resposta fisiolÓgica, qualidade da carne … · aos estagiários do laboratório de nutrição de...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CAMPUS DE BOTUCATU
RESPOSTA FISIOLÓGICA, QUALIDADE DA CARNE E EXPRESSÃO
GÊNICA NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE CORTE
SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES
NA DIETA
CYNTHIA PIERI ZEFERINO
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Zootecnia como
parte dos requisitos para obtenção
do título de Doutor em Zootecnia.
BOTUCATU - SP
Janeiro – 2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CAMPUS DE BOTUCATU
RESPOSTA FISIOLÓGICA, QUALIDADE DA CARNE E EXPRESSÃO
GÊNICA NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE CORTE
SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES
NA DIETA
CYNTHIA PIERI ZEFERINO
Zootecnista
ORIENTADORA: Profa. Dra. ANA SILVIA ALVES MEIRA TAVARES MOURA
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Zootecnia como
parte dos requisitos para obtenção
do título de Doutor em Zootecnia.
BOTUCATU – SP
Janeiro – 2013
“Celebra hoje sua vitória de ontem, para ter mais forças na batalha de amanhã”
(Paulo Coelho)
i
DEDICO
Aos meus pais Orivaldo e Dulce, os maiores mestres que a vida me deu,
pelo amor, dedicação, compreensão, ensinamentos, incentivo e exemplos de batalha.
E aos meus irmãos e maiores amigos Marco Aurélio e Flavia,
pelo amor, paz e por dividir os momentos de alegria e felicidade.
A vocês, toda minha conquista.
Obrigada de coração!
OFEREÇO
A DEUS
pela presença em minha vida, mostrando-me os caminhos e dando-me força para lutar e superar as
dificuldades diárias, tornando sonhos em realidades.
ii
Agradecimentos especiais
Agradeço à Deus, acima de tudo.
À minha orientadora Profa. Dra. Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura pela confiança,
ensinamentos, incentivo e dedicação em todos os momentos e também pela amizade sincera que
cultivamos durante quase oito anos de convivência.
Ao Prof. Dr. José Roberto Sartori pelos ensinamentos, contribuição ao meu desenvolvimento
profissional, oportunidade de realização de parte do experimento no Laboratório de Nutrição de
Aves e pela grande amizade.
Ao Prof. Dr. Luiz Lehmann Coutinho pelos ensinamentos, grande apoio e oportunidade de
realização de parte do experimento no Laboratório de Biotecnologia Animal.
iii
Agradecimentos
Ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, FMVZ/UNESP, Campus de Botucatu, pela oportunidade e apoio.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES - pela concessão de
bolsa de estudo, possibilitando o aprimoramento científico.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP - (processo número
2009/15624-4), pela concessão de auxílio financeiro a esta pesquisa.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPQ - (processo
número 202066/2011-8), pela concessão de bolsa de estudo, modalidade: Doutorado Sanduíche
no Exterior- Universidade de Missouri/EUA.
A empresa Vaccinar Indústria e Comércio Ltda pelo fornecimento do premix utilizado na ração
dos frangos de corte.
A empresa DSM Produtos Nutricionais do Brasil Ltda pelo fornecimento das vitaminas
utilizadas nos experimentos.
Aos pós-doutorandos Áurea Maria Canavessi, Gustavo Gasparin e Clarissa Boschiero pelos
ensinamentos nas análises de expressão gênica e pela amizade.
Aos pós-doutorandos Vitor Barbosa Fascina e Vanessa Cristina Pelícia pela grande colaboração
nas fases de campo deste trabalho.
À colaboradora e Profa. Dra. Claudia Marie Komiyama pelo grande auxílio na fase laboratorial
das análises de qualidade de carne.
Ao Prof. Dr. Gerson Barreto Mourão pela colaboração nas análises estatísticas de expressão
gênica.
Ao Prof. Dr. Antônio Celso Pezzato pelo apoio, ensinamentos e amizade.
iv
Ao Prof. Dr. Roberto de Oliveira Roça pela possibilidade de utilizar as instalações do
Laboratório de Qualidade de Carnes.
À bolsista de iniciação científica, Mônica Megumi Aoyagi, pela intensa dedicação durante a
execução dos experimentos e pela amizade sincera.
Ao funcionário do Laboratório de Nutrição de Aves, Wanderley Thiago da Silva, pelo auxílio,
atenção recebida e pela alegria do dia-a-dia.
Ao amigo Ivan Mailinch Gonçalves Pereira de Souza pela amizade, alegria e enorme
colaboração durante a execução dos experimentos.
Ao Prof. Dr. Millor Fernandes do Rosário pelo grande profissionalismo, consideração e
amizade.
À Profa. Dra. Margarida Maria Barros, coordenadora do programa de Pós-Graduação em
Zootecnia- FMVZ e ao Apoio Administrativo do Posto de Serviço da Pós-Graduação da FMVZ,
Seila Cristina Cassineli Vieira e Carlos Pazini Junior pela atenção recebida e auxílio prestado.
Aos funcionários da Fábrica de Ração pelo auxílio nas confecções das rações experimentais.
Aos funcionários do Laboratório de Biotecnologia Animal, Nirlei Aparecida Silva e Jorge Luis
Andrade pela atenção recebida e auxílio prestado.
À equipe formada pelos alunos de pós-graduação integrantes do Laboratório de Nutrição de
Aves; Fabyola Barros de Carvalho, Gustavo do Valle Polycarpo, Ana Cristina Stradiotti,
Carolina Carvalho de Miranda, Francine Vercese, Mariana Kyiomi Maruno, Priscila Cavalca
Araújo e Thaila Cristina Putarov pela amizade e imensa ajuda nas coletas de dados a campo.
Aos estagiários do Laboratório de Nutrição de Aves; Renata Sena, Lucas, Gabriel, Nathália,
Charlene, Danyele e Natani pelo grande auxílio na execução dos experimentos.
v
Aos alunos de pós-graduação integrantes do Laboratório de Biotecnologia Animal; Andrezza,
Lilian, Kerli, Aline, Minos, Priscila, Thaís Godoy, Luciana, Renato, Gabriela, Milla e Fábio pela
ajuda em determinados momentos, pela alegre convivência e amizade.
Às amigas Dênia e Marcela, meu agradecimento especial não só pela ajuda laboratorial, mas
pelos bons momentos compartilhados.
À amiga Irene Francisca de Arruda pela ajuda prestada.
À Simone Fernandes pela grande amizade, apoio e ajuda prestada.
Às amigas de pós-graduação Estela Siloto, Thais e Aline pela prazerosa amizade, ajuda e bons
momentos.
Ao orientador Prof. Dr. David R. Ledoux, aos colaboradores Prof. Dr. Kevin Wells e George
Rottinghaus da Universidade de Missouri, pela amizade, paciência e ensinamentos.
Aos amigos e colaboradores Rafael Murarolli, Estela Kobashigawa, Ben, Guilherme Hosotani e
Livea Gomes pela paciência, ajuda e divertidos momentos durante minha estada nos Estados
Unidos.
Ao grande amigo Rafael Damião Pinheiro Machado pela velha amizade, companhia nos
momentos mais difíceis e imensa ajuda neste trabalho.
E a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram na realização deste trabalho e não foram
citados nominalmente, mas que não estão esquecidos, meus sinceros agradecimentos.
vi
SUMÁRIO
Página
CAPÍTULO I
CONSIDERAÇÕES INICIAIS ....................................................................................... 02
1. Importância da avicultura de corte ........................................................................... 02
2. Indicadores fisiológicos e desempenho ..................................................................... 03
3. Rendimento de carcaça e qualidade de carne ........................................................... 07
4. Expressão gênica na musculatura esquelética ........................................................... 10
5. O uso das vitaminas C e E como antioxidantes ........................................................ 16
6. Justificativa e objetivos ............................................................................................. 22
Referências Bibliográficas ........................................................................................... 24
CAPÍTULO II
RESPOSTA FISIOLÓGICA, DESEMPENHO, RENDIMENTO DE CARCAÇA E
QUALIDADE DA CARNE DE FRANGOS DE CORTE SOB ESTRESSE POR
CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES NA DIETA .................................... 33
Resumo ........................................................................................................................ 33
Abstract ........................................................................................................................ 34
Introdução .................................................................................................................... 35
Material e Métodos ...................................................................................................... 36
Resultados e Discussão ................................................................................................ 44
Conclusão ..................................................................................................................... 57
Referências Bibliográficas ........................................................................................... 57
CAPÍTULO III
EXPRESSÃO GÊNICA NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE
CORTE SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES
NA DIETA ....................................................................................................................... 63
Resumo ........................................................................................................................ 63
Abstract ........................................................................................................................ 64
Introdução .................................................................................................................... 65
Material e Métodos ...................................................................................................... 66
Resultados e Discussão ................................................................................................ 79
vii
Conclusão ..................................................................................................................... 87
Referências Bibliográficas ........................................................................................... 87
CAPÍTULO IV
IMPLICAÇÕES ................................................................................................................. 92
ANEXO ................................................................................................................................ 93
viii
ÍNDICE DE TABELAS
Página
CAPÍTULO II
RESPOSTA FISIOLÓGICA, DESEMPENHO, RENDIMENTO DE CARCAÇA E
QUALIDADE DA CARNE DE FRANGOS DE CORTE SOB ESTRESSE POR
CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES NA DIETA .................................... 33
Tabela 1. Composições centesimais e nutricionais das dietas basais utilizadas em cada
fase do período experimental .............................................................................. 38
Tabela 2. Conteúdo de vitaminas C e E das dietas de crescimento e final, controle e
suplementadas, fornecidas às aves durante o período experimental,
determinadas pelo método de HPLC .................................................................. 39
Tabela 3. Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) dos indicadores fisiológicos de
frangos de corte, no período de 28 a 42 dias de idade, de acordo com a
suplementação da dieta e a condição térmica. .................................................... 46
Tabela 4. Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) das características de
desempenho de frangos de corte, no período de 28 a 42 dias de idade, de
acordo com a suplementação da dieta e a condição térmica. .............................. 49
Tabela 5. Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) das características de peso e
rendimento de carcaça, rendimento de cortes e peso relativo de órgãos de
frangos de corte, de acordo com a suplementação da dieta e a condição
térmica................................................................................................................. 52
Tabela 6. Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) das características de qualidade
de carne de frangos de corte, de acordo com a suplementação da dieta e a
condição térmica ................................................................................................. 56
CAPÍTULO III
EXPRESSÃO GÊNICA NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE
CORTE SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES
NA DIETA ....................................................................................................................... 63
ix
Tabela 1. Conteúdo de vitaminas C e E das dietas de crescimento e final, controle e
suplementadas, fornecidas às aves durante o período experimental,
determinadas pelo método de HPLC .................................................................. 68
Tabela 2. Identificação dos primers utilizados para amplificar por PCR os genes alvo e
referência e temperaturas de melting ................................................................. 75
Tabela 3. Expressão relativa do RNAm, valores de Cq (Quantification cycle) e erro-
padrão, dos genes avUCP, HSP70, MSTN e ACLY de acordo com a
suplementação da dieta dos frangos de corte e a condição térmica de estresse
por calor agudo, de 21 horas ............................................................................... 83
Tabela 4. Expressão relativa do RNAm, valores de Cq (Quantification cycle) e erro-
padrão, dos genes avUCP, HSP70, MSTN e ACLY de acordo com a
suplementação da dieta dos frangos de corte e a condição térmica de estresse
por calor crônico, de 16 dias ............................................................................... 86
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
CAPÍTULO I
CONSIDERAÇÕES INICIAIS ....................................................................................... 02
Figura 1. Estrutura molecular da vitamina C (ácido L-ascórbico). ....................................... 17
Figura 2. Estrutura do acetato de α-tocoferol. ....................................................................... 18
CAPÍTULO II
RESPOSTA FISIOLÓGICA, DESEMPENHO, RENDIMENTO DE CARCAÇA E
QUALIDADE DA CARNE DE FRANGOS DE CORTE SOB ESTRESSE POR
CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES NA DIETA .................................... 33
Figura 1. Valores médios de temperatura (painel superior), umidade relativa do ar (UR;
painel intermediário) e índice de temperatura e umidade (THI; painel inferior)
nas salas termoneutras 1 e 2 e de estresse por calor, no período de 16 a 31 de
agosto de 2010. ................................................................................................... 41
CAPÍTULO III
EXPRESSÃO GÊNICA NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE
CORTE SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES
NA DIETA ....................................................................................................................... 63
Figura 1. Valores médios de temperatura (painel superior), umidade relativa do ar (UR;
painel intermediário) e índice de temperatura e umidade (THI; painel inferior)
nas salas termoneutras 1 e 2 e de estresse por calor durante o período
experimental. ....................................................................................................... 70
xi
ANEXO
Página
Figura 1. Gel de agarose (1,5%) mostrando a integridade do RNA total das amostras de
músculo pectoralis major das aves, onde se visualiza as bandas estruturais de
RNA ribossômico (28 S; 18 S e 5,8 S). .............................................................. 94
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% para visualização dos fragmentos
amplificados para cada gene. 1 e 12 - Padrão de peso molecular 50 pares de
base (Fermentas), 2 - GAPDH (141 pb), 3- EEF1A1 (184 pb), 4 - ACTB (80
pb), 5 - MRPS27 (128 pb), 6 - RPL5 (180 pb), 7 - avUCP (77 pb), 8 - HSP70
(158 pb), 9 - MSTN (68 pb), 10 - ACLY (193 pb), 11 - PYGL (152 pb)... ........ 95
Figura 3. Curva de melting dos genes avUCP (acima) e calibrador RPL5 (abaixo). Cada
linha representa uma amostra cuja expressão foi quantificada. .......................... 96
Figura 4. Curva de diluição gerada para o gene ACTB. ....................................................... 97
Figura 5. Curva de amplificação gerada pelo programa LinRegPCR. .................................. 98
1
CAPÍTULO I
2
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1. Importância da avicultura de corte
A produção brasileira de carne de frango atingiu 13,06 milhões de toneladas em
2011 e os embarques de 3,94 milhões de toneladas representaram recorde histórico,
sendo o principal produto das exportações avícolas brasileiras. Com este desempenho o
Brasil se aproxima da China, hoje o segundo maior produtor mundial, abaixo apenas dos
Estados Unidos. Do volume total de frangos produzidos em 2011, 30,2% foram
destinados às exportações e 69,8% ao consumo interno, o que representou um novo
recorde para o setor, pois o consumo per capita brasileiro atingiu 47,4 quilos (UBABEF,
2012). A avicultura de corte se expande a cada ano de forma consistente, configurando
uma cadeia produtiva bem sucedida, não só no mercado interno, mas também no cenário
mundial. Esta condição de liderança e a competitividade do setor exigem constante
aprimoramento tecnológico, padronização e principalmente rígido controle de qualidade
dos produtos.
Apesar dos inúmeros desafios enfrentados pelos produtores, como doenças,
pressão econômica, problemas ambientais e de disponibilidade de alimentos, é previsto
que o crescimento da produção de carne de frango nos países em desenvolvimento
continuará a sustentar o aumento da demanda mundial. Embora muitos fatores possam
estar envolvidos nos sistemas produtivos, os aspectos climáticos se constituem no
primeiro fator limitante do desenvolvimento em regiões quentes (Renaudeau et al.,
2012), pois a maior parte das linhagens comerciais modernas de frangos de corte foi
geneticamente melhorada nas condições de países temperados. Além disso, a seleção
genética intensiva, para obtenção de taxas de crescimento mais rápidas em frangos de
corte, contribuiu para que as linhagens melhoradas atuais sejam muito susceptíveis ao
estresse térmico (Brossi et al., 2009). Portanto, o estresse por calor representa grande
preocupação para a avicultura, em particular nos países tropicais e nos países de clima
temperado durante o verão, por causar baixo desempenho de crescimento,
imunossupressão e alta mortalidade, o que resulta em significativas perdas econômicas
na produção (Mujahid et al., 2005; Renaudeau et al., 2012).
3
Na avicultura brasileira, os fatores climáticos ainda são, em geral, pobremente
manipulados e gerenciados, assim o microambiente das instalações avícolas nem sempre
é compatível com as necessidades fisiológicas das aves. Apesar da existência de
tecnologia nas instalações totalmente climatizadas, somente pequena parcela dos
produtores as utiliza devido à necessidade de elevado investimento. É importante
ressaltar que estudos sobre as consequências ambientais do estresse na produção têm
crescido substancialmente nos últimos anos por razões econômicas e de bem-estar
animal (Quinteiro-Filho et al., 2010).
Para obtenção de ótimo desempenho produtivo é preciso levar em consideração a
interação entre o animal e o ambiente, a fim de que o custo energético dos ajustes
fisiológicos seja o menor possível. Portanto, a manutenção do conforto térmico nos
aviários é um dos problemas enfrentados pelos produtores, pois o desempenho das aves
depende das condições ambientais (Macari et al., 2002). Melhor compreensão dos
fenômenos ambientais e de suas consequências é determinante para que as aves possam
manter suas funções fisiológicas normais e produzir carne com qualidade e eficiência
(Sevegnani et al., 2005).
Nos sistemas tropicais de produção animal pode-se lançar mão de estratégias
para o alívio dos efeitos do estresse por calor, como por exemplo, modificações da
composição da dieta a fim de promover maior ingestão ou compensar o baixo consumo
alimentar. Além disto, alterar o manejo alimentar, promovendo mudanças no tempo e/ou
frequência de alimentação, se constitui em ferramenta eficaz para a diminuição da
produção de calor metabólico e melhora da taxa de sobrevivência do animal (Renaudeau
et al., 2012).
2. Indicadores fisiológicos e desempenho
A galinha é uma espécie homeotérmica, cujo organismo regula a temperatura
dentro de limites estreitos, independentemente da variação térmica do ambiente externo
(IUPS, 2001), para isto, desenvolveu mecanismos precisos de controle da temperatura
corpórea que a permitem sobreviver em ampla diversidade ambiental. A temperatura
ideal (termoneutralidade) para pintainhos na primeira semana de vida é elevada (entre
4
33 e 35°C). Nesta idade, as aves têm dificuldade de manter a temperatura corporal,
devido à grande relação entre área e volume corporal, além da pequena capacidade de
produção de calor, em função da reserva energética reduzida.
O desenvolvimento da habilidade termorreguladora nas aves atinge sua plenitude
entre 10 a 15 dias de vida pós-natal. Com o desenvolvimento do frango de corte e
consequente maturação do sistema termorregulador, a temperatura de conforto térmico é
reduzida de 33- 35°C para 24°C, com quatro semanas de idade, e para 21 a 22°C com
seis semanas de idade (Macari et al., 2002). O ambiente confortável para frangos de
corte nas fases de crescimento (28 a 35 dias) e final (36 a 42 dias de idade) tem
temperatura de 15ºC a 25ºC e umidade relativa do ar de 50% a 70% (Tinôco, 2001).
O comportamento fisiológico das aves frente ao estresse por calor pode ser
avaliado por meio da temperatura retal (Dionello et al., 2002), pois esta se constitui num
bom indicativo da temperatura corporal interna. A temperatura corporal do pinto recém-
nascido varia de 39 a 40°C, já a temperatura retal de frangos de 14 a 42 dias de idade
varia de 41,4 a 41,5°C (Macari et al., 2002).
A exposição de frangos de corte ao estresse térmico agudo na fase pré-abate
induz alterações nos índices de termorregulação, representados por aumentos na
temperatura corporal e na taxa de ofegação (Sandercock et al., 2001). Lin et al. (2005)
verificaram elevação das temperaturas retal e da superfície da pele do peito em frangos
com quatro semanas de idade expostos ao calor a 35°C. A temperatura da superfície da
pele dos frangos expostos a temperaturas de 36°C e 38°C alcançou valores máximos de
44 e 46°C, respectivamente, enquanto a temperatura retal também se elevou no grupo
mantido a 38°C (Toyomizu et al., 2005).
Mujahid et al. (2005) forneceram a primeira evidência da produção de ânion
superóxido (O2-) nas mitocôndrias do músculo esquelético dos frangos de corte em
resposta ao estresse por calor agudo. Segundo os autores, esta maior produção de
superóxido foi associada ao aumento nas temperaturas retal e muscular, levando à perda
de peso corporal dos frangos.
