido nicotínico como matriz é dominado pelo pico do

tetrâmero. Utilizando ácido sinapínico, somente o íon molecular da subunidade monomérica

é observado, possivelmente porque a solução dessa matriz denatura a proteína. Isto indica

que a dessorção por laser pode refletir a conformação da molécula antes da dessorção.

57

• proteínas com pesos moleculares superior a 200.000Da tem sido analisadas, assim como um

grande número de glicoproteínas.

• Gramicidina S sintetase: 512KDa

• Anticorpo: contém pouco ou nenhum pico que possa ser atribuído a fragmentos formados

durante ou antes da dessorção.

• tolera impurezas das amostras comumente encontradas em amostras de origem biológicas,

tais como sais e tampões.

• não é fácil de ser hifenado.

• o uso de MALDI-TOF-MS na caracterização de produtos naturais foi demonstrado pelo

estudo de taxanos.

• a observação dos íons [M + H]+ , [M + Na]+ e [M + K]+ confirmam o peso molecular.

Fragmentos correspondendo a perda de substituintes também é observado, gerando

informações estruturais.

• melhores matrizes em termos de abundância e reprodutibilidade dos espectros foram 4-

nitroanilina e 4-nitrofenol.

• menos de 5 min foram gastos na aquisição e calibração de um espectro de massas

• foram examinados para dessorção a 337 nm.

• espectrômetro de massas com tempo de vôo linear.

• fonte de laser a 337 nm, laser de nitrogênio .

• íons acelerados a 10KV e detectados utilizando um detector padrão de dual microchannel

plate.

L a s e r

M a tr iz c o n te n d oa a m o s tra

A ltaV o lta g e m

Ío n s

D e te c to r

M a tr iz é o a s p e c to c h a v e d o M A L D I-T O F -M SM a tr iz é o a s p e c to c h a v e d o M A L D I-T O F -M S

58

59

Figura: Espectro de massas da albumina sérica bovina obtida por analisador de massas do tipo

tempo de vôo e laser para desorver e ionizar a molécula. Massa molecular de 66650 Daltons.

PDMS - Plasma Dessorption Mass Spectrometry

• dessorção por plasma foi desenvolvida por Macfarlane colaboradores em 1974;

• são empregados fragmentos decorrentes da fissão do elemento Califórnio (252 Cf →

142Ba18+ + 106Tc 22+ ) para ionizar compostos termolábeis.

• envolve exposição de uma amostra não volátil ao impacto com fragmentos de alta energia.

• ionização obtida pelo impacto de íons primários com energia da ordem de 100MeV

• análise de massas é efetuada com tempo de vôo. 105 - 107 espectros são acumulados para se

obter íons estatisticamente suficientes.

• não é possível utilizar EM-EM utilizando-se tubos de vôo retos.

• acoplamento com técnicas de separação não é possível.

• Vantagens: tolerância a impurezas, sensibilidade e simplicidade. Estas estão relacionadas ao

uso do suporte de nitrocelulose.

• tem sido útil na obtenção de pesos moleculares.

• são gerados fragmentos e podem gerar informações parciais sobre o seqüenciamento de

peptídeos e pequenas proteínas.

• a técnica pode determinar massas até ~ 35 Kda.

60

LIQUID SIMS

• espectrometria de massas de íons secundários.

• a ionização por “Liquid SIMS” (LSIMS) é obtida quando íons primários de Césio,

acelerados a 30-35 kV colidem com uma amostra posicionada sobre uma superfície e são

produzidos íons (íons secundários).

• ions secundários são produzidos como resultado do bombardeio de uma superfície (SIMS) ou

de um filme de líquido (LSIMS) por um feixe de íons acelerados.

• tem sido utilizado para a análise da superfície de materiais inorgânicos (como SIMS) e, mais

recentemente, para substâncias orgânicas pouco voláteis (como LSIMS)

• os resultados obtidos por FAB e LSIMS são comparáveis.

