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Replicación del ADN y la Metódica
del PCR Curso de Biología Molecular y Genómica,
Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM),
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Dr. Juan Venegas Hermosilla, PhD.
Programa de Biología Celular y Molecular
ICBM, Fac. de Medicina, U. de Chile.
Enero, 2018
Lógica y estructura de la clase
PARA PODER ENTENDER EN QUE CONSISTE LA REPLICACIÓN DEL
ADN, PRIMERO DEBEMOS CONOCER LAS BASES QUÍMICAS DE
LAS MOLECULAS QUE PARTICIPAN EN ESTE FENÓMENO
BIOLOGICO COMPLEJO.
DE TAL MANERA QUE… LA ESTRUCTURA QUE TENDRA ESTA
CLASE …
Estructura de la clase
1. Propiedades Químicas y Físicas del
ácido desoxirribonucleico ADN o DNA
2. Replicación
3. Mutaciones
4. El método de “replicación en cadena de
la polimerasa” o polymerase chain reaction
(PCR).
1. Propiedades Químicas y Físicas del
ácido desoxirribonucleico ADN o DNA
1.1. Características de los monómeros que
constituyen el ADN o DNA: los
desoxiribonucleótidos
Están constituidos por tres
componentes o tipos de moléculas:
a) Una base nitrogenada
b) Un azúcar, la desoxiribosa y
c) Un grupo fosfato,
tal como se muestra en la
próxima diapositiva…
Características del monómero del DNA: los
desoxiribonucleótidos
Figura (Fig.) 1.
Dependiendo del número de fosfatos,
los desoxiribonucleótidos pueden ser:
Mono, di o trifosfatos, tal como se ve en la figura:
Figura 2.
Puede tener 4 bases nitrogenadas
distintas Constituidas por dos tipos:
a) PIRIMIDICAS (de un solo anillo) y
b) PÚRICAS (de dos anillos), tal como se muestra en la fig.
Figura 3.
Importante
destacar que las
bases
nitrogenadas ya
habían sido
descritas en 1910
por Phoebus
Levene unidas a
azúcar y un
fosfato.
De las bases nitrogenadas depende la
interacción específica entre dos hebras de
DNA complementarias
-Asi, la timina interactúa específicamente con la adenina (T – A) a
través de dos puentes de hidrógeno y la
-Citosina interactúa específicamente con la guanina(C – G), a través
de tres puentes de hidrógeno
Fig. 4.
Las bases nitrogenadas al ser
anillos aromáticos, absorben luz
ultravioleta en un rango de longitud
de onda de 180 -300 nm Esta característica permite
detectar y cuantificar los
ácidos nucleícos (DNA o
RNA) mediante un
ESPECTROFOTOMETRO y
Evaluar su grado de
desnaturalización
(separación de sus hebras
Complementarias).
Fig. 5.
Características del azúcar a) Es un azúcar cíclico de 5 carbonos, por lo
cual se denomina como PENTOSA
b) En el carbono dos prima (2´, para
diferenciarlo del carbono 2 de la base
nitrogenada), tiene un HIDRÓGENO (H)
en vez de un HIDROXILO (HO-), es decir
dicho carbono está reducido o
“DESOXIDADO”, por eso este azúcar se
denomina como “DESOXIRIBOSA” o más
específicamente “2´-DESOXIRIBOSA”.
c) Se une a la base nitrogenada vía su
carbono 1´ y mediante un enlace “N-
glicocídico (unión carbono- nitrógeno).
d) Posee un extremo 3´-HO vía el cual se
unirá con otro desoxirribonucleótido
cuando ocurra la síntesis de DNA.
e) El carbono 5´ se une al grupo
Fosfato.
Fig. 6.
1.2. Características de la estructura de la doble hélice
de ADN descrita por James Watson y Francis Crick
en 1953, en base a los espectros de difracción de rayos
X obtenidos por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins
en 1951.
