importÂncia fisiolÓgica dos transportadores …
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AMANDA LIMA BATISTA
IMPORTÂNCIA FISIOLÓGICA DOS TRANSPORTADORES MITOCONDRIAIS DE ADENILATOS AACs EM Arabidopsis thaliana
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de Magister Scientiae.
VIÇOSA MINAS GERAIS - BRASIL
2019
Ficha catalográfica preparada pela Biblioteca Central da UniversidadeFederal de Viçosa - Câmpus Viçosa
T Batista, Amanda Lima, 1994-B333i2019
Importância fisiológica dos transportadores mitocondriaisde adenilatos AACs em Arabidopsis thaliana / Amanda LimaBatista. – Viçosa, MG, 2019.
ix, 45 f. : il. (algumas color.) ; 29 cm. Orientador: Adriano Nunes Nesi. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Viçosa. Referências bibliográficas: f. 34-37. 1. Arabidopsis thaliana - Metabolismo. 2. Mitocôndria.
3. Respiração. 4. Redox. I. Universidade Federal de Viçosa.Departamento de Biologia Vegetal. Programa de Pós-Graduaçãoem Fisiologia Vegetal. II. Título.
CDD 22. ed. 583.64
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais Juvenal e Márcia, pelo amor incondicional, exemplo e apoio sempre presente
À minha avó Orlandi, pelo abraço acalentado e pela confiança depositada
Ao meu noivo Vinicius, pelo amor, força, companheirismo e ajuda preciosa
Às minha irmãs Vanessa e Yasmin, pelo carinho, parceria e afago nas fases difíceis
DEDICO
“Agrada-te do SENHOR, e ele satisfará os desejos do teu coração. Entrega o teu caminho ao SENHOR, confia nele, e o mais ele fará.”
Salmos 37.4-5
“Acaso, pode uma mulher esquecer-se do filho que ainda mama, de sorte que não se compadeça do filho do seu ventre? Mas ainda que esta viesse a se esquecer dele, eu, todavia, não me esquecerei de ti. Eis que nas palmas das minhas mãos te gravei; os teus muros estão continuamente perante mim.”
Isaías 49.15-16
“Instruir-te-ei e te ensinarei o caminho que deves seguir; e, sob as minhas vistas, te darei conselho.”
Salmos 32.8
iii
AGRADECIMENTO
Toda honra, toda glória e ações de graças sejam dadas a Deus, o criador da vida, o
provedor da inteligência, o consolador nas dificuldades sempre presentes, que me instruiu, me
ensinou o caminho em que andar e que me aconselhou sob suas vistas.
Sou grata aos meus pais, Juvenal e Márcia pelo amor genuíno que transborda ao ponto
de senti-lo sempre, mesmo a 700 km de distância, pelo apoio em cada decisão tomada e
confiança que sempre dispensaram sobre mim. Á minha avó Orlandi pelo seu carinho e
abraço acalentado que aperta meu coração de tantas saudades. Agradeço as minhas irmãs
Vanessa e Yasmin pela força, torcida e por sempre estarem disponíveis para ouvir os
desabafos frequentes. Ao meu noivo Vinicius que nunca mediu esforços para estender a mão,
inclusive na realização dos experimentos desse trabalho, pelo seu companheirismo em todos
os momentos e pelo encorajamento nos momentos difíceis. Aos meus familiares que sempre
estão de braços abertos cheios de amor e consideração, preocupação e carinho. Ao Tiago e a
Dinorah pela amizade e por ser família, com toda consideração e atenção dispensada a mim.
À família PIBI e IBMV pelas orações e pelo sustento e fortalecimento da minha vida
espiritual. Ao Pastor Elífio pelo cuidado e conselhos ao longo das tomadas de decisões.
Agradeço ao professor Adriano pela receptividade em me orientar desde o início e apoio
ao longo da realização desse trabalho, possibilitando a oportunidade de aprender e trabalhar
na ciência, confiando e acreditando nessa pesquisa. Agradeço aos meus supervisores e amigos
Elias, Paula e o Jorge por toda ajuda no planejamento dos experimentos, as ideias e esforços
investidos nesse trabalho, além dos desabafos e compartilhamento de experiências pessoais
que foram e que são importantes pra mim, que vou levar comigo. Ao professor Wagner
Araújo pelo tempo disponibilizado e contribuições feitas no trabalho. Aos outros membros do
laboratório Unidade de Crescimento de Plantas que de alguma forma contribuíram para a
realização desse trabalho, em especial a Carol, Danielle Brito, Dora, Helen, Marcelo e
Roberto, que participaram na companhia de madrugadas, disponibilizaram materiais
utilizados, auxílio na obtenção de resultados e conversas e conselhos preciosos dados. Aos
membros da banca, professor Adriano e Wagner, pós-doutorandos Dora e William por
aceitarem o convite e aos outros professores do curso por todas as sugestões propostas e
ensinamentos durante esse período.
Agradeço a Universidade Federal de Viçosa (UFV), em especial ao Programa de Pós-
Graduação em Fisiologia Vegetal por fornecer todas as condições necessárias para o
desenvolvimento dessa dissertação e na aquisição de conhecimentos científicos preciosos com
iv
a mais alta qualidade de ensino. Agradeço também à Fundação de Amparo a Pesquisa de
Minas Gerais (FAPEMIG), ao Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento
da pesquisa e, especialmente, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) por financiar a bolsa que possibilitou a realização desse trabalho.
Obrigada a todos que se envolveram em minha vida nesse período, estando ou não
envolvidos diretamente com esse trabalho, mas que de forma especial foram instrumento
utilizados por Deus para que eu chegasse até aqui com as convicções que tenho hoje e que
contribuíram na jornada dessa vida rumo ao amadurecimento.
Que a paz de Cristo seja o juiz em seu coração, visto que vocês foram chamados para viver em paz, como membros de um só corpo. E sejam agradecidos. Habite ricamente em vocês a palavra de Cristo; ensinem e aconselhem-se uns aos outros com toda a sabedoria e cantem salmos, hinos e cânticos espirituais com gratidão a Deus em seu coração. Tudo o que fizerem, seja em palavra seja em ação, façam-no em nome do Senhor Jesus, dando por meio dele graças a Deus Pai.
Colossenses 3:15-17
Porque se um cair, o outro levanta o seu companheiro; mas ai do que estiver só; pois, caindo, não haverá outro que o levante.
Eclesiastes 4:10
E sabemos que todas as coisas contribuem juntamente para o bem daqueles que amam a Deus, daqueles que são chamados segundo o seu propósito.
Romanos 8:28
v
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................ vi
ABSTRACT .................................................................................................................. viii
1 - INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2 - MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 5
2.1 - Material vegetal .................................................................................................... 5
2.2 - Condições de crescimento .................................................................................... 5
2.3- Construção do alinhamento de sequências de aminoácidos .................................. 6
2.4 - Análises de expressão gênica ............................................................................... 6
2.5 - Análises de tecidos autotróficos ........................................................................... 7
2.6 - Parâmetros biométricos ........................................................................................ 7
2.7 - Determinação de metabólitos ............................................................................... 7
2.8 - Experimento de luz e escuro contínuo .................................................................. 8
2.9 - Análises de tecidos heterotróficos ........................................................................ 9
2.10 - Análises estatísticas ............................................................................................ 9
3 - RESULTADOS ......................................................................................................... 10
3.1 - Padrão diferencial de expressão entre órgãos e estágios do desenvolvimento ... 10
3.2 - Isolamento de mutantes com inserção de T-DNA nos genes AACs. .................. 11
3.3 - Parâmetros de crescimento e trocas gasosas....................................................... 12
3.4 - Avaliação do metabolismo ao longo do dia ....................................................... 14
3.5 - Avaliação da condição redox das plantas ........................................................... 20
3.6 – Avaliação do metabolismo em condição de luz e escuro contínuos .................. 21
3.7 - Análises em tecidos heterotróficos ..................................................................... 24
4 - DISCUSSÃO ............................................................................................................. 27
5 – CONCLUSÕES ........................................................................................................ 33
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 34
7 - FIGURAS E TABELAS SUPLEMENTARES ........................................................ 38
vi
RESUMO
BATISTA, Amanda Lima, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, março de 2019. Importância fisiológica dos Transportadores Mitocondriais de Adenilatos AACs em Arabidopsis thaliana. Orientador: Adriano Nunes Nesi.
A mitocôndria é a organela responsável pela maior parte do fornecimento do ATP necessário
para os processos metabólicos de manutenção do crescimento e respostas a vários estresses. O
transporte de adenilatos (AMP, ADP e ATP) através da membrana mitocondrial interna é
mediado por proteínas carreadoras especializadas, dentre as quais se encontram os carreadores
do tipo antiporte ADP/ATP (AAC), que exportam o ATP para o citosol e, simultaneamente,
importam o ADP para a matriz mitocondrial. Em Arabidopsis thaliana, são encontradas as
isoformas AAC1, AAC2 e AAC3, cujos papeis fisiológicos ainda permanecem desconhecidos.
Neste trabalho, avaliou-se em Arabidopsis thaliana o papel dos transportadores mitocondriais
de ADP/ATP, denominados AtAAC1, AtAAC2 e AtAAC3. Para tal, foram utilizadas
linhagens mutantes homozigotas com baixa expressão obtidas por inserção do T-DNA. Estas
plantas foram caracterizadas a nível fisiológico e bioquímico. A análise do padrão de
expressão dos genes AACs em plantas selvagens em condições ideais de cultivo demonstrou
que de fato eles provavelmente desempenham papeis fisiológicos distintos em função do
tecido e estágio do desenvolvimento. O gene AAC1 se apresentou como a isoforma mais
abundante, independente do tecido e estágio do desenvolvimento. O AAC2 e o AAC3 tiveram
expressão mais relevante em tecidos relacionados à fase reprodutiva, tais como grãos de
pólen, flores e síliquas. Análise da expressão demonstrou que, na ausência do gene AAC2,
ocorre regulação positiva dos demais transportadores de adenilatos da célula. Os mutantes
para os genes AAC1, AAC2 e AAC3 exibiram maiores taxas de respiração noturna em relação
a plantas WT sem apresentarem alterações na assimilação líquida de carbono e no
crescimento. Adicionalmente, a quantificação metabólica nas plantas mutantes das três
isoformas apontou tendência de maior acúmulo nos teores de aminoácidos, proteínas, glicose,
frutose, sacarose e amido ao longo do período luminoso e alto consumo dos mesmos durante
o período noturno. Também foram observadas maiores razões de poder redutor
[NAD(P)H/NAD(P)+] em mutantes para o gene AAC1, AAC2 e AAC3 comparado ao WT.
Tomados em conjunto, os resultados sugerem que, esses transportadores ADP/ATP estão
envolvidos principalmente no metabolismo do processo respiratório, balanço redox e
concentrações de metabólitos nitrogenados e carbonados. Assim, pode-se sugerir que a
dinâmica distribuição das moléculas de adenilato, promovida por estes transportadores, tenha
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papeis relevantes na sincronia entre o metabolismo diurno e noturno em plantas, contribuindo
assim para a manutenção do steady-state celular, por mecanismos que precisam ser
investigados. Para tal, é necessário, aprofundar a compressão do papel destes transportadores
nos tecidos vegetais e condições adversas bem como o papel de enzimas chave que atuam no
processo.
viii
ABSTRACT
BATISTA, Amanda Lima, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, March, 2019. Physiological significance of Mitochondrial Adenylate Carriers AACs in Arabidopsis
thaliana. Advisor: Adriano Nunes Nesi.
