protocolos extracción adn

7/23/2019 Protocolos Extraccin ADN

1/27

cionald

eBiobancos

Gua de protocolos utilizados para la

obtencin de cidos nuclicos en biobancos


2/27


3/27

Este documento ha sido elaborado con la participacin de las siguientes personas e

instituciones:

Coordinador:

Alberto Orfao de Matos -Banco Nacional de ADN

Adjunto coordinador:

Rosa Pinto LabajoBanco Nacional de ADN

Colaboraciones:

Juan Pascual Snchez.-Hospital Marqus de Valdecilla

Eugeni AragallFundacin Instituto de Investigacin Germans Tras i Pujol

Edurne Pedrosa Berrio -Fundacin Instituto de Investigacin Germans Tras i Pujol

Anta Solloso BanobreComplejo Hospitalario de la Corua

Manuel Posada de la PazInstituto de Enfermedades Raras-ISCiii

Elisabet Ars CriachFundacin Puigvert

Irene Vietez GonzlezComplejo Hospitalario Universitario de Vigo

b d l d bl


4/27

OBJETO

El objetivo de esta gua de trabajo consiste en la elaboracin de un documento donde se

recogen diferentes protocolos de trabajo (PNTs) utilizados en varios biobancos integrados en

la Red Nacional del ISCIII para la obtencin de cidos nucleicos a partir de diferentes tipos de

muestra.

Los protocolos han sido clasificados segn su principio de actuacin y en cada uno de ellos


5/27

1. INTRODUCCIN

El procedimiento general de extraccin de cidos nucleicos consiste en tres etapas

consecutivas: disgregacin de las clulas o tejidos (lisis celular), inactivacin de las nucleasas

intracelulares y en separacin de los cidos nucleicos de los dems componentes celulares.

La lisis celular depende en gran medida del tipo de muestra que se va a procesar.

Mientras que en muestras como sangre, clulas, ciertos tipos de tejidos o saliva puede

alcanzarse una eficiente lisis celular en tiempos relativamente cortos, en otros tipos de

muestras como tejidos incluidos en parafina la lisis celular requiere un tratamiento previo

mucho ms laborioso.

1.1.Lisis celular.

Durante la lisis celular se procede a la destruccin de las estructuras formadas por lpidos

y protenas permitiendo la liberacin de los cidos nucleicos del ncleo celular. La lisis se

lleva a cabo mediante una solucin salina que suele contener detergentes que desnaturalizanlas protenas y/o proteasas. Una vez separados los cidos nucleicos de las protenas y lpidos

se lleva a cabo su purificacin.

1.2.Purificacin de cidos nucleicos.

Los mtodos de purificacin presentan una gran variabilidad y estn desarrollados en

funcin de las propiedades fsico-qumicas de las molculas de ADN y ARN. Algunos de estos

f


6/27

1.2.4. Separacin magntica:

En este mtodo las muestras lisadas se mezclan con esferas magnticas con capacidad de

unirse a los cidos nucleicos. Tras una serie de lavados para conseguir la mxima purificacin

del material gentico las esferas son retiradas de la solucin mediante un separador

magntico.

Referencias:-Nucleic Acid Isolation and Purification Manual. www.roche-applied-science.com.

-DNA Isolation Methods. World of Forensic Science, 2006. Gale Cengage.


7/27

2.- PROTOCOLOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO.

La elaboracin de esta gua de trabajo se ha realizado teniendo en cuenta la informacin

aportada por varios de los biobancos integrados en la Red Nacional del ISCIII referente a los

protocolos utilizados para la extraccin de ADN genmico.

Estos protocolos se han clasificado en funcin de su principio de actuacin para la

obtencin de muestra. Se ha desarrollado para cada mtodo un protocolo general que

refleja las lneas de procesamiento comunes en todos los protocolos utilizados en los

biobancos con esteprincipio de actuacin. Teniendo en cuenta que los protocolos utilizados

en los biobancos pueden presentar particularidades se recomienda seguir las

especificaciones propias de cada protocolo. Para cada uno de los mtodos se describe el

alcanceas como el rendimientoy calidad de las muestras de ADN obtenidas.