La estructura de la molécula doble hebra fue descrita y
publicada en 1953 por James Watson y Francis Crick basados
en los espectros de difracción de rayos X obtenidos por
Rosalind Franklin y Maurice Wilkins en 1951 (Conferencia de
Npoles). En la foto de arriba aparece Watson (izquierda) y Crick
(derecha) describiendo la estructura en doble hélice de la
molécula de ADN como una especie de escalera de caracol con
muchos escalones. En 1962 Watson, Crick y Wilkins recibieron
el Premio Nobel de Medicina por su trabajo. Rosalind había
fallecido en 1958.
Fig. 7.
Rosalind Franklin
(1920 -1958)
Publicada el 25
de abril de
1953, en Nature
U. De Cambridge King´s College
1.2.1. Características del enlace covalente entre dos desoxirribonucleótidos, el enlace
fosfodiester
• LA UNIÓN DE DOS DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS SE REALIZA VÍA UN ENLACE FOSFODIESTER en el cual esta involucrado el oxígeno del carbono 3´ de la desoxirribosa de un dNMP, con el oxígeno del carbono 5´ del siguiente dNMP, unidos vía un grupo fosfato. Tal como se ve en la fig. 3.
• Este hecho da origen a una molécula POLAR. Es decir, que tiene un determinado SENTIDO, caracterizado por un extremo 5´ y un extremo 3´.
Fig. 8.
Hebra de DNA 5´-ATG-3´
o simplemente ATG
1.2.2. La molécula de ADN estaba
formada por dos hebras
ANTIPARALELAS.
Eso quiere decir que una de las hebras estaba en el sentido 5´- 3´ y
la otra en el sentido inverso, tal como se muestra en la Figura.
Fig. 9
En la descripción de
Watson y Crick esta fue una
idea clave de su modelo,
pues otros científicos, como
Linus Pauling y otros,
pensaban que podrían ser
tres hebras en una
estructura helicoidal.
1.2.3. Entre las hebras antiparalelas del ADN doble
hebra, hay COMPLEMENTARIDAD DE BASES
NITROGENADAS, (Fig.10).
- Eso implica que: siempre cuando en una hebra había una timina (T) en la otra hebra
había una adenina (A), y vise-versa.
- En cambio, cuando en una hebra había una citosina (C), en la otra había una guanina
(G).
- Este hecho, estaba en concordancia con el modelo de Erwin Chargaff, postulado en
1947, en el cual había demostrado que el porcentaje de T era igual al de A, y el de G al
de C.
-Además, la unión de una T con un A era a través de DOS puentes hidrógenos, en
cambio, la unión de una C con una A, era a través de TRES puente hidrógenos. ¿en
que afecta esto la estabilidad de la doble hélice?.
1.2.4. El fenómeno de la “desnaturalización” o
“denaturación” de la doble hebra de DNA
(separación de las hebras complementarias),
depende del porcentaje de citosina (C ) y guanina
(G) que contenga la molécula
-La temperatura Intermedia
entre el DNA no-desnaturalizado
y el completamente
desnaturalizado se denomina tm,
del inglés “melting
temperature”.
- A mayor % de C-G mayor tm
Fig. 11.
1.2.5. El esqueleto de azúcar-fosfato helicoidal.
Fig. 12
En cambio,
las bases
nitrogenadas
quedan hacia
adentro
formando
especie de
escalones
En la doble hélice los enlaces fosfodiester
forman un esqueleto de azúcar-fosfato
helicoidal, que queda hacia el exterior de la
molécula.
La forma A corresponde a la estructura de DNA cristalizada no-hidratada y la forma B a la
hidratada. Los espectros de difracción de rayos X de ambas formas, fueron obtenidos por
Franklin en 1951.
Aunque la mayor parte del genoma tiene estructura B, zonas ricas en bases G-C, pueden
adoptar la conformación Z. Estas distintas estructuras del DNA afecta la unión de proteínas
que interactúan con él y por ende sus funciones, tal como la regulación de la expresión génica
1.2.6. Diferentes conformaciones de la
estructura del DNA doble hebra: las estructuras A, B y
Z. La forma B fue la descrita por Watson y Crick en 1953, que
correspondía a la molécula hidratada.
De la información anterior:
¿Qué se podría inferir con respecto a como
podría ser la duplicación o replicación de
esta molécula?