Mitochondria is the organelle responsible for most of the ATP supply needed for the
metabolic processes of maintaining growth and responding to various stresses. The transport
of adenylates (AMP, ADP and ATP) through the internal mitochondrial membrane is
mediated by specialized carrier proteins, among which are carriers ADP / ATP antiport carrier
(AAC), which export the ATP to the cytosol and simultaneously , import the ADP into the
mitochondrial matrix. In Arabidopsis thaliana, the isoforms AAC1, AAC2 and AAC3 are
found, whose physiological roles remain unknown. In this work, the role of ADP / ATP
mitochondrial transporters, called AtAAC1, AtAAC2 and AtAAC3, was evaluated in
Arabidopsis thaliana. For this, homozygous mutant lines with low expression obtained by
insertion of the T-DNA were used. These plants were characterized at the physiological and
biochemical level. Analysis of the expression pattern of AAC genes in wild plants under
optimal culture conditions has shown that in fact they probably play distinct physiological
roles depending on the tissue and stage of development. The AAC1 gene presented as the most
abundant isoform, independent of tissue and stage of development. AAC2 and AAC3 had more
relevant expression in tissues related to the reproductive phase, such as pollen grains, flowers
and silica. Analysis of the expression demonstrated that, in the absence of the AAC2 gene,
positive regulation of the other adenylate transporters of the cell occurs. Mutants for the
AAC1, AAC2 and AAC3 genes exhibited higher rates of nocturnal respiration over WT plants
without showing changes in net carbon uptake and growth. In addition, metabolic
quantification in mutant plants of the three isoforms indicated a tendency of greater
accumulation in the amino acid, protein, glucose, fructose, sucrose and starch contents
throughout the light period and high consumption during the night period. Reducing power
ratios [NAD(P)H/NAD(P)+] were also observed in mutants for the AAC1, AAC2 and AAC3
gene compared to WT. Taken together, the results suggest that these ADP / ATP transporters
are mainly involved in respiratory process metabolism, redox balance and concentrations of
nitrogenous and carbonate metabolites. Thus, it may be suggested that the dynamic
distribution of the adenylate molecules, promoted by these transporters, has relevant roles in
the synchrony between diurnal and nocturnal metabolism in plants, thus contributing to the
maintenance of cell steady state, by mechanisms that need to be investigated. To this end, it is
ix
necessary to deepen the compression of the role of these carriers in plant tissues and adverse
conditions as well as the role of key enzymes that act in the process.
1
1 - INTRODUÇÃO
As mitocôndrias são organelas com papel fundamental no processo respiratório e
suprimento de energia celular. Além disso, contribui para o fornecimento de precursores
metabólicos para inúmeros processos essenciais de biossíntese e fixação de nitrogênio, bem
como participação indispensável na fotorrespiração em plantas C3 e no equilíbrio do status
redox celular (Sweetlove et al., 2007; O‟Leary et al., 2018). Em função da natureza
hidrofóbica das membranas mitocondriais, proteínas de transporte especializadas são
necessárias para mediar a passagem de metabólitos através da membrana interna que delimita
a organela (Palmieri et al., 2008).
A família de carreadores mitocondriais (MCF) é um conjunto de proteínas que
desempenham a função de mediar o transporte de metabólitos através das membrana
fosfolipídicas. Elas são amplamente estudadas e caracterizadas como as principais proteínas
de membrana que catalisam o transporte específico de vários substratos em plantas (Picault et
al., 2004; Haferkamp and Schmitz-Esser, 2012; Lee and Millar, 2016). Proteínas MCFs estão
presentes em todas as células eucarióticas, abrangendo 35 genes identificados em
Saccharomyces cerevisiae, cerca de 50 genes em Homo sapiens e 58 genes em Arabidopsis
thaliana (Picault et al., 2004; Palmieri et al., 2011). Todos os membros da família de
transportadores mitocondriais MCF contêm seis hélices a transmembrana e cinco segmentos
hidrofílicos que podem ser divididos em três domínios. Cada domínio consiste em duas -
hélices transmembrana separadas por um loop extramembranar hidrofílico extenso. Os três
domínios estão ligados por pequenos segmentos hidrofílicos (Millar and Heazlewood, 2003;
Picault et al., 2004).
Embora as proteínas MCF estejam localizadas principalmente na membrana
mitocondrial interna, membros do grupo também ocorrem em plastídios, peroxissomos e
retículo endoplasmático desempenhado papel tão importante quanto às proteínas
mitocondriais (Palmieri et al., 2008; Palmieri et al., 2011). Um exemplo de MCF extra-
mitocondrial é o transportador de adenilatos localizado na membrana do retículo
endoplasmático em A. thaliana (ER-ANT1), caracterizado como essencial para o crescimento,
acúmulo de lipídios, proteínas relacionados ao ER e importante no metabolismo
fotorrespiratório (Leroch et al., 2008; Hoffmann et al., 2013).
Dentre os diversos substratos transportados pelas MCFs, os adenilatos (AMP, ADP e
ATP) são metabólitos demandados em diferentes organelas e, portanto, precisam ser
2
distribuídos entre os compartimentos celulares para cumprirem suas múltiplas funções
biológicas. Tais compostos estão envolvidos em processos metabólicos fundamentais,
compreendendo síntese de ácidos nucleicos, atividade enzimática atuando como cofatores
(Missihoun et al., 2018), transdução de sinais intra e extracelulares (Cao et al., 2014; Pétriacq
et al., 2016) e fornecimento de energia para a célula (Geigenberger et al., 2010).
A adenosina trifosfato (ATP) é a principal molécula energética utilizada no
metabolismo de todos os seres vivos. Essa energia metabólica, grandemente fornecida pela
quebra das ligações fosfoéster do ATP, é demandada para manter os processos metabólicos de
manutenção do crescimento e respostas a vários estresses (Geigenberger et al., 2010; Fonseca-
pereira et al., 2018). Os principais locais de síntese de ATP em células vegetais são no
cloroplasto durante o dia, via etapa fotoquímica do processo fotossintético e, principalmente,
via fosforilação oxidativa mitocondrial através da atividade da ATP Sintase, que converte
ADP e fosfato inorgânico (Pi) em ATP na matriz mitocondrial, com relevância maior durante
a noite (Fernie et al., 2004; O‟Leary et al., 2018).
Para a partição eficiente da energia no interior da célula entre diversos processos
metabólicos, proteínas transportadoras específicas catalisam o transporte destes
compostos através da membrana interna da mitocôndria, fazendo a conexão entre a região de
produção de energia e o citosol (Geigenberger et al., 2010; Haferkamp; SChmitz-Esser, 2012;
Hoffmann et al., 2013; Fonseca-Pereira et al., 2018). Adicionalmente, através do transporte de
diversas moléculas entre os compartimentos, as proteínas de carreamento permitem a
manutenção do equilíbrio entre os níveis de ATP, ADP e AMP necessário para a otimização
da síntese de ATP (Roberts et al., 1997; Gout et al., 2014), bem como para a regulação
metabólica em células vegetais e manutenção do steady-state celular ( Igamberdiev;
Kleczkowski, 2009; Geigenberger; Riewe; Fernie, 2010; Fonseca-Pereira et al. 2018).
O transporte de adenilatos através da membrana mitocondrial interna é mediado por
proteínas carreadoras especializadas, dentre as quais se encontram os carreadores do tipo
antiporte ADP/ATP (AAC). O grupo das proteínas transportadoras AACs é altamente
conservado em células eucarióticas e desempenha importante função no balanço energético
entre mitocôndrias e citosol, sendo responsável pela troca do ATP produzido dentro da matriz
mitocondrial pelo ADP citosólico (Gnipová et al., 2015). Esses transportadores possuem
estrutura e função altamente relacionadas aos seus ortólogos de leveduras e animais
(Fontanesi et al., 2004; Haferkamp; Schmitz-Esser, 2012).
3
Em Saccharomyces cerevisiae, estão presentes os genes AAC1-3, sendo que somente a
disfunção na expressão de AAC2 resulta em alteração no crescimento quando as linhagens
mutantes são submetidas a condições de fontes de carbono não-fermentáveis (Drgoň et al.,
1992). Em Homo sapiens, mutações associadas à principal isoformas AAC, o gene ANT1,
desencadearam desordens mitocondriais caracterizadas por deleções do DNA mitocondrial.
Além disso, geraram miopatia mitocondrial devido a estagnação da ATP Sintase, causada
pelo esgotamento do ADP da matriz mitocondrial, posteriormente resultando em aumento na
produção de espécies reativas de oxigênio (Palmieri et al., 2005; Echaniz-Laguna et al.,
2012). Acarretaram também em anomalias na atividade da DNA polimerase mitocondrial e
dobramento incorreto de proteínas (Fontanesi et al., 2004; Dallabona et al., 2017). Em
Trypanosoma brucei, em baixa expressão do gene AAC, foi constatado que outra proteína
pudesse estar compensando sua atividade, sendo as proteínas APCs fortes candidatas a
transportadores alternativos (Stael et al., 2011; Peña-Diaz et al., 2012) .
Em A. thaliana, o transporte de adenilatos através da membrana mitocondrial interna é
realizada por três grupos de proteínas: (i) os APCs 1-3 (Adenine nucleotide/Phosphate
Carriers 1-3) que importam nucleotídeos de adenina para a matriz mitocondrial e exportam Pi
para o citosol (Lorenz et al., 2015); (ii) o ADNT1 (Adenine Nucleotide Transporter1) que
catalisa a exportação de ATP para o citosol e importação de AMP para a matriz mitocondrial
(Palmieri et al., 2008); e os AACs 1-3 (ADP/ATP Carrier 1-3) que catalisam a importação de
ADP em troca de ATP (Palmieri et al., 2011; Fonseca-pereira et al., 2018).
A maior parte dos transportadores putativos em plantas parece ser expressa em baixos
níveis de acordo com Picault et al. (2004) que considera o número de ESTs (do inglês:
Expressed Sequence Tag) como estimativas brutas da abundância de transcritos. Dos 58
transportadores MCF, apenas 11 apresentam pelo menos 10 ESTs. Três desses são proteínas
transportadoras de adenilatos, ADNT1 (At4g01100), AAC1 (At3g8580) e AAC2
(At5g13490), sendo que duas delas são pertencentes ao grupo dos AACs, com o AAC1 sendo
o transportador com maior número de ESTs (Picault et al., 2004). Mesmo sendo os
transportadores mais abundantes de acordo com nível de expressão, até então somente o
ADNT1 foi caracterizado funcionalmente, o qual demonstra ter importância no crescimento
de raízes e no processo respiratório (Palmieri et al., 2008).
Assim, mesmo sendo as mais expressas do grupo, poucos são os trabalhos que
investigam a razão biológica dos organismos eucarióticos possuírem repetidas isoformas para
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as proteínas AACs, sugerindo semelhanças e possíveis redundâncias de funções bioquímicas
entre elas. Outra questão pertinente a ser investigada é se a expressão dessas isoformas é
específica em determinados tecidos ou fases do desenvolvimento da planta ou ainda sob
exposição a determinadas condições ambientais.
Dessa forma, este trabalho teve como objetivo caracterizar o papel fisiológico dos
transportadores mitocondriais de adenilatos AAC1, AAC2 e AAC3 em A. thaliana, avaliando
os padrões de expressão desses genes em diferentes tecidos e fases de desenvolvimento. Além
disso, compreender como e em que nível o transporte de ADP/ATP mediado pelos
transportadores AACs possui papel relevante para processos fisiológicos e metabólicos em
condições normais e sob estresse em A. thaliana, a partir do isolamento de linhas mutantes
homozigotas com baixa expressão dos genes AAC1, AAC2 e AAC3.