• sugere-se que LSIMS seja mais sensível devido à possibilidade de focalização para o feixe

de íons de Césio.

V a c = 8 k V+ + +

V a c + 3 5 k V

C s +

C s +

C s +

61

Técnicas Hifenadas

• acoplamento em linha (“on-line”) de métodos é de grande potencial na química analítica.

• seletividade da amostra pode ser ajustada , levando a uma maior velocidade de análise ou

uma melhora nos limites de detecção.

• técnicas hifenadas ⇒ acoplamento de um método de separação como a cromatografia

com fase gasosa (CG), cromatografia com fluido supercrítico (SFC), cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) ou métodos por eletromigração (eletroforese em zona

capilar - CZE) com a espectrometria de massas.

• consiste em diferentes blocos ⇒ preparação da amostra, separação, interface, detecção

e aquisição/manipulação dos dados.

• técnica de separação, interface e a técnica de ionização estão se tornando indistinguíveis

como unidades separadas nos novos sistemas

CL/EM

• CLAE tem se tornado uma das técnicas mais utilizadas na análise de compostos

orgânicos.

• tem vantagens sobre a cromatografia com fase gasosa pois os compostos não precisam

ser vaporizados para a análise, necessita-se menos pré-tratamento da amostra e tem maior

grau de seletividade .

• limitação da CL é a ausência de um detector universal como o detector por ionização

com chama na CG.

• EM gera especificidade, seletividade e sensibilidade e informação estrutural na análise de

compostos orgânicos.

• a faixa de técnicas de ionização e a faixa de massa analisável, permite a análise de um

grande número de compostos orgânicos.

• CL/EM é atualmente utilizada routineiramente. Permite análise quali e quantitativa.

Interfaceamento CL/EM

MBI - acoplamento via correia móvel

PBI - feixe de partícula (“particle beam”)

HNI - nebulizador aquecido

CF-FAB - FAB com fluxo contínuo

62

TSP - acoplamento com nebulizador aquecido

ESI - acoplamento e ionização por nebulização em um campo elétrico.

• interface de primeira geração como a de correia móvel se procura contornar a aparente

incompatibilidade entre a introdução de um líquido em um alto vácuo pela remoção do

líquido.

• interface de segunda geração, métodos de ionização brandas foram acoplados com a

introdução dos líquidos, por exemplo: CF-FAB.

• sistema CL/EM de terceira geração, o interfaceamento e a ionização emergem como uma

técnica combinada. O método de interfaceamento é simultaneamente uma técnica de

ionização, como no caso do termospray e electrospray.

E stra tég ia d e In te r fa cea m en to C L /E M

E flu en te d a C o lu na

N eb u lização

D esso lu ção d a g o ta

Io n ização n a fase g aso sa

E v ap o ração d o Ío n

T S P , E S I, H N I

Io n ização D ire ta

C F -F A B

R em o ção d o S o lv en te

S o lu to V ap o rizad o

Ion ização

M B I, P B I

63

Interrelações entre a polaridade do soluto, Interrelações entre a polaridade do soluto, a interface e aa interface e a

velocidade de fluxo permitida velocidade de fluxo permitida

Apolar Polar Iônico MBI

PBITSP , HNI

CF-FAB

ESIESI

Faixa veloc. fluxo

ml/minµl/min

Fase ReversaFase Reversa(Fase Móvel(Fase MóvelÁgua/Metanol Água/Metanol (8:2) (8:2)

Ion-exchangeIon-exchangeIon-parIon-par

Fase NormalFase Normal(Fase Móvel(Fase Móvelex. Hex./solv. ex. Hex./solv. Polar 9:1)Polar 9:1)

Interface CL/EM via Nebulizador Aquecido (interface ao API)

� Características

� aceita fluxo total de uma coluna de grande diâmetro sem a nessecidade de divisão

� fase móvel aquosa até 100% de água

� velocidade de fluxo maior 1,0 ml/min

� possibilidade de uso de tampões voláteis e não-voláteis

� vaporização por pulverização de involáteis e compostos lábeis com o mínimo de degradação

térmica

� espectro simples ideal para EM/EM

� pode ser utilizado para introdução rápida de amostra sem a CL.