El alcance definido en cada mtodo seala para qu tipo de muestras se utiliza este

protocolo en los biobancos que han participado en la elaboracin de esta gua

El rendimiento indica el valor obtenido aportado por los datos experimentales de losdiferentes biobancos que los utilizan.

La calidad de las muestras obtenidas est determinada por la pureza, integridad yfuncionalidad de las mismas.

Pureza:

L d l t t l i d l l d i b b i d l


8/27

degradada presentar una estela o smeara lo largo del gel que ser ms pronunciada

cuanto mayor sea la degradacin de la muestra.

Funcionalidad:El hecho de que una enzima de tipo ADN polimerasa pueda actuar sobre una muestra

de ADN como molde de la reaccin de PCR es indicativo de que la pureza de la muestra es

ptima. Adems, dependiendo del tamao del fragmento amplificado se puede evaluar el

grado de integridad de la muestra.

Al final del documento se incluyen como anexos dos tablas en las que se refleja el

rendimiento y la calidad de las muestras obtenidas con cada uno de los protocolos utilizados

en los distintos centros que han participado en la elaboracin de esta gua.

Tabla 1. Se muestran los datos del rendimiento obtenido con cada protocolo para

d ti d t


9/27

2.1- MTODO DE PRECIPITACIN POR SALES.

2.1.1. PRINCIPIO.

En primer lugar se procede a una lisis celular con un detergente aninico que solubiliza los

componentes celulares e inhibe la accin de las nucleasas intracelulares. A continuacin se

desnaturalizan y se eliminan las protenas por precipitacin salina. El ADN en solucin se

precipita con isopropanol y se lava con etanol para finalmente ser resuspendido en un

tampn estabilizante para ADN.

2.1.2. ALCANCE.

Este mtodo se utiliza para la obtencin de ADN de los siguientes tipos de muestra:

Sangre perifrica:volmenes de entre 3 ml hasta 20 ml (las cantidades de reactivos de estemtodos son escalables en funcin del volumen de muestra).

Clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSPs):las preparaciones de CMSPs pueden

tener un volumen variable de entre 0,1-2 ml de medio y pueden ser procesados entre 1 y 3x10

7clulas.

Clulas:el nmero de clulas que puede ser procesado depende del tipo celular y del modode obtencin de las clulas (p.ej: cultivos celulares, clulas purificadas por citometra de flujo,

). En cualquier caso, puede procesarse un amplio rango de clulas, desde 1 x106hasta 50

x106, siempre y cuando se escalen proporcionalmente las cantidades de soluciones de

reactivos.

li d 2 l d li l d 2 l d t O


10/27

Paso 3. Se aade una solucin salina que permite la precipitacin de las protenascitoplasmticas y nucleares de la muestra. Se procede a una agitacin vigorosa de

la muestra (con vrtex) durante 20-30 segundos. A continuacin, se lleva a cabouna centrifugacin a la velocidad y tiempo necesarios para asegurar la

precipitacin total de las protenas. Las protenas precipitadas se observarn en el

fondo del tubo como un botn de color marrn. El sobrenadante debe observarse

sin turbidez o presencia de partculas o trazas de color marrn; si no fuese as,

debe procederse a una incubacin de la muestra durante 5 minutos en hielo

repitiendo de nuevo la centrifugacin.

Paso 4.El sobrenadante que contiene el ADN en solucin se transfiere a un nuevo tubocon isopropanol. La muestra se mezcla con el isopropanol invirtiendo el tubo

suavemente aproximadamente 50 veces. En este paso se puede observar la

aparicin de la hebra de ADN. No obstante, la observacin de esta hebra va a

depender de la cantidad de muestra de ADN procesada.

Paso 5.Se procede a la centrifugacin de la muestra para precipitar el ADN en el fondodel tubo. El ADN se observar como un precipitado de color blanquecino.

