Biotecnología del ADN

Recombinante

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUAUNAN- León

"Nunca consideres el estudio como una obligación, sino como una oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber".

Albert Einstein

DNA Descubrimiento

1869: se aisló por primera vez DNA

1944: se demostró que el DNA contiene el material genético.

1953: se descubrió la estructura de doble hélice del DNA

La estructura del DNA es una doble hélice, formada por cadenas orientadas en direcciones opuestas (antiparalelas).

INGENIERÍA GENÉTICA Técnica que consiste en la

introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos.

Conjunto de técnicas nacidas de la Biología molecular, que permite manipular el genoma de un individuo.

TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE Aislamiento y manipulación de

fragmentos de ADN de un organismo para introducirlo en otro (ADN recombinante).

Permite obtener cantidades ilimitadas que llevará el gen deseado.

El gen deseado puede introducirse en células de otros organismos (vegetales, bacterias, animales) en donde se expresará dicho gen.

Enzimas de restricción El clonamiento de genes requiere que el

DNA sea cortado en una forma muy precisa y reproducible.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cada enzima de restricción reconoce una secuencia

nucleotídica específica en donde corta el DNA.

Según el ataque, la enzima puede hacer un corte que genere extremos romos ó bien cohesivos.

La rotura del DNA produce una serie de características de fragmentos y estos se pueden ligar a otros DNA, como el vector de clonación

Aislamiento y manipulación de fragmentos de ADN de un organismo para introducirlo en otro (ADN recombinante)

Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restricción y su aplicación en Genética Molecular)

La enzima Eco R1 corta en la cadena del fragmento 1 y el mismo tipo de corte en el fragmento 2.

Estos cortes los realiza cuando encuentra las secuencias blanco. Deja entonces dos extremos complementarios (pegajosos) que luego son ligados por la ADN ligasa, por último se obtiene un ADN recombinante. El análisis de la figura justifica nuestro título de tijeras moleculares.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Corte cohesivo:

Corte romo:

ACCIÓN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

Extremos cohesivos

Secuencia Palindrómica

ACTIVIDAD DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Enzimas de restricción

Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

Extremos cohesivos

Vectores Los vectores de clonación son moléculas

transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.

Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.

Vectores Plásmidos: moléculas de ADN circular Tienen su propio origen de replicación

                                     

      

Plásmidos

1

Plásmidos

2

Extremos cohesivos

Plásmido

3

Molécula de ADN recombinante

gen de resistencia a la ampicilina

CÓSMIDOSSon plásmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cósmido uniendo los tres elementos génicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

Plásmido

BACTERIÓFAGO

figura d figura e figura f

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. 

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURAS

El cromosoma artificial de levaduras o YAC (Yeast artificial chromosome) forma parte de los vectores de clonación de alta capacidad siendo, de hecho, el de mayor capacidad (200 kb - 3.000 kb). Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack.Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura (eucariota), portando un centrómero y telómero terminales. Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.Son utilizados en construcción genómicas, siendo muy extendido su uso en los primeros años del Proyecto Genoma Humano. Sin embargo, son más inestables que otros vectores como BACs (cromosoma artificial bacteriano), que han acabado imponiéndose.Los YAC tienen un origen de replicación relajado en procariotas, por lo que aparecen muchas copias en cada bacteria (gran utilidad para producir masivamente el vector), pero un origen de replicación estricto en levaduras, apareciendo sólo una copia por célula de levadura.

Transformación celular Introducción de DNA foráneo a la célula

Etapa crítica para la obtención final de una célula recombinante.

Cada célula que capte el vector con el gen clonado lo traspasará a la progenie, la que también hará lo propio al reproducirse.

En general, se habla de “transformación” para procariontes y “transfección” para eucariontes

TRANSFORMACIÓN CELULAR Es condición esencial que el medio

externo a la célula contenga un factor que permita seleccionar a las que incorporaron el material genético de interés de las wild type

EXISTEN SIMILITUDES Y DIFERENCIAS ENTRE LA RECOMBINACIÓN EN LA NATURALEZA Y EN EL

LABORATORIO

1.Tanto la recombinación de ADN natural como la efectuada en el laboratorio incluyen el intercambio de ADN entre organismos, así como entre especies.