As necessidades de um sistema CL/EM são:

� confiança

� compatível com tecnologia padrão de colunas para CL

� aceitação de fase móvel aquosa e tampões comumente utilizados pelos utilitários dos

cromatógrafos

64

� sensibilidade

� especificidade não voláteis e compostos

� Cromatografia líquida está rapidamente se tornando o método de escolha na separação de

compostos que não podem ser analisados por cromatografia gasosa devido a sua baixa

volatilidade.

� o eluente de uma coluna cromatográfica de grande diâmetro é introduzido diretamente na fonte

API onde o líquido é pulverizado em um vaporizador aquecido brandamente.

� rápida retirada do solvente e vaporização das gotas minimiza a decomposição térmica e

preserva a identidade molecular para a ionização por transferência de próton na fonte APCI.

� introdução de toda a amostra da coluna resulta no limite de deteção na faixa do picograma.

� tampões são tolerados pela fonte a pressão atmosférica sem problemas de contaminação

significante e a rápida vaporização do eluente pulverizado permite o uso de 100% de água.

Descrição da Interface

� consiste em um pulverizador acoplado a uma câmara aquecida de dessolução/vaporização.

� o eluente flui através de um tubo de aço inoxidável de grande diâmetro diretamente a um

nebulizador onde é convertido em uma neblina fina por um jato de ar ou nitrogênio a alta

velocidade.

� gotas são carreadas por uma capa de gás.

� o gás aquecido (120oC) e a mistura da amostra fluem do tubo para a região de reação da fonte

de API onde a amostra é quimicamente ionizada pela transferência de carga ou de próton pelos

íons reagentes.

� a fase móvel vaporizada atua como gás reagente, produzindo íons [M+H]+ no modo positivo e

[M-H]+ no modo negativo.

� a cortina de gás previne que qualquer solvente, amostra ou tampão entre a região do analisador

e mantém o sistema de vácuo, lentes e os polos do quadrupolo sem contaminação.

� moléculas agrupadas (“clustered”) são retiradas dos íons ao passarem pela cortina de gás e

pelo orifício de amostragem atmosfera-vácuo.

� a grande quantidade de solvente, amostra e tampão que são constantemente pulverizados para

a fonte são carreados pelo fluxo de gás para fora da região de reação de 760 Torr. Uma bomba

de ar é utilizada para bombear o gás para fora da fonte.

65

Vaporização da amostra

� a incompatibilidade entre CL e EM tem sido a dificuldade de se converter moléculas

relativamente não voláteis solvatadas em um líquido em uma molécula gasosa sem induzir

decomposição excessiva.

� processo nesta interface é um de se dispersar o fluxo de líquido na forma de pequenas gotas

suspensas em um gás carreador.

� a uma temperatura suficientemente alta, as gotas são vaporizadas a uma velocidade que

permite que moléculas orgânicas intactas sejam dessorvidas das gotas ou partículas com o

mínimo de decomposição térmica.

� o processo de evaporação por pulverização rápida atua para preservar a identidade molecular

de compostos involáteis e relativamente lábeis, para formar um vapor molecular no gás

carreador útil para uma ionização química branda.

Ionização da amostra

� as moléculas da amostra vaporizada são carreadas no fluxo de gás direto para uma região de

reação íon-molécula a pressão atmosférica

� a ionização primária cria íons reagentes do vapor do solvente o qual flui através da região.

� a probabilidade de fragmentações durante a ionização é pequena e resulta em íons moleculares

e quase-moleculares .Gera informações sobre o peso molecular e o domínio dos íons quase-

moleculares é ideal para experimentos EM/EM onde se obtém informações estruturais.