A exposição de frangos de corte à temperatura ambiente elevada resulta em
mudança no equilíbrio ácido-base que leva ao aparecimento da alcalose respiratória,
doença responsável pela queda no desempenho. A alteração do equilíbrio ácido-base se
dá pelo aumento na taxa respiratória, resultando em perdas excessivas de dióxido de
5
carbono (CO2). Assim, a pressão parcial de gás carbônico no sangue diminui, levando à
queda na concentração de íons bicarbonato (HCO3-) e hidrogênio (H
+). Nessas
condições, ocorre compensação renal com aumento da excreção de HCO3- e redução de
excreção de H+ pelos rins na tentativa de manter o equilíbrio ácido-base da ave (Borges
et al., 2003). A adição de eletrólitos (sais) via água de bebida ou nas rações são práticas
que podem ser implementadas para corrigir estas distorções no equilíbrio ácido-base
decorrentes do estresse por calor. Entre os principais sais utilizados destacam-se o
cloreto de potássio (KCl), o bicarbonato de sódio (NaHCO3), o cloreto de cálcio (CaCl2)
e o cloreto de amônio (NH4Cl2), que são incorporados às rações de verão (Matos et al.,
2011).
O estado de conforto da ave, no qual há a constância do meio interno e os
sistemas homeostáticos controladores estão atuando com menor gasto de energia, deve
ser traduzido em maior ganho de peso, melhor conversão alimentar e, portanto, maior
produção (Macari et al., 2004). Embora as diferenças na tolerância térmica existam entre
as espécies de animais de produção, há também grandes diferenças entre as raças e entre
os indivíduos (Renaudeau et al., 2012). Cada ave responde de maneira diferente aos
fatores de estresse; as respostas podem variar em função da idade do animal, da
aclimatação e do sexo, portanto, os frangos machos tendem a ser mais susceptíveis ao
calor do que as fêmeas, devido ao seu maior peso e melhor conversão alimentar (Macari
et al., 2002).
Os animais de produção criados sob condições tropicais e subtropicais são
desafiados pelo calor na maior parte do tempo. As respostas de termorregulação, em
longo prazo, aumentam as exigências fisiológicas, que na maioria dos casos resultam em
desempenho reduzido. Estas respostas ocorrem durante a vida do animal e incluem a
redução da taxa metabólica, as mudanças no sistema cardiovascular, a alteração da perda
de calor (resposta vasomotora: vasodilatação) e as alterações na resposta
comportamental e na morfologia geral do animal (Renaudeau et al., 2012). Dependendo
da magnitude e da duração do estresse por calor sofrido pelas aves, pode ocorrer desde
pequena redução no apetite e no crescimento, até a morte (Macari et al., 2004).
O verão, em função da alta umidade acompanhada de alta temperatura do ar, se
constitui num desafio para a termorregulação e o bem-estar dos frangos de corte,
podendo interferir negativamente na produtividade, devido principalmente ao aumento
6
da mortalidade (Brossi et al., 2009), aumento da ingestão de água e diminuição da
ingestão de ração (Sevegnani et al., 2005). Frangos mantidos em situação de estresse por
calor aumentam seus gastos energéticos para dissipação de calor e manutenção da
homeotermia. Estima-se que para cada grama de água evaporada por ofegação durante o
estresse por calor, são necessárias 550 calorias (Furlan & Macari, 2002).
Quinteiro-Filho et al. (2010) demonstraram que frangos de corte submetidos ao
estresse por calor (31 e 36°C, durante 10 horas diárias), dos 35 aos 42 dias de idade,
reduziram a ingestão de alimentos e o ganho de peso, entretanto, apenas as aves
submetidas a 36°C, apresentaram melhora na conversão alimentar e aumento da
mortalidade. A redução no ganho de peso corporal ocorre porque as aves diminuem o
consumo de alimento a fim de diminuir a produção de calor para manutenção da
temperatura corporal.
Para testar a hipótese de que variações térmicas podem alterar as características
produtivas em frangos, é necessário que o efeito do consumo de ração seja controlado. A
restrição alimentar tem sido utilizada por diversos pesquisadores e com várias
finalidades. A maioria dos estudos de restrição alimentar em frangos de corte teve como
objetivo reduzir a gordura corporal e melhorar a conversão alimentar, mas à custa de
menor peso corporal final (Laganá, 2005).
Ao comparar aves mantidas em ambiente aquecido (30ºC) e em
termoneutralidade (20ºC) alimentadas em pair-feeding (consumo pareado), Al-Harthi &
Macleod (1996) não observaram diferenças de ganho de peso entre as aves. Os autores
ressaltam o grande efeito exercido pelo consumo de alimento sobre as características
produtivas das aves. Entretanto, há pesquisas que comprovam que aves submetidas ao
estresse por calor não diminuem somente o consumo de alimento. Dale & Fuller (1980),
através da técnica do pair-feeding, observaram que, mesmo igualando o consumo, as
aves submetidas ao estresse por calor não obtiveram taxa de crescimento igual a das
aves mantidas em ambiente termoneutro. Ainda segundo os autores, durante o estresse
por calor há piora na conversão alimentar. De acordo com a revisão de Renaudeau et al.
(2012), o uso da técnica do pair-feeding indicou que metade da redução do crescimento
devida ao estresse por calor não estava relacionada ao consumo de alimento e, portanto,
tinha outras origens.
7
Ao estudar os efeitos da exposição crônica ao calor (32ºC) e da
termoneutralidade (22ºC) associada ao pair-feeding sobre a digestibilidade dos
componentes da dieta em frangos de corte machos, dos 28 aos 42 dias de idade, Bonnet
et al. (1997) constataram que a diminuição da digestibilidade dos diferentes
componentes da dieta (amido, gorduras e proteínas) após a exposição ao calor explica,
em parte, a redução no desempenho de crescimento dos frangos expostos à temperaturas
elevadas e justifica o uso de formulação de ração adaptada para períodos quentes do
ano.
3. Rendimento de carcaça e qualidade de carne
Ao estudar o efeito da temperatura ambiente (16, 20, 25 e 32ºC) sobre as
características de carcaça de uma linhagem comercial de frangos de corte abatidos aos
42 dias de idade, De Oliveira et al. (2006) observaram que os rendimentos de carcaça e
peito aumentaram linearmente com a elevação da temperatura de 16 até 32ºC. O
rendimento de coxa sofreu efeito quadrático, aumentando até a temperatura de 19,4ºC. A
redução no peso dos órgãos metabolicamente ativos (coração e moela) com o aumento
da temperatura, associada aos processos termorregulatórios, constituíram-se ajustes
eficientes para manutenção da homeotermia das aves quando a temperatura aumentou de
16 para 32ºC.
Scheuermann et al. (2004) avaliaram o peso corporal e o peso e rendimento de
peito de frangos fenotipicamente divergentes para musculosidade, utilizando a linhagem
Leghorn e duas linhagens comerciais de frangos de corte (normal e alto rendimento de
peito), até os 35 dias de idade. De acordo com os resultados, a linhagem Leghorn teve
menor peso corporal e peso e rendimento de peito do que as linhagens de corte,
conforme esperado, e os frangos de corte apresentaram cerca de duas vezes mais fibras
musculares nos músculos do peito do que as aves da linhagem Leghorn, o que poderia
explicar parcialmente o maior rendimento de peito neste genótipo.
A qualidade de carne depende da influência ambiental a curto ou longo prazo, do
manejo de produção, da duração do transporte, das condições pré-abate e das
características inerentes ao animal, pois cada indivíduo responde de maneira diferente
8
em função da idade, do sexo e principalmente da linhagem. Todos estes fatores podem
alterar o metabolismo post mortem, responsável por determinar as características da
carne no momento do processamento (Sams, 1999).
Segundo Fletcher (1991), os principais atributos que determinam a qualidade da
carne são: a aparência, a textura, a suculência, o sabor e as propriedades funcionais. Os
mais importantes fatores influenciadores na seleção inicial do produto e na satisfação
final do consumidor são a textura e a aparência. Uma carne mais dura pode passar ao
consumidor a impressão de carne de animal mais velho, além disso, a textura pode estar
associada a fatores de estresse sofridos pelo animal antes do abate.
O pH muscular pode ser influenciado por fatores extrínsecos, como as condições
climáticas e intrínsecos, como, por exemplo, o tipo de músculo, espécie, raça e variação
individual (Fletcher, 1999). O pH final, medido 24 horas post-mortem, é determinante
para a qualidade de carne, pois está relacionado diretamente com as proteínas e os
pigmentos da carne. Assim, o valor de estabilização do pH influencia as características
de cor, capacidade de retenção de água, perda de peso por cozimento, suculência e
maciez (Fletcher, 1991; Qiao et al., 2001).
A cor da carne é importante por determinar a aceitação do consumidor no
momento da compra. Os fatores que podem afetá-la são: idade, sexo, dieta e genótipo
(Ristic & Zimmermann, 1992), localização do músculo e condições de manejo pré-
abate, como, por exemplo, o estresse térmico (Fletcher, 1999). Os principais
componentes que contribuem para a coloração da carne são os teores de mioglobina e
hemoglobina, o estado químico destes pigmentos e o complexo efeito do pH (Fletcher,
1991; Yang & Jiang, 2005). A mioglobina, proteína do músculo que confere cor
vermelha à carne, poderia tornar-se fundamental para melhorar a cor da carne magra,
pois correlações entre o seu conteúdo e outros indicadores de qualidade de carne, como
por exemplo, pH, cor e capacidade de retenção de água indicam que em suínos, a carne
com concentração mais elevada de mioglobina apresenta maior qualidade (Newcom et
al., 2004).
A capacidade de retenção de água é propriedade de importância fundamental em
termos de qualidade da carne. É o termo utilizado para descrever a habilidade do
músculo de se ligar à água sob diversas condições, ou seja, a capacidade da carne em
reter a água contida em sua estrutura mesmo sob a aplicação de força (Trout, 1988). O
9
interesse pelo estudo da capacidade de retenção de água do músculo decorre de sua
influência no aspecto da carne crua e de seu comportamento durante o processo de
cocção, tendo como objetivo avaliar a sua importância na palatabilidade do produto. A
funcionalidade da indústria está relacionada principalmente a este atributo de qualidade
de carne, pois grandes perdas de exsudado influenciarão a cor, a textura e a firmeza da
carne crua, o sabor, o odor e a suculência da carne cozida.
A capacidade de retenção de água pode ser determinada por metodologias que
utilizam a força de gravidade (perda por gotejamento), por aplicação de força (pressão
em papel filtro ou centrifugação) e por tratamento térmico (perda de peso por cocção).
Porém, a capacidade de retenção de água não é um indicador objetivo e sim uma
estimativa, pois não existe valor real para esta propriedade (Honikel & Hamm, 1994).
A perda de peso por cozimento está associada ao rendimento no momento do
consumo. O aquecimento da carne durante o cozimento produz alterações nas proteínas
dos músculos termossensíveis e, consequentemente, na aparência, sabor e textura,
provocando o encolhimento, a liberação do suco celular e a descoloração. Esta perda
não se deve apenas à água, mas também à parte da gordura existente na carne (Pardi et
al., 1993).
Dentre os métodos objetivos conhecidos para avaliar a maciez da carne, a força
de cisalhamento é o mais utilizado. Esta metodologia utiliza o texturômetro acoplado à
lâmina Warner-Bratzler que mede a pressão necessária para que a lâmina corte a
amostra de músculo. Há alguma discordância em relação aos valores limite de força de
cisalhamento para considerar a carne de peito de frango macia. Simpson & Goodwin
(1974) indicam 8 kgf.g-1
, enquanto Liu et al. (2004) utilizaram o valor de 7,5 kgf.g-1
como referência de limite de resistência ao corte.
Frangos da linhagem French Label expostos ao estresse térmico agudo pré-abate
(35°C durante duas horas) apresentaram características indesejáveis na carne do peito e
coxas, como por exemplo, menor pH final, cor mais pálida e menor rendimento de
cozimento das coxas (Debut et al., 2003). Sandercock et al. (2001) observaram que
frangos de corte machos submetidos ao estresse térmico agudo (32°C durante duas
horas), aos 35 e 63 dias de idade, também apresentaram resultados semelhantes, como
menor pH pós-abate e maiores perdas por gotejamento da carne de peito.
10
Interações entre fatores genéticos e condições de estresse ambiental podem
favorecer o desenvolvimento de carnes PSE (pálida, com textura flácida e exudativa).
Essas particularidades se refletem em produtos de baixo rendimento na produção
industrial e pouca aceitação pelos consumidores. Segundo Mckee & Sams (1998), aves
expostas a estresse térmico de curto prazo, imediatamente antes do abate, mostraram
alterações de qualidade da carne tais como coloração pálida e pH mais baixo, em
consequência da taxa elevada de glicólise post mortem e menor capacidade de retenção
de água pelo músculo, características típicas da condição PSE. Porém, Petracci et al.
(2001) sugeriram que a influência do estresse por calor sobre a qualidade de carne pode
variar de acordo com a duração e intensidade e também com os genótipos e tipos de
músculos usados nas análises.
Há pouca informação sobre as características e causas da PSE em carne de peito
de frango. Em função disto, Van Laack et al. (2000) objetivaram caracterizar a carne de
peito pálida e determinar se esta carne pode ser considerada PSE. Em comparação com a
carne normal, a carne de peito pálida teve pH mais baixo (5,7 vs. 5,9), maior
luminosidade (L*) (60,0 vs. 55,1) e menor rendimento durante o cozimento (95,2% vs.
105,8%). A solubilidade da proteína em amostras pálidas foi menor do que em amostras
normais, o que sugere desnaturação aumentada nos peitos pálidos, mas não foi
comprovado se esta desnaturação foi a causa de palidez e baixa capacidade de retenção
de água na carne de frango. Houve correlação negativa entre o pH e o valor de L* (r = -
0,76). O pH final baixo das amostras pálidas parece ter sido o principal determinante de
sua baixa capacidade de retenção de água.
Sob condições de baixa temperatura ambiente no ante-mortem, frangos de corte
desencadeiam mecanismos adicionais de produção de calor, como tremores musculares,
que levam a redução de glicose sérica e consumo das reservas de glicogênio, resultando
em rápida evolução do rigor-mortis. Estas condições podem gerar as carnes DFD que se
caracterizam por apresentarem pH elevado (em níveis próximos ao fisiológico),
coloração escura, consistência rígida e aparência seca.
4. Expressão gênica na musculatura esquelética
11
Admite-se que o fenótipo animal seja o resultado da interação entre seu material
genético (ação de todos os genes) e o ambiente. Desta forma, em resposta às alterações
ambientais, o organismo altera sua atividade gênica, evidenciando a existência de uma
regulação seletiva na expressão dos genes e direcionando a síntese de proteínas
específicas nas células (Regitano & Coutinho, 2001).
O processo de regulação térmica é complexo e o mecanismo molecular exato não
é totalmente compreendido (Li et al., 2011).Com o desenvolvimento de biotecnologias
moleculares, novas oportunidades estão disponíveis para caracterizar a expressão do
gene e identificar as principais respostas celulares ao estresse térmico. Estas novas
ferramentas permitirão aos pesquisadores melhorar a precisão e a eficiência da seleção
para tolerância ao calor. A regulação epigenética da expressão do gene pode se
constituir num método eficiente para melhorar a tolerância térmica (Renaudeau et al.,
2012).
A nutrigenômica é uma ciência nova que busca compreender o impacto dos
nutrientes sobre a expressão gênica e, também, como o genótipo de um indivíduo pode
influenciar sua resposta aos nutrientes da dieta (Duclos, 2007).
A fim de obter novas informações sobre a regulação do estresse por calor, Li et
al. (2011) estudaram a resposta global de genes de frangos de corte machos Arbor Acres,
expostos ao estresse cíclico dos 28 aos 49 dias de idade, para simular a alta temperatura
natural de verão. Para isto, bibliotecas de cDNA do músculo do peito e do fígado das
aves foram construídas e analisadas. O ensaio de microarranjo revelou 110 genes do
peito diferencialmente expressos em aves estressadas. A descoberta de novos genes
reativos ao calor [mitogen-activated protein kinase activating protein PM20/PM21;
suppressors of cytokine signaling (SOCS) box-containing protein 2 (ASB2); ubiquitin-
specific proteinase 45 (USP45) e TRK-fused gene (TFG)] sugere que as vias proteína-
quinase ativadas por mitogéno, as vias de ubiquitina-proteassoma e as vias nucleares do
fator ĸB desempenham papéis importantes na termorregulação.
A resposta ao estresse por calor representa um mecanismo universal,
desenvolvido por todos os organismos para lidar com as alterações adversas do
ambiente, que leva à síntese das proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins,
HSP) (Gabriel et al., 2002). Assim, maiores níveis protéicos de HSP70 foram
observados no fígado de pintos de corte após o estresse térmico agudo (36-37°C),
12
durante cinco horas (Dionello et al., 2001) e maior expressão da proteína HSP70 no
cérebro, coração e pulmões de embriões mantidos a 40°C durante quatro a seis horas
(Leandro et al., 2004). Em contrapartida, foram também relatados menores níveis
protéicos de HSP70 no cérebro de pintos de corte após o estresse térmico agudo (36-
37°C), durante cinco horas (Dionello et al., 2001) e menor síntese protéica de HSP nos
pulmões e coração em idade precoce (Yahav et al., 1997). Estes últimos autores
concluíram que o condicionamento térmico induziu um mecanismo que agiu em longo
prazo, reduzindo a hipertermia das aves durante o desafio de calor e, portanto reduzindo
a síntese de HSP.
Sohn et al. (2012) objetivaram mensurar a taxa de dano do DNA e os níveis de
expressão dos genes HSP70 e HSP90 em galinhas poedeiras da linhagem White
Leghorn, expostas aos efeitos de estresse por restrição alimentar e densidade elevada de
alojamento, às 64 semanas de idade. Os níveis de expressão dos genes foram medidos
em linfócitos, por PCR quantitativa em tempo real. As aves mantidas sob estresse
apresentaram maior dano ao DNA, queda de 5,4% no ganho de peso e aumento de
aproximadamente três vezes na expressão de HSP90α, mas não apresentaram efeito
sobre a expressão de HSP70 e HSP90β. Portanto, concluiu-se que a quantificação do
dano no DNA total e o nível de expressão do gene HSP90α podem ser utilizados como
marcadores de estresse fisiológico em aves.
Nos pequenos mamíferos, a termogênese facultativa se dá principalmente no
tecido adiposo marrom, por intermédio da proteína desacopladora (UCP1). Outras
quatro proteínas homólogas foram identificadas, também em mamíferos, dentre as quais
a UCP2 é expressa em todos os tecidos e a UCP3 nos tecidos adiposo, muscular
esquelético e coração (Mujahid et al., 2006). Em mamíferos, a UCP2 e a UCP3 parecem
ter funções associadas com o metabolismo energético, a separação do substrato e a
regulação do peso corporal (Evock-Clover et al., 2002).
As espécies de aves estudadas até o momento não possuem depósitos
identificáveis de tecido adiposo marrom ou tecido termogênico relacionado, em função
disto, sua temperatura corporal é mantida constante através de tremores do músculo
esquelético. Há forte evidência de que o mecanismo sem tremor das aves possa também
ter importância durante a exposição ao frio (Toyomizu et al., 2002). Os frangos
adquirem tolerância ao frio após maturação de seus músculos esqueléticos (Ijiri et al.,
13
2009a). Recentemente, foi identificada no músculo esquelético uma proteína específica
denominada proteína desacopladora aviária (avian uncoupling protein: avUCP),
homóloga à UCP2 e UCP3 (Mujahid et al., 2006).
Embora sejam pouco conhecidos os papéis fisiológicos e as funções da proteína
UCP1 e das homólogas UCP2, UCP3 e avUCP, sabe-se que seus níveis são induzidos
durante o jejum. Acredita-se que as UCPs do músculo esquelético desempenhem papel
na regulação de lipídeos como substratos energéticos, no controle da produção de
radicais livres (reactive oxygen species, ROS) (Abe et al., 2006) e no controle da
secreção de insulina. Elas também podem estar envolvidas na proteção contra os efeitos
deletérios dos radicais livres e na mediação da termogênese muscular facultativa
(Mujahid et al., 2006).
Pintos de corte de sete dias de idade, expostos ao condicionamento térmico
(40°C por 24 horas) apresentaram redução da temperatura corporal (-0,13°C) e menor
expressão de avUCP no músculo peitoral, entretanto, estes índices voltaram rapidamente
aos seus níveis normais 24 horas após o condicionamento térmico. De acordo com estes
resultados, Taouis et al. (2002) recomendaram estudos adicionais a respeito da redução
na expressão da avUCP induzida pelo condicionamento térmico, especialmente durante
o período crítico da última semana de produção de frangos, em climas tropicais.