5
2 - MATERIAL E MÉTODOS
2.1 - Material vegetal
Foram utilizadas nos experimentos linhagens de A. thaliana do tipo selvagem, ecotipo
Columbia (Col-0) e plantas homozigotas com inserção de T-DNA com reduzida expressão
dos três genes que codificam para transportadores mitocondriais de ADP/ATP, AAC1
(At3g8580), AAC2 (At5g13490) e AAC3 (At4g28390). Os mutantes para os genes AAC1
(aac1), AAC2 (aac2) e AAC3 (aac3) foram obtidos da coleção SALK_134240C,
SALK_207505C e SAIL_623_DO4, respectivamente. Tais plantas mutantes homozigotas
foram selecionadas por meio de reações de PCR, utilizando iniciadores que anelam
especificamente em cada gene e no T-DNA (AtAAC1: forward 5‟-
CGTAACACATGGGAGAACAATAGAGAAA-3‟, reverse 5‟-
TAAACTAAAGTCAACAGATCCAAACGATTTTGA-3‟; AtAAC2: forward 5‟-
AACTACTACTTCTCCTGTGTTTGTCCAA-3‟; reverse 5‟-
GAAACTGCAAAAAAAATGGAGAAAAAAACAAAAGC-3‟; AtAAC3: forward 5‟-
TTTGGGTCCATTTAGAAGAAGTCAAGAC-3‟; reverse 5‟-
GTTCGAGCAAAACAATCACTGATTCCTT-3‟; T-DNA primer LBb1.3: 5‟-
ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3‟; T-DNA primer LB3 for sail line 5‟-
TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC-3‟) (Figura Suplementar 1A). O
programa para o termociclador incluiu 40 ciclos de três etapas: (a) desnaturação a 95 °C por
45 segundos, (b) anelamento a 58 °C por 45 segundos e (c) extensão a 72 °C por um minuto e
25 segundos. O gel com as bandas referentes aos produtos de PCR pode ser visualizado na
Figura Suplementar 1B .
2.2 - Condições de crescimento
Sementes de todos os genótipos foram superficialmente esterilizadas com álcool a
70% durante um minuto e lavadas com água Mili-Q autoclavada. Posteriormente colocadas
em solução de hipoclorito a 2% e continuamente agitadas durante quinze minutos, e então
lavadas novamente com água Mili-Q autoclavada. Após a esterilização, foram germinadas em
meio MS (Murashige and Skoog, 1962) com metade da força iônica, suplementado com 1%
(p/v) de sacarose. As placas com as sementes foram submetidas ao processo de estratificação
por um período de três dias a 4 °C no escuro e, posteriormente, mantidas em câmara de
crescimento à 22 ± 2 ºC, umidade relativa de 60%, irradiância de 150 µmol de fótons m-2 s -1 e
6
fotoperíodo de 8 h de luz e 16 h de escuro, durante dez dias. Posteriormente, as plântulas
foram transplantadas para potes plásticos de 0.1-L de capacidade em substrato comercial
(Tropstrato HT®) e mantidas nas mesmas condições por um período de cinco semanas,
quando foram realizadas as avaliações fisiológicas e bioquímicas. Para as análises
bioquímicas as rosetas foram coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e
armazenadas a freezer -80 °C até a realização das avaliações. Para as avaliações dos tecidos
heterotróficos, após a estratificação, as placas de petri foram mantidas em sala de crescimento
a 22 ± 2 ºC, umidade relativa de 60%, irradiância de 150 µmol de fótons m-2 s -1 e fotoperíodo
de 8 h de luz e 16 h de escuro, durante dez dias e posteriormente transplantadas para substrato
até a produção de sementes.
2.3- Construção do alinhamento de sequências de aminoácidos
Alinhamentos múltiplos de sequências proteicas dos transportadores de adenilato foram
realizados através da base de dados GenBank (NCBI-NIH, Estados Unidos). Foi utilizada a
ferramenta “BLAST” (do inglês: Basic Local Alignment Search Tool) fornecida pelo NCBI
(do inglês: National Center for Biotechnology Information) para comparação de similaridades
entre as sequências de aminoácidos entre os genes analisados.
2.4 - Análises de expressão gênica
Para a análise da expressão gênica foi utilizada a técnica de PCR quantitativo em
tempo real (qRT-PCR). Foi realizada a extração do RNA total de plântulas e folhas maduras
utilizando-se o reagente TRIzol® (InvitrogenTM) conforme indicações do fabricante. Em
seguida o RNA total foi submetido a tratamento com DNase/RNase-free (InvitrogenTM) e
quantificado em espectrofotômetro a 260 nm. Aproximadamente 1 µg de RNA isolado foram
utilizados para sintetizar a fita de DNA complementar (cDNA) com o kit ImProm-II(TM)
Reverse Transcription System (Promega, Brasil) e Oligo (dT)15, seguindo as recomendações
descritas no mesmo. As reações de qRT-PCRs foram realizadas utilizando-se o equipamento
7300 Real Time System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) e o kit de amplificação
Power SYBR® Green PCR Master Mix (Life Technologies/Applied Biosystem) nas
recomendações do produto. Foram utilizados primers dos genes que codificam proteínas
transportadoras de adenilato estudada descritos na Tabela Suplementar 1, sendo usada o gene
constitutivamente expresso actina (At2g37620) como controle endógeno para normalização
dos valores da expressão gênica. Os primers usados foram desenhados usando o programa de
código aberto QuantPrime-qPCR (Arvidsson et al., 2008) e são descritos na Tabela
7
Suplementar 1. Foram utilizadas quatro plantas por genótipo e as amostras foram amplificadas
em duplicata com as seguintes etapas: 94 °C por 10 min, seguidos de 40 ciclos de 94 ºC por
15 s, 58 ºC por 15 s e 72 ºC por 15 s.
2.5 - Análises de tecidos autotróficos
Os parâmetros de trocas gasosas foram avaliados nas plantas com cinco semanas de
idade, após 30 minutos iniciado período luminoso através de um analisador de gases a
infravermelho em sistema aberto (IRGA – Infrared Gas Analyzer), modelo LI 6400XT (LI-
COR, Lincoln, NE,EUA), com fluorômetro acoplado (LI-6400-40, LI-COR Inc.) e com fluxo
contínuo de ar no sistema de 300 mol s-1. Curvas de resposta de taxa de assimilação líquida
de CO2 (A) em relação a radiação fotossinteticamente ativa (A/RFA) foram obtidas utilizando-
se uma câmara foliar de 2 cm2, temperatura de 25 ºC, concentração ambiente de CO2 (Ca)
dentro da câmara de 400 μmol CO2 mol–1 e variações da RFA na sequência: 1000, 1200, 1000,
800, 600, 400, 300, 150, 50, 25, 10 e 0 μmol fótons m-2s-1. As variáveis derivadas das curvas
A/RFA foram estimadas a partir de ajustes da curva de resposta à luz.
As taxas de respiração foram determinadas durante o período de escuro, após o período
de 30 minutos aclimatação da planta a condição. Para essas avaliações foram avaliadas dez
plantas por genótipo.
2.6 - Parâmetros biométricos
Plantas crescidas nas condições mencionadas no item 3.2 foram coletadas com cinco
semanas de idade para avaliação dos parâmetros de crescimento, sendo eles a massa seca da
roseta (MSR), massa seca do sistema radicular (MSSR), razão raiz/parte aérea (RPA), número
de folhas (NF), área foliar total (AFT), área foliar específica (AFE), área foliar da roseta
(AFR) e área foliar específica da roseta (AFER). A AFT e AFR foi determinada pela
digitalização de imagem, onde a imagem do material vegetal foi digitalizada com auxílio de
um scanner (HP Scanjet G2410 1200X1200) e as imagens obtidas foram processadas a partir
do software imageJ. A AFE e AFER foram obtidas pela fórmula: AFE(ou AFER)=AFT(ou
AFR)/MSR.
2.7 - Determinação de metabólitos
Cinco rosetas inteiras de cada linhagem foram coletadas e imediatamente congeladas
em nitrogênio líquido às 0h, 4h e 8h, correspondendo ao início, meio e fim do período
8
luminoso, e às 16h e 0h que representam o meio e final do período de escuro e armazenadas a
-80 ºC até as análises. Posteriormente, as amostras foram homogeneizadas e alíquotas de
aproximadamente 20 mg de matéria fresca foram submetidas à extração metanólica conforme
descrito por Lisec et al. (2006). Utilizando-se um leitor de microplacas (OptiMax Tunable
Microplate Reader) foi quantificado na fração solúvel os teores de clorofilas, nitrato (Sulpice
et al., 2009), glicose, frutose e sacarose (Fernie et al., 2001), aminoácidos solúveis totais
(Sienkiewicz-porzucek et al., 2010) e ácidos orgânicos como malato e fumarato (Nunes-Nesi
et al., 2007). Já na fração insolúvel foram determinados os teores de amido (Fernie et al.,
2001) e proteína (Bradford, 1976). A taxa de síntese de sacarose e amido foram calculadas
pela diferença líquida do conteúdo do composto no final da noite (0h) e no final do dia (8h)
em razão do tempo (em horas) desse período. A taxa de degradação foi calculada a partir da
diferença líquida no conteúdo do composto no final do dia (8h) e no final da noite (0h) em
razão do tempo (em horas) desse período.
Para quantificação de nucleotídeos de piridina foram realizadas alíquotas de
aproximadamente 20 mg de amostras foliares foram coletadas no meio do período de luz para
quantificação dos nucleotídeos NAD+, NADH, NADP+ e NADPH de acordo com o protocolo
descrito por (Gibon et al., 1997). Foram utilizadas cinco plantas por genótipo em todas as
análises.
2.8 - Experimento de luz e escuro contínuo
Para este experimento foi utilizado o procedimento detalhado no item 3.2, com plantas
WT, aac1, aac2 e aac3 com cinco semanas a partir da germinação. Para o controle do
experimento, rosetas de cinco plantas de cada genótipo foram coletadas no meio do período
luminoso (4h). Depois, algumas plantas foram mantidas a luz contínua à irradiância de 150
µmol de fótons m-2 s -1 e outras mantidas a pleno escuro, na mesma câmara de crescimento.
Para o experimento de luz contínua, rosetas de cinco plantas diferentes foram coletadas em
intervalos de 28 e 52 horas após a exposição nessa condição. No escuro, cinco rosetas
diferentes foram coletadas após quatro e oito dias após submissão da condição. Quanto a
coleta dos materiais, após terem sido coletados foram imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C até as análises bioquímicas.
9
2.9 - Análises de tecidos heterotróficos
A viabilidade do grão de pólen foi avaliada pela metodologia proposta por, Lorenzon e
Almeida (1996), tendo comutado o comprimento do tubo polínico a partir da digitalização de
imagem e auxílio do software ImageJ. Foi computado comprimento das síliquas produzidas
por cada um dos genótipos, bem como o número, comprimento e largura de sementes por
síliquas através do auxílio do software ImageJ. Também foi avaliada a massa de mil
sementes. Foram utilizadas seis repetições biológicas para a realização dessa caracterização.
Sementes das plantas aac1, aac2, aac3 e WT foram esterilizadas e plaqueadas para
germinar em meio MS (Murashige and Skoog, 1962) com metade da força iônica,
suplementado com 1% de sacarose e mantidas sob mesmas condições descritas no item 3.2
por 72 horas. Posteriormente, foram avaliadas a percentagem de germinação, o índice de
velocidade de germinação (IVG), o tempo médio de germinação (TMG) e velocidade média
de germinação (VMG) utilizando oito repetições com 50 sementes para cada um dos
genótipos. As variáveis foram calculadas segundo Bruginski et al. (2009) com as seguintes
fórmulas:
- Germinação: calculada pela fórmula Germinação = (N/100) x 100, em que: N =
número de sementes germinadas ao final do teste. Unidade: %.
- IVG: calculado pela fórmula IVG = Σ (ni/ti), em que: ni = número de sementes que
germinaram no tempo „i‟; ti = tempo após instalação do teste. Unidade: adimensional.
- TMG: calculado pela fórmula TMG = (Σniti)/Σni, em que: ni = número de sementes
germinadas por dia; ti = tempo de incubação. Unidade: dias.
- VMG: calculada pela fórmula VMG = 1/t em que: t = tempo médio de germinação.