Paso 6.Con mucho cuidado, se elimina el sobrenadante por decantacin y el tubo con elprecipitado de ADN se coloca invertido sobre una hoja limpia de papel absorbentepara eliminar al mximo el remanente de isopropanol.

Paso 7.Se aade Etanol al 70%, se tapa el tubo y se invierte con suavidad varias vecespara lavar el precipitado de ADN.

Paso. 8. La muestra se centrifuga y el etanol se elimina por decantacin o extraccinmediante punta de pipeta (con mucho cuidado puesto que el ADN puede

d d l f d d l t b ) D b d l i it d d


11/27

Para ello se aaden tres volmenes de una solucin de lisis de glbulos rojos al volumen

inicial de sangre total a lisar. La muestra se mezcla por inversin y se deja actuar durante 5

minutos invirtiendo el tubo con suavidad varias veces durante la incubacin. Si la muestra seha lisado completamente se observar un cambio de color hacia una tonalidad bastante ms

oscura. Posteriormente se procede a una centrifugacin para precipitar los leucocitos de la

muestra que quedan pegados en el fondo del tubo mientras que el sobrenadante que

contiene los glbulos rojos lisados se elimina por decantacin. Es conveniente dejar un

pequeo volumen de lquido residual de 200-400 l para resuspender los leucocitos

mediante un vigoroso vrtex de aproximadamente 20 segundos. A continuacin, se procede

a la lisis celular de los leucocitos correspondiente al paso 1del protocolo general descrito

anteriormente.Esta lisis adicional de eritrocitos tambin puede realizarse sobre muestras de clulas

mononucleares de sangre perifrica (CMSPs) si se observa presencia de glbulos rojos en la

muestra.

Muestras de saliva: previamente al procesamiento de las muestras de saliva recogidas enun recipiente con preservante Oragene se recomienda una incubacin de la muestra a 50C

durante 1-2 horas con objeto de optimizar el rendimiento final de ADN obtenido. Este tiempo

de incubacin puede incrementarse si se considera necesario para aumentar el rendimientofinal de muestra.

Muestras de tejido: las muestras de tejido deben ser homogeneizadas para que las clulasqueden ms expuestas a la accin de los reactivos. Existe una gran variedad de mtodos de

disrupcin de tejido desde sonicacin, hasta trituradores mecnicos, utilizacin de mortero,

adicin de esferas de vidrio y fuerte agitacin entre otros mtodos. En algunos protocolos de

extraccin de ADN la solucin de lisis celular se aade una vez homogeneizada la muestra,

mientras que en otros la homogeneizacin de la muestra se lleva a cabo en la propia solucin


12/27

-RealPure SSSkit. Durviz s.l.u (Valencia, Espaa). www. durviz.com.

-DNA Isolation Kit for Mammalian Blood.Roche. (Basel, Switzerland). www.roche.com.

-Tissue DNA Extraction kit-AGF. AutoGen. (Massachussetts, USA). www. autogen.com.

-Oragene DNA Saliva Extraction-AGF. AutoGen. (Massachussetts, USA). www.autogen.com.

2.1.6. RENDIMIENTO.

El rendimiento esperado para cada uno de los protocolos anteriores es el siguiente:-Miller et al., (1988): el rendimiento esperado es de aproximadamente 25 g ADN/ ml de

sangre total.

-Gentra Puregene Handbook: el rendimiento obtenido en muestras de sangre total oscilaentre 25-50 g ADN/ ml de sangre, establecindose el rendimiento medio en torno a 35 g

ADN/ ml de sangre.

En muestras de saliva el rendimiento medio se sita alrededor de 55 g ADN /ml de saliva

siempre y cuando se haya recogido la cantidad de saliva adecuada (2ml) en el contenedorcorrespondiente.

En muestras de clulas el rendimiento es de entre 5 y 7 g ADN/ 106clulas, aunque este

valor puede resultar muy variable dependiendo del tipo celular.

-Qiagen Genomic DNA Handbook: el rendimiento obtenido est en el rango de 25-35 gADN/ ml de sangre.