O estresse por calor agudo (34°C por 18 horas) estimulou a produção de
superóxido mitocondrial no músculo esquelético de frangos de corte, possivelmente pela
redução na expressão da avUCP, em contrapartida, nenhuma diferença na expressão de
avANT (avian adenine nucleotide translocator), outro carreador mitocondrial de ânions,
foi observada (Mujahid et al., 2006). Estes resultados forneceram a primeira evidência
de que a hipertermia estimula a produção de superóxidos no músculo esquelético de
frangos, via regulação descendente da avUCP.
Evock-Clover et al. (2002) objetivaram caracterizar a UCP no músculo
esquelético de frangos machos de 21 dias de idade, mantidos sob condições de estresse
nutricional. Da mesma forma que nos mamíferos, houve aumento na expressão do gene
avUCP nas aves durante a privação alimentar por 24 ou 48 horas, seguido de
normalização destes níveis após a realimentação por 24 horas. Segundo os autores, este
aumento nos níveis de avUCP está altamente correlacionado com as concentrações de
triglicerídeos no plasma, de ácido graxos não-esterificados, de insulina, IGF-I e IGF-II,
14
bem como com a expressão do gene receptor IGF-I e IGF-I no músculo esquelético,
indicando a relação do gene com o aumento da oxidação de ácido graxo no músculo
esquelético.
Abe et al. (2006) pesquisaram as alterações na expressão do gene avUCP e sua
relação com a produção de ROS pelas mitocôndrias, no músculo esquelético de frangos
mantidos em jejum. Os autores observaram aumento na expressão do gene avUCP em
aproximadamente oito vezes após o jejum de 24 horas, e em cinco vezes após o jejum de
48 horas e diante disto, concluíram que produção de ROS é regulada pela avUCP, pois a
maior expressão do gene após o jejum de 24 horas foi acompanhada de maior produção
de ROS.
Toyomizu et al. (2002) estudaram as diferenças nos níveis de expressão de
RNAm dos genes homólogos avUCP e avANT no músculo esquelético de aves
aclimatadas ao frio. A melhora da conversão alimentar das aves aclimatadas ao frio
estava parcialmente envolvida com a expressão dos transportadores mitocondriais de
ânion: avUCP e avANT. Desta forma, o aumento nos níveis de expressão destes genes,
leva ao aumento na ação de desacoplamento induzido por ácido graxo da mitocôndria,
que por sua vez acredita-se influenciar a regulação da termogênese pelo músculo
esquelético. A elucidação do mecanismo fisiológico envolvido com a expressão de
avUCP/avANT e dos mecanismos moleculares envolvidos com o desacoplamento
induzido por ácido graxo ajudaria na compreensão da regulação da termogênese. Os
autores destacam a necessidade de mais estudos para o entendimento deste mecanismo.
Segundo Mujahid et al. (2007), a exposição de aves ao estresse por calor agudo
(34ºC por 6, 12 e 18 horas) induziu à menor expressão da avUCP que levou à maior
produção de superóxido mitocondrial no músculo peitoral. Além disto, a expressão do
gene e o conteúdo de proteína avUCP mitocondrial foram dependentes do tempo: o
transcrito do gene avUCP teve sua expressão reduzida após 6 horas, enquanto o teor de
proteína avUCP teve sua expressão reduzida somente após 12 horas de estresse por
calor.
O ciclo do ácido cítrico, que ocorre no interior das mitocôndrias, desempenha
papel central nos mecanismos metabólicos de obtenção de energia das células. A
primeira etapa é realizada pela enzima citrato sintase, que catalisa a reação de
condensação do acetil-CoA juntamente com o oxaloacetato, produzindo o citrato. Uma
15
baixa atividade desta enzima pode limitar a velocidade de toda a sequência de reações
do ciclo do ácido cítrico, alterando a homeostase (Lehninger et al., 2008).
A enzima glicogênio fosforilase catalisa a reação de degradação do glicogênio a
glicose-1-fosfato, via glicólise, para fornecimento de energia muscular (ATP) e
manutenção do nível constante de glicose no sangue. Esta enzima reguladora controla a
velocidade de quebra dos carboidratos na via glicolítica (Lehninger et al., 2008). Um
desequilíbrio fisiológico causado por altas temperaturas e umidade relativa do ar, no
momento do abate, influencia diretamente as reservas do glicogênio muscular,
responsáveis pelo desenvolvimento das reações bioquímicas post mortem (Petracci et
al., 2001), que determinarão a qualidade da carne e suas propriedades funcionais
(Cheftel et al., 1989). Sob condições normais, a velocidade da glicólise é ajustada à
velocidade do ciclo do ácido cítrico de tal forma que é metabolizada apenas a
quantidade exata de glicose, que fornece ácido pirúvico suficiente para suprir o ciclo do
ácido cítrico com seu combustível: os grupos acetila do acetil-CoA (Lehninger et al.,
2008). Estudos envolvendo a expressão, no músculo esquelético, dos genes que
codificam as enzimas citrato sintase (ACLY) e glicogênio fosforilase (PYGL), que
podem influenciar o desempenho e a qualidade de carne sob estresse térmico, não foram
encontrados.
A miostatina (MSTN) tem se revelado um dos fatores mais relevantes para a
regulação da formação da massa muscular, durante o desenvolvimento e crescimento
das aves. Esta proteína atua como um potente regulador negativo do crescimento
muscular esquelético, inibindo a proliferação de mioblastos durante a miogênese e
persistindo por toda a fase adulta da ave. Inúmeras pesquisas têm demonstrado que a
superfamília beta de fatores transformantes e de crescimento (TGF-β), da qual a
miostatina faz parte, é constituída por potentes inibidores da diferenciação miogênica,
fundamentais na regulação do desenvolvimento embrionário e na manutenção da
homeostase dos tecidos de animais adultos (Thomas et al., 2000).
Ijiri et al. (2009a) ao submeterem pintos de sete dias de idade ao frio, por 24
horas, detectaram diminuição da expressão do gene da miostatina nos músculos das
pernas das aves e aumento da massa nos músculos de contração lenta e rápida aos sete
dias, mas este efeito não foi observado aos oito dias de idade das aves. Estes resultados
sugerem que a regulação da expressão da miostatina nos músculos da perna é necessária
16
aos pintos para adquirir tolerância ao frio até os sete dias de idade. Segundo os autores,
estas aves podem servir como modelo animal para estudos acerca das respostas
adaptativas e sua regulação nos músculos.
Em outro estudo, Ijiri et al. (2009b) avaliaram o envolvimento da miostatina no
aumento da massa muscular esquelética de aves aos sete dias de idade, com exposição
aguda (a 4°C por 24 horas) e crônica (a 4°C por oito dias) ao frio. A exposição aguda ao
frio induziu menor expressão da miostatina e aumento no peso do músculo esquelético.
Esta alteração na expressão do gene rapidamente retornou ao nível normal após o
término da exposição ao frio. Por outro lado, os pintos expostos ao frio em longo prazo
não apresentaram alteração no nível de expressão da miostatina, no entanto, houve
aumento no peso do músculo esquelético. Com base nestes resultados, os autores
sugerem que o gene da miostatina possa estar envolvido no crescimento muscular das
aves durante a fase inicial de adaptação à exposição ao frio.
Scheuermann et al. (2004) determinaram a ontogenia da miostatina a partir de
embriões de galinha de genótipos divergentes para musculosidade. Desta forma, foi
utilizada a linhagem Leghorn e duas linhagens comerciais de frangos de corte (normal e
alto rendimento de peito) nos dias 1 a 20 do desenvolvimento embrionário. Não houve
efeito de genótipo ou interação genótipo x idade embrionária sobre a expressão da
miostatina e a maior muscularidade dos frangos de corte em relação às Leghorns não foi
atribuída à menor expressão da miostatina durante o desenvolvimento embrionário.
5. O uso das vitaminas C e E como antioxidantes
O estresse por calor prejudica o estado antioxidativo das aves: a peroxidação
lipídica nos tecidos se eleva e gera acumulação de radicais livres. Quando esta
acumulação excede a capacidade antioxidativa, ocorre disfunção da célula e, portanto,
queda no desempenho produtivo, além da deterioração da qualidade de carne (Maini et
al., 2007). O interesse por práticas que possam amenizar os efeitos oxidativos do
estresse térmico sobre as aves de corte tem aumentado.
Os fatores nutricionais são considerados importantes moduladores do sistema
antioxidante. Nos últimos anos, têm sido realizados muitos estudos sobre os efeitos das
17
vitaminas, pelo fato de serem largamente utilizadas como antioxidantes na indústria de
alimentos (Halici et al., 2011). O emprego das vitaminas C e E, acima dos níveis
estabelecidos pelas exigências nutricionais, pode se constituir em alternativa para
minimizar os efeitos do estresse sobre o desempenho animal.
O ácido ascórbico, também conhecido como vitamina C, desempenha importantes
funções em muitas reações bioquímicas, como a oxidação reversível, através da
incorporação de oxigênio ao substrato, e a redução. É classificado como hidrossolúvel,
por isto, alguns autores destacam sua atuação como coenzima em sistemas enzimáticos e
outros afirmam ser em parte desconhecida sua função no organismo por não haver
nenhuma forma de coenzima descrita (Mc Dowell, 1989).
Existem diversas substâncias que apresentam atividade em vitamina C, das quais a
mais importante é o ácido L-ascórbico (Figura 1).
Figura 1. Estrutura molecular da vitamina C (ácido L-ascórbico) (Mc Dowell, 1989).
Por ser facilmente oxidada quando exposta ao ar, a vitamina C apresenta, em sua
forma comercial, um revestimento com etilcelulose, que minimiza a perda de atividade
durante o armazenamento das rações (Ammermann et al. 1995).
A vitamina C é classificada como não essencial para as aves, pois, a quantidade
sintetizada no fígado é suficiente para manutenção do crescimento e metabolismo.
Entretanto, em frangos submetidos à elevação de temperatura ambiente (de 21ºC para
31ºC) pode haver redução da quantidade sintetizada, chegando até a exaustão dos
estoques (Macari et al., 2002). Na fase de alerta do estresse, os níveis de vitamina C no
sangue se reduzem drasticamente ou até mesmo desaparecem.
Em condições adversas, tais como sob estresse, a suplementação de vitamina C na
dieta pode ser benéfica (Rutz, 2002). A suplementação de 1.000 a 3.000 ppm de
vitamina C nas rações dos frangos de corte tem sido proposta para reduzir os efeitos do
18
estresse sobre o animal (Macari et al., 2002). É importante salientar que a
suplementação de vitamina C deve ser feita antes do início do estresse, ou seja, melhores
resultados foram obtidos com o uso da vitamina C dentro de 24 horas antes do
estabelecimento do estresse (Rutz, 2002). No entanto, o efeito da suplementação da
dieta de frangos com vitamina C acima dos níveis de exigência ainda é controverso
(Grau et al., 2001), pois muitos pesquisadores não encontraram efeito benéfico desta
suplementação na dieta de aves submetidas às condições adversas (Mc Dowell, 1989).
Silva et al. (1993) ao avaliarem o efeito da suplementação de vitamina C (75 e
150 mg/kg) na alimentação de frangos de corte na fase final de criação (dos 35 aos 48
dias) relataram que a suplementação na dosagem de 75 mg/kg de ração melhorou a
conversão alimentar das aves.
A vitamina E é um nutriente lipossolúvel, ou seja, é armazenada nas células
gordurosas e liberada em pequenas doses para atender às necessidades do organismo.
Constitui-se em um potente sequestrador de radicais livres e no mais poderoso
antioxidante não enzimático lipossolúvel da natureza (Lauridsen et al., 1997).
Oito formas de vitamina E são encontradas na natureza: quatro de tocoferol e
quatro de tocotrienol (ambos α, β, γ e δ). Os tocoferóis puros são facilmente oxidáveis.
A esterificação dos tocoferóis com o acetato melhora a estabilidade ao oxigênio
atmosférico, por isto, os suplementos comerciais normalmente contêm acetato de DL- α
tocoferol (Mc Dowell, 1989). A estrutura do acetato de α-tocoferol é apresentada na
Figura 2.
Figura 2. Estrutura do acetato de α-tocoferol (Mc Dowell, 1989).
O α-tocoferol possui maior atividade biológica em relação aos demais tocoferóis,
por isto, é mais eficiente na absorção e no armazenamento. Um miligrama de acetato de
19
DL- α tocoferol tem atividade de vitamina E de 1 unidade internacional (UI) (Islabão,
1982; Mc Dowell, 1989; Ammermann et al., 1995).
A deficiência de vitamina E em pintos é responsável pelo aparecimento de
doenças como diátese exsudativa, encefalomalácia, distrofia muscular e necrose
hepática (Islabão, 1982; Mc Dowell, 1989). As aves não sintetizam vitamina E, e são,
portanto, dependentes de fontes dietéticas para atender suas exigências (Tamehiro et al.,
2005). As exigências de vitamina E não são fixas, pois dependem da presença de outros
nutrientes na dieta, tais como o selênio, aminoácidos sulfurados e ácidos graxos
polinsaturados (Rutz, 2002).
Frangos de corte de crescimento rápido são suscetíveis a doenças por deficiência
de selênio, como a diátese exsudativa. A suplementação da dieta até os 42 dias com
vitamina E (acetato de α-tocoferol, a 50 mg/kg) diminui a incidência da diátese
exsudativa nas aves, entretanto, a suplementação com selênio (selenito de sódio, a 0,3
mg/kg) reduz a taxa de mortalidade e confere maior proteção contra a diátese
exsudativa. A proteção pela vitamina E pode ser mediada por mecanismos
independentes de selênio (Huang et al., 2011).
Informações sobre os níveis de absorção da vitamina E em aves, além de
escassas, são altamente variáveis e não têm sido quantificadas sob condições de campo
(Villaverde et al., 2004). Este fato se agrava quando as aves são submetidas ao estresse
por calor, provocado pela rápida elevação na temperatura ambiente, com repercussão na
redução do consumo de ração, e também na elevação e aceleração de perdas na
concentração de vitamina E na dieta (Scheideler & Froning, 1994).
A suplementação da dieta de frangos de corte com a vitamina E é muito discutida
atualmente, principalmente no combate aos prejuízos causados pelo estresse por calor,
devido à sua função antioxidante. Por outro lado, esta suplementação proporciona níveis
endógenos aumentados de vitamina E post-mortem nos músculos das aves, reduzindo a
oxidação lipídica da carne e, portanto, melhorando sua estabilidade de armazenamento
(Jensen et al., 1998). Este benefício se traduz em maior tempo de prateleira da carne
(Grau et al., 2001; Villaverde et al., 2004).
Para que esta vitamina seja eficaz, altos níveis devem ser fornecidos antes e
durante o período de estresse (Frigg et al., 1992). O NRC (1994) indicou a exigência de
20
10 mg/kg de vitamina E, no entanto, a suplementação em níveis 20 a 25 vezes maiores
tem sido usada na fase final de criação de frangos de corte (Barreto et al., 1999).
Maini et al. (2007) estudaram os efeitos antioxidativos da suplementação de
vitamina E (200 mg/kg de ração) em frangos de corte Cobb, até os 42 dias de idade,
durante os meses de verão, com índice de temperatura e umidade (THI) variando de 73 a
80. As aves que receberam suplementação com antioxidantes apresentaram nível
reduzido de peroxidação lipídica e elevada atividade de glutationa, catalase, superóxido
dismutase e glutationa redutase nos eritrócitos. Portanto, a suplementação exerceu efeito
de melhora frente ao estresse por calor através da alteração nos sistemas antioxidativos
enzimáticos e não enzimáticos de eritrócitos. De acordo com este perfil enzimático, a
vitamina E tem potencial para atenuar o estresse oxidativo em frangos de corte sob
estresse por calor.
Gao et al. (2010) estudaram os efeitos da administração de glicocorticóide
dexametasona a longo prazo e a suplementação da dieta com vitamina E (acetato de dl
α-tocoferol) sobre a indução da peroxidação lipídica no músculo esquelético de frangos
de corte machos, aos 35 dias de idade. Os resultados indicaram que a administração
exógena de glicocorticóides em longo prazo aumentou a peroxidação lipídica e também
o nível de saturação dos ácidos graxos do músculo esquelético. O crescimento dos
frangos foi suprimido por dexametasona, ao passo que foi melhorado pelo tratamento
com nível elevado de vitamina E (200 mg/kg de ração). Desta forma, a suplementação
com vitamina E foi favorável ao desempenho de frangos de corte por suprimir a
peroxidação lipídica no plasma e no tecido muscular esquelético, aliviando o estresse
oxidativo induzido pelo tratamento com dexametasona.
Frigg (1990) ao avaliar o efeito da adição de diferentes níveis de vitamina E (25;
50; 100 e 200 mg/kg) na dieta de frangos de corte verificou que o maior nível fornecido
melhorou o ganho de peso e a conversão alimentar, além da melhora na estabilidade da
ração fornecida. Kennedy et al. (1991) estudaram o efeito da adição de dois níveis de
vitamina E (10 e 180 UI/kg) na ração de frangos de corte e também obtiveram melhores
resultados nos animais alimentados com o maior nível de vitamina E. Voljč et al. (2011)
avaliaram as recomendações para a suplementação de vitamina E na dieta de frangos de
corte (85 a 200 UI de all-rac-α-tocoferol e 85 UI de RRR-α-tocoferol) e a ingestão
elevada de ácido graxo poliinsaturado (através da inclusão de óleo de linhaça na dieta)
21
sobre o nível de estresse oxidativo in vivo e a estabilidade oxidativa in vitro da carne. Os
autores concluíram que as concentrações baixas, bem como as concentrações altas de
vitamina E não foram suficientes para prevenir os efeitos nocivos da oxidação lipídica in
vivo e que, para melhorar a estabilidade dos lipídeos da carne, maior suplementação de
vitamina E faz-se necessária, especialmente após o tratamento por calor.
As vitaminas C e E apresentam efeito sinérgico, ou seja, interagem numa base
intracelular para fornecer proteção antioxidativa. Na membrana celular, a vitamina E é
oxidada na forma de radicais livres ou ROS. Acredita-se que a vitamina C intracelular
atue como regeneradora da vitamina E, de forma a reduzir sua quantidade oxidada.
Desta forma, a vitamina C colabora para que a vitamina E mantenha suas propriedades
antioxidantes (Chan, 1993). Em outras palavras, a vitamina C apresenta ação terapêutica
por potencializar a capacidade da vitamina E de evitar a lipoperoxidação.
Halici et al. (2011) objetivaram compreender os efeitos das vitaminas C (250
mg/kg) e E (250 mg/kg) adicionadas às rações de codornas japonesas, expostas ao
estresse térmico (34ºC, durante 9 horas diárias) por 21 dias. Como era esperado, o
estresse térmico exerceu efeitos indesejáveis, tais como aumento do nível da
peroxidação lipídica, caracterizando o estresse oxidativo nas aves. Entretanto, a
suplementação da dieta com antioxidantes (vitaminas C e E) diminuiu o nível de
peroxidação lipídica e aumentou a atividade da enzima superóxido dismutase, aliviando
os efeitos adversos do estresse oxidativo causado pela alta temperatura.
Archile-Contreras et al. (2011) estudaram in vitro se as vitaminas C e E
influenciam o equilíbrio entre a síntese e a degradação de colágeno via secreção de
metaloproteinases, durante o crescimento de bovinos para a produção de carne. As
vitaminas C e E aumentaram o turnover do colágeno exercido pelos fibroblastos
intramusculares (músculos longissimus dorsi e semitendinoso) bovinos. Estes resultados
podem ter implicações in vivo sobre o desempenho, como também a elevada taxa de
turnover do colágeno pode conduzir à solubilidade aumentada do colágeno nos
músculos, o que pode afetar a maciez da carne. Desta forma, tornam-se necessários mais
estudos para a compreensão dos efeitos que os micronutrientes podem ter sobre a
remodelação da matriz extracelular e seu possível impacto no modelo animal in vivo.