Unidade: dias-1.
Para analisar o crescimento radicular, foram germinadas de seis a oito sementes de
cada um dos genótipos em placas verticais mantidas em mesmas condições já descritas no
presente item. O comprimento das raízes foi calculado a cada dois dias num período total de
dez dias, iniciando após o período de estratificação e exposição à luz, baseado em Palmieri
(2008). Foram utilizadas 7 placas como repetição para cada genótipo.
2.10 - Análises estatísticas
Os resultados obtidos foram submetidos a análise de variância, com repetições
referentes a cada análises considerando o delineamento inteiramente casualizado. Os
resultados entre os genótipos foram comparados por teste t de Student utilizando o algoritmo
10
contido no software Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA, EUA), sendo
considerados significantes os valores com P < 0,05.
3 - RESULTADOS
3.1 - Padrão diferencial de expressão entre órgãos e estágios do desenvolvimento
O genoma de A. thaliana codifica 58 proteínas carreadoras do tipo MCF, onde uma
análise filogenética classificou os genes AAC1, AAC2 e AAC3 como membros do MCF,
agrupando-os no mesmo táxon que os genes ER-ANT1 e PM-ANT1 (localizados no retículo
endoplasmático e membrana plasmática, respectivamente) (Picault et al., 2004). Entre os
transportadores AACs, o AAC1 apresenta maior similaridade entre as sequências de
aminoácidos com AAC2 do que com AAC3, com 86,53% e 74,94% de similaridade,
respectivamente. Entre o AAC2 e AAC3 são apresentados 74,62% de similaridade na
sequência de aminoácidos (Tabela Suplementar 2).
Figura 1. Padrão de expressão dos transportadores de adenilatos AAC1, AAC2 e AAC3 em plantas de A. thaliana do tipo selvagem (Col 0) em diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento. Os órgãos e estágios de desenvolvimento foram respectivamente sementes com dois dias de idade depois de embebidas, plântula com quatro dias após a germinação, folha jovem (15 dias), folha madura (um mês), folha senescente (dois meses), nervura (um mês), flor (dois meses), pólen maduro(dois meses), síliqua (dois meses) e raiz (um mês). Os valores representam a média ± erro padrão de três amostras independentes
0
1
2
3
4 AAC1 AAC2 AAC3
Expr
essã
o re
lativ
aD
2D 4D FJ FM FS N FL P SIL R
11
Para avaliar o padrão de expressão dos genes AAC1, AAC2 e AAC3 em A. thaliana,
plantas WT cultivadas em condições ideais de crescimento tiveram seus níveis de transcrição
analisados em vários órgãos e estágios de desenvolvimento por meio da técnica de RT-PCR
quantitativo, utilizando a expressão do gene da actina endógena como referência interna. Nos
diferentes órgãos analisados, o gene AAC1 foi distintamente o mais expresso em todas as
situações, independente do tipo de órgão e do estágio de desenvolvimento (Figura 1)..
Verificou-se que os genes AAC2 e AAC3 são expressos em níveis relativamente mais baixos
em tecidos vegetativos, porém são regulados positivamente na fase reprodutiva nos tecidos
florais, síliquas e grão de pólen (Figura 1).
Os padrões de expressão verificados estão de acordo com os resultados observados em
trabalhos anteriores, onde o perfil de expressão gênica por microarranjo disponíveis
publicamente (Figura suplementares 2, 3 e 4) (Winter et al., 2007).
3.2 - Isolamento de mutantes com inserção de T-DNA nos genes AACs.
Com o objetivo de avaliar o papel fisiológico dos transportadores AACs, foram
selecionadas linhagens homozigotas de A. thaliana com única inserção de T-DNA para os
genes AAC1, AAC2 e AAC3. As linhagens isoladas para os genes AAC1, AAC2 e AAC3 foram
obtidos da coleção SALK_134240C, SALK_207505C e SAIL_623_DO4, com inserção de T-
DNA na região promotora, no íntron e no éxons, respectivamente (Figura 2A). Nas linhagens
mutantes genotipadas e isoladas para o gene AAC1 (aac1), AAC2 (aac2) e AAC3 (aac3) foram
encontrados apenas 47%, 0,15% e 0,15%, respectivamente, da expressão observada no
genótipo selvagem (WT), respectivamente (Figura 2B).
Selecionadas as linhagens mutantes homozigotas, foi verificado o nível de expressão
dos outros transportadores de adenilatos nos mutantes e compará-las ao status de expressão do
WT. A princípio foi realizada a análise de expressão para os transportadores localizados
somente na mitocôndria (Figura 2C) e, posteriormente, para os transportadores de adenilatos
não-mitocondriais, localizados nos plastídios, peroxissomo e retículo endoplasmático (Figura
2D). Tanto nos transportadores localizados na mitocôndria como os das outras organelas foi
possível observar variações no padrão de expressão em plantas mutantes em comparação com
plantas tipo selvagem. Na linhagem aac2, houve aumento significativo na expressão de todos
os transportadores avaliados em relação ao padrão de expressão observado nos demais
genótipos. Logo, em situações de baixa expressão do transportador AAC2, verificou-se um
12
aumento no nível de expressão dos outros transportadores de adenilatos da célula, sugerindo
um efeito compensatório adotado pela planta ao nível de expressão. Na linhagem aac3 foram
observadas alterações significativas no nível de expressão somente para os transportadores de
adenilato localizados no peroxissomo, PNC1 e PNC2. Já na linhagem aac1, não houve
variações significativas na expressão entre os transportadores localizados na mitocôndria.
Entretanto, a maioria dos transportadores de adenilatos com localização não-mitocondrial
NTT1, NTT2, PNC1 e PNC2 teve seu nível de expressão significativamente diminuída em
plantas mutantes para AAC1.
3.3 - Parâmetros de crescimento e trocas gasosas
Selecionadas as linhagens mutantes, as plantas WT, aac1, aac2 e aac3 foram cultivadas
e avaliadas na quinta semana de cultivo. Embora as linhagens mutantes isoladas tenham
confirmada baixa expressão dos seus respectivos transportadores, elas não apresentaram
fenótipo visivelmente anormal ou diferente nesta idade em comparação com o WT (Figura
1E). A análise mais detalhada dos parâmetros de crescimento confirmou que o crescimento
das plantas mutantes não apresentam diferenças significativas em relação ao WT (Tabela 1).
Foi realizada avaliação de curva de resposta da fotossíntese à luz, na qual as plantas
foram submetidas variação de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) de 0 a 1200 mols de
fótons m-2 s-1, à 400 mol de CO2 sob um fluxo constante no sistema de 300 mol s-1. Nessa
avaliação não foi encontrada diferença significativa na assimilação de CO2 entre as linhagens
mutantes e WT em nenhuma das irradiâncias avaliadas (Figure 3A).
As demais análises de trocas gasosas foram realizadas sob condição de 400 mols de
CO2 com PAR de 150 mols de fótons m-2 s-1, condição na qual as plantas foram submetidas
durante o seu crescimento no período das cinco semanas. Referente a gs, Ci, Ci/Ca, ETR e E,
não foram encontradas diferenças significativas entre as linhagens mutantes e o tipo selvagem
(Figura 3B,C,D,E,F e G). No entanto, houve aumento na taxa de respiração noturna (Rd) para
as linhagens aac1, aac2 e aac3, em 9,06%, 13,54% e 20,28% em relação aos valores
apresentados pelo WT, respectivamente (Figura 3H).
13
Figura 2. Isolamento e caracterização genética de linhagens mutantes por inserção de T-DNA para os transportadores de adenilato AAC1, AAC2 e AAC3 em Arabidopsis thaliana. A, representação esquemática do gene AtAAC1 (At3g08580), AtAAC2 (At5g13490) e AtAAC3 (At4g28390) indicando os respectivos locais de inserção do T-DNA. As caixas representam os éxons e as setas pretas indicam as posições dos primers usados na técnica RT-PCR quantitativo para seleção das plantas mutantes. B, expressão de AAC1, AAC2 e AAC3 em folhas de A. thaliana do tipo selvagem (WT) e nas respectivas linhagens mutante. C, expressão dos transportadores de adenilatos mitocondriais nos genótipos avaliados no trabalho (WT, aac1, aac2 e aac3). D, expressão dos transportadores de adenilatos não-mitocondriais nos genótipo avaliados no trabalho (WT, aac1, aac2 e aac3). E, fenótipo das rosetas dos genótipos de A. thaliana com cinco semanas de idade com reduzida expressão dos transportadores de adenilato em relação ao WT. Os valores representam a média ± erro padrão de quatro plantas e os asteriscos indicam diferenças significativas pelo teste t de Student (P < 0,05) em comparação com o WT. As plantas avaliadas possuíam cinco semanas de idade no momento da coleta. Transportadores: *AAC1: ADP/ATP carrier 1, AAC2: ADP/ATP
14
carrier 2, AAC3: ADP/ATP carrier 3, APC1: Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 1, APC3: Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 3, ADNT1: Adenine Nucleotide Transporter 1, NTT1: nucleotide transporter 1, NTT2: nucleotide transporter 2, ATBT1: Arabidopsis Brittle 1, PCN1: Peroxisomal adenine nucleotide carrier 1, PCN2: Peroxisomal adenine nucleotide carrier 2, ER-ANT1: Endoplasmic Reticulum Adenylate Transporter1.
Tabela 1. Parâmetros de crescimento de plantas de A. thaliana com baixa expressão dos genes AAC1, AAC2 e AAC3. As plantas avaliadas possuíam cinco semanas de idade.
PARÂMETROS WT aac1 aac2 aac3
MSR 0,125 ± 0,006 0,135 ± 0,005 0,128 ± 0,006 0,116 ± 0,003
MSSR 0,015 ± 0,001 0,017 ± 0,001 0,017 ± 0,001 0,014 ± 0,001
RPA 0,104 ± 0,003 0,114 ± 0,003 0,120 ± 0,005 0,1105 ± 0,002
NF 30,50 ± 2,850 28,50 ± 0,544 28,00 ± 1,490 24,50 ± 0,470
AFT 58,70 ± 2,910 65,91 ± 2,360 65,00 ± 2,270 58,72 ± 1,610
AFE 46,63 ± 1,974 48,691 ± 1,627 50,14 ± 1,580 51,25 ± 0,970
AFR 55,36 ± 2,600 55,95 ± 1,710 56,37 ± 1,560 54,40 ± 1,110
AFER 43,97 ± 2,011 41,33 ± 1,306 43,90 ± 1,330 46,71 ± 0,955
Os valores representam a média ± erro padrão de seis amostras independentes. Abreviações: *MSR: massa seca da roseta (g), MSSR: massa seca do sistema radicular (g), RPA: razão raiz/parte aérea, NF: número de folhas, AFT: área foliar total (cm2), AFE: área foliar específica (m2 kg-1), AFR: área foliar da roseta (cm2), AFER: área foliar específica da roseta (m2 kg-1).
3.4 - Avaliação do metabolismo ao longo do dia
Para avaliar os efeitos resultantes da baixa da expressão dos transportadores AACs no
metabolismo, foram quantificados pigmentos ao meio do dia (4h) e compostos associados ao
metabolismo do nitrogênio (Figura 4) e do carbono (Figura 5) ao longo do dia, em condições
ideais de crescimento.
Quanto aos pigmentos quantificados, maiores níveis de clorofila a foram encontrados
em plantas aac2 e aac3 (Figura suplementar 5A) enquanto que a concentração de clorofila b
tendeu a aumentar para todos os genótipos mutantes, sendo significante apenas para aac3
(Figura suplementar 5B). Assim, foi possível observar menores valores na razão clorofila a/b
para os mutantes das três linhagens (Figura suplementar 5D) e tendência de aumento nos
níveis totais de clorofila a e b para os três mutantes em relação ao WT.