-Flexigene DNA Handbook:el rendimiento medio obtenido es de aproximadamente 37 g

ADN/ l t 13 ADN/ 106

l l t d l l l


13/27

saliva se ha observado una relacin inferior a 1.5 en algunos casos, sin que se vea afectada la

integridad o funcionalidad de la muestra.

Integridad:

Las muestras de ADN obtenidas con este protocolo se pueden considerar muestras de una

integridad muy alta puesto que habitualmente se observan como una nica banda definida

en gel de agarosa. Como excepciones hay que sealar: 1)muestras de saliva, puesto que enalgunos casos puede observarse un leve smear a lo largo de la carrera junto con la

presencia de una banda ntegra mayoritaria en la parte superior del gel, y 2)muestras deADN procedentes de tejidos fijados y parafinados en las que se observa un pronunciado

smeara lo largo del gel de agarosa.

Funcionalidad:

En la mayor parte de los protocolos utilizados las muestras permiten la amplificacin de un

fragmento de ADN de gran tamao (> 17 kb). En las muestras de ADN obtenidas con el

mtodo descrito por Miller et al., (1988)se ha comprobado la amplificacin de fragmentosde 8,4 kb que permiten una buena secuenciacin del ADN. La funcionalidad de las muestras

de ADN obtenidas con el protocolo Tissue DNA Extraction kit-AGF se ha comprobadomediante la amplificacin de fragmentos de 795 pb, 453 pb y 227 pb tanto en tejido fresco

congelado como en tejido fijado y parafinado.


14/27

2.2.- MTODO DE EXTRACCIN DE ADN CON SOLVENTES ORGNICOS.

2.2.1. PRINCIPIO.

Este protocolo permite la purificacin de ADN mediante la adicin de fenol y cloroformo lo

que da lugar a la aparicin de 2 fases: una fase acuosa superior que contiene los cidos

nucleicos y una fase orgnica que contiene las protenas disueltas en el fenol y los lpidos

disueltos en el cloroformo. Para la purificacin de ADN el fenol debe tener un pH7-8.

Posteriormente se precipita el ADN de la fase acuosa con isopropanol o etanol absoluto y se

lava con etanol al 70% para eliminar sales y pequeas molculas orgnicas que podran an

estar presentes en la muestra. Por ltimo el ADN se resuspende en un tampn apropiado.

2.2.2. ALCANCE.

Este mtodo puede ser utilizado para la obtencin de ADN de diferentes tipos de muestra

como sangre perifrica, clulas o tejidos. En los biobancos integrados en la Red Nacional del

ISCIII este mtodo se aplica para la obtencin de ADN a partir de sangre y tejido fresco

congelado.

2.2.3. PROTOCOLO GENERAL.

Paso 1. Se procede al lisado celular de la muestra. La lisis se lleva a cabo en funcin del tipode muestra que se va a procesar pero es necesario que antes de la adicin del fenol

la lisis sea completa y el lisado resultante sea homogneo.

S d l d f l l l d li d l l i


15/27

Paso 9.El precipitado se lava con 500 l de etanol al 70%. La muestra se centrifuga a 12,000g durante 10-15 min. Opcionalmente se puede realizar un segundo lavado con

etanol para maximizar la purificacin de la muestra.

Paso 10.Se elimina el etanol y se deja secar el precipitado de ADN. Finalmente el ADN esresuspendido en un volumen adecuado de tampn TE o agua destilada.

Nota: solucin CIA: mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico en una proporcin 24:1

tampn TE :Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM

2.2.4. ESPECIFICACIONES PARA DIFERENTES TIPOS DE MUESTRA.(Ver epgrafe con el mismo ttulo en el apartado 2.1.4. descrito en la pginas 7 y 8 de esta

gua).

2.2.5. PROTOCOLO DE SOLVENTES ORGNICOS QUE SE HA UTILIZADO EN EL DESARROLLODE ESTA GUA.

Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual2nd Edition. Vol.3,pages E3-E4. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2.2.6. RENDIMIENTO.