22
6. Justificativa e objetivos
O estresse pelo calor se tornará problema crescente no futuro, em função do
avanço no aquecimento global. Técnicas de manejo ambiental, incluindo melhoramento
na instalação e nos sistemas de refrigeração e mudanças na estratégia alimentar tornam-
se fundamentais para atenuar o efeito prejudicial do estresse térmico sobre o
desempenho animal. O entendimento das respostas do animal ao desafio térmico
também é indispensável para o sucesso na implementação das medidas que visam
melhora da produção em clima quente. Embora o efeito das condições naturais de calor
(verão) sobre o desempenho dos animais pareça ser já conhecido em sua maior parte, o
mecanismo molecular exato não é totalmente compreendido, por isto são necessários
esforços para identificar genes específicos associados com a tolerância e a sensibilidade
ao estresse pelo calor e o estudo da expressão gênica pode ser uma ferramenta útil no
auxílio destas descobertas.
Em função do exposto, foram realizados dois trabalhos com os objetivos de
verificar se a suplementação da dieta com antioxidante (vitaminas C e E acima dos
níveis nutricionais recomendados) seria capaz de reduzir, ou neutralizar, os efeitos
provocados pelo estresse por calor sobre as características de desempenho, rendimento
de carcaça e cortes e qualidade da carne de frangos de corte, dos 28 aos 42 dias de idade,
bem como avaliar a expressão dos genes relacionados ao desenvolvimento muscular
(MSTN), à resposta ao choque térmico (HSP70), ao metabolismo energético (ACLY e
PYGL) e ao estresse oxidativo (avUCP) na musculatura esquelética do peito de frangos
de corte durante o estresse por calor agudo, de 21 horas, e crônico, de 16 dias.
O Capítulo II, intitulado RESPOSTA FISIOLÓGICA, DESEMPENHO,
RENDIMENTO DE CARCAÇA E QUALIDADE DA CARNE DE FRANGOS DE
CORTE SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES
NA DIETA será submetido à publicação na revista: Meat Science, sob responsabilidade
editorial da “American Meat Science Association”.
O Capítulo III, intitulado EXPRESSÃO GÊNICA NO MÚSCULO
ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE CORTE SOB ESTRESSE POR CALOR
23
QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES NA DIETA será submetido à publicação na
World’s Poultry Science Journal, sob responsabilidade editorial da “World’s Poultry
Science Association”.
24
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32
CAPÍTULO II
33
RESPOSTA FISIOLÓGICA, DESEMPENHO, RENDIMENTO DE CARCAÇA E
QUALIDADE DA CARNE DE FRANGOS DE CORTE SOB ESTRESSE POR CALOR
QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES NA DIETA
Resumo
A temperatura ambiente elevada representa o principal fator limitante do
desenvolvimento da produção avícola em regiões de clima quente. O objetivo do trabalho foi
verificar se a dieta suplementada com vitaminas C e E, seria capaz de neutralizar, ou reduzir, os
efeitos do estresse por calor, aplicado dos 28 aos 42 dias de idade, sobre a resposta fisiológica, o
desempenho, rendimento de carcaça e qualidade da carne de frangos. Foram utilizados 384
frangos de corte machos distribuídos num delineamento inteiramente casualizado, com arranjo
fatorial 2 x 3 (com e sem suplementação da dieta com vitaminas e temperaturas ambientais
associadas ao pair-feeding) e 16 repetições. As aves foram mantidas em termoneutralidade até
os 28 dias. A partir desta idade, foram alojadas em grupos de quatro por gaiola, em três salas
climatizadas: duas termoneutras (22,6 e 22,5ºC) e uma de estresse por calor (31,7ºC). Metade
das aves recebeu dieta suplementada com vitaminas C (536 mg/kg) e E (127 mg/kg). Na sala de
estresse por calor as aves tiveram livre acesso à ração; nas salas termoneutras metade das aves
recebeu ração à vontade e a outra metade recebeu quantidade limitada, no sistema pair-feeding.
Foram avaliados a temperatura retal e da superfície da pele e características de desempenho,
rendimento de carcaça e qualidade instrumental da carne. As análises de qualidade de carne
foram realizadas no músculo pectoralis major (peito) 24 horas após o abate. A suplementação
da dieta com vitaminas C e E não foi capaz de neutralizar, nem de reduzir, os efeitos negativos
do estresse por calor sobre as características de desempenho, rendimento de carcaça e qualidade
de carne das aves. A semelhança nos resultados de desempenho entre aves em estresse por calor
e em pair-feeding sugere que a queda no desempenho sob estresse por calor deveu-se,
principalmente, à redução no consumo de alimentos.
Palavras-chave: maciez, metabolismo, pair-feeding, peito, vitaminas
34
PHYSIOLOGICAL RESPONSE, PERFORMANCE, SLAUGHTER YIELD AND MEAT
TRAITS OF CHICKENS UNDER HEAT STRESS THAT RECEIVED ANTIOXIDANTS
IN THE DIET
Abstract
Elevated ambient temperature represents the main limiting factor for the development of
chicken production in hot climate regions. The objective of this study was to evaluate if the diet
supplemented with vitamins C and E would be able to reduce, or neutralize the negative effects
of heat stress applied between 28 and 42 days of age, on the physiological response,
performance, slaughter yield and meat quality of chickens. A total of 384 male broiler chickens
were assigned to a completely randomized design, with a 2 x 3 factorial arrangement (diet with
or without vitamins supplementation and ambient temperatures associated with pair-feeding)
and 16 replications. The chickens were kept in thermoneutral conditions up to 28 days of age.
From this age and on, were housed in groups of four per cage, in three environmentally
controlled chambers: two were thermoneutral (22,6 e 22,5ºC) and one for heat stress (31,7ºC).
Half the chickens were offered a diet supplemented with vitamins C (536 mg/kg) and E (127
mg/kg). In the heat stress chamber, the chickens had free access to the feed; in the thermoneutral
chambers half the chickens had free access to the feed and the other half received a limited
amount, in a pair-feeding system. Rectal and body surface temperatures and performance,
slaughter yield and meat quality traits were evaluated. Meat quality analyses were performed in
the pectoralis major muscle 24 hours after slaughter. Diet supplementation with vitamins C and
E were not able to neutralize, neither to reduce, the negative effects of heat stress on the
performance, slaughter yield and meat quality traits. The similarity of performance results
between the chickens submitted to heat stress and pair-feeding, suggested that the reduction in
performance under heat stress were due mainly to the drop in feed consumption.
Keywords: breast, metabolism, pair-feeding, tenderness, vitamins
35
Introdução
O ambiente confortável para frangos de corte na fase de crescimento
compreende temperatura de 15ºC a 25ºC e umidade relativa do ar de 50% a 70%
(Tinôco, 2001). Na região Sudeste do Brasil há duas estações distintas: uma estação fria
e seca (de abril a setembro), e uma estação quente e úmida (de outubro a março), que
limita o desempenho dos frangos (Brunini et al., 2008). Desta forma, a manutenção do
conforto térmico nos aviários se constitui num dos problemas enfrentados pelos
produtores brasileiros, tendo em vista que o microambiente nem sempre é compatível
com as necessidades fisiológicas das aves.
Temperaturas ambientais acima do valor de termoneutralidade tendem a
influenciar a manutenção da homeotermia das aves, de forma a induzir ajustes
fisiológicos; reduzir o consumo de alimentos, com consequente piora no desempenho
dos animais; alterar o rendimento de carcaça e piorar a qualidade da carne (Brossi et al.,
2009). O estresse por calor altera a estrutura e as funções da membrana celular e o
metabolismo oxidativo dos organismos (Mager & De Kruijff, 1995). A elevação da
peroxidação lipídica nos tecidos gera acúmulo de radicais livres e, quando a capacidade
antioxidativa é excedida, ocorre queda na produtividade animal, além da deterioração da
qualidade da carne de frango, em função do seu alto teor de ácidos graxos
poliinsaturados (Nanari et al., 2004; Maini et al., 2007).
O ácido ascórbico, também conhecido como vitamina C, não é essencial para as
aves, pois seu fígado sintetiza quantidade suficiente para manutenção do crescimento e
metabolismo; entretanto, o estresse por calor reduz drasticamente a quantidade
sintetizada e a ave pode chegar até a exaustão dos estoques (Macari et al., 2002). Em
virtude disto, tem sido proposta a suplementação desta vitamina nas rações dos frangos
de corte, por auxiliar na redução dos efeitos do estresse sobre o animal (Macari et al.,
2002; Rutz, 2002), no entanto, o efeito da suplementação em níveis altos ainda é
controverso (Grau et al., 2001).
O tocoferol, ou vitamina E, não é sintetizado pelas aves, que são, portanto,
dependentes de fontes dietéticas para atender suas exigências (Tamehiro et al., 2005).
As exigências de vitamina E não são fixas, pois dependem da presença de outros
nutrientes na dieta, tais como aminoácidos sulfurados, ácidos graxos polinsaturados e
36
selênio (Rutz, 2002). A suplementação de vitamina E é muito discutida atualmente,
principalmente no combate aos prejuízos causados pelo estresse por calor, devido à sua
função antioxidante que a torna um potente sequestrador de radicais livres (Lauridsen et
al., 1997). O NRC (1994) indicou a exigência de 10 mg/kg de vitamina E na dieta basal
de frangos de corte; no entanto, a suplementação em níveis 20 a 25 vezes maiores tem
sido usada na fase final de criação de frangos de corte (Barreto et al., 1999).
Este trabalho foi conduzido para verificar se a suplementação da dieta com
vitaminas C e E, acima dos níveis recomendados, é capaz de reduzir, ou neutralizar, os
efeitos do estresse por calor sobre o desempenho, rendimento de carcaça e cortes e
qualidade da carne de frangos, dos 28 aos 42 dias de idade.
Material e Métodos
Animais, manejo inicial e condições experimentais
Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pela Comissão de
Ética no Uso de Animais (CEUA, protocolo número 142/2009) da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP – Universidade Estadual Paulista,
Campus de Botucatu.
O experimento foi realizado no Laboratório de Nutrição de Aves da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP – Universidade Estadual
Paulista, Campus de Botucatu. Foram utilizados 384 pintos de corte machos da
linhagem Cobb, com um dia de idade, vacinados no incubatório contra as doenças de
Gumboro, Marek e Bouba aviária. Aos sete dias de idade, as aves foram revacinadas
contra a doença de Gumboro1, via água de bebida.
No período pré-experimental, os pintos foram alojados na proporção de oito por
gaiola (de 0,60 x 0,50 x 0,45 m), em duas salas climatizadas a 34°C, na primeira
semana, e a 32ºC, na segunda semana de idade. A partir da terceira semana, a densidade
foi reduzida para seis aves por gaiola e a temperatura foi reduzida à razão de 4°C por
semana, de modo a atingir 24°C, ao final da quarta semana de idade. No início do
período experimental, aos 28 dias, procedeu-se à distribuição de quatro aves por gaiola,
1CEVAC
® Gumbo L (Ceva Saúde Animal Ltda.)
37
em três salas climatizadas de 5,00 x 3,00 x 2,65 m: duas termoneutras e uma de estresse
por calor. Cada sala abrigou 32 gaiolas de arame galvanizado, totalizando 96 gaiolas,
equipadas com bebedouros tipo nipple e comedouros de calha.
As dietas basais foram formuladas à base de milho e farelo de soja, de acordo
com as recomendações de Rostagno et al. (2005) para frangos de corte machos de
desempenho médio, e produzidas na fábrica de rações da FMVZ (UNESP). As aves
receberam dieta pré-inicial (de 1 a 7 dias) com 22,0% de PB e 2950 kcal de EM/kg,
dieta inicial (de 8 a 21 dias) com 20,8% de PB e 3000 kcal de EM/kg, dieta de
crescimento (de 22 a 35 dias) com 19,4% de PB e 3100 kcal de EM/kg e dieta final (de
36 a 42 dias) com 18,0% de PB e 3150 kcal de EM/kg.
Durante a fase experimental (de 28 a 42 dias), metade das aves recebeu ração
suplementada com 536 mg/kg de vitamina C2 e 127 mg/kg de vitamina E
3, nas dietas de
crescimento e final (Tabela 1).
O experimento seguiu um delineamento inteiramente casualizado, com arranjo
fatorial 2 x 3 (suplementação ou não da dieta com vitaminas e temperaturas ambientais
associadas ao pair-feeding) e 16 repetições para as características de respostas
fisiológicas e de desempenho e 24 repetições para as características de abate e qualidade
de carne. A unidade experimental para os indicadores fisiológicos, o rendimento de
carcaça e a qualidade da carne foi o indivíduo, enquanto que, para o desempenho, foi a
gaiola.
2Rovimix
® C-EC (DSM). L-Ácido ascórbico a 97,5%. Inclusão de 550 mg/kg.
3Rovimix
® E-50Adsorbate (DSM). Acetato de dl-α –Tocoferol a 50%. Inclusão de 253 mg/kg.
38
Tabela 1. Composições centesimais e nutricionais das dietas basais utilizadas em cada
fase do período experimental.
Ingredientes Fases
Crescimento (28 a 35 d) Final (36 a 42d)
Milho 62,38 66,56
Farelo de soja 45% 30,73 26,84
Fosfato bicálcico 1,67 1,52
Calcário calcítico 0,83 0,79
Óleo de soja 3,16 3,11
Sal comum 0,48 0,45
Suplemento vitamínico1 0,10 0,05
Suplemento mineral2 0,05 0,05
DL-Metionina (99,0%) 0,18 0,17
L-Lisina HCl (78,4%) 0,23 0,28
Cloreto de colina (60%) 0,05 0,04
L-Treonina (98,5%) 0,06 0,08
Inerte (caulim)3 0,08 0,08
Total 100 100
Composição nutricional calculada
Energia metabolizável (kcal/kg) 3100 3150
Proteína bruta (%) 19,41 18,03
Cálcio (%) 0,83 0,77
Fósforo disponível (%) 0,41 0,38
Aminoácidos digestíveis
Lisina (%) 1,18 1,12
Metionina (%) 0,48 0,45
Metionina + cistina (%) 0,79 0,74
Triptofano (%) 0,23 0,21
Treonina (%) 0,81 0,76
Arginina (%) 1,27 1,15 1MC-MIX Frangos Engorda 1 kg (Mcassab
®) níveis de garantia/kg de ração fase de crescimento: vit. A
(9.000 UI); vit D3 (1.600 UI); vit E (14 mg); ácido fólico (0,3 mg); pantotenato de cálcio (9 mg); biotina
(0,05 mg); niacina (30 mg); piridoxina (1,8 mg), riboflavina (4 mg); tiamina (1 mg); vit. B12 (12 µg); vit.
K3 (1,5 mg); selênio (0,25 mg) e antioxidante (30 mg). MC-MIX Frangos Abate 0,5 kg (Mcassab®
) níveis
de garantia/kg de ração fase final: vit. A (3.000 UI); vit D3 (500 UI); vit E (5 mg); pantotenato de cálcio
(4 mg); biotina (0,015 mg); niacina (5 mg); piridoxina (0,4 mg), riboflavina (1 mg); tiamina (0,3 mg); vit.
B12 (3 µg); vit. K3 (0,5 mg); selênio (0,2 mg) e antioxidante (15 mg). 2Premix Mineral Aves (Vaccinar
®) níveis de garantia/kg de ração: Zn (55 mg); Fe (48 mg); Mn (78 mg);
Cu (10 mg); I (0,7 mg); Se (0,18 mg). 3Nas rações suplementadas o caulim foi substituído pela vitamina C (inclusão de 550 mg/kg) e vitamina E
(inclusão de 253 mg/kg).
39
Para a quantificação dos níveis de vitaminas presentes nas rações experimentais,
amostras foram enviadas ao Laboratório de Análises Químicas “Labtec”, localizado em
Hortolândia-SP, e analisadas, em duplicata, por cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC). Os resultados destas análises são descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Conteúdo de vitaminas C e E das dietas de crescimento e final, controle e
suplementadas, fornecidas às aves durante o período experimental,
determinadas pelo método de HPLC.
Tipo de ração Conteúdo de vitaminas (mg/kg da dieta)
C E
Dieta de crescimento
Controle 46 42
Suplementada 257 109
Dieta final
Controle 21 18
Suplementada 288 93
As dietas controle, de crescimento e final, não foram suplementadas com
vitaminas (Tabela 2). Pequenas quantidades de vitamina C (46 e 21 mg/kg de ração,
respectivamente) e E (42 e 18 mg/kg de ração, respectivamente) estavam presentes nos
ingredientes naturais da ração, como o milho, o farelo de soja e o óleo de soja e,
também, no suplemento vitamínico, no caso da vitamina E.
As aves tiveram livre acesso à água de bebida. Na sala de estresse por calor, a
ração foi oferecida à vontade. Nas duas salas termoneutras, metade das aves recebeu
ração à vontade e a outra metade recebeu quantidade limitada de ração, no sistema pair-
feeding. Esta técnica foi utilizada para isolar os possíveis efeitos da redução de consumo
de ração, que ocorre em condições de estresse por calor, sobre as características
40
estudadas. Para isto, a cada dia foi calculado o consumo médio de ração na sala de
estresse por calor e esta quantidade foi fornecida no dia seguinte para as aves nas gaiolas
do pair-feeding. Estas aves, mantidas sob alimentação controlada, foram alimentadas
duas vezes ao dia (manhã e tarde) para evitar que o consumo diário total fosse ingerido
em curto período de tempo. As gaiolas com alimentação à vontade e as controladas no
sistema pair-feeding foram aleatoriamente distribuídas nas duas salas termoneutras.
O programa de luz foi contínuo (24 horas de luz artificial) durante todo o período,
utilizando-se lâmpadas fluorescentes de 75 watts. A temperatura e a umidade relativa do
ar foram registradas diariamente nas salas às 09h00, 14h00 e 21h00. As temperaturas
máximas e mínimasforam coletadas diariamente, às 21h00 para o cálculo das médias de
temperatura ambiente e umidade relativa do ar (Müller, 1989) e para a obtenção do
índice de temperatura e umidade (THI), segundo Kelly & Bond (1971).
De acordo com a Figura 1, a temperatura e a umidade relativa do ar (médias
diárias), durante todo período experimental foram 22,6°C e 78,5% na sala termoneutra
1; 22,5°C e 71,3% na sala termoneutra 2 e 31,7°C e 59,1% na sala de estresse por calor.
O THI foi considerado normal nas condições de termoneutralidade 1 e 2 (71 e 70,3
respectivamente), mas elevado sob a condição de estresse por calor (82), denotando
ambiente de desconforto térmico para as aves (Kelly & Bond, 1971), conforme
planejado.
41
Figura 1. Valores médios de temperatura (painel superior), umidade relativa do ar (UR;
painel intermediário) e índice de temperatura e umidade (THI; painel inferior)
nas salas termoneutras 1 e 2 e de estresse por calor, no período de 16 a 31 de
agosto de 2010.
42
Indicadores fisiológicos
Para medição dos indicadores fisiológicos (temperaturas retal e da superfície da
pele) foi sorteada uma ave por gaiola, totalizando 96 aves. Os dados foram coletados em
horário fixo (sempre entre 14h00 e 16h00) e em dois dias consecutivos de cada semana,
entre 28 e 42 dias de idade. A temperatura retal foi tomada por sondas acopladas ao
termômetro digital de três canais (Physitemp
). No momento da medição, a sonda era
imersa em gel lubrificante e introduzida no reto da ave por aproximadamente 1 minuto.
A temperatura da superfície da pele foi tomada por meio do termômetro infravermelho
com mira digital, do tipo pistola (Icel
), posicionado a aproximadamente 25 cm da pele
da ave, em três pontos do corpo (crista, peito e perna). A média das duas medidas de
temperatura retal e da superfície da pele, tomadas na mesma semana, foi calculada e
consistiu no valor semanal do indivíduo (temperaturas de 28 a 35 dias e de 36 a 42dias
de idade das aves).
Avaliação do desempenho
A viabilidade, expressa em porcentagem, foi obtida através da relação entre o
número de aves sobreviventes menos as mortas no período dos 28 aos 42 dias de idade e
o número inicial de aves. O desempenho foi avaliado através do peso inicial e final dos
frangos, do ganho de peso, do consumo de ração e da conversão alimentar, no período
dos 28 aos 42 dias de idade. O ganho de peso foi calculado pela diferença entre o peso
final e o peso inicial. O consumo de ração foi registrado semanalmente. Para isto, foram
pesadas as quantidades fornecidas e as sobras de ração por gaiola. A conversão
alimentar foi obtida pela razão entre o consumo de ração e o ganho de peso das aves, já
corrigido pelo peso das aves mortas.
Avaliação do rendimento de carcaça, de cortes e órgãos
Aos 42 dias de idade, 144 aves foram sorteadas (24 de cada um dos tratamentos),
submetidas a jejum alimentar de oito horas e posteriormente destinadas ao Abatedouro
Experimental Avícola da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da
UNESP – Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, para pesagem e abate.