15
Figura 3. Efeito da redução da expressão de AAC1, AAC2 e AAC3 nos parâmetros de trocas gasosas em folhas de plantas de A. thaliana com cinco semanas de idade. A, curva de resposta da fotossíntese líquida (A) à intensidade de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) em plantas submetidas a 400 ppm de CO2. B, taxa de assimilação líquida de CO2 (A) em função da unidade de área foliar. C, condutância estomática (gs). D, concentração interna de CO2 (Ci). E, taxa de transporte de elétrons no PSII (ETR). F, razão entre as concentrações de CO2 intercelular da folha e a do ar (Ci/Ca). G, transpiração (E). H, respiração no escuro (Rd). Valores representam a média ± erro padrão de dez plantas individuais. Asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT).
A B
C D
E F
G H
RFA ( mol m -2 s -1)
0 200 400 600 800 1000 1200
A (
mol
CO
2 m
-2 s
-1 )
-2
0
2
4
6
8
10
12
WT aac1aac2aac3
A (µ
mol
CO
2 m
-2 s
-1)
0
1
2
3
4
5
6*RFA: 150 mol m -1 s -1
gs (
mol
CO
2 m
-2 s
-1)
0.0
0.1
0.2
0.3
Ci (
µmol
CO
2 m
-2 s
-1)
0
100
200
300
400
ET
R (µ
mol
m-2
s-1
)
0
10
20
30
40
50
E (
nmol
H2O
m-2
s-1
)
0
1
2
3
Ci/C
a (µm
ol C
O2
m-2
s-1
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Rd (
µmol
CO
2 m
-2 s
-1)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
**
*
A B
C D
E F
G H
WT aac1 aac2 aac3 WT aac1 aac2 aac3
16
Figura 4. Quantificação de metabólitos em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, cinco semanas após a germinação. A, nitrato B, aminoácidos. C, proteína. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas. Asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT). A área cinza do gráfico representa o período de escuro. MF: massa fresca.
Entre os outros compostos associados ao metabolismo do nitrogênio, foi possível
observar que, ao meio do dia, as linhas aac1 e aac2 exibiram alta concentração de nitrato em
relação ao WT, o qual é catabolizado até o final do dia (Figura 4A). Esse consumo de nitrato é
acompanhado concomitantemente com aumento significativo nos teores de aminoácidos e
Nitr
ato
(mm
ol k
g-1 M
F)
*
* *
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Am
inoá
cido
s (m
mol
kg-1
MF)
*
*
* *
*
*
*
Prot
eína
(mg
g-1 M
F)
4h 8h
*
0h0
5
10
15
20
* *
Horário de coleta
A
B
C
0
4
8
12
16
20 WT aac1 aac2 aac3
17
proteínas nas três linhagens mutantes em relação ao WT, resultando no acúmulo dessas
moléculas no final do dia (8h) (Figura 4B e C). Esse comportamento sugere que o nitrato foi
utilizado na síntese de aminoácidos e proteínas. Observando a avaliação do final da noite (0h),
é possível observar teores similares e até menores desses compostos, sugerindo um alto
consumo de aminoácidos e proteínas durante a noite.
Maiores alterações observadas entre as plantas mutantes e o WT ocorreram em relação
aos compostos associados ao metabolismo do carbono. Diferenças maiores na concentração
de malato foram encontradas durante o período luminoso, sugerindo acúmulo de ácidos
orgânicos ao longo desse período em plantas mutantes para AAC1 e AAC2 (Figura 5A). Nas
concentrações de fumarato, foram observados maiores acúmulos ao final do período luminoso
entre as plantas mutantes aac1 e aac2, e grande consumo desse composto durante a noite,
destacando maiores efeitos no genótipo aac2 e menores efeitos em plantas aac3 (Figura 5B).
Uma visão geral da flutuação das concentrações de ácidos orgânicos, em função do período de
coleta, pode ser observada na Figura 5H. Observando a soma de malato e fumarato, é possível
estabelecer um padrão em que, durante o período luminoso, o mutante aac2 principalmente,
aumenta consideravelmente a concentração desses compostos, o qual é consumido
rapidamente durante o período de escuro.
Quanto aos outros compostos associados ao metabolismo do carbono, foi possível
observar diferenças na concentração de carboidratos não-estruturais entre as plantas mutantes
e WT entre os diferentes pontos de coleta. Foi constatado aumento nos níveis de glicose,
frutose, sacarose e amido ao longo do período luminoso acarretando no acúmulo dos mesmos
no final do dia e rápido consumo durante a noite (Figura 5C, D, E e F). No caso do amido,
somente o aac2 apresentou acúmulos significativos durante o dia. Porém, no meio da noite
(16h), os mutantes das três isoformas apresentaram menores concentrações de amido. No final
da noite (24h) e no início do dia (0h) os mutantes das três isoformas apresentaram
concentrações de amido similares as do selvagem, sugerindo que durante a noite os mutantes
tiveram uma maior e mais rápida degradação do amido. Uma visão geral das flutuações das
concentrações de carboidratos totais, em função do período de coleta, pode ser observada na
Figura 5G. Observando a soma de glicose, frutose, sacarose e amido, é possível constatar um
padrão onde mutante aac2 apresenta altos teores desses carboidratos durante o período
luminoso, o qual é consumido rapidamente durante o período de escuro.
18
Figura 5. Quantificação de metabólitos em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade. A, malato. B, fumarato. C, glicose. D, frutose. E, sacarose. F, amido. G, carboidratos totais referente à soma dos valores de glicose, frutose, sacarose e amido. H, soma de malato e fumarato. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas. Asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT). A área cinza do gráfico representa o período de escuro. MF: massa fresca.
0
1
2
3
4
5
6
Glic
ose
(mm
ol k
g-1 M
F)
*
0
10
20
30
Am
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quiv
kg-1
MF)
*
*
*
*
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0.4
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ol k
g-1 M
F)
*
*
*
*
*
0.0
0.5
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Saca
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mol
kg-1
MF) *
*
*
*
0
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*
*
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mol
kg-1
MF)
*
* *
**
*
*
Horário de coleta
0
2
4
6
8
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12
14
16
Horário de coleta
Som
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s áci
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rgân
icos
(mm
ol k
g-1 M
F)
*
A B
C D
E F
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kg- M
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0h 4h 8h 16h 24h0
10
20
30
40
*
**
*
*
G H
0h 4h 8h 16h 24h0
5
10
15
20
25
* **
*
*
*
*
WT aac1 aac2 aac3
19
Dados os resultados da taxa de síntese de sacarose, foi possível constatar maior taxa de
síntese nas três linhagens mutantes aac1, aac2 e aac3, acrescidos em 195%, 215% e 123% em
relação ao WT (Figura 6A). Já as taxas de síntese e degradação do amido apresentaram
aumento significativo na linhagem aac2 em relação ao WT, com acréscimo de 47,8% na taxa
de síntese e 39,8% na degradação (Figura 6B e C).
Figura 6- Taxas de síntese e degradação de sacarose e amido em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade. A, taxa de síntese de sacarose. B, taxa de síntese de amido. C, taxa de degradação de amido. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas individuais. Asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT). MF: massa fresca.
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
* *
*
0
1
2
3
0.0
0.5
1.0
1.5
WT aac1 aac2 aac3
*
T
axa
de sí
ntes
e de
am
ido
(m
mol
de
glic
equ
iv k
g-1 M
F h- )
T
axa
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egra
daçã
o de
am
ido
(m
mol
de
glic
equ
iv k
g-1 M
F h- )
T
axa
de sí
ntes
e de
saca
rose
(
mm
ol k
g- MF
h- )
*
20
3.5 - Avaliação da condição redox das plantas
Sabendo da importância que o balanço entre as formas reduzidas e oxidadas dos
nucleotídeos de piridina exercem no funcionamento da célula e que medidas centrais de status
redox celular são as razões de NADH/NAD+ e NADPH/NADP+, foram quantificadas as
concentrações de NADH, NAD+, NADPH, NADP+ e suas razões. A linhagem aac1
apresentou um aumento significativo na concentração de NADH (Figura 7A) e na razão
NADH/NAD+ em relação ao WT (Figura 7E). Com relação às concentrações de NADPH
(Figura 7B) não foram observadas diferenças significativas entre as linhas mutantes e o WT.
Já nas concentrações de NADP+ (Figura 7D) apresentaram uma tendência de diminuição nas
linhas mutantes. Aumentos significativos na NADPH/NADP+ foram observados para os
mutantes aac2 e aac3 (Figura 7F).
Figura 7. Quantificação de nucleotídeos de piridina em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade coletadas no meio do período de luz. A, NADH. B, NADPH. C, NAD+. D, NADP+. E, NADH/NAD+. F, NADPH/NADP+. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas. Asteriscos indicam diferenças significativas (P < 0,05) segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT). MF: massa fresca.
NA
D+ (
nmol
g- M
F)
0
20
40
60
80
NA
DH
(nm
ol g
- MF)
0
5
10
15
20
25
WT
NA
DH
/NA
D+
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
aac1 aac2 aac3
*
NA
DP+ (
nmol
g- M
F)
0
10
20
30
40
*
NA
DPH
(nm
ol g
- MF)
0
5
10
15
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0.0
0.2
0.4
0.6
NA
DPH
/NA
DP+
WT aac1 aac2 aac3
**
*A B
C D
E F
21
3.6 – Avaliação do metabolismo em condição de luz e escuro contínuos
Como observado no experimento sob condições ideais de cultivo, as plantas mutantes
apresentaram um padrão na flutuação das concentrações dos compostos associados ao
metabolismo do carbono, principalmente, em função do período de coleta. A fim de
aprofundar o entendimento dos dados obtidos, foi proposto um experimento onde as plantas
mutantes e o tipo selvagem foram submetidos a duas contições independentes, luz e escuro
contínuos.
A concentração de clorofila a apresentou maiores valores em plantas e aac3 (Figura
suplementar 5A), enquanto que a concentração de clorofila b não alterou significativamente
comparada ao WT (Figura suplementar 5B). De forma similar, não observou-se alterações na
soma das clorofilas, nem na razão das clorofila a e b (Figura suplementar 5C e D)
Entre os compostos associados ao metabolismo do nitrogênio, as linhagens mutantes
aac2 e aac3 apresentaram acúmulo na concentração de aminoácidos ao longo das 52 horas de
luz contínua. Em adição, foi observado aumento na concentração dos aminoácidos ao longo
dos oito dias na condição de escuro, mas apenas para o mutante aac2 (Figura 8A).
Concomitantemente, os teores de proteínas sofreram maiores alterações entre mutantes e WT
no período de escuro. Nessa condição, os mutantes aac2 e aac3 apresentaram tendência de
acumular mais proteínas comparado ao tipo selvagem ao longo dos oito dias na condição
imposta (Figura 8B).
As maiores alterações foram observadas entre as plantas com baixa expressão dos
transportadores AACs e WT em relação aos compostos associados ao metabolismo do
carbono. Quanto ao malato, ainda que a variação das concentrações não tenha sido
estatisticamente diferente, é possível observar tendência de acúmulo do composto nos
mutantes, principalmente aac2 na condição de exposição à luz contínua. No escuro, é
interessante observar menores concentrações do composto nos genótipos aac1 e aac3, em
relação ao WT (Figura 9A). Quanto ao fumarato, foram observados maiores níveis em plantas
aac2 em relação a plantas tipo selvagem no escuro (Figura 9B). Essa descrição observada de
forma geral na Figura 9H, com o comportamento das flutuações da soma das concentrações
de malato e fumarato.
22
Figura 8. Quantificação de metabólitos em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade e posteriormente expostas a condições de 28 horas de luz contínua, 52 horas de luz continua, quatro dias de pleno escuro e oito dias de pleno escuro. As amostras foram coletadas no mesmo período do dia. A, aminoácidos. B, proteína. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas. Asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT). A área branca do gráfico representa a condição controle referente à coleta realizada antes da submissão do tratamento luminoso, a amarela é referente às condições de luz contínua e a cinza é referente às condições de pleno escuro. MF: massa fresca.