-La COMPLEMENTARIDAD de bases nitrogenadas sugería que
una hebra podía ser el MOLDE O MATRIZ de la otra (Fig. 10).
2. Replicación del DNA
2.1. Hebra molde (templado, matriz o
parental) y hebra hija
Fig. 13. La doble hélice de Watson y Crick, sugería que la molécula de DNA
que surgía de la duplicación (la nueva doble hélice) estaba constituida por una
hebra parental (antigua) que serviría de MOLDE (templado o matriz) para la
síntesis de una hebra hija complementaria (nueva). Esto sugería que la
duplicación del DNA era SEMICONSERVATIVA.
Los científicos que demostraron que efectivamente era así, fueron Meselson y
Stahl.
2.2. Experimento de Meselson y Stahl (1957). a) Realizó cultivos de bacterias por
varias generaciones en presencia del
isótopo pesado 15N. De esta manera
se aseguró que todo el DNA de las
bacterias quedara marcado con 15N.
Aisló el DNA y lo centrifugo. Todo el
DNA sedimenta cerca del fondo del
tubo, DNA pesado (15N- 15N).
b) Posteriormente, trasladó las bacterias
a un medio de cultivo con 14N, dejó que
se originara una primera generación de
ellas. Encontró que el DNA sedimentaba
en una zona intermedia, lo que
correspondió a DNA híbrido (15N- 14N).
c) En una segunda generación de
estas bacterias, encontró dos
zonas donde sedimento el DNA,
correspondiente a DNA liviano
(14N- 14N) e híbrido. . d) Finalmente, en un tercer ciclo de replicación de DNA, se
obtienen mayor número de DNA liviano que de híbrido.
Fig. 14
Con el experimento de Meselson y Stahl, se
demostró que la replicación era semi-
conservativa, pero surgía una nueva
pregunta:
• ¿En que dirección o sentido se realizaba
la síntesis de las hebras hijas?.
2.3. ¿Cuál seria entonces el sentido
(dirección) de la síntesis de la hebra
hija?.
• La respuesta a esta pregunta vino de los estudios de Reiji Okazaki (1960), analizando mediante microscopía electrónica la replicación del DNA cromosomal de la bacteria Escherichia coli, en el cual uno de los 4 dNTPs (como sustrato de la síntesis de DNA) era dTTP marcado con el isótopo tritium (13H).
• Con estos estudios él demostró que la síntesis de las hebras hijas era en el sentido 5´- 3´, que además, una de las hebras se sintetizaba en forma discontinua (a los que posteriormente se le llamaron “Fragmentos de Okazaki) y la otra en forma continua.
• Es decir, que la replicación del DNA es también
• SEMI-DISCONTINUA.
2.4. Resultados de los estudios de Okazaki:
replicación SEMIDISCONTINUA
• Esto implica que hay una hebra “líder” (continua) y una hebra retrasada (discontinua).
• De este modelo surge el concepto de “horquilla de replicación” = vértice donde se va abriendo la doble hélice.
• Nótese que la dirección del avance de la horquilla no es igual a la dirección de la síntesis de la hebra retrasada.
Fig. 15
Sin embargo, todavía quedaban mas
preguntas por contestar, entre ellas:
• 2.5. ¿Dónde se iniciaba la replicación del DNA, en sitios
al azar o en algún sitio especifico?
• 2.6. Si se iniciaba en un sitio especifico u ORIGEN DE
REPLICACION: ¿ esta seria en una sola dirección
(unidireccional) o ambas direcciones (bidireccional) ?.
Experimentos de John Cairns mediante microscopia electrónica
con timidina tritiada.
Comienza en un origen y es usualmente bidireccional:
Este experimento confirmó además que la síntesis de ambas hebras era
simultánea y que se generaba una estructura que sería llamada “BURBUJA
DE REPLICACIÓN”.
Lehninger, pag. 951, IV Ed. 2005 Fig. 16
2.5. Origen y 2.6. Sentido (o dirección) de la
replicación del DNA.
En rojo se
indica la
presencia de
la timidina
tritiada, a
distintos
tiempos del
comienzo de
la
replicación.
2.7. La burbuja de replicación
• Los resultados de los experimentos anteriores indican que en la replicación del DNA se produce una estructura que se llama “burbuja de replicación” (ver Fig. 17 anexa).