66

67

(A) m/z 195 (B) Figura: CLAE/EM utilizando ionização química a pressão atmosférica no modo negativo. Fragmentograma do íon m/z 195 e espectro de massas do 2,4,6-triclorofenol de uma amostra de água de rio.

Figura: CLAE/EM-MSI utilizando ionização química a pressão atmosférica no modo positivo.

Fragmentogramas dos íons m/z 252, m/z 238, m/z 216 e m/z 202, característicos dos herbicidas

alachlor, metolachlor, atrazina e simazina, e cromatograma de íons totais (CIT; TIC) de uma

amostra de água de rio.

100 150 200 250 m/z0

100

%

21.00 21.75 22.50 23.25 24.00 24.75 25.50tR 0

100

%

195 197

199

68

CG/EM

� vem se tornando rotineiro desde a década de sessenta.

� o acoplamento de um método de separação como a cromatografia com fase gasosa com a

espectrometria de massas aumenta grandemente a especificidade da análise e a CG/EM é

atualmente uma ferramenta rotineira na análise de misturas orgânicas complexas.

� Aplicações: estudos estruturais, para compostos desconhecidos, análise de misturas (obter

informações de muitos componentes ou identificar e quantificar alguns componentes).

� Principais limitações: vaporização térmica da amostra seguida pela ionização na fase gasosa;

somente moléculas apolares ou de média polaridade, termoestáveis e volatilizáveis são

analisadas. Moléculas polares somente são analisadas via derivatizações.

� Exemplo: açúcares, álcoois, ácidos, moléculas polifuncionalizadas.

� maioria dos compostos de interesse biológico não se vaporizam ao serem aquecidos.

Derivatizações se faziam necessárias.

� problemas com as colunas empacotadas: baixas eficiências das colunas e grande tempos de

retenção.

� Colunas capilares permitem a separação de misturas com alta resolução. Desta forma, é

possível analisar misturas cada vez mais complexas em espaços de tempo cada vez menores.

� As quantidades de amostra que podem ser injetadas nas colunas capilares são muito pequenas,

acarretando a necessidade de injetores especiais e detectores mais rápidos e sensíveis.

� o espectrômetro de massas pode ser acoplado diretamente ao cromatógrafo a gás, de modo que

os componentes que eluem vão diretamente para a fonte de íons, que operam sob vácuo. Desta

forma, uma parte da coluna trabalha em pressões baixas. Portanto, o controle do gás de arraste

é mais crítico, havendo sempre alguma perda da eficiência da coluna.

� Gases: hélio (melhor e mais caro) e Hidrogênio (explosivo e mais barato). Com estes gases as

colunas capilares trabalham com maior eficiência de separação.

� “SCAN”: velocidade de varredura dos espectros.

� os tempos de varredura são suficientemente rápidos para permitir a obtenção de vários

espectros de massas completos durante a eluição de um único pico (vários espectros de massas

por segundo) na unidade de cromatografia com fase gasosa.

� velocidade de varredura afeta a acurácia da medição íon-molécula.

69

� ideal é que sejam obtidos de 8 a 15 medidas de cada pico. Caso sejam efetuadas um número

menor de medidas, pode-se perder informações do cromatograma, comprometendo a sua

resolução.

� Já um número excessivo de medidas pode provocar o acúmulo desnecessário de informações,

saturando a capacidade do disco e tornando demoradas as operações de tratamento dos dados

adquiridos.

� Cromatogramas de massas ou fragmentogramas: são o registro da variação da intensidade

correspondente aos íons de uma determinada relação m/z.

� “SIM” : Monitoramento Seletivo de Íons - MSI.

� descreve a operação na qual as intensidades de vários íons específicos são registrados ao invez

do espectro de massas inteiro.

� alta especificidade e sensibilidade de detecção podem ser obtidos para compostos escolhidos

previamente.