Dentre os carboidratos, variações mais evidentes são vistas na quantificação de sacarose
e amido. Em plena luz, as plantas mutantes das três linhagens se caracterizam por maior
acúmulo de sacarose. No escuro (após oito dias), é possível visualizar que a concentração de
sacarose continua elevada em plantas mutantes em relação as plantas WT (Figura 9E). Por
outro lado, não foram observadas diferenças nos conteúdos de amido durante o período
luminoso entre plantas mutantes e WT. Entretanto, no período escuro, plantas mutantes aac1
e aac3 apresentaram menores teores de amido, sugerindo uma maior degradação do amido
nessas linhas comparado ao tipo selvagem (Figura 9F). Esses dados inferem que o excesso de
sacarose entre os mutantes observada aos oito dias de escuro não era devido ao baixo
consumo desse composto durante a noite, mas possivelmente, devido da alta degradação do
amido, que disponibiliza grande quantidade de sacarose nessa condição, talvez mediante a
uma alta demanda celular. Essa descrição pode ser observada de forma geral na Figura 9H,
com o comportamento das flutuações da soma das concentrações da glicose, frutose, sacarose
e amido.
A B
0
5
10
15
20
25
30
35
*
* *
*
*
Prot
eína
(mg
g- MF)
0
5
10
15
20
25
30
35
*
*
*
*
* *
*
*
Am
inoá
cido
s (m
mol
kg- M
F)
A B
Horário de coleta Horário de coleta
Controle 28 h de luz
52 h de luz
4 dias deescuro
8 dias deescuro
Controle 28 h de luz
52 h de luz
4 dias deescuro
8 dias deescuro
WTaac1aac2aac3
23
Figura 9. Quantificação de metabólitos em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade e posteriormente expostas a condições de 28 horas de luz contínua, 52 horas de luz continua, quatro dias de pleno escuro e oito dias de pleno escuro. As amostras foram coletadas no mesmo período do dia. A, malato. B, fumarato. C, glicose. D, frutose. E, sacarose. F, amido. G, carboidratos totais referentes a soma dos valores de glicose, frutose, sacarose e amido. H, soma dos valores de malato e fumarato. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas. Asteriscos indicam
0
2
4
6
8
10
12
14
16
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*
**
*
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kg- M
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g- MF)
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4
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*
* *
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0.8
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*
*
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20
25
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*
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mol
kg-
MF)
0
2
3
4
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*
*
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*
*
A B
C D
E F
G H
Controle 28 h de luz
52 h de luz
4 dias deescuro
8 dias deescuro
Controle 28 h de luz
52 h de luz
4 dias deescuro
8 dias deescuro
Horário de coleta Horário de coleta
24
diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem. A área branca do gráfico representa a condição controle referente à coleta realizada antes da submissão do tratamento luminoso, a amarela é referente às condições de luz contínua e a cinza é referente às condições de pleno escuro. MF: massa fresca.
3.7 - Análises em tecidos heterotróficos
Com base nos resultados obtidos nas análises de expressão diferencial dos
transportadores AACs em diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento, foi possível
constatar alta expressão dos transportadores AAC2 e AAC3 em órgãos e tecidos associados
ao estágio reprodutivo da planta, sugerindo que esses transportadores exercem papel
importante nessa fase. Com o objetivo de conferir o efeito da baixa expressão dos
transportadores AACs nesses tecidos, parâmetros de caracterização da fase reprodutiva e
desenvolvimento de sementes foram avaliados.
Foram realizadas análises de germinação de grãos de pólen e comprimento do tubo
polínico entre as plantas mutantes o controle. Para ambas as análises, germinação de pólen e
comprimento do tubo polínico, não foram observadas alterações significativas entre o tipo
selvagem e as linhagens mutantes (Figura 10A e B).
Plantas com baixa expressão do transportador AAC1 produziram um menor número de
síliquas por planta, 27,8% a menos que o WT (Figura 10C). Em relação ao comprimento das
síliquas, o número de sementes por síliqua e à massa de 1000 sementes, foram observadas
alterações nos genótipos aac2 e aac3, os quais foram significativamente superiores quando
comparados ao WT (Figura 10D, E e F). Além disso, as plantas mutantes apresentaram
menores valores das dimensões aferidas das sementes, sendo elas o comprimento e a largura,
que foram estatisticamente diferentes das observadas nas plantas WT, sugerindo que as
sementes das linhagens mutantes são menores que as do WT (Figura 10G e H).
Foi verificada a porcentagem de germinação em função do tempo (dias) dos genótipos
estudados em duas condições diferentes em relação à concentração de sacarose adicionada ao
meio de cultura usado como substrato para as sementes. Foi observado que no meio sem
sacarose o genótipo aac3 apresentou maior germinação (Figura suplementar 7A e B), sem
apresentar diferenças estatísticas nos parâmetros IVG, TMG e VMG (Tabela suplementar 3).
Já no meio com 1% de sacarose, não houve alteração entre as linhagens mutantes e o WT
(Figura suplementar 7C e D), sem apresentar diferenças estatísticas nos parâmetros IVG,
TMG e VMG (Tabela suplementar 3).
25
Figura 10. Parâmetros relacionados a fase reprodutiva de plantas WT e com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3. A, número total de síliquas. B, comprimento da síliqua. C, número de sementes por síliqua. D, massa de 1000 sementes. E, comprimento das sementes. F, largura das sementes. G, germinação do grão de pólen. H, comprimento do tubo polínico. Valores representam a média ± erro padrão de seis plantas. Asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem (WT).
* *
Núm
ero
tota
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0.00
100.00
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* *
* *
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60.00
H
BA
WT aac1 aac2 aac3 WT aac1 aac2 aac3
26
Também foi avaliado o crescimento radicular dos genótipos estudados em função do
tempo (dias) em três condições diferentes em relação à concentração de sacarose adicionada
ao meio de cultura usado como substrato para as sementes. Na condição sem sacarose, não
houve diferenças estatísticas entre os mutantes e o WT, mas houve um leve aumento no
comprimento das raízes dos genótipos mutantes (Figura suplementar 8A e B). Não houve
alterações no crescimento radicular na condição com 0% se sacarose (Figura suplementar 8C
e D). No meio com 2% se sacarose também não houve alterações significativas, porém
observa-se tendência de menor crescimento radicular entre os mutantes em comparação com o
WT (Figura suplementar 8D e E).
27
4 - DISCUSSÃO
Os resultados das análises qRT-PCR indicam que o gene AAC1 é a isoforma dominante
entres os AACs em A. thaliana, independente do tecido e estágio do desenvolvimento. Essa
observação é consistente com os dados de expressão gênica publicamente disponíveis (Winter
et al., 2007) (Figura Suplementar 2). Como já caracterizado em outros estudos, AAC1 é a
mais abundante das proteínas transportadoras mitocondriais, apresentando mais de 300 ESTs,
três vezes o número do Transportador de Fosfato 1 (do inglês Phosphate Carrier 1 [PiC1 ;
At5g14040]), o segundo membro mais abundante registrado (Millar and Heazlewood, 2003;
Picault et al., 2004; Haferkamp, 2007). Portanto, pode-se sugerir que o transportador AAC1
cumpre a função principal na transferência de energia das mitocôndrias para o citosol em A.
thaliana (Haferkamp, 2007) e talvez por esse motivo, no presente trabalho, não foi possível
isolar um mutante knockout capaz de se desenvolver até a fase reprodutiva.
Os genes AAC2 e AAC3 apresentam níveis de expressão consideravelmente inferiores
aos do AAC1, com picos de expressão em tecidos relacionados à fase reprodutiva como
encontrados nas flores, pólen e síliquas, corroborando com Haferkamp (2007) e com os dados
de expressão (Figuras suplementares 3 e 4, respectivamente). Ainda que não tenha o nível de
expressão comparado ao gene AAC1, o AAC2 também está entre os 11 transportadores
mitocondriais que apresentam pelo menos 10 ESTs (do inglês: Expressed Sequence Tag)
sendo, portanto, um dos transportadores MCFs mais expressos (Picault et al., 2004). Essa
variação no padrão de expressão entre órgãos e estágios do desenvolvimento sugere que esses
transportadores exerçam o papel fisiológico de forma não redundante.
Teoricamente, a diminuição na expressão dos transportadores AACs, ao reduzir a
quantidade destes transportadores, contribui para uma menor capacidade de distribuição do
ATP da matriz mitocondrial para o citosol. Dessa forma o processo pelo qual o ATP é
exportado da mitocôndria para o citossol e o ADP é importado para a matriz mitocondrial
ocorre em menores proporções limitando a atividade da ATP Sintase. O turnover de adenilato
limita a via respiratória, em função da restrição no fornecimento de adenilatos (O‟Leary and
Plaxton, 2017; O‟Leary et al., 2018). Quando ocorre de forma lenta, pode acarretar em
alterações no steady-state energético (Geigenberger et al., 2010), contribuindo assim para a
redução da cadeia transportadora de elétrons da mitocôndria (mCTE). Essa redução da mCTE
promove aumento no poder redutor da organela, que quando não regenerado à sua forma
oxidada, pode comprometer o balaço redox no compartimento. Considerando que,
28
principalmente durante o dia, a mitocôndria esta envolvida com a dissipação de redutores
provenientes de outros processos metabólicos como fotossíntese e fotorrespiração (Scheibe
and Dietz, 2012; Liang et al., 2015; Selinski and Scheibe, 2018), o turnover reduzido dos
adenilatos pode contribuir para uma sobrecarga na atividade mitocondrial e um
comprometimento dela no período luminoso (Zhang et al., 2012; Liang et al., 2015). Assim, a
hipótese em que a baixa expressão dos transportadores AACs acarreta no aumento do poder
redutor celular no período luminoso, pode ser corroborada com os resultados apresentados na
Figura 7, onde a razão NADPH/NADP+ é maior nas linhagens aac2 e aac3, e NADH/NAD+ é
maior em aac1.
Considerando a menor capacidade de distribuição do ATP/ADP como um fator que
promove o estresse oxidativo no sistema, pode-se sugerir que a proteína AAC2 tenha um
importante papel na distribuição de energia no estresse, uma vez que o gene é up-regulado
nessa condição (Fonseca-pereira et al., 2018). O transportador AAC2 também é caracterizado
por apresentar menor afinidade aos substratos ATP/ADP e maiores valores de Vmáx,
comparado ao transportador AAC1 (Haferkamp et al., 2002). Assim o AAC2 pode agir como
transportador de menor afinidade, que é requerido em situação de maior razão ATP/ADP na
matriz mitocondrial. Sendo assim, pode-se inferir que o transportador AAC2 atue na
complementação da atividade do AAC1 quando há excesso de energia na mitocôndria. No
caso da ausência desse transportador, a alta razão ATP/ADP na matriz mitocondrial não seria
redistribuída de forma dinâmica, sendo necessário que os outros transportadores de adenilatos
compensassem essa função, com o propósito de evitar alteração no steady-state energético
celular. Essa hipótese justifica o aumento significativo encontrado na expressão, tanto dos
transportadores de adenilato mitocondriais, como nos não-mitocondriais na linhagem aac2,
favorecendo assim a exportação de ATP da mitocôndria e a importação dessa molécula em
outras organelas, respectivamente, contribuindo para um turnover dinâmico de adenilatos.
Apesar de constatada baixa expressão dos genes AAC1, AAC2 e AAC3 nas linhas
mutantes isoladas, a diminuição da expressão dos transportadores AACs na mitocôndria não
teve efeito letal nos mutantes para nenhuma das isoformas. Isso pode ser explicado pelo fato
de existirem as outras isoformas AACs na ausência a isoformas suprimida, bem como a
existência de outros transportadores de adenilato na mitocôndria que podem assumir o papel
da isoformas suprimida, compensando a falta do transportador. Em T. brucei, por exemplo,
proteinas APC‟s demonstraram compensar o transporte de adenilatos em baixa expressão do
gene AAC (Stael et al., 2011; Peña-Diaz et al., 2012).
