espectrometria de massas - princípios e aplicações
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ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
- PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES
Lhaís Leal
Márcia Vieira
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Mass Spectrometry -MS
Técnica analítica de identificação, quantificação e
caracterização molecular e estrutural de amostras,
com base na sua composição elementar.
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Princípio
Ionização - formação de íons livres
Fragmentação e detecção desses íons com base
na sua relação de massa/carga(m/z)
Registro do número de íons formando um
espectro de massas
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Espectrômetro de massas
• Identificar compostos desconhecidos.
• Quantificar materiais conhecidos.
• Elucidar as propriedades químicas e estruturais das
moléculas
• Medir a massa molecular de alguns compostos.
• Determinar modificações pós-traducionais de proteínas.
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Aplicações
• Análise de proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos.
• Na indústria farmacêutica.
• Aplicabilidade clínica: análise de hemoglobina, teste de
drogas, “screening” neonatal.
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Primeiros MS
• 1897, descoberta do
elétron por J.J. Thomson• Tubo de raios catódicos
• e- como partícula subatômica
que circunda o núcleo atômico
das moléculas.
• 1907, “Espectrógrafo de
massa” rudimentar.
• 1909, descoberta de isótopos
estáveis do gás Neon.
• 1919, Aston aprimorou o
espectrômetro de massa.
J J. Thomson
Fonte das imagens:http://www.mundofisico.joinville.udesc.br
F. W. Aston
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Componentes básicos
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Como uma amostra é analisada?
Introdução
da amostra
IONIZAÇÃO
Formação
de íonsAnalisador de
massa (m/z)
SEPARAÇÃO
Detector
DETECÇÃO
Ions detectados
ANÁLISE DOS DADOS
ESPECTRO DE MASSAS
•Líquida
•Gasosa
•Sólida
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Introdução da amostra
• Amostras: • Sólidas
• Líquidas
• Gasosas
• Técnicas cromatográficas acopladas ao MS.
Ex.: LC/MS e GC/MS
• Eletroforese
• Inserção direta.
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Métodos de ionização
• O método escolhido depende da complexidade
da amostra:
• Ionização em fase gasosa.
• Por dessorção.
• Por evaporação.
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Ionização
química a pressão
atmosférica(APcI)
[M+H]+=M+ou M-
Impacto de elétrons (EI):
M+
Ionização em fase gasosa
(Phase-gas)
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Dessorção
Dessorção em campo(FD)Emissor de metal com
microagulhas de carbono
Bombardeamento
rápido de átomos
(FAB)Feixes de argônio ou xenônio
Dessorção
de plasma
(PDMS)Fissão de Californio 252
Dessorção a Laser
Matriz-assistida
(MALDI)
Dessorção: a transferência de átomos, moléculas ou agregados de um sólido para a fase gasosa.
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Por evaporação
Electrospray (ESI)Formação de aerossol
ThermosprayIonização por
aquecimento
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Análise de proteínas por MS
2DE
Recorte dos
spots de interesseDigestão com tripsina
Com ou sem cromatografia
MS
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MALDI
Fonte: http://www.chm.bris.ac.uk/ms/newversion/maldi-ionisation.htm
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Electrospray (ES)
Fonte: http://www.magnet.fsu.edu
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Analisador de massa
• Tem por objetivo separar os íons que são
produzidos na fonte de ionização de
acordo com as diferentes relações de
massa-carga;
• Principais características : o limite de
massa, a transmissão iônica e o poder
de resolução em massa.
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Tipos de analisadores
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Analisador de setor magnético
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Quadrupolo
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Quadrupolo
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Quadrupolo x Instrumento de setor
magnético Vantagens
• Alta sensibilidade;
• Opera mais eficientemente sobre íons de baixa velocidade;
• Ideal para interface para LC e electrospray.
Desvantagem
• Inferior com relação a resolução e ao tamanho da massa;
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TOF (Time of flight)
• O princípio de operação do TOF-MS
envolve a medida do tempo que um íon
leva para viajar da fonte de íons até o
detector.
• Após ionizada, a amostra entra no tubo e a
separação é feita baseado na diferença de
velocidade entre as partículas.
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TOF
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Tandem mass spectrometer
• Combinação de mais de um analisador para obter análise
em tandem no espaço;
• Os analisadores acoplados podem ser do mesmo tipo
(triplo quadrupolo) ou com equipamentos híbridos;
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• Confere maiores informações estruturais e aumento da
seletividade para espectrometria de massa.
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Interpretação de espectrometria de
massa• EI mass spectra
Feixe de
elétrons de
70 Ev.
Remove
um
elétron da
amostra.
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Espectrometria de massa é a apresentação de
fragmentos carregados positivamente versus suas
concentrações relativas.
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Padrão de fragmentação
• O padrão de fragmentação interfere no reconhecimento dopico;
• Envolve a quebra das ligações entre os elementos quecompõe a substância;
• Cada substância apresenta um padrão de fragmentaçãoespecífico;
• A intensidade do pico do íon molecular depende daestabilidade do íon molecular.
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Padrão de fragmentação
• A quebra de uma ligação está favorecida nos pontos deramificação das moléculas no sentido de formarcarbocátions mais estáveis;
• Grupos de composto capazes de gerar picos de íonmolecular prominentes:
Aromáticos > Alcenos conjugados> Componentes cíclicos > Sulfeto orgânico > alcanos curtos > Mercaptanos
• Íons moleculares produzidos pelos componentes acima:
Cetonas > aminas > ésteres > éteres > ácidos carboxílicos > amida
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Fragmentação do benzeno
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• Proteases: grupo de enzimas hidrolíticas que desempenha um
papel importante em muitos processos regulatórios;
• Coagulação e a fibrinólise são proteolíticos associados a
cicatrização de feridas ;
• Coagulação: Fibrinogênio Fibrina
• Fibrinólise: Trombos Fibrina
Trombina
Plasmina
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• RAJESH,R. et al. tem apresentado o envolvimento das
proteases do látex de Calotropis gigantea na coagulação e
fibrinólise;
• Menon et al. isolaram e caracterizaram duas proteases serina
• a partir de S. extracto de látex grantii;
• Objetivo do estudo purificar e caracterizar uma glicoproteína
fibrinogenolítica do látex de Synadenium grantii.
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Referências
• RAJESHA, R; NATARAJUA,A.; GOWDAA, C.D.R.;
FREYB, B.M; FREYB, F.J.; VISHWANATH, B.S.
Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable
glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on
human fibrinogen and fibrin clot .Biochimie 88 ,1313 –
1322,2006.
• SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, X. F.; KIEMLE, J.D.
Spectrometric Identification of Organic Compound. 7
ed. 1, 8-17.1963;