El rendimiento obtenido con este protocolo en muestras de sangre total se sita en torno a

30-70 g ADN/ ml de sangre. En tejidos el rendimiento resulta mucho ms variable

dependiendo del tipo de tejido y de la cantidad de muestra de partida. No obstante, la

i l i i b di i l d ADN l


16/27

2.3- MTODO DE ADSORCIN EN COLUMNAS DE SLICE.

2.3.1. PRINCIPIO.

El principio de extraccin de este tipo de mtodo se basa en la capacidad de adsorcin de

los cidos nucleicos en una columna de slice ante la presencia de altas concentraciones de

sales caotrpicas. Los contaminantes de la muestra son eliminados con posteriores lavados

de la columna y finalmente el ADN es eludo con H20 o un tampn de resuspensin de baja

fuerza inica a pH neutro o ligeramente alcalino.

2.3.2. ALCANCE.

Cuando se utiliza una columna para la purificacin de cidos nucleicos es importante no

saturar la capacidad de la columna de unir cidos nucleicos debido a un exceso de muestra.

De hecho, el rendimiento y la calidad del ADN (o ARN) obtenido con este mtodo depende en

gran medida de la cantidad y calidad de la muestra de partida.

Este mtodo puede ser utilizado para la obtencin de ADN de los siguientes tipos demuestra:

Sangre perifrica: existen kits con columnas de slice con diferentes capacidades deretencin de tal manera que se pueden procesar volmenes que oscilan entren 0,02 ml y 10

ml de sangre.

Clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSPs):las preparaciones de CMSPs puedentener un volumen variable puesto que se pueden procesar desde 5x 10

6 leucocitos hasta

id d d 1 108 l i i d l ki l id d d


17/27

muestra donde la presencia de ARN puede ser alta se recomienda aadir RNAsa

siguiendo las indicaciones del kit que vaya a ser utilizado.

Paso 3. Se aade a la muestra una solucin de unin de cidos nucleicos a la columna.Puede ser una solucin provista por el kit o etanol absoluto. La mezcla se aplica a la

columna de slice que se encuentra adaptada a un tubo vaco y mediante

centrifugacin el ADN queda retenido en la columna mientras que las protenas y

otros contaminantes de la muestra son arrastrados con la solucin de lisado al

tubo.

Paso 4.Sobre la columna, que se ha transferido a un nuevo tubo, se aade una solucin de

lavado para eliminar el resto de contaminantes de la muestra que son arrastradosen esta solucin por centrifugacin. Este paso suele repetirse dos veces para

asegurar una buena pureza de la muestra.

Paso 5.Se transfiere la columna a un nuevo tubo y se lleva a cabo una nueva centrifugacina la mxima velocidad posible (durante 1-2 minutos) para asegurar una eliminacin

completa de los restos de la solucin de lavado de la columna previamente a la

elucin del ADN.

Paso 6.La columna se transfiere a un nuevo tubo con tapa y se lleva a cabo la separacindel ADN de la columna de slice aadiendo H20 o un tampn de baja fuerza inica.

El tampn de resuspensin debe aplicarse en el centro de la columna y con un

volumen suficiente para asegurar que se reparte uniformemente por toda la

superficie de slice. Se aconseja un tiempo de incubacin de la columna con el

tampn de resuspensin de 4-5 minutos para aumentar el rendimiento de ADN. Por

ltimo, se realiza una centrifugacin que permite la coleccin del ADN en solucin

en el tubo y se desecha la columna.


18/27

-QiAampDNA Mini and Blood Mini Handbook for DNA purification from whole blood,plasma, serum, buffy coat, lymphocytes, dried blood spots, body fluids, cultured cells.

swabs, tissue. Qiagen. (Hilden, Germany). www. qiagen.com.

-QIAamp DNA FFPE Tissue Handbook for purification of genomic DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Qiagen. (Hilden, Germany). www. qiagen.com.

2.3.6. RENDIMIENTO.

El rendimiento esperado para cada uno de los protocolos utilizados es el siguiente:

-Manual PerfectPureTM DNA Blood Kit: el rendimiento obtenido oscila entreaproximadamente 25-40 g ADN/ ml sangre.