29
Ainda que o efeito da baixa da expressão das proteínas AACs favoreça o estresse
oxidativo do sistema, não houve alteração nos parâmetros de trocas gasosas sugerindo que a
eficiência fotossintética não foi afetada pela redução na expressão individual de
transportadores AACs. Uma possível explicação para esse resultado são os diversos
mecanismos de regeneração dos aceptores de elétrons essenciais na fase fotoquímica. Dentre
esses mecanismos, existe a migração do excesso do poder redutor proveniente dos
cloroplastos para a mitocôndria via “lançadeiras de malato” durante o período luminoso. O
malato proveniente dos plastídios pode ser importado pela mitocôndria e oxidado a
oxaloacetato, gerando NADH nesse processo e contribuindo para o aumento de poder redutor
no compartimento (Noguchi and Yoshida, 2008; Scheibe and Dietz, 2012; O‟Leary et al.,
2018; Selinski and Scheibe, 2018). Esses mecanismos constituem uma vantagem fundamental
em termos de flexibilidade metabólica em situações em que a oferta de poder redutor é maior
que a demanda para seu uso (O‟Leary et al., 2018). No presente estudo, as linhagens mutantes
apresentaram tendência de acúmulo de malato durante o período luminoso, que pode ser
resultante da dissipação energética a partir do malato, acompanhado pela possível baixa taxa
de consumo desse metabólito pela mitocôndria, uma vez que o efeito da redução das proteínas
transportadoras AACs possivelmente favorece um desbalanço redox na organela e
consequentemente uma sobrecarga na atividade mitocondrial.
Não foi possível verificar alterações nos parâmetros de crescimento entre os mutantes e
o tipo selvagem. No entanto, foi observada maior respiração noturna entre os mutantes.
Considerando que a respiração noturna é responsável por grande parte do fornecimento de
esqueleto de carbono e alta produção energética, essa via metabólica possibilita atender as
demanda necessárias nos processos de manutenção, resultando em altas taxas de crescimento
dos tecidos (Ainsworth and Long, 2005; Markelz et al., 2014). Assim, pode-se inferir que
maiores taxas respiratórias entre os mutantes durante a noite pode compensar o crescimento
vegetativo e outras demandas, possivelmente comprometido durante o período luminoso,
acarretando na similaridade fenotípica entre os mutantes AACs e o WT. Além disso, visto que
as plantas mutantes tendem a apresentar estresse oxidativo, complexos proteicos
desacopladores de energia podem estar sendo regulados positivamente e estarem atuando na
membrana interna da mitocôndria, desvinculando a alta taxa respiratória da produção
energética (Vishwakarma et al., 2015). Esse mecanismo pode ser realizado através da
atividade da Oxidase Alternativa (AOX) que reduz o O2 à H2O com menor bombeamento de
30
prótons para o espaço intermembrana da mitocôndria, contribuindo assim para um redução na
produção de ATP via processo respiratório (Vishwakarma et al., 2015).
Nas avaliações metabólicas, foi possível constatar padrões na flutuação das
concentrações dos compostos quantificados mediante aos cinco pontos de coleta, deixando
evidente diferentes comportamentos do metabolismo durante o período luminoso e o escuro.
Com o propósito de confirmar os padrões e intensificar os fenótipos observados, foi realizado
o experimento onde as plantas mutantes e WT foram submetidas sob condições independentes
de luz contínua e pleno escuro. Os resultados foram condizentes com os obtidos previamente
no experimento sob condições normais.
Quanto aos compostos relacionados ao nitrogênio, verificou-se uma alta concentração
de nitrato ao meio dia para os mutantes das três isoformas de AACs em relação ao WT. Esse
excesso de nitrato foi consumido ao longo do dia, concomitantemente com aumentos
significativos na quantidade de aminoácidos e proteínas, inferindo que esse nitrato foi
utilizado para a síntese dessas outras moléculas. Durante o dia, o poder redutor fornecido pela
fotossíntese e fotorrespiração às mitocôndrias pode substituir a necessidade de formação de
redutores através do ciclo TCA, tornando-o principal fornecedor de esqueleto de carbono para
síntese de outras moléculas (Sweetlove et al., 2010; Tcherkez et al., 2012). Considerando que
os mutantes AACs tenderam a possuir maior poder redutor, essa condição possibilita que o
ciclo TCA atenda demandas ainda maiores de esqueleto de carbono para vias de biossíntese
aminoácidos e proteínas (Noguchi and Yoshida, 2008; Liang et al., 2015; O‟Leary et al.,
2018), o que corrobora com as altas concentrações desses compostos observadas nas plantas
mutantes AACs.
Além do metabolismo do nitrogênio, alterações foram observadas nos níveis de
compostos associados ao metabolismo do carbono. Os mutantes com baixa expressão para os
transportadores AACs, principalmente o aac2, apresentaram maiores concentrações de
carboidratos não-estruturais ao final do período de luz, principalmente da sacarose. Esse
resultado sugere que esse açúcar pode ter sido consumindo em menor quantidade ou
sintetizado em maior quantidade, ou ainda que ambos os processos estivesses acontecendo
durante o período luminoso. Dentre os fatores que podem acarretar na diminuição respiração
diurna, vale destacar a regulação pós-traducional de enzimas importantes da respiração. O
Complexo Piruvato Desidrogenase (PDC) (Tovar-Méndez et al., 2003) e Glicose-6-fosfato
Desidrogenase plastidial (Wenderoth et al., 1997), por exemplo, podem ser inibidas pela luz e
31
pelo aumento de poder redutor sendo esses, portanto, fatores importantes no processo
respiratório. Considerando que o possível aumento da razão ATP/ADP pode inibir a mCTE e
gerar acúmulo de redutores na matriz mitocondrial em plantas com baixa expressão dos AAC,
essas enzimas podem ter sido inibidas, acarretando no aumento da concentração de
substrato/intermediários das reações da via respiratória, fazendo com que a sacarose não
estivesse sendo consumida na mesma velocidade como em condições normais, favorecendo
seu acúmulo (O‟Leary et al., 2018). Além dessa regulação, diversos produtos da respiração,
quando acumulados, tem a capacidade inibir enzimas da glicólise e do ciclo TCA (O‟Leary
and Plaxton, 2017; O‟Leary et al., 2018), contribuindo para também para o consumo mais
lento da sacarose e outros intermediários metabólicos utilizados na respiração, como malato,
fumarato, glicose e frutose, que também tenderam a acumular em maior quantidade nos
mutantes avaliados. Esses resultados corroboram a hipótese que, durante o dia, a respiração é
dificultada em função da baixa expressão dos transportadores AACs.
Por outro lado, o trabalho realizado por Liang et al. (2015), com A. thaliana mutantes
que exibiam altos níveis energéticos na forma de ATP, no cloroplasto durante o dia, e na
mitocôndria durante a noite, demonstraram maiores concentrações de sacarose durante o
período luminoso, dada pela maior atividade da sacarose fosfato sintase (SPS) promovida
pelo excesso de ATP. Essa possibilidade pode ser sustentada para o presente trabalho
considerando que o estresse oxidativo pode estimular a expressão dos transportadores de
adenilato da célula, contribuindo para exportação do ATP da mitocôndria, o qual pode atuar
na atividade da SPS, promovendo assim alta síntese de sacarose.
Curiosamente, ao longo do período de escuro, os açúcares acumulados durante o dia
foram catabolizados de modo que, no início do dia, as concentrações dos carboidratos não-
estruturais foram similares ou até menores que às do tipo selvagem (Figura 5 e 9). No escuro,
as condições redox da célula são mais favoráveis à homeostase, uma vez que a fase
fotoquímica da fotossíntese nem a fotorrespiração não mais contribui com poder redutor para
a mitocôndria. Além disso, no escuro as proteínas da mCTE são maximizadas, bem como a
maior capacidade de algumas enzimas do ciclo TCA, fazendo da mitocôndria a principal
fornecedora de ATP para a célula nesse período (Lee et al., 2010; Liang et al., 2015; O‟Leary
et al., 2018). Isso sugere que essa concentração extra de açúcares permitiu que mais substrato
estivesse disponível à noite, induzindo uma maior respiração noturna mitocondrial, como foi
constatado nos mutantes estudados (Figura 3H).
32
Assim, numa visão geral, os transportadores de adenilato AAC1-3 contribuem para um
fornecimento da energia para os demais compartimentos celulares, promovendo o turnover
dinâmico dos adenilatos. Essa renovação dinâmica de ATP e ADP contribui para o steady-
state celular, de modo auxiliar na manutenção do estado redox do sistema. Ainda poucas
abordagens foram realizadas para avaliar o efeito de pools alterados de adenilato nas plantas,
fazendo-se necessários experimentos mais aprofundados para auxiliar no esclarecimento desse
campo de estudo.
33
5 – CONCLUSÕES
O transportador mitocondrial de adenilato AAC1 é a isoformas é dominante entre os
AACs em A. thaliana, independente do tecido e estágio do desenvolvimento. AAC2 e o
AAC3 são expressos em baixos níveis em nos tecidos e ao longo das fases do
desenvolvimento, sendo regulados positivamente em tecidos relacionados a fase reprodutiva,
como grão de pólen, flor e síliqua. A diminuição da expressão dos genes AAC1, AAC2 e
AAC3 não tem efeito letal nos mutantes para nenhuma das isoformas, provavelmente pelo
efeito de compensação da atividade suprimida dos AACs assumido pelos outros
transportadores de adenilato existentes na mitocôndria. Nem o crescimento e nem o processo
fotossintético é compromentido nas plantas mutantes isoladas no trabalho. Porém as plantas
mutantes para as três isoformas apresentam maiores taxas de respiração noturna. Além da
respiração, o metabolismo das plantas mutantes exibem alterações nos padrões de
comporamento no período diurno e noturmo. Durante o dia ocorre aumento de poder redutor
nas formas de NADPH e NADH. Da mesma forma, ocorre acúmulo de compostos
nitrogenados e carbonados, o qual são rapidamente consumido durante a noite. Dessa forma, o
excesso de subtrato acumulado durante o dia, provavelmente impulsiona maiores taxas de
respiração durante a noite. Assim, maiores taxas respiratórias entre os mutantes durante o
escuro podem compensar o crescimento vegetativo, possivelmente comprometido durante o
período luminoso, ou ainda ser resultado de maior dissipação do excesso energético pela
AOX. Assim, os transportadores AACs promovem uma dinâmica partição de adenilatos que
contribue para sincronismo entre o metabolismo diurno e noturno, favorescendo a
manutenção do estado redox e steady-state celular.
34
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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38
7 - FIGURAS E TABELAS SUPLEMENTARES
Figura 1- Genotipagem das plantas mutantes homozigotas com inserção de T-DNA para os genes AAC1, AAC2 e AAC3. A, representação esquemática do gene AtAAC1 (At3g08580), AtAAC2 (At5g13490) e AtAAC3 (At4g28390) indicando os respectivos locais de inserção do T-DNA. As caixas pretas representam os éxons e as setas cinzas indicam as posições dos primers usados na técnica PCR para genotipagem para seleção das plantas mutantes homozigotas. B, As bandas em gel de agarose 1% correspondentes aos produtos da reação de PCR, utilizando-se primers indicados no item 2.1.