• En esta estructura hay dos horquillas de replicación, que avanzan en sentidos opuestos.
La burbuja de replicación: avance
bidireccional de las orquillas.
Fig. 17.
Resumiendo hasta aquí: las
características generales de la
replicación del DNA (doble hélice)
son: - Es semi-conservativa
- La síntesis de las hebras hijas es en el
sentido (“dirección”) 5´-3´.
- Es semi-discontinua
- Comienza en un sitio especifico (origen) y
- Es usualmente bidireccional
3. Bases moleculares de la
replicación del DNA
3.1. Estudios realizados en la bacteria
Escherichia coli (Arthur Kornberg).
Secuenciado completamente en 1997 (Science 277 (5331) :1453-1462), cepa K-12, tiene una longitud de 4.639.221 pares de bases (pb) o 4,6 Mb y codificaría para 4288 proteínas.
Fig. 18.
3.1.1. DNA cromosomal de la
E.coli: doble hebra circular
cerrado.
3.1.2. Características del origen de
replicación u oriC.
Fig. 19.
- HU y IHF = proteínas tipo histona que ayudan a la unión de la
proteína DnaA a la doble hebra en el oriC.
3.1.3. Primera etapa de
la replicación:
formación de un
complejo de pre-
elongación
Ocurre en tres eventos
con gasto de ATP:
1.- Unión de proteínas tipo histonas
(HU, IHF) al OriC y abertura del
segmento de tres repeticiones con
DnaA.
2.- Unión de la Helicasa DnaB con
ayuda de la DnaC, a cada hebra.
3.- Unión de la Primasa DnaG y
proteínas SSB con salida de DnaA. Fig. 20.
3.1.3.4. Unión de una TOPOISOMERASA al Complejo
de pre-elongación.
Se requiere para relajar la tensión producida por la
abertura de la doble hélice que se producirá por el avance
de las horquillas de replicación en la etapa de elongación.
Fig. 21.
Fig. 22.
Fig. 23.
3.1.4. Segunda etapa de la replicación:
La elongación. Comienza con la síntesis de los RNA partidores
(“primers” o cebadores) por la Primasa.
Fig. 24.
Elongación de los partidores por la DNA
polimerasa III de E. coli, tanto en la hebra líder
como en la hebra retrasada.
Fig. 25.
3.1.5. Características de las enzimas que
realizan la síntesis de DNA durante la
replicación: Las DNA Polimerasas (DNA pol).
3.1.5.1. Requerimientos para su reacción:
a) Requieren una hebra de DNA molde
(templado o matriz).
b) Necesitan un partidor, cebador ó “primer”.
c) Utilizan un desoxirribonucleótido trifosfato (d-ATP, d-
GTP, d-CTP y d-TTP
d) Polimerizan en sentido 5’ a 3’,
adicionando nucleótidos al extremo 3’
libre.
3.1.5. 2. Reacción catalizada por
todas las DNA polimerasa
Fig. 26.
3.1.5.3. Actividad correctora exo 3´-5´.
Llamada inicialmente como “Edición” (del inglés “editing”),
termino con que el ahora se denomina otro proceso
molecular.
Fig. 27. Fig. 28.
Es importante mencionar que todas las DNA pol.
de E. coli realizan este mecanismo
3.1.5.4. Las tres DNA pol. de E. coli
3.1.5.5. Estructura general de las DNA
polimerasas: forma de una mano derecha
(modelo de la pol I de E. coli)
Fig. 29.
3.1.5.6. La DNA polimerasa III de E.
coli. Enzima que participa en la replicación del DNA
cromosomal de esta bacteria.
La enzima completa (holoenzima), está constituida por 17
subunidades: 10 de ellas diferentes (a-y)
Estructura de la holoenzima de la DNA polimerasa III de E.
coli
Fig. 30.
Fig. 31.
El dímero de la pol III forma una especie de
“anillo” entorno al DNA (corte transversal).
El dímero de la pol III forma una especie de
“anillo” entorno al DNA (representación
volumétrica).
Fig. 32.