A insensibilização foi efetuada com atordoador elétrico de 55 volts, por dez
segundos e a sangria pela secção unilateral da veia jugular e artéria carótida. As carcaças
43
foram escaldadas a 57°C por três minutos, mecanicamente depenadas e manualmente
evisceradas. O resfriamento foi feito em tanques de água e gelo (Chiller) a 16°C no pré-
resfriamento e de 0 a 2°C no resfriamento, por 30 minutos (até que a temperatura interna
corporal atingisse 3°C). As carcaças, sem sangue, penas e vísceras, e os depósitos de
gordura abdominal tiveram seus pesos auferidos e os rendimentos foram determinados
considerando-se os pesos da carcaça eviscerada e da gordura, em relação ao peso vivo
ao abate. Os cortes comerciais (asa, peito, coxa e sobrecoxa e dorso) foram pesados em
balança com precisão de 1 g e seus rendimentos foram calculados em relação ao peso da
carcaça eviscerada. Os órgãos (fígado, moela, proventrículo e coração) foram pesados e
seus pesos relativos foram calculados com base no peso vivo ao abate.
Avaliação da qualidade de carne
As análises foram conduzidas no Laboratório de Qualidade de Carne da
Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA) da UNESP – Universidade Estadual
Paulista, Campus de Botucatu. Para avaliação da qualidade de carne foram inteiramente
dissecadas a porção direita e esquerda do músculo pectoralis major (peito) das 144
carcaças utilizadas no rendimento de carcaça. Estas porções de músculo foram
embaladas em sacos plásticos e conservadas sob resfriamento a 4°C, por 24 horas.
A medição do pH foi realizada no músculo dissecado, 24 horas após o abate.
Usou-se o peagâmetro Homis
, modelo 238, acoplado à sonda de vidro Digimed
,
modelo CF1. A sonda foi inserida diretamente no músculo até uma profundidade de três
milímetros, aproximadamente.
A cor objetiva foi tomada em três porções da amostra de músculo por meio do
colorímetro Konica Minolta
, modelo CR-400, no sistema CIELab, onde foram
avaliados os parâmetros L* (luminosidade), variando de preto (0) a branco (100), a*
(teor de vermelho), variando de verde (-60) a vermelho (+60) e b* (teor de amarelo),
variando de azul (-60) a amarelo (+60). Para estas determinações, as amostras foram
previamente expostas ao ar por 30 minutos, à temperatura de 15ºC antes das medidas da
cor, de acordo com metodologia proposta por Van Laack et al. (2000).
A capacidade de retenção de água foi avaliada segundo a metodologia descrita
por Hamm (1960), com base na medição da perda de água liberada quando aplicada
pressão de dez quilogramas, por cinco minutos, sobre amostras de 0,50 g de tecido
44
muscular. A porcentagem da água perdida foi calculada a partir da diferença de peso da
amostra antes e após sofrer pressão. Através da equação: [100 – % perda de água], foi
obtida a capacidade de retenção de água.
Para a análise de perda de peso por cozimento, a porção direita e esquerda das
amostras de filés de peito foram simultaneamente pesadas, embaladas a vácuo em sacos
plásticos de polietileno e cozidas em banho-maria a 85°C, por 45 minutos, até atingir a
temperatura interna final de 75 a 80°C (Banho Ultratermostatizado
, modelo MA=184).
Depois de resfriadas até a temperatura ambiente, as amostras foram secas em papel
toalha e pesadas novamente. A diferença entre o peso inicial (peito in natura) e final
(peito cozido) correspondeu à perda de peso por cozimento (Honikel, 1987).
Para medição da força de cisalhamento foram utilizadas as mesmas amostras de
carne cozida, empregadas na determinação da perda de peso por cozimento, as quais
foram cortadas em pelo menos cinco paralelepípedos com dimensões de 1x1x2 cm em
corte transversal, paralelamente à direção das fibras do músculo e colocadas com as
fibras orientadas no sentido perpendicular às lâminas do aparelho Warner-Bratzler
acoplado ao texturômetro TA.XT. plus - Texture Analyser (Stable Micro Systems
,
American Meat Science Association, 1995). A velocidade de descida do dispositivo de
corte utilizada foi de 10 mm/s.
Análises estatísticas
Os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando-se o procedimento
GLM (General Linear Models) do programa estatístico SAS (SAS, 2003). Foram
considerados no modelo de análise os efeitos fixos da suplementação da dieta com
vitaminas, da condição térmica associada ao pair-feeding e da interação, além do erro
aleatório. O peso médio inicial das aves foi incluído no modelo de análise do
desempenho como covariável, que só foi mantida no modelo quando significativa
(P<0,05).Quando necessário, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey.
Resultados e Discussão
Indicadores fisiológicos
45
Não houve efeito de interação dieta x condição térmica sobre os indicadores
fisiológicos das aves. Entretanto, detectou-se efeito de dieta sobre a temperatura da
perna das aves dos 36 aos 42 dias de idade, com menores valores nas aves que
receberam dieta suplementada com vitaminas C e E (Tabela 3).
Houve efeito de condição térmica tanto de 28 a 35, como de 36 a 42 dias de
idade (Tabela 3) sobre a temperatura retal e da superfície da pele (crista, peito e perna)
dos frangos, que se elevaram devido ao estresse por calor, conforme era esperado. Estes
resultados refletem a diminuição da capacidade de dissipação de calor e a consequente
elevação da temperatura corporal da ave, comprovando a influência do estresse por calor
sobre a termorregulação. Vários autores relataram alterações nos índices de
termorregulação em frangos de corte submetidos ao estresse térmico, representadas por
aumentos na temperatura retal e da superfície da pele (Sandercock et al., 2001; Lin et
al., 2005; Toyomizu et al., 2005), além da maior frequência respiratória.
A restrição alimentar imposta pelo pair-feeding não afetou a termorregulação
(Tabela 3): as aves mantidas em termoneutralidade e em termoneutralidade com pair-
feeding apresentaram temperatura retal e da superfície da pele semelhantes.
46
Tabela 3: Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) dos indicadores fisiológicos de frangos de corte, no período de 28 a 42 dias de
idade, de acordo com a suplementação da dieta e a condição térmica.
Temperatura
(°C)
Dieta 1 Condição térmica
2
Controle Suplem. Prob.3 TN TNP EC Prob.
3
28 a 35 dias de idade
Retal 41,47 (0,08) 41,32 (0,08) 0,1822 41,02 (0,10)a 41,14 (0,10)
a 42,03 (0,10)
b < 0,0001
Crista 35,10 (0,17) 35,04 (0,17) 0,7867 32,69.(0,21)
a 33,08 (0,21)
a 39,43 (0,21)
b < 0,0001
Peito 37,04 (0,14) 36,78 (0,14) 0,2086 35,49 (0,18)a 35,24 (0,18)
a 39,99 (0,18)
b < 0,0001
Perna 36,25 (0,20) 36,19 (0,20) 0,8280 34,03 (0,25)a 34,38 (0,25)
a 40,26 (0,25)
b < 0,0001
36 a 42 dias de idade
Retal 41,49 (0,07) 41,52 (0,07) 0,8150 40,96 (0,09)a 41,08 (0,09)
a 42,47 (0,09)
b < 0,0001
Crista 33,94 (0,26) 33,39 (0,25) 0,1250 31,78 (0,31)a 31,22 (0,31)
a 37,99 (0,31)
b < 0,0001
Peito 37,34 (0,13) 37,35 (0,13) 0,9374 36,08 (0,16)a 35,85 (0,16)
a 40,11 (0,16)
b < 0,0001
Perna 37,21 (0,19) 36,62 (0,18) 0,0249 35,60 (0,23)a 35,36 (0,22)
a 39,79 (0,23)
b < 0,0001
1Controle= ração sem suplementação adicional de vitaminas C e E; Suplem.= ração com suplementação adicional de vitaminas C (536 mg/kg) e E
(127 mg/kg). 2TN = termoneutra (22,6 e 22,5ºC), TNP = termoneutra com pair-feeding (22,6 e 22,5ºC); EC= estresse por calor (31,7ºC).
3Prob.=
probabilidade de erro do tipo I. a, b
= Médias seguidas de letras diferentes na linha diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
47
Desempenho
Não houve efeito da interação dieta x condição térmica sobre as características
de desempenho das aves. As aves do grupo controle apresentaram peso médio inicial
mais elevado do que as do grupo suplementado com vitaminas (Tabela 4). Esta
diferença não era esperada, tendo em vista que, antes da distribuição aleatória dos
indivíduos nos tratamentos para início do experimento aos 28 dias, foi feita a
classificação e a seleção das aves com pesos intermediários para a formação das
repetições, de forma a homogeneizar os lotes. Para eliminar este efeito, o peso médio
inicial foi incluído como covariável no modelo de análise das características de
desempenho. Houve efeito da covariável peso médio inicial sobre o peso médio final das
aves (P<0,0001), o consumo médio de ração (P<0,0001) e a taxa de conversão alimentar
(P=0,0441) que foi, portanto, mantida no modelo de análise destas características.
Houve efeito de dieta sobre o ganho de peso médio diário das aves e sobre a taxa
de conversão alimentar (Tabela 4). A adição de vitaminas C e E reduziu o ganho de peso
médio diário e piorou a conversão alimentar, mas o consumo de ração não foi afetado. O
efeito sobre o peso médio final também se aproximou muito da significância.
Archile-Contreras et al. (2011) observaram in vitro que as vitaminas C e E
influenciaram no metabolismo do colágeno, aumentando o turnover durante o
crescimento de bovinos. Segundo os autores, esta elevada taxa de turnover do colágeno
pode ter implicações in vivo sobre o desempenho. Pode-se supor que, no presente
estudo, a suplementação com vitaminas contribuiu para o aumento do turnover de
colágeno no músculo, explicando parcialmente os resultados obtidos.
Niu et al. (2009) ao estudarem o efeito de diferentes níveis de suplementação da
dieta com vitamina E (100 e 200 mg/kg de ração) sobre o desempenho de frangos de
corte machos, até os 42 dias de idade, submetidos ao estresse por calor (23,9 a 38°C)
também não observaram melhores resultados de desempenho. Segundo Frigg et al.
(1992), para que a vitamina E seja eficaz, altos níveis devem ser fornecidos não só
durante o período de estresse, mas também no período que o antecede, o que não foi
realizado nestes experimentos.
De acordo com Souza et al. (2006) e Almeida et al. (2009), frangos de corte
alimentados com ração suplementada com vitamina E não apresentaram alterações no
consumo de ração, nem no ganho de peso e nem na conversão alimentar, até os 49 dias
48
de idade; entretanto, outros estudos relataram que a suplementação de vitamina E
proporcionou maior ganho de peso e melhora na conversão alimentar de frangos de
corte (Frigg, 1990; Kennedy et al., 1991; Sahin et al., 2004; Gao et al., 2010).
O pair-feeding foi eficiente, pois o consumo médio de ração não diferiu entre as
condições de termoneutralidade associada ao pair-feeding e estresse por calor (Tabela 4)
atestando que o objetivo deste trabalho foi atingido.
Detectou-se efeito de condição térmica sobre todas as características de
desempenho, exceto a viabilidade (Tabela 4). O estresse por calor deprimiu o peso
médio final, o ganho de peso médio diário e o consumo médio de ração, além disto,
piorou a conversão alimentar. As aves em termoneutralidade associada ao pair-feeding
apresentaram desempenho semelhante ao das aves em estresse, portanto, o efeito do
estresse por calor sobre o desempenho se deveu, em sua maior parte, à redução do
consumo de alimentos. De acordo com a revisão de Renaudeau et al. (2012), o uso da
técnica do pair-feeding indicou que metade da redução do crescimento devida ao
estresse por calor não estava relacionada ao consumo de alimento e, portanto, tinha
outras origens.
Frangos de corte mantidos sob estresse por calor apresentaram queda no
desempenho provocada pela redução no consumo de ração, que se traduziu em menor
peso corporal e piora na conversão alimentar (Niu et al., 2009; Quinteiro-Filho et al.,
2010; Li et al., 2011). Isto ocorreu porque a temperatura elevada fez com que a ave
diminuísse o consumo de ração, na tentativa de reduzir a produção de calor metabólico.
Este efeito é mediado pela diminuição da concentração plasmática do principal
hormônio metabólico: o triiodotironina (T3). A redução do crescimento em frangos é
maior que a redução do consumo de alimento, resultando também em pior conversão
alimentar. Durante o estresse por calor, pode ocorrer piora na conversão alimentar em
função da menor digestibilidade, o que também contribui para a diminuição das
quantidades de nutrientes disponíveis ao crescimento das aves (Bonnet et al., 1997; Hai
et al., 2000).
Não houve efeito de dieta, nem de condição térmica sobre a viabilidade (Tabela
4), portanto, as temperaturas de estresse não foram extremas de forma a propiciar
aumento da temperatura corporal em níveis letais.
49
Tabela 4: Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) das características de desempenho de frangos de corte, no período de 28 a 42 dias
de idade, de acordo com a suplementação da dieta e a condição térmica.
Característica1
Dieta5 Condição térmica
6
Controle Suplem. Prob.7 TN TNP EC Prob.
7
PMI (g) 1204 (13) 1167 (13) 0,0401 1188 (15) 1206 (16) 1163 (15) 0,1419
PMF2 (g) 2052 (23) 1986 (23) 0,0532 2246 (28)
b 1902 (29)
a 1910 (29)
a < 0,0001
GPMD (g/dia) 72,68 (1,94) 66,28 (1,93) 0,0218 88,40 (2,33)b 60,22 (2,41)
a 59,82 (2,37)
a <0,0001
CMR3(g) 1635 (25) 1600 (25) 0,3423 1870 (30)
b 1490 (31)
a 1493 (31)
a <0,0001
CA4 1,948 (0,037) 2,094 (0,037) 0,0073 1,840 (0,044)
a 2,091 (0,046)
b 2,132 (0,045)
b <0,0001
VIAB (%) 98,56 (0,91) 99,26 (0,91) 0,5903 97,85 (1,09) 100,00 (1,13) 98,89 (1,11) 0,3966
1PMI =peso médio inicial, em g; PMF = peso médio final, em g; GPMD = ganho de peso médio diário, em g/dia; CMR= consumo médio de ração, em
g; CA = conversão alimentar; VIAB. = viabilidade, em %. 2,3,4
As características de PMF; CMR e CA tiveram o PMI incluído como covariável no
modelo de análise.5Controle= ração sem suplementação adicional de vitaminas C e E; Suplem.= ração com suplementação adicional de vitaminas C
(536 mg/kg) e E (127 mg/kg). 6TN = termoneutra (22,6 e 22,5ºC), TNP = termoneutra com pair-feeding (22,6 e 22,5ºC); EC= estresse por calor
(31,7ºC). 7Prob.= probabilidade de erro do tipo I.
a, b = Médias seguidas de letras diferentes na linha diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
50
Rendimento de carcaça, de cortes e órgãos
Não houve efeito de interação dieta x condição térmica sobre as características
de qualidade de carcaça e de rendimento de carcaça.
A suplementação da dieta com vitaminas C e E piorou o peso vivo ao abate e o
peso da carcaça e também o rendimento de coxas e sobrecoxas das aves (Tabela 5). Foi
encontrado menor ganho de peso médio diário nas aves alimentadas com ração
suplementada (Tabela 4), o que explica os menores valores de peso vivo ao abate e peso
de carcaça nestas aves. Estes resultados diferem do estudo de Almeida et al. (2009) que
não observaram influência da suplementação de vitamina E (200 e 400 mg/kg de ração)
sobre a composição e o rendimento de carcaça e o rendimento de cortes e de asas de
frangos de corte, abatidos aos 49 dias de idade.
Archile-Contreras et al. (2011) observaram in vitro que as vitaminas C e E
influenciaram no metabolismo do colágeno, aumentando o turnover durante o
crescimento de bovinos. Segundo os autores, esta elevada taxa de turnover do colágeno
pode ter implicações in vivo sobre o peso e o rendimento de carcaça. Pode-se supor que,
no presente estudo, a suplementação com vitaminas contribuiu para o aumento do
turnover de colágeno no músculo, explicando parcialmente os resultados obtidos.
A condição térmica influenciou todas as características, exceto o rendimento de
coxas e sobrecoxas (Tabela 5). Em relação à condição termoneutra, o estresse por calor
reduziu o peso vivo ao abate e o peso da carcaça, mas aumentou o rendimento de
carcaça e os rendimentos de gordura, asas e dorso. O calor também reduziu os
rendimentos de peito, fígado, proventrículo e coração. Resultados semelhantes foram
descritos por De Oliveira et al. (2006) que atribuíram o aumento no rendimento de
carcaça à redução do peso relativo dos órgãos e do trato gastrointestinal sob estresse por
calor.
Esta diferença nos pesos relativos dos órgãos metabolicamente ativos, como
fígado e coração, entre as aves mantidas em estresse por calor e termoneutralidade,
provavelmente constituiu um ajuste fisiológico dos frangos à temperatura ambiente.
Temperaturas ambientes baixas ou mais amenas favoreceram o consumo de alimento e a
elevação do metabolismo, que por sua vez, conduziu ao aumento do peso relativo dos
órgãos. Ao contrário, no ambiente de alta temperatura, houve redução do tamanho
relativo destes órgãos, em função da necessidade de se reduzir a produção de calor
51
interno. Desta forma, a modificação das porcentagens de órgãos nos diferentes
ambientes ocorreu em função dos efeitos das temperaturas sobre o consumo de ração.
Considerando a influência que órgãos metabolicamente ativos, como o fígado, têm sobre
a produção de calor e, consequentemente, sobre o gasto de energia, pode-se deduzir que
a exigência de mantença dos frangos expostos ao estresse por calor é menor que em
termoneutralidade. Assim os frangos associaram a redução na exigência de mantença à
diminuição da massa de órgãos.
A condição térmica influenciou o rendimento de gordura abdominal, que foi
maior sob estresse por calor. De acordo com a revisão de Renaudeau et al. (2012),
frangos expostos ao calor retiveram mais gorduras e ganharam menos proteína. O
aumento na deposição de gordura periférica é explicado pela diminuição na lipólise
periférica. A diminuição na deposição de proteína pode ser explicada pela queda da
capacidade de síntese protéica e pela alteração na regulação de insulina nos músculos. A
taxa de proteólise no músculo também pode ser afetada dependendo da temperatura de
estresse.
A restrição alimentar imposta pelo pair-feeding reduziu a porcentagem de
gordura abdominal e aumentou a porcentagem de moela, entretanto, não influenciou o
rendimento de peito, que foi semelhante à termoneutralidade (Tabela 5). Há grande
interesse do mercado no rendimento de cortes, principalmente o peito, corte de maior
valor comercial da carcaça.
52
Tabela 5. Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) das características de peso e rendimento de carcaça, rendimento de cortes e peso
relativo de órgãos de frangos de corte, de acordo com a suplementação da dieta e a condição térmica.
Característica1 Dieta
2 Condição térmica
3
Controle Suplem. Prob.4 TN TNP EC Prob.