Figura suplementar 2- Análise in silico do gene AAC1 em diferentes tecidos. Fonte: Arabidopsis eFP Browser <http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi>
39
Figura suplementar 3- Análise in silico do gene AAC2 em diferentes tecidos. Fonte: Arabidopsis eFP Browser <http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi>
Figura suplementar 4- Análise in silico do gene AAC3 em diferentes tecidos. Fonte: Arabidopsis eFP Browser < http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi>
40
Figura suplementar 5. Quantificação de clorofilas em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade coletadas ao meio do dia. A, clorofila a. B, clorofila b. C, conteúdo de clorofila a + b. D, razão clorofila a/b. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas individuais e os asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem. MF: matéria fresca
0
1
2
3
4
Clo
rofi
la a
/b (
mg
g-1
MF)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Clo
rofi
la a
+b (
mg
g-1
MF)
*
* *
Clo
rofi
la a
(m
g g-
1 M
F)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Clo
rofi
la b
(m
g g-
1 M
F)
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
WT aac1
*
aac2 aac3 WT aac1 aac2 aac3
A B
C D
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Clo
rofi
la b
(m
g g-1
MF)
*
*
Clo
rofi
la a
(m
g g-1
MF)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0WTaac1aac2aac3
0
1
2
3
4
Clo
rofi
la a
+b (
mg
g-1 M
F)
A B
C D
0
1
2
3
4
Clo
rofi
la a
/b (
mg
g-1 M
F)
Controle 28 h de luz
52 h de luz
4 dias deescuro
8 dias deescuro
Controle 28 h de luz
52 h de luz
4 dias deescuro
8 dias deescuro
Horário de coleta Horário de coleta
41
Figura suplementar 6. Quantificação de clorofilas em folhas de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3, em plantas com cinco semanas de idade e posteriormente expostas a condições de 28 horas de luz contínua, 52 horas de luz continua, quatro dias de pleno escuro e oito dias de pleno escuro. As amostras foram coletadas no mesmo período do dia. A, clorofila a. B, clorofila b. C, conteúdo de clorofila a + b. D, razão clorofila a/b. Valores representam a média ± erro padrão de cinco plantas individuais e os asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem. A área branca do gráfico representa à condição controle referente à coleta realizada antes da submissão do tratamento luminoso, a amarela é referente às condições de luz contínua e a cinza é referente às condições de pleno escuro. MF: massa fresca.
Figura Suplementar 7- Germinação de sementes de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3. Percentual de germinação em meio MS com 0% (A) e 1% (C) de sacarose ao longo de três dias. Percentual de germinação em meio MS com 0% (B) e 1% (D) de sacarose ao final da avaliação. Valores representam a média ± erro padrão de dez placas, cada uma com 50 sementes por genótipo e os asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem. MS: Murashige e Skoog.
0
80
100
0
20
40
60
80
100
WTaac1aac2aac3
Ger
min
ação
a
0% d
e sa
caro
se (
%)
*
Ger
min
ação
a
0% d
e sa
caro
se (
%)
Dias
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0
20
40
60
80
100
WTaac1aac2aac3
Ger
min
ação
a
1% d
e sa
caro
se (
%)
0
80
100
Ger
min
ação
a
1% d
e sa
caro
se (
%)
A B
C D
WT aac1 aac2 aac3
42
Figura suplementar 8- Avaliação do crescimento radicular a partir de sementes de A. thaliana com expressão reduzida de AAC1, AAC2 e AAC3. Comprimento radicular avaliado num período de 13 dias com sementes cultivadas em meio MS contendo 0% (A),1% (C) e 2% (E) de sacarose. Comprimento radicular ao final do período de avaliação de sementes cultivadas em meio MS contendo 0% (B), 1% (D) e 2% (F) de sacarose. Valores representam a média ± erro padrão de oito placas, cada uma com cinco sementes por genótipo e os asteriscos indicam diferença significativa (P < 0,05), segundo o teste t de Student, em comparação com o tipo selvagem. MS: Murashige e Skoog.
Dias
Com
prim
ento
rad
icul
arco
m 0
% d
e sa
caro
se (
cm)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
WTaac1aac2aac3
Com
prim
ento
rad
icul
arco
m 1
% d
e sa
caro
se (
cm)
0
2
4
6
0
1
2
3
4
5
6
7
Com
prim
ento
rad
icul
arco
m 1
% d
e sa
caro
se (
cm)
Dias
2 4 6 8 10 12 14
0
2
4
6
8
Com
prim
ento
rad
icul
arco
m 2
% d
e sa
caro
se (
cm)
0
2
4
6
8
Com
prim
ento
rad
icul
arco
m 2
% d
e sa
caro
se (
cm)
C D
E F
WT aac1 aac2 aac3
Com
prim
ento
rad
icul
arco
m 0
% d
e sa
caro
se (
cm)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
A B
WTaac1aac2aac3
WTaac1aac2aac3
43
Tabela Suplementar 1- Primers utilizados nas análises de RT-PCR realizadas neste estudo
Gene Locus Forward primer Reverse primer
AAC1 At3g08580 5‟-CTCCTCACTGGTGACTTACAGGAC-3‟ 5‟-TTGTACTTGACAGCTTCACCAGAC-3‟
AAC2 At5g13490 5‟- CTCATTTCTTCTTCTTCGCTCA-3‟ 5‟- AGCTCAAGAGTTGGCCAGAA-3‟
AAC3 At4g28390 5‟- GTGTTGGGTAAGAAGTATGGCT-3‟ 5‟- AGAACTAAGACAAAGGGCCACA-3‟
APC1 At5g61810 5'-GGAGCCAGGTCCTTTGATACAAC-3' 5'-TCAGAAACTCTTGGCCCATGC-3'
APC3 At5g07320 5'-CGAGATGGGCGTGTTGATTACC-3' 5'-AATGCCGGCCTTAACAAGAGC-3'
ADNT1 At4g01100 5'-TGGAAGGCTAACTGTCCAGACC-3' 5'-TGGAAGCCAACCACGGTACAAG-3'
NTT1 At1g80300 5'-TGTGTATGTCGGTGCCCTTCAG-3' 5'-GCAGCTTTGCCTTTAACCTTGG-3'
NTT2 At1g15500 5'-TACTCGCAGCAGTGTACGTTGG-3' 5'-GCAGCTTTGCCTTTAACCTTGG-3'
ATBT1 At4g32400 5'-CTCGCCTTACAATTCAGAGAGGTG-3' 5'-AGAGTTCTGTGGGTCCTTCCTC-3'
PNC1 At3g05290 5'-ATCCAGCAATCAGGTGCAAGG-3' 5'-TTCTCCATATGGCATACACAACCC-3'
PNC2 At5g27520 5'-TCTCTGCCTTTATGGCGTTTGTG-3' 5'-GCTTGAATCATAACCTTGCACCTG-3'
ER-ANT1 At5g17400 5'-TGGAGAGGAAACCAAGCCAATGTC-3' 5'-TGCAAAGTTGGAAGCCTGTGTAGG-3'
ACT At2g37620 5'-CTTGCACCAAGCAGCATGAA -3' 5'-CCGATCCAGACACTGTACTTCCTT-3'
AAC1: ADP/ATP carrier 1, AAC2: ADP/ATP carrier 2, AAC3: ADP/ATP carrier 3, APC1: Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 1, APC3: Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 3, ADNT1: Adenine Nucleotide Transporter 1, NTT1: nucleotide transporter 1, NTT2: nucleotide transporter 2, ATBT1: Arabidopsis Brittle 1, PCN1: Peroxisomal adenine nucleotide carrier 1, PCN2: Peroxisomal adenine nucleotide carrier 2, ER-ANT1: Endoplasmic Reticulum Adenylate Transporter1, ACT: Actin.
44
Tabela Suplementar 2- Similaridade (em porcentagem) entre sequências de aminoácidos deduzidos de todas as proteínas transportadoras de adenilatos contidas na célula vegetal, até então descritas em Arabidopsis thaliana.
(%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 -AAC1 100,00
2 -AAC2 86,53 100,00
3 -AAC3 74,94 74,62 100,00
4 -APC1 27,30 27,05 28,25 100,00
5 -APC2 29,54 28,32 29,29 67,62 100,00
6 -APC3 26,84 27,21 27,78 80,83 74,33 100,00
7 -ADNT1 26,54 26,89 27,71 36,31 34,58 35,49 100,00
8 -NTT1 - - - - - - 47,37* 100,00
9 -NTT2 - - - - - - 47,37* 89,42 100,00
10 -TAAC/PAPST1 30,00 29,39 31,43 30,22 36,69 30,97 31,73 - - 100,00 11 -ATBT1 28,72 27,30 29,89 35,02 32,85 35,14 34,47 - - 33,45 100,00
12 -PNC1 23,23 22,64 22,52 24,91 26,53 23,37 22,73 - - 27,81 22,07 100,00 13 -PNC2 24,24 22,97 22,90 24,05 24,57 24,05 25,74 - - 24,08 21,62 86,73 100,00
14 -ER-ANT1 61,77 61,09 63,79 28,21 28,62 26,64 28,66 - - 30,79 28,09 24,88 25,56 100,00 15 -PM-ANT1 40,40 39,40 39,27 30,26 25,48 27,39 30,47 35,48* 26,56* 28,00 25,68 20,58 21,41 37,25 100,00
AAC1 (AT3G08580): ADP/ATP carrier 1, AAC2 (AT5G13490): ADP/ATP carrier 2, AAC3 (At4g28390): ADP/ATP carrier 3, APC1 (At5g61810) : Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 1, APC2 (At5g51050): Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 2, APC3 (At5g07320): Adenine nucleotide/Phosphate Carrier 3, ADNT1(At4g01100): Adenine Nucleotide Transporter 1, NTT1(At1g80300): nucleotide transporter 1, NTT2 (At1g15500): nucleotide transporter 2, TAAC/PAPST1 (At5g01500): PAPS/PAP carrier in plastids and an ATP/ADP carrier in the thylakoid membrane, ATBT1(At4g32400): Arabidopsis Brittle 1 PCN1 (At3g05290): Peroxisomal adenine nucleotide carrier 1, PCN2 (At5g27520): Peroxisomal adenine nucleotide carrier 2, ER-ANT1(At5g17400): Endoplasmic Reticulum Adenylate Transporter1, PM-ANT1(At5g56450): Plasma Membrane Adenylate Transporter. O símbolo „*‟ representa similaridades com valor de cobertura menor que 20. O símbolo „-„ representa similaridade não detectada.
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Tabela suplementar 3. Parâmetros relacionados à avaliação da germinação de plantas de A. thaliana com baixa expressão dos genes AAC1, AAC2 e AAC3 em meio MS contendo 0% e 1% de sacarose. As avaliações foram realizadas num período de três dias, a contar posteriormente ao período de estratificação, onde as sementes foram submetidas ao escuro numa temperatura de 4°C durante três dias
0% sacarose
PARÂMETROS WT aac1 aac2 aac3
IVG 46,58 ± 1,44 46,6 ± 2,00 45,76 ± 0,81 43,87 ± 1,67
TMG 0,94 ± 0,03 0,93 ± 0,04 0,92 ± 0,01 0,87 ± 0,03
VMG 1,07 ± 0,04 1,08 ± 0,05 1,09 ± 0,02 1,15 ± 0,05
1% sacarose
PARÂMETROS WT aac1 aac2 aac3
IVG 50,02 ± 1,15 49,84 ± 1,19 47,33 ± 1,45 49,20 ± 1,95
TMG 1,00 ± 0,02 1,00 ± 0,03 0,94 ± 0,02 0,99 ± 0,03
VMG 0,99 ± 0,03 0,99 ± 0,04 1,05 ± 0,03 1,01 ± 0,05
Os valores representam a média ± erro padrão de oito placas independentes contendo 50 sementes de cada genótipo; valores em negrito apresentam diferenças significativas pelo teste t de Student (P < 0,05) em comparação com o tipo selvagem (WT). Abreviações: *IVG: índice de velocidade de germinação (adimensional). TMG: tempo médio de germinação (dias). VMG: velocidade média de germinação (-dias). MS: Murashige e Skoog.