-Genomic DNA from Blood: con este protocolo se alcanza un rendimiento medio de

aproximadamente 30 g ADN/ ml de sangre.

-QIAampDNA Mini and Blood Mini Handbook: para muestras de sangre este mtodopermite obtener un rendimiento de 25-35 g ADN/ ml de sangre.

Para muestras de saliva extradas con preservante Oragene se obtiene un rendimiento de15-25 g ADN/ ml de saliva. Para muestras de saliva obtenidas por torunda se obtienen

alrededor de 15-25 g ADN/ torunda.

En muestras de clulas se han obtenido valores en torno 1,5-5 g ADN/ 106 clulas; la

extraccin de ADN a partir de clulas fijadas en solucin de Carnoy (etanol absoluto,

cloroformo, cido actico glacial en proporcin 6:3:1) ha permitido obtener cantidades de 1-

4 g ADN/ 106clulas.

Para muestras de tejido el rendimiento esperado es de en torno a 0,2-1,2 g ADN/ mg de

jid l d d h d l i id d d l d jid


19/27

de tejidos FFPE se observa un smearpronunciado a lo largo del gel de agarosa reflejando

una mayor degradacin del ADN.

Funcionalidad:las muestras que presentan una banda definida en la parte superior del gelde agarosa son capaces de amplificar por una reaccin de PCR un fragmento > 17.5 kb. En

muestras de ADN de saliva o de clulas fijadas en medio de Carnoy no siempre se logra

amplificar fragmentos >17.5 kb. No obstante, en la mayora de los casos se logra amplificar

fragmentos de ADN de aproximadamente 5- 7 kb. No se ha comprobado mediante PCR la

funcionalidad de muestras de tejido fresco congelado, aunque dado que tanto la integridad

como la pureza obtenidas con este tipo de muestras son altas, probablemente se logren

amplificar por PCR fragmentos de ADN de gran tamao. Las muestras procedentes de tejidosFFPE suelen amplificar fragmentos de aproximadamente 300 pb y se ha comprobado que son

funcionales en una reaccin de qPCR que amplifica fragmentos de 100-150 pb.


20/27

2.4- MTODO DE PURIFICACIN POR UNIN A MICROESFERAS MAGNTICAS.

2.4.1. PRINCIPIO.

Este mtodo utiliza esferas magnticas cuya superficie est recubierta con polmeros

naturales o sintticos que presentan una alta afinidad por los cidos nucleicos. Las esferas

magnticas se aaden al lisado de la muestra lo que permite su unin a las molculas de

ADN. Cuando se sita un imn en la pared del tubo, ste permite el agrupamiento en dicha

pared de las esferas con el ADN unido, mientras que los contaminantes de la muestra en

solucin son eliminados por pipeteo o decantacin. Despus de varios ciclos de resuspensiny lavado en los que las esferas quedan retenidas por el imn, el ADN es eludo en un tampn

adecuado.

2.4.2. ALCANCE.

Este mtodo se utiliza para la obtencin de ADN de los siguientes tipos de muestra:

Sangre perifrica:pueden procesarse volmenes de entre 5 y 10 ml de sangre perifrica.Clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSPs):las preparaciones de CMSPs pueden

tener un volumen variable de entre 0,1-2 ml de medio.

Cultivos celulares: pueden procesarse hasta 1.2 x107clulas.

Lquido amnitico: pueden procesarse volmenes de entre 1-3 ml.

Saliva: pueden procesarse 2 ml de saliva mezclados con 2 ml de preservante Oragene.


21/27

Paso 6. Se realizan dos nuevos lavados siguiendo el mismo procedimiento descrito en elpaso 5. Al eliminar el tampn de lavado en el ltimo paso no se retira el tubo del

separador magntico de modo que las esferas quedan agrupadas en la parte deltubo en contacto con el separador.

Paso 7.Se aade una nueva solucin de lavado sobre las esferas magnticas agrupadas y serealiza una incubacin durante 1 minuto. Tiempos ms prolongados de incubacin

o la dispersin de las bolas magnticas durante la misma pueden dar lugar a un

rendimiento ms bajo reflejado en la obtencin de una menor cantidad de ADN.