4
PV abate (g) 2040 (33) 1912 (34) 0,0082 2178 (41)b 1922 (41)
a 1828 (41)
a < 0,0001
Pcarcaça (g) 1460 (25) 1369 (26) 0,0124 1547 (31)b 1362 (30)
a 1335 (31)
a < 0,0001
Rcarcaça (%) 71,55 (0,18) 71,55 (0,19) 0,9972 71,27 (0,23)a 70,80 (0,23)
a 72,59 (0,23)
b < 0,0001
Rgordabd (%) 1,28 (0,05) 1,30 (0,05) 0,6876 1,35 (0,06)b 1,00 (0,06)
a 1,54 (0,06)
c < 0,0001
Rasas (%) 11,36 (0,08) 11,47 (0,08) 0,3398 11,09 (0,10)a 11,73 (0,09)
c 11,42 (0,10)
b < 0,0001
Rpeito (%) 37,62 (0,23) 37,62 (0,23) 0,9872 38,05 (0,28)b 38,06 (0,28)
b 36,74 (0,28)
a 0,0011
Rcoxasob (%) 31,54 (0,15) 31,02 (0,15) 0,0127 31,15 (0,18) 31,24 (0,18) 31,45 (0,18) 0,4887
Rdorso (%) 18,62 (0,15) 18,95 (0,16) 0,1327 18,57 (0,19)a 18,22 (0,19)
a 19,56 (0,19)
b < 0,0001
PRfígado (%) 1,90 (0,03) 1,88 (0,03) 0,7814 2,05 (0,04)b 1,81 (0,04)
a 1,81 (0,04)
a < 0,0001
PRmoela (%) 1,49 (0,03) 1,56 (0,03) 0,1182 1,48 (0,04)a 1,67 (0,03)
b 1,42 (0,04)
a < 0,0001
PRprov. (%) 0,31 (0,01) 0,33 (0,01) 0,1392 0,32 (0,01)b 0,33 (0,01)
b 0,30 (0,01)
a 0,0128
PRcor. (%) 0,50 (0,01) 0,52 (0,01) 0,1556 0,57 (0,01)c 0,50 (0,01)
b 0,46 (0,01)
a < 0,0001
1Pcarcaça = peso da carcaça, em g; Rcarcaça = rendimento da carcaça, em %; Rgordabd = rendimento de gordura abdominal, em %; Rasas = rendimento de asas, em %;
Rpeito = rendimento do peito, em %; Rcoxasob = rendimento de coxas e sobrecoxas, em %; Rdorso = rendimento do dorso, em %; PRfígado = peso relativo do fígado,
em %; PRmoela = peso relativo da moela, em %; PRprov. = peso relativo do proventrículo, em %; PRcor. = peso relativo do coração, em %. 2Controle= ração sem
suplementação adicional de vitaminas C e E; Suplem. = ração com suplementação adicional de vitaminas C (536 mg/kg) e E (127 mg/kg). 3TN = termoneutra (22,6 e
22,5ºC); TNP = termoneutra com pair-feeding (22,6 e 22,5ºC); EC = estresse por calor (31,7ºC). 4Prob = probabilidade de erro do tipo I.
a, b, c: Médias seguidas de letras
diferentes na linha diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
53
Qualidade de carne
Não houve efeito da interação dieta x condição térmica sobre as características
de qualidade de carne. Também não se detectou efeito da suplementação da dieta, o que
significa que a adição de vitaminas C e E não influenciou a qualidade de carne (Tabela
6). Voljč et al. (2011) observaram que a suplementação de vitamina E (85 e 200 UI/kg)
na dieta de frangos de corte não foi suficiente para prevenir os efeitos nocivos da
oxidação lipídica in vivo, e que, para melhorar a estabilidade dos lipídeos da carne,
maior suplementação de vitamina E far-se-ia necessária, especialmente após o
tratamento por calor.
Houve efeito da condição térmica sobre o pHdo músculo pectoralis major 24
horas após o abate. O estresse pelo calor aumentou o pH final (Tabela 6).
Em processos fisiológicos com falta de oxigenação (como o período post
mortem), a degradação do glicogênio muscular ocorre via glicólise anaeróbica e leva à
formação de ácido láctico a partir do piruvato, reduzindo o pH muscular. Essa redução é
necessária para uma correta maturação da carne no processo denominado conversão do
músculo em carne (Brossi et al., 2009).
O desequilíbrio fisiológico causado por altas temperaturas no momento do abate
tem efeito direto sobre as reservas de glicogênio muscular, responsáveis pelo
desenvolvimento das reações bioquímicas post mortem (Petracci et al., 2001). O estresse
térmico sofrido por frangos de corte, no período pré-abate (agudo), gera conseqüências
negativas sobre o pH, que tende a ser inferior na carne dos animais estressados (Brossi
et al., 2009). Entretanto, durante o estresse por calor crônico ocorre uso rápido das
reservas de glicogênio muscular e em conseqüência, o esgotamento in vivo. Isto leva à
menor queda no pH post mortem (Mckee & Sams, 1998; Brossi et al., 2009), o que
resulta em pH mais elevado da carne.
Debut et al. (2003) ao submeterem frangos da linhagem French Label ao
estresse por calor agudo pré-abate (35°C, durante duas horas) verificaram menor valor
de pH após o abate. Entretanto, no presente estudo o estresse pelo calor crônico (14
dias) aumentou o pH final. Estes diferentes resultados podem ser em função da
diferença no material genético das aves e, principalmente, da duração do estresse, pois,
acredita-se que o estresse agudo tenha efeito de reduzir o pH e o crônico de aumentá-lo.
54
Detectou-se efeito de condição térmica sobre a cor da carne (Tabela 6). As aves
mantidas em estresse por calor e em termoneutralidade associada ao pair-feeding
apresentaram maior luminosidade e menor índice de vermelho, indicando que o calor
tornou a carne mais clara e mais pálida, devido à redução do consumo de alimento pelas
aves. Lawrie (1998) afirmaram que carnes com pH mais elevado apresentam-se mais
escuras, pois sua superfície dispersa menos luz do que o normal, entretanto, os
resultados do presente estudo contrariam os de Lawrie (1998). As carnes com maior
valor de pH, resultantes do estresse por calor, não se apresentaram mais escuras,talvez
porque o pH não tenha sido elevado o suficiente para alterar a cor da carne. Não houve
efeito de condição térmica sobre o teor de amarelo.
Detectou-se efeito da condição térmica sobre a perda de peso por cozimento
(Tabela 6). As aves mantidas em estresse por calor apresentaram maior perda em
relação aquelas mantidas na termoneutralidade e na termoneutralidade associada ao
pair-feeding, indicando que este efeito ocorreu devido ao calor e não devido à redução
do consumo alimentar pelas aves.
Houve efeito da condição térmica sobre a força de cisalhamento (Tabela 6). As
aves mantidas em termoneutralidade associada ao pair-feeding apresentaram menor
força de cisalhamento em relação às mantidas sob estresse por calor. Este resultado
indica que a restrição alimentar sem calor aumentou a maciez da carne, contribuindo
para a melhora da qualidade, provavelmente devido ao maior potencial proteolítico
post-mortem. O teor de colágeno, principal proteína do tecido conjuntivo, também
poderia influenciar a força de cisalhamento, pois segundo Archile-Contreras et al.
(2011), o aumento do turnover de colágeno durante o crescimento de bovinos pode
conduzir à solubilidade aumentada do colágeno nos músculos, afetando a maciez da
carne.O calor não afetou a força de cisalhamento.
Esperava-se que a maior perda de peso por cozimento resultasse em carne menos
suculenta e, portanto, mais rígida, revelando assim maior força de cisalhamento, mas os
resultados do presente estudo não confirmam completamente esta hipótese porque a
força de cisalhamento foi igual entre termoneutra e estresse por calor.
Não houve efeito da condição térmica sobre a capacidade de retenção de água no
músculo pectoralis major, portanto, o calor e a restrição alimentar não afetaram esta
característica (Tabela 6). Era esperado que o estresse por calor prejudicasse a
55
capacidade de retenção de água, pois a elevação do pH final da carne, aumenta a
capacidade das proteínas da carne em reter água a ponto de não permitir o
extravasamento (Dransfield & Sosnicki, 1999), tornando a carne mais rígida (seca).
Muitos estudos têm investigado os mecanismos de retenção de água pelo músculo em
nível molecular e microestrutural, mas há muito a ser pesquisado sobre a natureza das
ligações de água no músculo e como as estruturas macromoleculares influenciam sua
retenção dentro dos tecidos biológicos (Baianu et al., 1991).
Diante destes resultados, é preciso compreender como a extensão ou a
intensidade do estresse pode originar respostas tão variáveis, efeitos e conseqüências tão
distintas e, com isso, prevenir ou contornar os possíveis problemas e prejuízos na
qualidade de carne (Brossi et al., 2009). É necessário também determinar as possíveis
medidas para limitar a variação do pH ou normalizá-lo nas carnes durante o
processamento para com isso melhorar as características funcionais da carne de peito de
frangos (Van Laack et al., 2000).
56
Tabela 6: Médias de quadrados-mínimos (erros-padrão) das características de qualidade de carne de frangos de corte, de acordo com a
suplementação da dieta e a condição térmica.
Característica1
Dieta 2 Condição térmica
3
Controle Suplem. Prob.4 TN TNP EC Prob.
4
pH24 h 5,81 (0,02) 5,83 (0,02) 0,4684 5,78 (0,02)a 5,77 (0,02)
a 5,92 (0,02)
b <0,0001
L* 44,17 (0,32) 43,60 (0,32) 0,2082 42,76 (0,39)a 44,67 (0,39)
b 44,22 (0,39)
b 0,0021
a* 4,43 (0,11) 4,68 (0,11) 0,1206 5,12 (0,14)b 4,29 (0,14)
a 4,25 (0,14)
a <0,0001
b* 1,40 (0,14) 1,30 (0,15) 0,6590 1,17 (0,18) 1,37 (0,17) 1,50 (0,18) 0,4254
CRA (%) 58,12 (0,66) 58,17 (0,68) 0,9606 58,04 (0,83) 58,05 (0,81) 58,34 (0,83) 0,9569
PPC (%) 27,73 (0,27) 27,47 (0,28) 0,4953 26,70 (0,34)a 27,35 (0,33)
a 28,74 (0,34)
b 0,0001
FC (kgf/cm2) 3,70 (0,11) 3,80 (0,12) 0,5490 3,91 (0,14)
b 3,44 (0,14)
a 3,89 (0,14)
b 0,0288
1pH 24 h = pH do músculo pectoralis major,24 h após o abate; L* = luminosidade; a* = teor de vermelho; b* = teor de amarelo; CRA = capacidade de
retenção de água, em %; PPC = perda de peso por cozimento, em %; FC = força de cisalhamento, em kgf/cm2.
2Controle = ração sem suplementação
adicional de vitaminas C e E; Suplem. = ração com suplementação adicional de vitaminas C (536 mg/kg) e E (127 mg/kg). 3TN = termoneutra (22,6 e
22,5ºC); TNP = termoneutra com pair-feeding (22,6 e 22,5ºC); EC = estresse por calor (31,7ºC). 4Prob = probabilidade de erro do tipo I.
a, b = Médias
seguidas de letras diferentes na linha diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
57
Conclusão
A suplementação da dieta com vitaminas C e E não foi capaz de neutralizar, nem
de reduzir, os efeitos negativos do estresse por calor sobre as características de
desempenho, rendimento de carcaça e qualidade de carne de frangos, dos 28 aos 42 dias
de idade. A semelhança nos resultados de desempenho entre aves em estresse por calor
e em pair-feeding sugere que a queda no desempenho das aves estressadas por calor se
deveu, principalmente, à redução no consumo de alimentos.
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62
CAPÍTULO III
63
EXPRESSÃO GÊNICA NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE FRANGOS DE CORTE
SOB ESTRESSE POR CALOR QUE RECEBERAM ANTIOXIDANTES NA DIETA
Resumo
A temperatura ambiente elevada representa grande preocupação para os avicultores,
pois a seleção das linhagens comerciais de frangos de corte, conduzida em países de clima
temperado, associada ao alto desempenho alcançado, contribuiu para que estas aves fossem
muito susceptíveis ao estresse por calor. O objetivo do trabalho foi verificar se a dieta
suplementada com vitaminas C e E seria capaz de neutralizar, ou de reduzir, os efeitos do
estresse por calor em frangos de corte aos 29 e aos 44 dias de idade. Em busca do entendimento
dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta das aves ao calor, os níveis de expressão
de RNAm dos genes MSTN (myostatin), HSP70 (heat shock 70kDa protein 2), ACLY (ATP-
citrate synthase) PYGL (glycogen phosphorylase) e avUCP (avian uncoupling protein) na
musculatura do peito das aves foram avaliados em dois momentos: após estresse por calor
agudo, com 21 horas de duração, e crônico, com 16 dias. Foram alojados 384 frangos de corte
machos, 160 dos quais foram utilizados na análise de expressão gênica. As aves foram
distribuídas num delineamento inteiramente casualizado, com arranjo fatorial 2 x 2 (com e sem
suplementação da dieta com vitaminas e duas temperaturas ambientais) no experimento de
estresse agudo e com arranjo fatorial 2 x 3 (com e sem suplementação da dieta com vitaminas e
duas temperaturas ambientais mais o pair-feeding) no experimento de estresse crônico, ambos
com 16 repetições. As aves foram mantidas em termoneutralidade até os 28 dias. A partir desta
idade, foram alojadas em grupos de quatro por gaiola em três salas climatizadas: duas
termoneutras (22,6 e 22,5ºC) e uma de estresse por calor (31,7ºC). Metade das aves recebeu
dieta suplementada com vitaminas C (536 mg/kg) e E (127 mg/kg). Na sala de estresse por
calor, as aves tiveram livre acesso à ração; nas salas termoneutras, metade das aves recebeu
ração à vontade e a outra metade recebeu quantidade limitada, no sistema pair-feeding. Na
avaliação da expressão gênica foi empregada a PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR).
Sob estresse por calor agudo, a suplementação da dieta com vitaminas reduziu a expressão da
avUCP, não conferindo, portanto, proteção antioxidativa. A adição de vitaminas reduziu a
expressão da MSTN e inibiu a expressão do ACLY o que estava provavelmente associado à
manutenção da homeotermia. Em relação ao estresse por calor crônico, a suplementação com
vitaminas reduziu a expressão da avUCP em termoneutralidade com pair-feeding, mas induziu a
expressão da MSTN sob estresse por calor.
Palavras-chave: avUCP, estresse agudo, estresse crônico, MSTN, ROS
64
GENE EXPRESSION IN THE SKELETAL MUSCLE OF BROILER CHICKENS
UNDER HEAT STRESS THAT RECEIVED ANTIOXIDANTS IN THE DIET
Abstract
High ambient temperature represents a great concern to the poultry producers, because
the selection of the modern broiler lines, conducted in temperate climates, associated to the
elevated level of performance achieved, contributed to the high susceptibility of these birds to
heat stress. The objective of the study was to evaluate if a diet supplemented with vitamins C
and E would be able to neutralize, or to reduce, the effects of heat stress in broilers at 29 and 44
days of age. Looking for a better understanding of the molecular mechanisms involved in the
chickens’ response to heat, the mRNA expression of the MSTN (myostatin), HSP70 (heat shock
70kDa protein 2), ACLY (ATP-citrate synthase) PYGL (glycogen phosphorylase) and avUCP
(avian uncoupling protein) genes in the breast muscle of chickens was investigated in two
occasions: after acute stress, lasting for 21 h, and after chronic stress, lasting 16 days. A total of
384 male broilers were housed in cages, from which 160 were used in the gene expression
analysis. The chickens were assigned to a completely randomized design with a 2 x 2 factorial
arrangement (with or without vitamin supplementation in the diet and two ambient
temperatures) in the acute stress experiment and with a 2 x 3 factorial arrangement (with or
without vitamin supplementation in the diet and two ambient temperatures plus the pair-
feeding) in the chronic stress experiment, both with 16 replications. The chicks were kept in a
thermoneutral environment up to 28 days. From this age on, they were housed in groups of four
per cage in three environmentally controlled chambers: two thermoneutral (22,6 e 22,5ºC) and
one of heat stress (31,7ºC). Half the chickens received a diet supplemented with vitamins C
(536 mg/kg) and E (127 mg/kg). In the heat stress chamber, they had free access to the feed, but
in the thermoneutral chambers, half the chickens had free access to the feed whereas the other
half received a limited amount in the pair feeding system. The quantitative real time PCR (RT-
qPCR) was used in the evaluation of gene expression. Under acute heat stress, diet
supplementation with vitamins reduced the expression of avUCP, not conferring, therefore,
antioxidant protection. The addition of vitamins reduced the expression of MSTN and inhibited
expression of ACLY, which was probably associated to the maintenance of homeothermy. In
relation to the chronic heat stress, the supplementation with vitamins reduced the expression of
avUCP in thermoneutrality with pair-feeding, but induced MSTN expression under heat stress.
Keywords: avUCP, acute stress, chronic stress, MSTN, ROS
65
Introdução
A temperatura ambiente elevada representa grande preocupação para a
avicultura, em particular nos países tropicais e nos países de clima temperado durante o
verão, pois a maior parte das linhagens comerciais de frangos de corte modernas foi
geneticamente melhorada nas condições de países temperados. Esta seleção genética
intensiva, usada na obtenção de taxas de crescimento mais rápidas em frangos de corte,
contribuiu para que as linhagens melhoradas atuais sejam muito susceptíveis ao estresse
térmico (Brossi et al., 2009) apresentando, nestas condições, baixo desempenho de
crescimento, imunossupressão e alta mortalidade, o que resulta em significativas perdas
econômicas na produção (Mujahid et al., 2005; Renaudeau et al., 2012).
Admite-se que o fenótipo animal seja o resultado da interação entre seu material
genético (ação de todos os genes) e o ambiente. Em resposta às alterações ambientais, o
organismo altera sua atividade gênica, evidenciando a existência de uma regulação
seletiva na expressão dos genes e direcionando a síntese de proteínas específicas nas
células (Regitano & Coutinho, 2001).
A nutrigenômica é uma ciência nova que busca compreender o impacto dos
nutrientes sobre a expressão gênica e, também, como o genótipo de um indivíduo pode
influenciar sua susceptibilidade aos nutrientes da dieta (Duclos, 2007). Os fatores
nutricionais são considerados importantes moduladores do sistema antioxidante (Halici
et al., 2011), por isto, o emprego das vitaminas C e E, acima dos níveis estabelecidos
pelas exigências nutricionais, pode se constituir em alternativa para minimizar os efeitos
prejudiciais do estresse térmico sobre os animais de produção,inclusive os frangos de
corte.
A vitamina C desempenha importantes funções em muitas reações bioquímicas,
como a oxidação reversível, através da incorporação de oxigênio ao substrato e a
redução. A vitamina E constitui-se em um potente sequestrador de radicais livres e no
mais poderoso antioxidante não enzimático lipossolúvel da natureza (Lauridsen et al.,
1997). Juntas, elas apresentam efeito sinérgico, ou seja, interagem numa base
intracelular para fornecer proteção antioxidativa. Na membrana celular, a vitamina E é
oxidada na forma de radicais livres (reactive oxygen species, ROS). Acredita-se que a
vitamina C intracelular atue como regeneradora da vitamina E, de forma a reduzir sua
66
quantidade oxidada. Desta forma, a vitamina C colabora para que a vitamina E
mantenha suas propriedades antioxidantes (Chan, 1993). Em outras palavras, a vitamina
C apresenta ação terapêutica por potencializar a capacidade da vitamina E de evitar a
lipoperoxidação.
Este estudo objetivou verificar se a dieta suplementada com antioxidante
(vitaminas C e E acima dos níveis recomendados) é capaz de neutralizar, ou de reduzir,
os efeitos do estresse por calor agudo, com 21 horas de duração, e crônico, com 16 dias,
em frangos de corte aos 29 e aos 44 dias de idade, respectivamente. Em busca do
entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta ao calor, foram
investigados os níveis de expressão de RNAm de genes relacionados ao
desenvolvimento muscular (myostatin; MSTN), à resposta ao choque térmico (heat
shock 70kDa protein 2; HSP70), ao metabolismo energético (ATP-citrate synthase;
ACLY e glycogen phosphorylase; PYGL) e ao estresse oxidativo (avian uncoupling
protein; avUCP) na musculatura esquelética do peito das aves.
Material e Métodos
Animais, manejo inicial e condições experimentais
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pela Comissão de Ética
no Uso de Animais (CEUA, protocolo número 142/2009) da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP – Universidade Estadual Paulista, Campus
de Botucatu.
O experimento foi realizado no Laboratório de Nutrição de Aves da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP – Universidade Estadual
Paulista, Campus de Botucatu. Foram utilizados 384 pintos de corte machos da
linhagem Cobb, com um dia de idade, vacinados no incubatório contra as doenças de
Gumboro, Marek e Bouba aviária. Aos sete dias de idade, as aves foram revacinadas
contra a doença de Gumboro1, via água de bebida.
No período pré-experimental, os pintos foram alojados na proporção de oito por
gaiola (de 0,60 x 0,50 x 0,45 m), em duas salas climatizadas a 34°C, na primeira
1CEVAC
® Gumbo L (Ceva Saúde Animal Ltda.)
67
semana, e a 32ºC, na segunda semana de idade. A partir da terceira semana, a densidade
foi reduzida para seis aves por gaiola e a temperatura foi reduzida à razão de 4°C por
semana, de modo a atingir 24°C, ao final da quarta semana de idade. No início do
período experimental, aos 28 dias, procedeu-se à distribuição de quatro aves por gaiola,
em três salas climatizadas de 5,00 x 3,00 x 2,65 m: duas termoneutras e uma de estresse
por calor. Cada sala abrigou 32 gaiolas de arame galvanizado, totalizando 96 gaiolas,
equipadas com bebedouros tipo nipple e comedouros de calha.