70

Figura: Fração de hidrocarbonetos aromáticos do material particulado da atmosfera de Campos dos Goytacazes, amostrado em 21/11/97 no sítio Corpo de Bombeiros, centro da cidade.

(A) Cromatograma de íons totais (CIT); (B) Fragmentograma m/z 152, pico base do acenaftileno.

71

Figura: Análise do extrato orgânico total de uma amostra de sedimento de um afloramento de

Jundiaí, Bacia do Parnaíba (Maranhão):

(C) Cromatograma de íons totais (CIT); (D) Fragmentograma m/z 219, pico base do reteno.

16.00 20.00 24.00 28.00 32.00

16.00 20.00 24.00 28.00 32.00

(A)

(B)

72

SUMÁRIO CG/EMSUMÁRIO CG/EM

VARREDURA LINEAR

☺PERFIL TOTAL DA AMOSTRA☺ESPECTRO DE MASSAS

DETECÇÃO DE COMPONENTESTRAÇOS

MONITORAMENTO SELETIVO DEÍONS (MSI)

☺DETECÇÃO SELETIVA☺DETECÇÃO DE COMPONENTES

TRAÇOS☺PERFIS DE DISTRIBUIÇÃO DE

FAMÍLIAS CONHECIDASNÃO EXISTE ESPECTRO DE MASSAS

73

CROMATOGRAFIA GASOSA-CROMATOGRAFIA GASOSA-ESPECTROMETRIA DE MASSASESPECTROMETRIA DE MASSAS

ANÁLISE DE MISTURAS COMPLEXASANÁLISE DE MISTURAS COMPLEXAS

ENVOLVENDO

SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA DEMISTURAS COMPLEXASIONIZAÇÃO DE COMPOSTOSSEPARADOSSEPARAÇÃO DOS ÍONSDETECÇÃO DOS ÍONSANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DOS ÍONS

74

Figura: Análise de uma mesma amostra contendo fenantreno e antraceno (mesma concentração, mesmo volume de injeção). Não se atenha a diferença no tempo de retenção. (A) fragmentograma m/z 178; (B) Monitoramento seletivo do íon m/z 178.

(A)

(B)

75

76

Figura: CG/EM-MSI, fragmentos m/z 191 e m/z 218, íons característicos de série de hopanos e

αββ esteranos de fração de hidrocarbonetos alifáticos de amostra de petróleo de bacia brasileira.

CZE/MS

• Eletroforese de zona capilar (“CZE”) e a espectrometria de massas (“MS”) foram

interfaceadas em 1987

• tem emergido como uma aquisição importante no campo da química analítica, combinando

velocidade e alta eficiência de separação e baixo consumo de amostra gerado pela CZE, com

a sensibilidade e universalidade da espectrometria de massas.

• CZE é uma técnica de separação de compostos iônicos em um tubo aberto pela aplicação de

um gradiente de voltagem. Compostos migram diferentemente pelo tubo como resultado de

sua mobilidade eletroforética. O fluxo eletroosmótico da CZE líquida é uma técnica

instrumentalmente simples, utilizando normalmente um capilar de sílica fundida (50-100 cm)

contendo uma solução tampão como coluna de separação, aplicando-se uma voltagem de 20-

20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

m/z 191

T21 T23

Ts

H30

G H31

H33

H35

H29

35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0

m/z 218

C29αββ

C28αββ

C27αββ

R

S

77

60kV em uma das extremidades da coluna e com detecção UV ou fluorescência através das

paredes do capilar.

• os diâmetros dos capilares são de 100microns ou menores no sentido de minimizar

gradientes térmicos através do tubo, o qual pode romper o fluxo laminar e destruir o processo

de separação.

• amostras são introduzidas por métodos eletroforéticos (voltagem induzida) ou hidroestática

(sifon), com volumes de injeções na ordem de 1-200nL.

