SENSORES EM LINHA PARA PROPRIEDADES CELULARES

Determinação da concentração de biomassa

- São medidas indiretas- Necessitam de uma curva de calibração (correlação entre a

variação da propriedade medida e a concentração celular)- Um dos maiores problemas é a falta de linearidade de tal

curva em altas concentrações de biomassa- Não existe um método de aplicação geral, por causa das

restrições devido às características do crescimento e do meio de cultivo

- A maioria dos métodos mede a biomassa total

A. Turbidimetria

A turbidez de um meio depende do número de partículas que ele contém, do tamanho e da forma destas partículas

Os métodos levam em conta que a turbidez do meio é proporcional à sua concentração de biomassa

O feixe de luz incidente na suspensão celular está sujeito a pelo menos cinco fenômenos:

- Absorção da luz pela biomassa- Transmissão da luz- Espalhamento da luz na mesma direção de incidência do feixe- Espalhamento perpendicular à direção de incidência do feixe- Espalhamento na direção contrária ao de incidência do feixe

Embora existam aparelhos para medir estes fenômenos, a maioria mede, em meios biológicos, a luz transmitida

Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.

Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.

Espalhamento 90o

Espalhamento frontal

Luz incidente

Amostra turva

Espalhamento 180o

Luz transmitida

Esquema de uma sistema de medida de biomassa em linha por turbidimetria.

Medidor de

turbidez

Biorreator

Meio

Câmara de desgaseificação

Análise e registro

de dados

Diagrama esquemático de uma célula de fluxo para medida de luz transmitida (a) e variação da densidade ótica com a concentração de biomassa para diferentes valores de d (b).

Uma das formas de se determinar concentrações de biomassa em faixas maiores é variar a espessura do caminho de percurso do feixe de luz.

Tubo interno

Densidade ótica

Entrada da amostra

Saída da amostra

Densidade celular

Esquema de turbidímetro para medida da luz transmitida e da luz espalhada no sentido de incidência do feixe (a) e para medida da luz espalhada no sentido oposto ao de incidência do feixe (b).

(a)

(b)

Esquema de determinação de biomassa por medida da luz espalhada no sentido oposto ao de incidência do feixe: (a) detalho do instrumento de medida e (b) esquema geral.

a b

B. Fluorescência

• Princípio do método: fluorescência do NADH e NADPH de células vivas quando irradiados com luz ultravioleta

• Comprimento de onda de incidência: 340-360 nm• Comprimento de onda de fluorescência: cerca de 460 nm• A intensidade de fluorescência é afetada pela quantidade

de biomassa, pelo estado metabólico das células e também por fatores abióticos como bolhas e componentes fluorescentes do meio

• Não há circulação de amostra pelo equipamento, o que indica uma montagem mais simples em relação a outros

• O método tem potencial para uso em sistemas com células imobilizadas

Desenho esquemático de um sensor de fluorescência.

Fluorescência de uma cultura de Zymomonas mobilis em função da concentração de biomassa, em diferentes concentrações de glicose.

• A produção de calor é um parâmetro relacionado com atividade metabólica, concentração de biomassa e consumo de substrato

• O maior problema é “separar” o calor produzido pelas células do calor produzido ou consumido por outros processos (aeração, agitação, adição de ácido/base, ou nutrientes)

• O estado metabólico das células influencia na quantidade de calor gerado, alterando os termogramas. Neste caso, a relação entre calor produzido e quantidade de biomassa fica comprometida

C. Calorimetria

• A concentração de biomassa pode ser estimada a partir do volume da torta filtrada, do fluxo de filtração, do volume de filtrado e da diferença de pressão através do sistema de filtração

• Corresponde a um sistema de medida semicontínuo• Foi demonstrado que a concentração de biomassa pode ser

obtida pela equação: X = (1/ν). VC/(Vf+VC)

Onde:X é a concentração de biomassa (g/L)v é o volume específico da torta (L/g)VC é o volume da torta (L)

Vf é o volume do filtrado (L)

D. Filtração

Diagrama esquemático de um sistema de filtração para medida de biomassa.

Comparação de dados de biomassa obtidos por filtração em linha com os obtidos por métodos off-line, para o cultivo de Penicillium chrysogenum.