3.1.6. Secuencia de eventos que ocurren
durante el avance la horquilla de
replicación:
Fig. 33.
Dímero de la pol III cuando esta sintetizando
simultáneamente la hebra líder y la hebra
retrazada.
Fig. 34.
3.1.7. Tercera etapa de la replicación:
remoción de los partidores y ligamiento de los
fragmentos de Okazaki.
Fig. 35.
3.1.8. Cuarta etapa de la replicación: Separación de
los dos DNA duplex replicados por la topoisomerasa
IV.
Fig. 36.
3.2. Diferencias principales en la
Replicación de procariontes y eucariontes
EVENTO PROCARIONTES EUCARIONTES
Inicio de la replicación
Origen de replicación Un único oriC Múltiples en cada
cromosoma
Secuencia de consenso del
oriC
Si Poco conocido
Actividad primasa Por una enzima
individual (dnaG)
Actividad Incorporada en
la pol a
Elongación
DNA pol replicadora Homodímero de pol III Heterodimeros
constituidos por pol d y
pol e
Factor de replicación C ausente Cambia pol a por pol d o
pol e
Antígeno nuclear de
proliferación (PCNA)
Ausente Aumenta procesibidad de
pol d y pol e
Factores de ensamblado de la
cromatina
Ausente Acetilasas y desacetilasas
de histonas
Terminación
Eliminación de los RNA
cebadores
Pol I RNAasa H1 y
endonucleasa flap 1
Elongación de extremos 5´ de
los teloneros
Ausente Telomerasa
III. Mutaciones
- En términos generales: mutación es todo cambio que ocurre en la
secuencia del DNA
-Inicialmente, como todos los genomas conocidos eran de DNA, el concepto se
aplico sólo a esta molécula.
-Sin embargo, como posteriormente quedó en evidencia que también existían
organismo (los virus) cuyo genoma era de RNA, hoy en día el concepto de
mutaciones es “todo cambio que ocurre en la secuencia del genoma”, sea
este DNA o RNA.
- Este cambio o mutación puede ocurrir en cualquier segmento del genoma:
zonas codificantes o no-codificantes.
-Por lo tanto, si está en zonas codificantes de proteínas puede provocar
alteraciones en la estructura y función de ellas.
-Si la mutación es en zonas “no codificantes”, puede alterar la expresión de los
genes regulados por segmentos o elementos regulatorios.
Tipos de mutaciones: puntuales
Las mutaciones más frecuentes
que se producen por errores
durante la replicación son por
incorporación de un nucleótido
equivocado “mismatch”
Es decir: transiciones y
transversiones
Muchas de estas mutaciones puntuales (de
cambio de un nucleótido por otro) son silenciosas
y contribuyen a la variabilidad y el polimorfismo
que se encuentra en la poblaciones y que
permiten distinguir diferentes linajes o grupos de
individuos
A estas
mutaciones
puntuales se les
conoce como
polimorfismo de
nucleótido único
:“single nucleotide
polymorphism
(SNP).
VARIABILIDAD GENÉTICA
GENOMA
INDIVIDUO POBLACIONES
Son en última instancia las variaciones del DNA las que
originan variaciones entre un individuo y otro y son las
variaciones entre individuos que comparten un mismo
ambiente las que originan las diferencias entre las
poblaciones
Mutaciones que producen cambios en
largos segmentos del genoma: llamadas
rearreglos genéticos mayores
• Re-arreglos del genoma:”crosing-over”
recombinación homologa que ocurre
durante la meiosis
• Duplicaciones
• Traslocaciones: grandes segmentos de
inserciones y deleciones
• Cambios en el números de cromosomas:
poliploidias y aneuplodias
Mutaciones cromosómicas
• Aberraciones estructurales:
• Deleciones terminales, insterticiales, cromosomas
en anillos, inversiones, traslocaciones.
• Aberraciones numéricas (Aneuploidias) son
alteraciones en el número de algún cromosoma:
nulisomías (2n-1), trisomías (2n+1), etc. Ej. Trisomia
21 en síndrome de Down.
• Mutaciones genómicas (poliploidías): aumento en el
número de copias del genoma completo, ej.