• moléculas biológicas como peptídeos, proteínas e nucleotídeos tem demonstrado eficiência

de separação tão alta quanto 106 pratos teóricos utilizando CZE.

• o fenômeno de eletroosmose produz fluxos de líquidos de sub-mL/min na direção impressa

pela polaridade da voltagem e pela química de superfície do capilar de separação.

• Smith e colaboradores (1988) desenvolveram uma interface via electrospray para a CZE/MS,

sendo atualmente o método de ionização em espectrometria de massas mais favorável.

• a interface faz um contato elétrico com o tampão eletroforético por intermédio de uma

pequena agulha ou um fino filme de metal depositado na superfície do capilar. O solvente da

nebulização produzida deste modo é evaporado com N2 quente antes que os íons entrem no

analisador de massas.

• quando informações adicionais são necessárias utiliza-se a espectrometria de massas

“tandem” com o modo de varredura de íon filho.

• Desvantagem da CZE: pequeno volume de amostra que pode ser injetado. Resultado é a

necessidade de soluções mais concentradas a ser injetadas do que ocorre na CL/EM.

• Lee e colaboradores (1989) descreveram uma variação da interface via electrospray, a

interface Ionspray para CZE/MS e CZE/MS/MS.

• uma interface via FAB com fluxo contínuo também foi descrita para CZE/MS. Nesta, o

efluente da CZE é combinado com um fluxo de matriz glicerol-água via um capilar de sílica

fundida coaxial.

As fontes de Electrospray e Ionspray resultam em:

• produção de íons de espécies carregadas em soluções aquosas, como preferido na CZE;

• processo de ionização a temperaturas ambiente suaves para compostos lábeis.

78

• formação de cargas múltiplas o que amplia a faixa de massa do analisador e permite a análise

de biopolímeros na faixa de massa do kDa, uma aplicação típica de CZE.

• utilização do sistema EM/EM, gerando informações estruturais e/ou alta especificidade de

análise.

ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM TANDEM

� Dissociação induzida por colisão – DIC: fragmentação de um íon poliatômico após colisão

energética com um gás de colisão (CID - “collision induced dissociation”)

� Conceito básico: medição das razões massa/carga de íons antes e depois da reação no

espectrômetro de massas

� mp+ → md+ + mn

� mp+ → íon pai

� íon pai X íon molecular

� íon molecular é o íon de massa equivalente ao peso molecular do composto introduzido; pode

ser selecionado como íon pai;

� íon pai não necessariamente é um íon molecular, fragmentos formados na fonte de íon são

freqüentemente selecionados como íons pai

� md+ - íon filho, indicando uma relação direta entre ele e o íon pai;

� mn - fragmento neutro formado na reação de dissociação. Como o espectrômetro de massa

só analisa partículas carregadas, esta espécie não é detectada. mp+ e md+ são medidas, mn é

inferido.

� Experimento básico: seleção do íon pai no primeiro estágio de análise em um instrumento e

depois a análise dos íons filhos, freqüentemente formado em um processo DIC, no segundo

estágio. Uma barreira de energia de ativação deve ser ultrapassada antes que a reação possa

ocorrer.

� admitindo-se um gás de colisão em uma região de reação para induzir dissociações ativada

por colisão do íon pai com um gás de colisão inerte (DIC) coração da EM/EM. Energia extra

adicionada a mp+ .

� mp+ N md+ + mn

� instrumentos de baixa energia, se o gás for espécie quimicamente reativa, pode ocorrer uma

reação de associação íon/molécula;

79

� mp+ + N → md+ + mn

� Varredura do íon filho: a massa do íon pai é fixada e as massas de todos os íons filhos

formados a partir deste íon pai são medidos, isto é, md1+ , md2+ , md3+ .

� é essencialmente o espectro de massas de um íon em um espectro de massas.

� íons filhos são normalmente característicos da estrutura do íon pai e é um modo de se

determinar sua estrutura.