2.Las recombinaciones de ADN que ocurren de manera natural suceden al azar y de manera no dirigida. En general, algunos genes específicos no se mueven de manera preferencial, y no hay algún “objetivo” que dirija los movimientos del ADN. En las recombinaciones de ADN en el laboratorio, se mueven piezas específicas de ADN entre organismos elegidos deliberadamente para lograr un objetivo específico.

El esquema de esteEl esquema de este “dogma” “dogma” ha sido encontrado repetidamente ha sido encontrado repetidamente y se considera una regla generaly se considera una regla general (salvo en los retrovirus)(salvo en los retrovirus)

Proteína

TECNICAS

La PCR ha revolucionado el diagnóstico virológico. Se han empleado diferentes protocolos, de los cuales se destacan aquellos que detectan la presencia del gen que codifica la envoltura viral o alguno de los genes que codifican las proteínas no estructurales. La PCR anidada (nested /PCR), de mayor sensibilidad es ampliamente utilizada.Recientemente, se han impuesto sistemas más sensibles que permiten detectar y cuantificar el ácido nucleico viral presente en el suero aun en presencia de un bajo número de copias. La PCR en tiempo real ha sido aplicada con éxito en la detección y cuantificación de dengue en muestras de suero y linfocitos de sangre periférica. El ensayo se realiza en un solo vial lo que disminuye las posibilidades de contaminación, la señal que se produce en las muestras positivas se monitorea en tiempo real, esto permite a su vez la cuantificación del ácido nucleico.

Principio del PRC

No es una técnica analítica per. se, es una metodología, resultante de la aplicación práctica de tres conceptos.

Ciclo del PCR

Cada ciclo de una PRC, consta de tres etapas:

Desnaturalización:

Calentamiento para la separación de las dos hebras del ADN mediante una incubación breve (30-120‘s) a una temperatura entre 68 y 97˚ c que debe ser superior a la de fusión de la región de ADN que se requiere amplificar.

Elongación: Etapa de amplificación (72-75˚C, 1-3 min.)

en la que el ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicación transcurren dirección 5`--3´ a partir del extremo 3´- OH de cada cebador, empleando como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de desnaturalización

Templado:

O hibridación enfriamiento rápido por debajo de Tm de forma que se permite la hibridación de las hebras sencillas del ADN de interés con los oligos cebadores, con temperaturas de 37 a 65˚ C que se mantienen entre 10 y 120’s.

METODOS DE EXTRACCION DE DNA

• Método fenol-cloroformo

• Método del acetato de potasio

• Método del acetato de potasio modificado• Método de bromuro de cetil-trimetil amonio

Observa el siguiente video youtube: http://www.youtube.com/watch?v=V9PtQlp-e7g

APLICACIONES DE LA TÉCNICA PCR

Investigaciones génicas: Clonación de genes Detección de clones recombinados Estudio de ADN de fósiles

Medicina: Exploración de enfermedades génicas Diagnóstico prental Detección del reordenamiento de tumores ancerosos.

Microbiología e Infectología: Identificar ADN de virus, parásitos y bacterias.

Detectar la presencia de agentes infec- ciosos(herpes virus, virus del SIDA, vi-

rus de la hepatitis).

Medicina forense y Criminalística: Determinación de maternidad y paternidad Análisis en casos de violación y asesinato.

APLICACIONES DEL PCR

Clonación Celular de los Fragmentos de ADN Detección de secuencias sin purificación previa Secuenciación de ácidos nucleicos Establecimiento de polimorfismo de secuencia Rastreos de mutaciones Tipado de ADN para transplantes Diagnostico de enfermedades genéticas Resolución de problemas forenses Estudio Evolutivo Detección de microorganismos infecciosos Detección de Células Tumorales Amplificación de DNA para su poder de clonación celular

Es un proceso cíclico Es un proceso cíclico (cada ciclo consta de 3 pasos)(cada ciclo consta de 3 pasos)

94ºC desnaturalización (separación 94ºC desnaturalización (separación de las dos hebras de de las dos hebras de ADNADN))

50ºC Anillamiento de "cebadores"50ºC Anillamiento de "cebadores"

72ºC copia de cada una de las 72ºC copia de cada una de las hebras de hebras de ADNADN por la por la ADNADN polimerasapolimerasa

En 1983 Kary Mullis da a conocer esta técnica y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por este descubrimiento

35 ciclos 236= 68 billones de copias

La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos

http://www.youtube.com/watch?v=eauONOJ3F00

Electroforesis en gel

Electroforesis Capacidad de las macromoléculas para deslazar en Un campo eléctrico, con velocidad proporcional a su

carga E inversamente a su tamaño.