Genoma tetraploide (4 copias del genoma).
Curso: Biología Molecular y Genómica
Enero 2018.
“Conceptos elementales sobre la
técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)”
Dr. Juan Venegas Hermosilla
Programa de Biología Celular y Molecular
Instituto de Ciencias Biomédicas
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
• El PCR es una técnica enzimática que
permite la amplificación de ácidos nucleícos
(DNA o RNA), millones de veces.
• Esto hace que el PCR sea una técnica muy
poderosa en amplios campos de la biología,
las ciencias, la medicina forense, la
biotécnología, etc.
La técnica de PCR fué
desarrollada por Kary Mullis • Científico y surfista de
Newport Beach, California.
• Por este trabajo Kary Mullis
ganó el premio Nobel de
Química en 1993.
• El desarrolló la técnica
trabajando para la compañía
Cetus Corporation en la
década del 70.
¿Como el PCR amplifica millones de
veces un ácido nucleíco?
¿Como el PCR amplifica millones de
veces un ácido nucleíco?
• El PCR consta de tres etapas:
– a) Denaturación del DNA blanco
– b) Hibridización “annealing” del partidor directo e
inverso con el DNA blanco
– c) Elongación de los partidores mediante una DNA
polimerasa termoestable
• El paso de una etapa a otra, se logra por cambios
de temperatura de la mezcla de reacción.
• Para que ocurra la elongación de los partidores
se requiere todo lo necesario para que haya
síntesis de DNA, es decir: dNTP, Mg2+, un
tampón, sales, además de los partidores.
Esquema de la técnica de PCR: Un ciclo de
amplificación
Técnica de PCR: Segundo ciclo de
amplificación.
Resultados después de múltiples
ciclos de amplificación.
- Se ha calculado que después 25 ciclos de amplificación, una
molécula de DNA doble hebra se multiplica más de UN MILLON
DE VECES
- Esto permite VISUALIZAR el PRODUCTO DE PCR o
AMPLICON por una simple electroforesis.
Electroforesis de productos de
PCR (amplicones).
El producto de amplificación se puede
detectar en electroforesis en geles de
agarosa
• Carril 1: marcador “ladder”, carriles 2-3 muestras de
producto de PCR de pol beta de T. cruzi a diferente
diluciones.
El equipo que lleva a cabo la técnica de
PCR se llama Termociclador:
• Actualmente en el mercado existen una
gran variedad de estos equipos, basados
en diferentes sistemas para producir
cambios rápidos de temperatura
• Hay equipos pequeños para sólo 16
muestras, hasta equipos múltiples, en los
cuales se pueden realizar simultanemente
diferentes ensayos de PCR
• Un par de termocicladores se muestran en
la siguiente diapositiva
Ejemplo de Termocicladores
Algunas aplicaciones de la técnica de
PCR • Diagnostico medico: Para detectar e identificar agentes
infecciosos tales como: virus, bacterias, parasitos, hongos, etc.
• Detección de enfermedades genéticas: Ejemplo, determinar sí una mutación específica que provoca fibrosis quística ha sido heredada por los hijos.
• Estudios evolutivos: analizar las relaciones filogenéticas entre especies desaparecidas (muestras arqueologicas) y de especies vivientes.
• “DNA fingerprinting”: Perfil de productos de amplificación especificos de cada individuo de una población. Esto permite identificar personas desaparecidas, autores de crimenes, etc.
Referencias
• http://www.accessexcellence.org/AB/GG/polymerase.html
• http://www.accessexcellence.org/AB/BC/Kary_B_Mullis.html
• http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm
• http://www.karymullis.com/
• http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/PolymeraseChainReaction/
• http://www.emblheidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/clo_pcr_strategy/primer_design.html
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/NAWBIS/Modules/DNA/dna9.html
• http://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html
• http://www.alumni.ca/~leema3m/bg/pcr.html
• http://marvin.ibest.uidaho.edu/~heckendo/CS504/Students/P/waltari.pdf
Muchas gracias
por su atención
y paciencia ¡¡
FIN...
Material suplementario:
Deoxyribonucleotides and ribonucleotides of nucleic acids
Watson-Crick model for the structure of DNA.