� o primeiro estágio de análise de massas seleciona íons de uma razão m/z particular (íon pai)

de todos os íons inicialmente formados. Este íon pai selecionado passa através da região de

reação. Íons filhos formados da dissociação do íon pai na região de reação são analisados;

� espectro analítico único da EM/EM - estudar misturas desconhecidas rapidamente em

relação a uma classe de compostos

� Varredura de perda de fragmento neutro: experimento EM/EM especificando-se mn ;

muitos íons se dissociam pela perda de uma molécula neutra pequena associada ao grupo

funcional ou subestrurura do íon pai.

� identifica todos os íons pais de uma mistura que se fragmentam pela perda de um fragmento

neutro de massa definida;

� confirmação da identidade do grupo funcional pode ser obtida pelo espectro de íons filhos do

íon pai identificado pela varredura de perda de fragmento neutro;

� vantagem: significante ganho de velocidade de análise, evitando-se identificar todos os

componentes de uma mistura se somente uma classe definida de compostos é de interesse.

� Varredura de íon pai: md+ é a variável independente

� classe de compostos pode incluir uma subestrutura particular que forma um íon bem estável.

Íons pais derivados de membros desta classe tendem a se dissociar levando a um íon desta

subestrutura. Quando há um íon filho comum, este pode ser fixado e se faz uma varredura

para detectar todos os íons pais.

� EM/EM: limites de detecção melhores do que um espectrômetro de massas de estágio único.

� A sensibilidade e limite de detecção de um espectrômetro de massas não está limitado pelo

ruído do detector mas pelo ruído “químico”.

� Ruído Químico: sinal medido no espectro de massas devido a geração de íons de outros

componentes da amostra, contaminação de fundo da amostra do sistema de introdução de

amostra e da fonte de íons do espectrômetro de massas.

80

� Maior sensibilidade e limites de detecção são obtidos na EM/EM, pois o primeiro estágio de

análise de massas filtra muito deste ruído “químico”.

� Monitoramento Seletivo de Íons (MSR): experimento que atinge o menor limite de detecção

possível para um determinado composto na EM/EM de íon filho.

� todas as variáveis são fixadas.

� o primeiro analisador de massas é fixado para selecionar um determinado íon pai e o segundo

analisador de massas é fixado para selecionar um determinado íon filho. Análogo ao

monitoramento seletivo de íons (MSI).

� aumentar especificidade: EM/EM/EM: o íon filho selecionado se fragmenta em uma segunda

região de reação, e um íon “neto” é selecionado por um terceiro analisador de massas.

� Ativação por colisão: processo no qual um íon colide com um gás de colisão e uma parte da

energia do íon é convertida em energia interna do íon. No caso em que há uma subsequente

dissociação do íon na mesma região de reação, o processo é denominado dissociação induzida

(ou ativada) por colisão (DIC ou DAC).

� Região de reação: região usualmente entre os analisadores, em um instrumento de setores, no

qual um íon pode sofrer uma mudança na massa e/ou carga. Em espectrômetro de massas

baseados em setores esta região de reação é normalmente referida como “região livre de

81

campo”. Outros instrumentos têm regiões de reação nos quais campos elétricos são utilizados

para confinar um fragmento.

82

Figura: Sistema triplo quadrupolo da Varian e parâmetros a serem ajustados.

83

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85

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98

Figura: Espectrometria de Massas utilizando analisador tipo “Íon Trap”, EM6.

Espectrometria de massas aplicada a peptídeos e proteínas

99

• devido ao tamanho, polaridade e baixa volatilidade dos peptídeos e proteínas, sua análise por

espectrometria de massa só se tornou realmente útil após a descoberta da técnica de ionização

por dessorção, a PDMS em 1974 e FAB em 1981.