TIPOS :

Electroforesis de campo punzante Electroforesis de frente móvil o libre Electroforesis en gel Electroforesis capilar

TIPOS Y PREPARACION DE GELES

• Gel de Silic•Gel de Poliacrilamida 

El gel de sílice es una forma granular y porosa de dióxido de silicio hecho a partir deSilicasódico.

se utiliza para reducir la humedad en espacioscerrados; normalmente hasta un 40%.

Proceso de preparación del gel dePoliacrilamida 

La preparación del gel de Poliacrilamida consiste fundamentalmente en disolver en agua una mezcla de Acrilamida y Bis-Acrilamida en una determinada proporción.

que es función del grado de reticulación deseado en el polímero, y añadir Urea, Amoniopersulfato (APS) y N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED). La función de la Urea es servir de desnaturalizante, mientras que el APS y el TEMED actúan como catalizadores y la Bis-Acrilamida como co-monómero. Un ligero calentamiento hasta unos 45 ºC favorece la disolución y acelera el comienzo de la reacción de polimerización. A continuación se vierte mediante la jeringuilla la mezcla así preparada entre placas de vidrio con una separación prefijada y se deja polimerizar, obteniéndose un gel del espesor deseado. El TBE es un tampón habitual compuesto de TRIS, Ácido Bórico y EDTA.

La segunda parte del núcleo, gel se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, en contraste con la poliacrilamida, es una neurotóxica y debe ser manejada cuidadosamente para evitar envenenamientos.La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica)

Secuenciación automática

ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCCAGTGACTTTGTCCAAC GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCCAGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT

ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA

Secuenciación de genomas

http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8

Técnica de SOUTHERN BLOT

ADN RECOMBINANTE

La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes, especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos. Estas investigaciones permanentemente generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen profundas implicancias éticas.

ADN RECOMBINANTE Transformación de bacterias y localización de un segmento

de DNA de interés por medio de una sonda radiactiva

LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ECORI ESCINDE ESTE PLÁSMIDO EN LA SECUENCIA GAATTC,

DEJANDOEXTREMOS "PEGAJOSOS" EXPUESTOS.

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

CLONACION

CLONACION Se define como la tecnología para producción de

individuos genéticamente idénticos. Es un sistema de reproducción en la que no participan ovocitos y espermatozoides en la formulación genética, sino que la carga genética contenida en el ADN de los cromosomas es provista por células somáticas. Se han utilizado diferentes tipos de células, de origen embrionario, fetal o diferenciado de animales adultos, que transferidas a ovocitos enucleados producen un nuevo individuo genéticamente idéntico a la célula donante. Este tema expone los métodos básicos de la tecnología del DNA recombinante que se utilizan para aislar, replicar y analizar Los tejidos

CELULAS MADRE

(f) (h)(g)Ciclo líticoCiclo lítico

Ciclo lisogénicoCiclo lisogénico

Genoma de hongos: 44 millones de pares de basesHuesped: Escherichia coliVector: Bacteriófagos capacidad: 20 mil pares de bases

Genoma humano: 3000 millones de pares de basesHuesped: Saccharomyces cerevisiaeVector: YAC (cromosoma artificial de levadura) MegaYAC (capacidad: 1 millón de pares de bases)

•Detección de mutacionesMétodo de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

•Secuenciación de ADNs fósiles Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría están dañadas o degradadas)

•Diagnóstico de enfermedades genéticasDiagnóstico prenatal / Diagnóstico pre implantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos defecundación in vitro

•Identificación de especies y control de cruces entre animales Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

•Secuenciación de genomas Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)

Obtención de vacunas recombinantes(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)

La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico

Inyección de proteínas víricas en un chimpancé

plásmido bacteriano

Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levaduraADN

Extracción del ADN del virus

Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo

Mediante ingeniería genética se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo

ADN enfermo

ADN sano

ADN complementario del ADN enfermo

Diagnóstico de enfermedades de origen genético

ADN de la persona que se quiere diagnosticar

¿Hibridación?¿No hibridación?

Renaturalización del ADN con la sonda fluorescente

Desnaturalización del ADN

Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomalía

BiochipMicroarrayDNAchip

DIAGNÓSTICO