E. Outros métodos

• Métodos por viscosidade

• Métodos Eletroquímicos - Métodos Impedométricos - Sensores potenciométricos- Sensores tipo células de combustível- Sensores amperométricos

• Métodos acústicos

Determinação de biomassa ativa

- A viabilidade celular pode ser medida em separado por três principais métodos:

- Coloração vital- Replicação celular- Atividade metabólica

- Tais métodos demandam tempo considerável

Citometria de fluxoTécnica que permite analisar várias características celulares ao mesmo tempo

O aparelho, citômetro de fluxo, capta e digitaliza a dispersão de luz provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz

Componentes básicos do citômetro de fluxo:

Fluido – suspensão de partículas e fluxo laminar

Óptico - Fonte de iluminação, Captação da dispersão da luz e da fluorescência e Filtração da dispersão e da fluorescência

Eletrônico - Conversão do sinal em valores analógico-digitais Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador

Exemplo do que pode ser analisado por citometria de fluxo.

MetabolismosMetabolismos

ReceptoresReceptores ADNADN CitoquinasCitoquinas

EnzimasEnzimas

Antigénios celularesAntigénios celularesTamanhoTamanho

ComplexidadeComplexidade

FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”

Baixa pressão da amostra

12µl/min

Amostra

Fluxo Laminar

BAIXA PRESSÃO DIFFERENCIAL

Bainha Bainha Amostra

Fluxo Laminar

Bainha Bainha

ALTA PRESSÃO DIFFERENCIAL

Alta pressão da amostra

60µl/min

SISTEMA FLUIDO

FACSCaliburFL1

Red Diode LaserRed Diode Laser~635 nm~635 nm

SSC

FL3

FL4

670LP

661/16

585/42

488/10

90/10 Beam Splitter

DM 560SP

FluorescenceCollection Lens

DM 640LP

Half Mirror

488/10

.488 nm488 nmBlue LaserBlue Laser FSC Diode

FocusingLens

FL2

530/30

Beam Combiner FlowCell

FlowCell

SISTEMA ÓTICO

Diagrama esquemático representando os sistemas ótico e fluido de um citômetro de fluxo.

Ótica de espalhamento frontal

Sensor de FSSensor de FS

LaserLaser

Ótica de espalhamento lateral

LaserLaser

Sensor de FSSensor de FS

Sensor SS 90Sensor SS 9000

Ótica de fluorescência

LaserLaser

Sensor de FSSensor de FS

Detectores de FluorescênciaDetectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)(PMT1, PMT4 etc.)

ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)

LASER

Foto de um citômetro de fluxo.

Foto do sistema ótico de um citômetro de fluxo.

Tipos de diagramas (Resposta)

• 1 parâmetro– Histograma

• 2 parâmetros– Gráfico de pontos– Gráfico de Contorno– Gráfico de Densidade

Foto de um citômetro de fluxo.

Análise por Injeção em Fluxo (Flow Injection Analysis)

Fundamento: Injeção de uma amostra numa corrente líquida contínua não segmentada.

À corrente de amostra são adicionados reagentes, de modo a formar uma zona de reação que é continuamente transportada para um detector, o qual pode determinar absorbância, potencial elétrico ou qualquer outra propriedade física da solução

A análise (FIA) compreende três blocos principais:

- Manipulação da amostra e transporte, que consiste em retirar uma amostra do reator e condicioná-la para a análise

- Especificação, que consiste na eliminação de interferentes e outros produtos, de maneira a assegurar a proporcionalidade da propriedade medida com o analito

- Detecção, que consiste no emprego de um transdutor, de forma a gerar um sinal proporcional à espécie a ser determinada

Existe uma grande flexibilidade para se compor esses três blocos, de modo a se montar distintos sistemas de análise.

Principais vantagens do sistema FIA:

- Alta frequência de análises- Pequenos volumes da amostra- Amostragem e preparação da amostra integrados ao sistema- Calibração a qualquer momento- Poucas interferências- Confiabilidade- Longos períodos de operação dos sensores- Flexibilidade para incorporação de novas técnicas analíticas

Determinação de biomassa em bioprocessos

• Essencial para o conhecimento e controle de bioprocessos

• Variável utilizada para a determinação das velocidades específicas de crescimento, de consumo de substrato e de formação de produtos

• Modelagem matemática do crescimento, do consumo de substrato e da formação de produto

• Comportamento cinético do processo