É necessário que a técnica seja aplicada a

• proteínas/peptídeos simples

• proteínas/peptídeos conjugados (a carboidratos, lipídeos, fosfatos)

Produzindo

• peso molecular (Mr)

• estrutura covalente (sequência, grupos modificantes)

• estruturas não-covalentes (conformação, interação)

Gerando

• faixa de massas alta

• alta precisão na determinação da massa

• compatibilidade EM/EM

• capacidade de análise de misturas

• tolerância frente a impurezas

• alta sensibilidade

• simplicidade

Performance necessária na técnica analítica

� desejável a obtenção de faixa do peso molecular por volta de 1MDa e uma exatidão de 1Da.

� maioria das técnicas de ionização são brandas

� fragmento é limitado e a informação estrutural é escassa.

� obtenção de informações estruturais detalhadas EM/EM

� pode-se manipular picomole e com certos métodos de separação atinge-se femtomol com

CLAE capilar e eletroforese

PDMS

� limite prático tem sido 20-35kDa, para proteínas simples ou conjugadas

100

� não tem sido eficiente na análise de glicoproteínas, proteínas altamente fosforiladas e

metaloporfirinas.

� acoplamento com técnicas hifenadas não é possível

� útil na obtenção dos pesos moleculares

FAB

� faixa de massa prática 10-15kDa, bom para proteínas e peptídeos pequenos

� de grande valor é a compatibilidade da técnica EM/EM com FAB no estudo estrutural

detalhado.

ESI

� determinação de massa precisa de pedaços de DNA com massa molecular até 100MDa foi

obtida por ESI/FT/ICR/MS

� a espectrometria de massas pode sem dúvida substituir o método padrão de sequênciamento de

peptídeos e proteínas, degradação de Edman.

� somente instrumentos que utilizam alta energia de colisão como o espectrômetro de massas de

4-setores, podem distinguir entre leucina e isoleucina, as quais apresentam a mesma massa.

� 1990 - foi demonstrado o uso da EM na determinação da conformação de proteínas. Gera

informações a respeito do estado conformacional de proteínas.

� determina-se a estrutura de adutos de DNA - DNA modificados por interações com compostos

carciongênicos e drogas

� Exemplo: uso da EM/EM par determinar a estrutura de adutos de Hidrocarbonetos Policíclicos

Aromáticos (HPA’s - carciongênicos) com DNA. Pode-se distinguir diferenças estruturais

pequenas em HPA-DNA ao nível do subpicomole.

• McLafferty e colaboradores utilizaram a EM para estudar a mudança Hidrogênio/Deutério na

fase gasosa, baseado no conceito de que o número de prótons que sofrem mudança na fase

gasosa é uma medida dos prótons situados no exterior da extrutura tridimensional da proteína

na fase gasosa.

MALDMS

• especialmente vantajoso na análise de proteínas bem grandes e proteínas conjugadas

Como medir a Massa Molecular de uma proteína

101

• o programa do sistema calcula automaticamente a MM de uma proteína

• o espectro de massas de uma proteína obtido via ESI consiste em uma série de picos, cada um

representando um íon da molécula da proteína contendo um número específico de prótons.

• os íons tem a fórmula geral (M+nH)n+

• M é a massa molecular da proteína

• n é o número de prótons (cargas)

• H é a massa do próton (1,00794)

• o espectrômetro de massas mede a razão massa para carga (m) de cada pico como m

= (M+nH)/n

• segue-se que a MM (M=n(m-H)) pode ser rapidamente calculada pela razão massa para carga

medida se n for achado.

• pode-se determinar n através de qualquer dois picos consecutivos diferindo de um próton na

série

• m2 =(M+nH)/n m1= (M+(n+1)H)/(n+1)

• onde m2 e m1 são as razões massa/carga medidas de quaisquer dois picos com n e n+1

prótons respectivamente

• resolvendo as duas equações acima, a carga n de m2 é determinada como

n= (m1 -H)/(m2 - m1)

102

103

REFERÊNCIAS

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