Paso 8. Se elimina la solucin de lavado y se aade el volumen adecuado de tampn de

resuspensin (tambin puede utilizarse tampn TE a pH 8.0 o H20 a pH 8.0). Seretira el separador para mezclar bien las esferas con el tampn de resuspensin de

ADN. La solucin se incuba durante 10 minutos con agitacin a temperatura

ambiente para eluir el ADN de las esferas. Esta incubacin puede realizarse a 55C

para optimizar la elucin del ADN.

Paso 9.Se aplica el separador magntico al tubo durante aproximadamente 3 minutos paraseparar las esferas magnticas de la suspensin de ADN. La solucin de ADN se

pasa a un tubo limpio con cuidado de no arrastrar las esferas magnticas. Si an se

observarse presencia de esferas magnticas en las solucin de ADN se repite de

nuevo este ltimo paso.

2.4.4. ESPECIFICACIONES PARA DIFERENTES TIPOS DE MUESTRA.

(Ver epgrafe con el mismo ttulo en el apartado 2.1.4. descrito en la pgina 7 y 8 de estagua).


22/27

En muestras de lquido amnitico se alcanza un rendimiento en torno a 0,5-3 g ADN/ ml

de muestra.

Para tejidos frescos se ha observado un rendimiento de alrededor a 2-6 g ADN/ mg detejido. El resultado puede variar en funcin de la naturaleza del tejido que se procese.

2.4.7. CALIDAD DE LAS MUESTRAS.

Pureza: si se detecta la presencia de esferas magnticas en la muestra las relaciones deabsorbancia pueden resultar afectadas por lo que se recomienda aplicar de nuevo el

separador magntico a la solucin de ADN durante unos 3 minutos para eliminar las esferas

que pudiesen quedar en de la muestra de ADN.

En general con este mtodo las relaciones de absorbancia A260/280 presentan valores

entre >1.7 y 2.1. Mientras que en la mayora de los casos la relacin A260/230 es >1.5.

Integridad: tras la migracin del ADN mediante electroforesis se observa una bandadefinida en la parte superior del gel de agarosa indicativa de una integridad ptima del ADN

Funcionalidad: la mayora de las muestras obtenidas con este mtodo permiten la

amplificacin de fragmentos de ADN de elevado tamao molecular (>17.5 kb) mediantereaccin de PCR.


23/27


24/27

21

Tablas RENDIMIENTO obtenido:

1A. Se muestran los datos del rendimiento obtenido para cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en precipitacinpor sales y extraccin con solventes orgnicos.

MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO

PRECIPITACIN CON SALESSOLVENTESORGNICOS

Miller et al.(1988)Gentra

Puregene

Quiagen Genomic

DNAFlexigene DNA RealPure SSS

DNA Isolation Kit for

Mammalian Blood

Tissue DNA Extraction

kit-AGF

Oragene DNA Saliva

Extraction-AGFFenol/ Cloroformo

T

IPODEMUESTRA

sangre perifrica 25 g ADN /ml

de sangre 35 g ADN /ml

de sangre25-35 g ADN/ ml

de sangre. 37 g ADN/ ml

sangre 35 g ADN /ml de

sangre2-5 g ADN/106

clulas30-70 g ADN/ ml de

sangre

CMSPs 13 g ADN/106

clulas

clulas5-7 g ADN/106

clulas

mdula sea2-5 g ADN/106

clulas

clulas fijadas enCarnoy

saliva 55 g ADN /ml

de saliva 140 g ADN/ ml de

saliva.

tejido frescocongelado

3,5 g ADN/ mg

tejidomuy variable

tejidos FFPE 30 g ADN/3 corte

de 8 m

lquido amniotico

cogulo


25/27

22

1B. Se muestran los datos del rendimiento obtenido para cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en adsorcin encolumnas de slice y unin a esferas magnticas.