As dietas basais foram formuladas à base de milho e farelo de soja, de acordo
com as recomendações de Rostagno et al. (2005) para frangos de corte machos de
desempenho médio, e produzidas na fábrica de rações da FMVZ (UNESP). As aves
receberam dieta pré-inicial (de 1 a 7 dias) com 22,0% de PB e 2950 kcal de EM/kg,
dieta inicial (de 8 a 21 dias) com 20,8% de PB e 3000 kcal de EM/kg, dieta de
crescimento (de 22 a 35 dias) com 19,4% de PB e 3100 kcal de EM/kg e dieta final (de
36 a 44 dias) com 18,0% de PB e 3150 kcal de EM/kg.
Durante a fase experimental (de 28 a 44 dias), metade das aves recebeu ração
suplementada com 536 mg/kg de vitamina C2 e 127 mg/kg de vitamina E
3, nas dietas de
crescimento e final.
O experimento de estresse por calor agudo, de 21 horas, seguiu um delineamento
inteiramente casualizado, com arranjo fatorial 2 x 2 (suplementação ou não da dieta com
vitaminas e duas temperaturas ambientais) e 16 repetições, envolvendo 64 aves.
Entretanto, no experimento do estresse por calor crônico, de 16 dias, as aves foram
distribuídas em arranjo fatorial 2 x 3 (suplementação ou não da dieta com vitaminas e
duas temperaturas ambientais mais pair-feeding), com 16 repetições, envolvendo 96
aves. O indivíduo representou a unidade experimental. Os demais indivíduos (224)
foram usados nas avaliações de indicadores fisiológicos, desempenho, rendimento de
carcaça, de cortes e órgãos e qualidade de carne.
Para a quantificação dos níveis de vitaminas presentes nas rações experimentais,
amostras foram enviadas ao Laboratório de Análises Químicas “Labtec”, localizado em
Hortolândia-SP, e analisadas, em duplicata, por cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC). Os resultados são descritos na Tabela 1.
2Rovimix
® C-EC (DSM). L-Ácido ascórbico a 97,5%. Inclusão de 550 mg/kg.
3Rovimix
® E-50Adsorbate (DSM). Acetato de dl-α –Tocoferol a 50%. Inclusão de 253 mg/kg.
68
Tabela 1. Conteúdo de vitaminas C e E das dietas de crescimento e final, controle e
suplementadas, fornecidas às aves durante o período experimental,
determinadas pelo método de HPLC.
Tipo de ração Conteúdo de vitaminas (mg/kg da dieta)
C E
Dieta de crescimento
Controle 46 42
Suplementada 257 109
Dieta final
Controle 21 18
Suplementada 288 93
As dietas controle, de crescimento e final, não foram suplementadas com
vitaminas (Tabela 1). Pequenas quantidades de vitamina C (46 e 21 mg/kg de ração,
respectivamente) e E (42 e 18 mg/kg de ração, respectivamente) estavam presentes nos
ingredientes naturais da ração, como o milho e o farelo de soja e, também, no
suplemento vitamínico, no caso da vitamina E.
As aves tiveram livre acesso à água de bebida. Na sala de estresse por calor, a
ração foi oferecida à vontade. Nas duas salas termoneutras, metade das aves recebeu
ração à vontade e a outra metade recebeu quantidade limitada de ração, no sistema pair-
feeding. Esta técnica foi utilizada para isolar os possíveis efeitos da redução de consumo
de ração, que ocorre em condições de estresse por calor, sobre as características
estudadas. Para isto, a cada dia foi calculado o consumo médio de ração na sala de
estresse por calor e esta quantidade foi fornecida no dia seguinte para as aves nas
gaiolas do pair-feeding. Estas aves, mantidas sob alimentação controlada, foram
alimentadas duas vezes ao dia (manhã e tarde) para evitar que o consumo diário total
fosse ingerido em curto período de tempo. As gaiolas com alimentação à vontade e as
69
controladas no sistema pair-feeding foram aleatoriamente distribuídas nas duas salas
termoneutras.
O programa de luz foi contínuo (24 horas de luz artificial) durante todo o período,
utilizando-se lâmpadas fluorescentes de 75 watts. A temperatura e a umidade relativa do
ar foram registradas diariamente nas salas às 09h00, 14h00 e 21h00. As temperaturas
máximas e mínimasforam coletadas diariamente, às 21h00 para o cálculo das médias de
temperatura ambiente e umidade relativa do ar (Müller, 1989) e para a obtenção do
índice de temperatura e umidade (THI), segundo Kelly & Bond (1971).
De acordo com a Figura 1, a temperatura e a umidade relativa do ar (médias
diárias), durante todo período experimental foram 22,6°C e 78,5% na sala termoneutra
1; 22,5°C e 71,3% na sala termoneutra 2 e 31,7°C e 59,1% na sala de estresse por calor.
O THI foi considerado normal nas condições de termoneutralidade 1 e 2 (71 e 70,3
respectivamente), mas elevado sob a condição de estresse por calor (82), denotando
ambiente de desconforto térmico para as aves (Kelly & Bond, 1971), conforme
planejado.
70
Figura 1. Valores médios de temperatura (painel superior), umidade relativa do ar (UR;
painel intermediário) e índice de temperatura e umidade (THI; painel
inferior) nas salas termoneutras 1 e 2 e de estresse por calor durante o período
experimental.
71
Coleta de tecidos
A coleta de tecidos foi realizada no Laboratório de Nutrição de Aves da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP – Universidade
Estadual Paulista, Campus de Botucatu. Foram sacrificadas duas aves por gaiola,
totalizando 160 aves, em dois períodos: estresse por calor agudo, de 21 horas, e crônico,
de 16 dias. O período de estresse por calor agudo envolveu 64 aves sacrificadas com 29
dias de idade e o período de estresse por calor crônico envolveu 96 aves sacrificadas
com 44 dias de idade.
Após o sacrifício por deslocamento cervical, a pele foi cortada na região do
peito, de forma a expor o músculo pectoralis major. De cada ave foi extraída, com
assepsia, uma amostra superficial quadrada de aproximadamente 1,5 cm de lado,
coletada sempre na porção direita e na mesma região deste músculo. A coleta das
amostras foi realizada em duplicata e o armazenamento realizado de duas diferentes
formas para permitir estudos futuros. Cada amostra foi subdividida em dois crio tubos
identificados; um criotubo foi inserido imediatamente no interior de um tubo falcon de
15 mL, congelado em nitrogênio líquido a -196°C,e depois transferido para o freezer -
80°C, e o outro criotubo,contendo1 mL da solução de inibidor de RNase (RNAlater®
Tissue Collection: RNA Stabilization Solution, Applied Biosystems), foi congelado em
freezer a -20°C. Para a extração de RNA total e análise da expressão gênica foram
utilizadas as amostras dos criotubos com solução de inibidor de RNase.
Análise da expressão gênica no músculo esquelético
As análises de expressão gênica foram conduzidas no Laboratório de
Biotecnologia Animal da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq) da
USP – Universidade de São Paulo, Campus de Piracicaba. Foram estudados os genes
relacionados ao desenvolvimento muscular (myostatin; MSTN), à resposta ao choque
térmico (heat shock 70kDa protein 2; HSP70), ao metabolismo energético (ATP-citrate
synthase; ACLY e glycogen phosphorylase; PYGL) e ao estresse oxidativo (avian
uncoupling protein; avUCP).
O método empregado foi a PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Em
função de este método requerer correção para as variações dentro dos experimentos,
foram empregados os cinco genes referência (calibradores das corridas) mais utilizados
72
nos estudos de expressão gênica, devido à alta estabilidade de expressão: o ACTB (actin
beta) por estar envolvido na motilidade, estrutura e integridade celular; o EEF1A1
(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) por participar na elongação da
tradução; o GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)por estar envolvido
na iniciação da tradução; o MRPS27 (mitochondrial ribosomal protein S27) por
participar da síntese de proteínas mitocondriais e o RPL5(ribosomal protein L5) por
atuar na síntese de proteínas no citoplasma (Cikos et al., 2007; Vandesompele et al.,
2009; Zaros et al., 2010). Li et al. (2011) indicaram que o ACTB é mais adequado que o
GAPDH como gene referência em pesquisa relacionada ao estresse por calor.
Extração do RNA total
O RNA total foi isolado das amostras de tecidos do músculo peitoral congeladas
em solução de inibidor de RNase, a partir do protocolo descrito pela empresa fabricante
do reagente TRIzol® (Invitrogen). Os tecidos foram macerados em 1 mL de TRIzol
® e
incubados por cinco minutos à temperatura ambiente. A esta mistura adicionou-se 200
μL de clorofórmio, e as amostras foram incubadas novamente, na mesma condição
anterior. Após centrifugação a 11.000 rpm, durante 15 minutos a 4ºC, a fase aquosa
(sobrenadante) foi recuperada em novo microtubo. A este foram adicionados 500 μL de
isopropanol 100% e ele foi incubado por dez minutos a temperatura ambiente. Em
seguida, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm, por dez minutos a 4ºC e o pellet
formado foi lavado com 1 mL de etanol 75%, sendo procedida nova centrifugação à
9.000 rpm, por 5 minutos a 4ºC. O pellet de RNA foi desidratado à temperatura
ambiente e ressuspendido em 20 μL de água DEPC a 0,01%.
Para verificação da integridade do RNA total do material extraído, as amostras
foram aplicadas num gel de agarose (1,5%) e submetidas à eletroforese em cubas
previamente tratadas com peróxido de hidrogênio e lavadas com água DEPC. A
presença das três bandas estruturais, correspondentes às frações dos RNA ribossômicos:
28S, 18S e 5,8S indicou que não houve degradação das amostras analisadas (Figura 1,
Anexo).As amostras foram posteriormente quantificadas em espectrofotômetro
(NanoDrop®
2000) para avaliação da concentração de RNA total, considerando a
relação ideal de absorbância (1,8 ≤ A260/280 nm≤ 2,0), e diluídas em água DEPC, para a
concentração final de 0,5 μg/μL.
73
Tratamento com DNase e Síntese de cDNA
A fim de degradar o DNA genômico, que porventura estivesse presente nas
amostras de RNA, foi efetuado o tratamento com a enzima DNase e, posteriormente, a
síntese de cDNA. Para o tratamento com DNase foi utilizado o Kit DNase I, RNase-
free®
(Fermentas) e a síntese de cDNA foi feita segundo protocolo do Kit ImProm-IITM
Reverse Transcription System®
(Promega).
A quantidade de RNAtotal diluído utilizada na reação de tratamentofoi de 2 μL
(concentração final de 1 μg). Estes RNAs foram tratados a partir de 1µL de DNase; 0,5
µL de RNase Out (RNaseOUT™ Ribonuclease Inhibitor-Invitrogen); 1 µL de Buffer
(10X Reaction Buffer with MgCl2)e 5,5 µL de água-DEPC (Mix 1). As amostras foram
colocadas no termociclador, a 37°C, por 30 minutos. Em seguida, foi adicionado 1 µL
de EDTA (50 mM) e as amostras foram levadas novamente ao termociclador a 65°C,
por 10 minutos, com o objetivo de inativar a enzima DNase.
Para início da síntese de cDNA foi adicionado ao RNA tratado, 1 µL de primer
oligo dT (0,5 µg/µL) e realizada a incubação a 70ºC por cinco minutos, seguida de
resfriamento em gelo por cinco minutos. Para cada tubo de amostra contendo 12 µL de
RNA tratado, foram adicionados 8 µL do Mix 2, descrito a seguir: 4 µL de Reaction
Buffer 5 X (ImProm-II™); 1,2 µL de MgCl2 (25 mM); 1 µL de dNTP Mix (0,5 mM);
0,5 µL de inibidor de nucleases (Recombinant RNasin®
Ribonuclease Inhibitor); 1 µL
de enzima transcriptase reversa (ImProm-II™) e 0,3 µL de água livre de nucleases.
Após incubação a 25ºC, por cinco minutos, foi realizada a transcrição reversa a 42ºC
por 60 minutos, procedendo-se a inativação da enzima a 70ºC, durante 15 minutos. Os
cDNAs sintetizados foram aliquotados em dois microtubos de 10µL cada, um para uso e
outro para reserva, e armazenados em freezer a - 20°C.
A eficácia das reações de tratamento do RNA com DNase e de síntese do cDNA
das amostras foi verificada através da técnica de PCR, incluindo controles negativos em
duplicata (amostras sem RNA e sem cDNA). Em seguida, foi feita a eletroforese em gel
de agarose a 1,5 % para visualização do produto amplificado.
Desenho dos Primers
74
Os primers utilizados para a amplificação dos genes referência EEF1A1 e RPL5
foram desenhados por Ninov (2010), os do GAPDH foram desenhados por Marchesin
(2008) e os primers utilizados para a amplificação do gene alvo HSP70 foram
desenhados por Almeida (2007), conforme mostrado na Tabela 2.
Pares de primers específicos, com aproximadamente 20 bases, foram desenhados
para amplificar os genes constitutivos MRPS27 e ACTB e os genes alvo avUCP,
ACLY, PYGL e MSTN(Tabela 2), com base nas sequências completas de RNAm,
disponíveis no banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). O programa
Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) foi
empregado na construção dos primers, que em seguida, foram avaliados quanto à
qualidade, com o auxílio do programa
NetPrimer(http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprimer.html). Eles foram
desenhados para amplificar regiões de cerca de 150 pares de bases. Para eliminar a
interferência de possíveis contaminações das amostras de cDNA com DNA genômico,
estes pares de primers foram desenhados para amplificar regiões de limite entre éxons
consecutivos, intercalados por íntrons. Neste caso, se o DNA genômico fosse
amplificado, o produto gerado seria bem mais extenso e a contaminação seria
facilmente identificável.
A especificidade da reação para cada um dos primers foi verificada por
eletroforese em gel de agarose a 1,5%, através da presença de banda única
correspondente ao produto amplificado de cada um dos genes (Figura 2, Anexo) e
também pela análise da temperatura de melting de cada um dos genes, realizada pelo
software do equipamento LightCycler®
480 System II (Roche) (Tabela 2). A temperatura
de melting é avaliada pela dissociação da fita dupla de DNA, com o aumento da
temperatura, e é definida quando a curva atinge seu platô. Esta análise permite verificar
a qualidade da reação, a ausência de contaminantes e a geração de produto inespecífico
sendo assim, o produto é considerado específico quando apenas um pico,correspondente
a temperatura de melting, é gerado (Figura 3, Anexo).
75
Tabela 2. Identificação dos primers utilizados para amplificar por PCR os genes alvo e referência e temperaturas de melting.
Gene NCBI
(geneID) Localização no gene Sequência dos primers
Tamanho
(pb)
Temperatura de
melting (°C)
ACLY 395373 Exon 15 Direto: 5’- GGTGACCACAGGCAGAAGTT -3’
193 80,6 Exon 16 Reverso: 5’- CAGCAATAATGGCAATGGTG -3’
ACTB 396526 Exon 1 Direto: 5’- GGCAATGAGAGGTTCAGGTG -3’
80 81,7 Exon 2 Reverso: 5’- GTTTCATGGATACCACAGGACTC -3’
avUCP 373896 Exon 4 Direto: 5’- CTACGACCTCATCAAAGGACAC -3’
77 83,7 Exon 5 Reverso: 5’- AGCAGCCACGAAGTGACAG -3’
EEF1A1 373963
Exon 3 Direto: 5’- TTCCACTGAGCCACCTTACA -3’
184 82,7 Exon 4 Reverso: 5’- GGTAACCTTCCATCCCTTGA -3’
GAPDH 374193 Exon 7 Direto: 5’- TGGAGAGATGGCAGAGGTG -3’
141 84,9 Exon 8 Reverso: 5’- AACAGAGACATTGGGGGTTG -3’
HSP70 423504 Exon Direto: 5’- ATTCTTGCGTGGGTGTCTTC -3’
158 85,8 único Reverso: 5’- GATGGTGTTGGTGGGGTTC -3’
MRPS27 427216 Exon 10 Direto: 5’- AACGGAGCAGTCTAAAATACCC -3’
128 81,4 Exon 11 Reverso: 5’- GCTTTTCCTTGACGAGTTGG -3’
MSTN 373964 Exon 1 Direto: 5’- ACAACCGAGACGATTATCACAA -3’
68 77,4 Exon 2 Reverso: 5’- TTTGGTTTTCCCTCCATTTG -3’
PYGL 378909 Exon 12
Exon 13
Direto: 5’- AGAACAAGACCAACGGCATC -3’
Reverso: 5’- GAACAGGTCGTCATCCACAA -3’ 152 88,3
RPL5 395269 Exon 4 Direto: 5’- GTTTTTGGTGCTCTGAAGGG -3’
180 82,8 Exon 5 Reverso: 5’- AGCATCTTCATCCTCCTCCA -3’
76
PCR Quantitativa em Tempo Real (RT-qPCR)
Após a síntese de cDNA, as condições de PCR - temperatura de anelamento,
concentração, volume de reagentes e condições de ciclagem - foram otimizadas para
cada par de primers. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose a
1,5%.
Os genes alvo: HSP70, avUCP, ACLY, PYGL e MSTN e os genes referência:
EEF1A1, RPL5, GAPDH, MRPS27 e ACTB foram quantificados quanto à sua
expressão pelo método RT-qPCR no equipamento LightCycler®
480 System II (Roche).
A metodologia da transcrição reversa, seguida da qRT-PCR, permite a quantificação
relativa dos níveis de expressão gênica entre os diferentes indivíduos ou tratamentos.
Este sistema baseia-se na detecção e quantificação de um marcador fluorescente, que
neste caso foi o SYBR®
Green (Roche), cujo sinal está em proporção direta com a
quantidade de produto amplificado em uma reação. O volume final da reação de PCR
foi de 10 μL, com 2µL de cDNA na diluição 1:4; 5 µL de SYBR Green I Master 2X
(Roche) (composto por Taq DNA polymerase; tampão; dNTPs; o marcador SYBR Green
I e cloreto de magnésio); 0,4 µL de cada primer direto e reverso(10 µM/µL) e 2,2 μL de
água livre de nucleases.
As condições da reação de PCR do gene ACLY foram pré-incubação a 95°C por
5 minutos; seguida de 45 ciclos de: desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a
54°C por 30 segundos e extensão final a 72°C por 20 segundos. As condições da reação
para todos os outros pares de primers foram: pré-incubação a 95°C por 2 minutos;
seguida de 45 ciclos de: desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 58°C por
20 segundos e extensão final a 72°C por 20 segundos. Após o término da reação de
PCR, a curva de melting foi gerada para cada gene entre as temperaturas de 95°C por 5
segundos, 75°C por 1 minuto e 95°C contínuo. A etapa final de resfriamento foi de
40°C por 30 segundos.
Todos os experimentos de RT-qPCR incluíram uma amostra sem cDNA como
controle negativo, em duplicata, e um calibrador, em triplicata, que foi a amplificação
do gene RPL5 conhecido, a partir de uma alíquota do pool de cDNA de todas as
amostras. Os resultados de expressão gênica foram gerados e registrados como valores
de Que (Quantification cycle).
77
Cálculo da eficiência de amplificação
O teste de eficiência de amplificação dos iniciadores, através da curva de
diluição em série (Rasmussen, 2001) foi realizado para cada gene,em duplicata, antes
das corridas, com o objetivo de testar a qualidade de amplificação nas diferentes
diluições seriadas dos cDNAs (1:2,1:4,1:8 e 1:16). A partir do resultado do teste foi
possível escolher a diluição a ser utilizada na reação de RT-qPCR. Uma representação
do teste de eficiência de amplificação dos genes através da curva de diluição em série de
cDNA é apresentada na Figura 4 (Anexo).
Os dados de fluorescência obtidos no equipamento LightCycler®
480 System II
(Roche) foram exportados para o programa LinRegPCR (Ramakers et al., 2003) para
determinação da eficiência de amplificação individual de cada amostra dos genes
referência e alvo. Os valores de eficiência variaram de 1,6 a 2,0. Uma representação
gráfica contendo 80 amostras cuja eficiência foi determinada pelo programa LinRegPCR
é apresentada na Figura 5 (Anexo).
Este programa utiliza no mínimo três pontos da curva de amplificação e emprega
uma análise de regressão linear dos dados de fluorescência da fase exponencial da PCR,
para determinar a quantidade de RNAm (R0) e a eficiência de amplificação (E) de
acordo com as equações 1, 2 e 3, descritas a seguir. Através do programa LinRegPCR os
valores de Cq foram determinados para cada amostra.
logR=log(E + 1)× n + logR0; intercepto=logR0, coeficiente angular=log[E + 1] (1)
R0 = 10 Intercepto
(2)
E =10 Coeficiente angular
- 1 (3)
Segundo Meijerink et al. (2001), para que a RT-PCR quantitativa seja confiável
e reprodutível, as amplificações devem apresentar cerca de 100% de eficiência a cada
ciclo de reação. O valor da eficiência deve ser de aproximadamente 2, o que significa a
duplicação do material genômico a cada ciclo de amplificação e corresponde a 100% de
eficiência. Em função disto, foi utilizada a correção para 2 da eficiência de amplificação
individual de cada amostra gerada pelo programa LinRegPCR (Equação 4).
78
Cq2ij = log2 (E_geneijCq_gene(ij)
) (4)
em que:
Cq2ij: Cq da amostra ij corrigido para a eficiência 2,0;
E_geneijCq_gene(ij)
: eficiência real calculada pelo LinRegPCR elevado ao Cq da amostra
para o gene ij.
Normalização dos Dados
Para normalização dos dados gerados na RT-qPCR, os valores de CqC dos genes
referência (EEF1A1, RPL5, GAPDH, MRPS27 e ACTB) foram estimados,
considerando um modelo matemático misto, com efeito aleatório associado à
variabilidade natural do indivíduo amostrado (equação 5):
Yij = μ + gi + aj + eij (5)
em que:
Yij: Cq na base 2 observado para o gene referência i no animal j;
μ: média geral dos Cq;
gi: efeito fixo do iésimo gene referência (i=1, ..., 5);
aj: efeito aleatório associado ao animal, considerando aj ~ NID (0, σa2);
eij: efeito aleatório residual, com eij ~ NID (0, σe2).
A partir deste modelo, foram obtidos os valores BLUP (Best Linear Unbiased
Predictor) para o efeito animal, sendo estes considerados como os fatores de ajustes dos
valores Cq dos genes alvo.
Análises estatísticas
Para a quantificação relativa, os dados de expressão dos genes alvo foram
submetidos à análise de variância, utilizando-se o procedimento MIXED (Mixed Linear
Models) do programa estatístico SAS (SAS, 2003). Foram considerados no modelo de
análise os efeitos fixos da suplementação da dieta com vitaminas, da condição térmica
associada ou não ao pair-feeding e da interação, além do erro aleatório (Equação 6). A
79
interação foi considerada significativa quando P (probabilidade de erro do tipo I) <0,10.
Para comparação de médias entre os tratamentos foram utilizados contrastes de médias,
considerados significativos quando P<0,05.
Yijk = μ + Ai + Lj + (A x L)ij + eijk (6)
Em que:
Yijk: valores de Cq normalizados;
μ: média geral;
Ai: efeito fixo da dieta;
Lj: efeito fixo da condição térmica;
A x L ij: efeito fixo da interação dieta e condição térmica;
eijk: erro aleatório.
Resultados e Discussão
Não foi possível apresentar o resultado de expressão do gene PYGL resultante
do estresse por calor agudo e crônico, porque a maioria das amostras não foram
amplificadas durante a reação de RT-qPCR. Isto pode ter ocorrido devido à baixa ou
nenhuma expressão do gene no tecido muscular das aves (UniGene,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Expressão Relativa dos genes resultante do estresse por calor agudo, de 21 horas
A expressão do RNAm dos genes alvo foi apresentada em valores de Cq
(Quantification cycle). Quanto mais baixo o valor de Cq, mais cedo ocorreu a detecção
do RNAm do gene, consequentemente, maior foi a expressão gênica (Tabela 3).
Detectou-se efeito da interação dieta x condição térmica sobre a expressão do
gene avUCP(Tabela 3). Sob estresse por calor agudo, a expressão do gene foi menor nas
aves que receberam ração suplementada com vitaminas em relação às aves controle,
80
entretanto em condição termoneutra não houve diferença entre ração controle e
suplementada.
Taouis et al. (2002) e Mujahid et al. (2006) observaram que o estresse por calor
estimulou a produção de superóxido nas mitocôndrias do músculo esquelético do peito
de frangos de corte, possivelmente pela redução na expressão da avUCP. Estes
resultados evidenciaram que a hipertermia estimulou a produção de superóxidos no
músculo esquelético dos frangos, via regulação descendente da avUCP.
Mujahid et al.(2007) estudaram, in vitro, a questão do tempo vs. expressão da
avUCP e concluíram que a repressão da expressão da avUCP induzida pelo estresse por
calor agudo é dependente do tempo (34ºC por 6, 12 e 18 h): durante o estágio inicial do
estresse pelo calor agudo, os transcritos de enzimas envolvidas na β-oxidação estavam
super expressos, além dos maiores níveis de ácidos graxos não-esterificados no plasma
e do aumento de genes mitocondriais transportadores de ácidos graxos. Este pico de
oxidação de substratos na mitocôndria resultou em maior produção de superóxido, desta
forma, a expressão da avUCP seis horas após o estresse por calor pode não ter sido
suficiente para aliviar a superprodução de ROS. Entretanto, durante o estágio mais
avançado de estresse pelo calor, houve redução da expressão do gene avUCP, enquanto
os substratos de oxidação voltaram ao nível controle. Essa redução de expressão pode
ter causado superprodução de ROS na mitocôndria, mantendo a produção de
superóxidos alta nos estágios mais tardios do estresse por calor. Portanto, segundo os
autores, a superprodução de ROS na mitocôndria do músculo esquelético de frangos sob
estresse por calor, deve resultar da intensificação da oxidação de substratos e repressão
da avUCP de forma dependente do tempo.
Pode-se inferir que a suplementação com vitaminas reduziu, no presente estudo,
a expressão da avUCP sob estresse por calor agudo, levando à produção excessiva de
ROS na mitocôndria do músculo esquelético dos frangos. Estudos sobre o efeito da
suplementação de vitaminas na expressão deste gene são necessários, pois a
suplementação da dieta não foi capaz de conferir proteção antioxidativa contra os
efeitos deletérios dos radicais livres, conforme era esperado. Taouis et al. (2002)
recomendaram estudos adicionais a respeito da redução na expressão da avUCP
induzida pelo condicionamento térmico, especialmente durante o período crítico da
última semana de produção de frangos em climas tropicais.
81
Detectou-se efeito da dieta com vitaminas sobre a expressão do gene da MSTN,
que foi mais expresso nas aves que receberam ração controle (31,71±0,44) em relação à
ração suplementada com vitaminas (33,61±0,45) (Tabela 3). Isto significa que a adição
de vitaminas reduziu a expressão da MSTN, independentemente da condição térmica.
Archile-Contreras et al. (2011) observaram in vitro que as vitaminas C e E
influenciaram no metabolismo do colágeno, aumentando o turnover durante o
crescimento de bovinos. Segundo os autores, esta elevada taxa de turnover do colágeno
pode ter implicações in vivo sobre o desempenho, rendimento de carcaça e qualidade de
carne. Pode-se supor que, no presente estudo, esta redução na expressão da MSTN, em
função da suplementação com vitaminas, possa estar relacionada ao maior turnover de
colágeno no músculo.
Houve efeito da interação dieta x condição térmica sobre a expressão do gene
ACLY. A suplementação com vitaminas reduziu a expressão do ACLY sob estresse por
calor agudo, entretanto, não houve diferença de expressão em termoneutralidade
(Tabela 3). Este resultado sugere que o gene ACLY tem expressão inibida sob alta
temperatura ambiental em consequência da redução na produção de energia pelas
células e de calor corporal, para manter a homeotermia. Esta redução na expressão do
gene é responsável pela menor atividade da enzima citrato sintase durante a reação de
catálise do acetil-CoA com o oxaloacetato, promovendo queda na produção do citrato.
A menor produção de citrato é responsável por limitar a velocidade de toda a sequência
de reações do ciclo do ácido cítrico (Lehninger et al., 2008), de forma a minimizar a
produção de energia pelas células, com consequente queda na produção de calor
corporal.
Não houve efeito da interação dieta x condição térmica, nem efeito isolado de
suplementação da dieta e de condição térmica sobre a expressão do gene HSP70 (Tabela
3). Este resultado difere dos obtidos de trabalhos conduzidos em outros tipos de tecido
de aves mais jovens expostas a temperaturas elevadas. Foi observada maior expressão
de HSP70 no fígado de pintos de corte (Dionello et al., 2001) e no cérebro, coração e
pulmões de embriões (Leandro et al., 2004). Entretanto, foram observados menores
níveis de HSP70 no cérebro de pintos de corte (Dionello et al., 2001) e nos pulmões e
coração de aves em idade precoce (Yahav et al., 1997), sugerindo que o
82
condicionamento térmico induziu um mecanismo que agiu em longo prazo, reduzindo a
hipertermia das aves durante o desafio de calor e, portanto reduzindo a síntese de HSP.
De acordo com o exposto, pode-se inferir que, no presente estudo, as aves não
apresentaram alteração no nível de expressão do HSP70 porque se adaptaram
rapidamente, ou seja, a alteração na expressão retornou ao nível normal em menos de 21
horas de tratamento de dieta e condição térmica (resposta em curto prazo).
83
Tabela 3: Expressão relativa do RNAm, valores de Cq (Quantification cycle) e erro-padrão, dos genes avUCP, HSP70, MSTN e ACLY de
acordo com a suplementação da dieta dos frangos de corte e a condição térmica de estresse por calor agudo, de 21 horas.
Gene1
Termoneutra Estresse por calor agudo Valor de P4
Controle Suplementação Controle Suplementação Dieta2 CT
3 Dieta x CT
avUCP 33,55 (0,48) 33,89 (0,50) 32,64 (0,51)a 34,93 (0,58)
b 0,0143 0,9037 0,0682
HSP70 32,69 (0,47) 32,60 (0,47) 32,62 (0,47) 33,28 (0,47) 0,5407 0,5148 0,4314
MSTN 31,00 (0,62) 33,29 (0,61) 32,42 (0,62) 33,93 (0,67) 0,0039 0,1085 0,5373
ACLY 33,84 (0,46) 33,54 (0,46) 34,33 (0,50)a 35,73 (0,56)
b 0,2759 0,0099 0,0949
1avUCP = avian uncoupling protein; HSP70 = heat shock 70kDa protein 2; MSTN= myostatin; ACLY = ATP-citrate synthase.
2Dieta = Controle
(ração sem suplementação adicional de vitaminas C e E) e Suplementação (ração com suplementação adicional de 536 mg de vitamina C/kg e 127
mg de vitamina E/kg). 3CT = condição térmica: Termoneutra (22,6 e 22,5ºC) e Estresse por calor agudo, de 21 horas (31,7ºC).
4P = probabilidade de
erro do tipo I. a, b
= Médias seguidas de letras diferentes na linha diferiram entre si pelo contraste de médias a 5% de probabilidade.
84
Expressão Relativa dos genes resultante do estresse por calor crônico, aos 16 dias
Detectou-se efeito da interação dieta x condição térmica sobre a expressão do
gene avUCP. A suplementação de vitamina em termoneutralidade com pair-feeding
reduziu a expressão do gene avUCP, entretanto, em termoneutralidade e estresse por
calor crônico não houve diferença detectável (Tabela 4). Isto significa que sob efeito da
restrição alimentar, a expressão da avUCP foi maior na dieta controle e, além disto, o
calor crônico e a suplementação isoladamente não apresentaram efeito sobre a
expressão da avUCP.
Dentre os possíveis papéis fisiológicos da avUCP acredita-se que seus níveis são
induzidos durante o jejum ou privação de alimento (Mujahid et al., 2006). O aumento na
expressão do gene avUCP no músculo esquelético de frangos após o jejum de 24 e de
48 horas conduziu à menor produção de ROS pelas mitocôndrias (Abe et al., 2006) e,
portanto, menor oxidação do substrato (Mujahid et al., 2007). Segundo Evock-Clover et
al. (2002) o aumento na expressão da avUCP estava correlacionado com as
concentrações de triglicerídeos no plasma, de ácido graxos não-esterificados, de insulina
e de IGF-I e IGF-II, indicando a diminuição da oxidação de ácido graxo. Estes autores
concluíram que a adaptação metabólica à privação alimentar em frangos conduziu ao
aumento na expressão da avUCP. Embora o papel bioquímico exato ou o mecanismo de
ação desta UCP seja atualmente desconhecido, é provável que a avUCP esteja
envolvida na regulação, ou seja regulada pela oxidação de ácido graxo, especialmente
em períodos de estresse nutricional.
Pode-se inferir, no presente estudo, que a restrição alimentar imposta pelo pair-
feeding foi capaz de induzir a expressão da avUCP e, consequentemente, inibir a
produção de ROS na mitocôndria do músculo esquelético, levando à redução da
oxidação de ácido graxo.
Detectou-se efeito da interação dieta x condição térmica sobre a expressão do
gene da MSTN. Sob estresse por calor crônico, a suplementação com vitaminas
aumentou a expressão da MSTN, entretanto, em termoneutralidade e com pair-feeding
não houve efeito da suplementação com vitaminas sobre a expressão da MSTN (Tabela
4).
85
De acordo com Thomas et al. (2000) a proteína miostatina atua regulando
negativamente o crescimento muscular esquelético,para manutenção da homeostase nos
tecidos de aves adultas. Diante disto, pode-se sugerir que a suplementação de vitaminas
atuou no aumento da expressão da MSTN na tentativa de diminuir a massa muscular e
com isto, manter a homeotermia das aves estressadas por calor crônico.
Não houve efeito da interação dieta x condição térmica, nem efeito da vitamina
nem do calor crônico sobre a expressão do gene ACLY (Tabela 4). Diante destes
resultados pode-se supor que o ACLY atuou no metabolismo energético contribuindo na
manutenção da homeotermia somente nas aves mais jovens ou nos períodos mais curtos
de estresse térmico (Tabela 3). No caso do estresse crônico, o gene não foi
diferencialmente expresso, pois, provavelmente, após 16 dias de iniciado os tratamentos
de dieta e condição térmica, as aves já tenham se ajustado metabolicamente e a
alteração na expressão já havia retornado ao nível normal (resposta em curto prazo).
Não houve efeito da interação dieta x condição térmica, nem efeito isolado de
suplementação da dieta e de condição térmica sobre a expressão do gene HSP70 (Tabela
4). Estes resultados são semelhantes aos observados por Sohn et al. (2012) que também
não encontraram alteração nos níveis de expressão do gene HSP70 em galinhas
poedeiras da linhagem White Leghorn, expostas à restrição alimentar, às 64 semanas de
idade.
86
Tabela 4: Expressão relativa do RNAm, valores de Cq (Quantification cycle) e erro-padrão, dos genes avUCP, HSP70, MSTN e ACLY de
acordo com a suplementação da dieta dos frangos de corte e a condição térmica de estresse por calor crônico, de 16 dias.
Gene1
Termoneutra Termoneutra com pair-feeding Estresse por calor crônico Valor de P4
Controle Suplem. Controle Suplem. Controle Suplem. Dieta2 CT
3 Dieta x CT
avUCP 33,71 (0,60) 33,19 (0,60) 32,93 (0,62)a 34,69 (0,62)
b 34,56 (0,67) 33,48 (0,64) 0,9106 0,6582 0,0620
HSP70 33,00 (0,51) 32,58 (0,51) 32,39 (0,51) 33,71 (0,51) 33,81 (0,51) 33,90 (0,53) 0,4354 0,1075 0,2227
MSTN 32,89 (0,61) 32,27 (0,63) 33,66 (0,70) 34,53 (0,73) 34,64 (0,63)b 32,07 (0,65)
a 0,1549 0,0811 0,0429
ACLY 35,24 (0,82) 34,29 (0,67) 35,64 (0,78) 35,04 (0,83) 34,85 (0,74) 35,40 (0,75) 0,5970 0,7537 0,5767
1avUCP = avian uncoupling protein; HSP70 = heat shock 70kDa protein 2; MSTN= myostatin; ACLY = ATP-citrate synthase.
2Dieta = Controle (ração
sem suplementação adicional de vitaminas C e E) e Suplem. (ração com suplementação adicional de 536 mg de vitamina C/kg e 127 mg de vitamina
E/kg). 3CT = condição térmica: Termoneutra (22,6 e 22,5ºC), Termoneutra com pair-feeding (22,6 e 22,5ºC) e Estresse por calor crônico, de 16 dias
(31,7ºC). 4P = probabilidade de erro do tipo I.
a, b= Médias seguidas de letras diferentes na linha diferiram entre si pelo contraste de médias a 5% de
probabilidade.
87
Conclusão
Sob estresse por calor agudo, a suplementação da dieta com vitaminas C e E
reduziu a expressão da avUCP, não conferindo, portanto, proteção antioxidativa. A
adição de vitaminas reduziu a expressão da MSTN e inibiu a expressão do ACLY, o que
estava provavelmente associado à manutenção da homeotermia. Em relação ao estresse
por calor crônico, a suplementação com vitaminas reduziu a expressão da avUCP sob a
condição de termoneutralidade com pair-feeding, mas induziu a expressão da MSTN
sob estresse por calor.
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91
CAPÍTULO IV
92
IMPLICAÇÕES
A utilização de níveis adequados de vitaminas C e E é importante na indústria de
rações, visto o relevante papel que exercem na manutenção da saúde e desenvolvimento
das aves. Entretanto, a suplementação da dieta com vitaminas C (536 mg/kg) e E (127
mg/kg) não foi capaz de neutralizar, nem de reduzir, os efeitos negativos do estresse por
calor sobre as características de desempenho, rendimento de carcaça, de cortes e órgãos
e qualidade de carne de frangos dos 28 aos 42 dias de idade.
É necessário avaliar outros fatores além dos níveis de suplementação, como por
exemplo, a digestibilidade dos nutrientes presentes nas dietas fornecidas sob condição
de calor, o período de fornecimento e o tempo de administração da suplementação
vitamínica nas diferentes fases da dieta dos frangos de corte com o intuito de se
estabelecer níveis e condições ideais de uso para promover, desta forma, o aumento no
desempenho, no rendimento de carcaça e na qualidade de carne em regiões de clima
tropical.
O entendimento do efeito sinérgico entre as vitaminas C e E também é
importante, pois a formulação de dietas com níveis de vitaminas em proporções
inadequadas quer seja no excesso, ou deficiência de quantidade poderia criar condições
de desbalanceamento vitamínico.
Pesquisas acerca dos genes reativos ao calor são necessárias para a compreensão
das funções moleculares na termorregulação. É sabido que muitos outros genes estão
envolvidos, por isto, torna-se difícil a interpretação dos efeitos do estresse por calor
sobre a expressão de forma isolada. Como consideração para novas pesquisas é sugerida
a análise global da expressão gênica sob estresse por calor. Estudos em diferentes
tecidos e em diferentes tempos de estresse também podem ser úteis na exibição de
padrões de expressão dos genes e seus modelos de regulação.
93
ANEXO
94
Figura 1. Gel de agarose (1,5%) mostrando a integridade do RNA total das amostras de
músculo pectoralis major das aves, onde se visualiza as bandas estruturais de
RNA ribossômico (28 S; 18 S e 5,8 S).
28 S →
5,8 S →
18 S →
95
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% para visualização dos fragmentos
amplificados para cada gene. 1 e 12 - Padrão de peso molecular 50 pares de
base (Fermentas), 2 - GAPDH (141 pb), 3 - EEF1A1 (184 pb), 4 - ACTB (80
pb), 5 - MRPS27 (128 pb), 6 - RPL5 (180 pb), 7 - avUCP (77 pb), 8 - HSP70
(158 pb), 9 - MSTN (68 pb), 10 - ACLY (193 pb), 11 - PYGL (152 pb).
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1
50 pb →
150 pb →
250 pb →
500 pb →
1000 pb →
12
96
Figura 3. Curva de melting dos genes avUCP (acima) e calibrador RPL5 (abaixo). Cada
linha representa uma amostra cuja expressão foi quantificada.
Curva de melting do
gene calibrador (RPL5)
Curva de melting
do gene avUCP
Temperatura de
melting (83,7°C)
Controle
negativo
97
Figura 4. Curva de diluição gerada para o gene ACTB.
Erro: 0,0231
Eficiência: 1,944
Coeficiente angular: -3,464
Y Intercepto: 22,43
98
Figura 5 – Curva de amplificação gerada pelo programa LinRegPCR.