37 g ADN/ mg

25-35 g ADN/ 10 g

8-16 g ADN/ 10

6

clulas

25 g ADN/ ml de

sangre

0,5-3 g ADN/ ml de

muestra

2-6 g ADN/ mg de

tejido


20 g /200 l

25-33 g ADN/ ml de

sangre

25 g ADN/ ml de saliva

30 g ADN/ ml de sangre25-35 g ADN/ ml de

sangre

15-25 g ADN/ ml o

torunda

1,5-5 g ADN/ 106clulas

1-4 g ADN/ 106clulas

0,2-1,2 g ADN/ mg de

tejido

25-40 g ADN/ ml sangre

mdula sea

Buffy Coat Kit

special

Genomic DNA Isolation

from Saliva

Chemagic Amniotic

Fluid Kit special

Chemagic DNA

Cell Kit special

UNIN A ESFERAS MAGNTICAS

QIAamp DNA FFPE

Tissue

ADSORCIN EN COLUMNAS DE SLICE

TIPODEMUESTRA

Chemagic DNA

Blood Kit

Chemagic DNA

Tissue Kit

Manual PerfectPureTM

DNA Blood Kit

Genomic DNA from

Blood

QiAampDNA Mini

and Blood Mini

lquido amniotico

cogulo

sangre perifrica

CMSPs

clulas

saliva

tejido fresco

congelado

tejidos FFPE

clulas fijadas en

Carnoy


26/27

23

Tablas CALIDAD observada en las muestras:

2A.Se muestran los datos de la calidad observada en cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en precipitacin porsales y extraccin con solventes orgnicos.


PRECIPITACIN CON SALES SOLVENTES ORGNICOS

Miller etal.(1988) Gentra Puregene Quiagen Genomic DNA Flexigene DNA RealPure SSSDNAIsolationKitfor

MammalianBloodTissue DNA Extractionkit-AGF

Oragene DNASaliva

Extraction-AGFFenol/ Cloroformo

TIPODEMUESTRA

sangreperifrica

P:A260/280: 1.8-2P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:

>1.5P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:>1.5 P: 260/280: >1.8;A260/230:> 2

P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:

>1.5P: A260/280: >1.8;A260/230:> P: A260/280 > 1.7; A260/230< 1.5

I: banda definida parte superiorgel


I: banda definida parte superiorgel I: banda definida parte superiorgelI: banda definida parte superiorgel



F: PCRamplificacin > 8,4kb,secuenciacin alta calidad

F: PCRamplificacin>17kb F: PCRamplificacin>17kb F: PCRamplificacin>17kb F: PCR amplificacin>17kbF: PCRamplificacin>17kb enla mayoramuestras . Siempre amplificacin de 7 kb

CMSPs

P: 260/280: >1.8;A260/230:>1.9


clulas

P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:

>1.5

I: banda definida parte superior

gelF: PCRamplificacin>17kb

mdula sea

P: 260/280: >1.8;A260/230:>1


gel

PCR: amplificacin>17 kb

clulas fijadas en Carnoy

saliva

P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:

1.7;A260/230:

>1.4

I: banda definida conleve smear

F: PCRamplificacin>17kb enla

mayora mues tras . Siempre

amplificacinde 7kb

tejidofrescocongelado

P: 260/280: >1.9;A260/230:>1.8

P:260/280:>1.7;A260/230:< 1.5


gelI: banda definida parte superiorgel

PCR: amplificacinbandas :795,

453y 227pb

F: PCRamplificacin>17kb enla mayora

muestras . Siempre amplificacin de 7 kb

tejidos FFPE

P: 260/280: >1.9;A260/230:> 2

I: smearpronunciado

F: PCRamplificacin bandas:

795, 453y 227pb

lquidoamniotico

cogulo

P:pureza

I:integridadF:funcionalidad


27/27

24

2B. Se muestran los datos de la calidad observada en cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en adsorcin en columnas deslice y unin a esferas magnticas.


ADSORCIN EN COLUMNAS DE SLICE UNIN A ESFERAS MAGNTICAS

Manual PerfectPureTM DNABloodKit Genomic DNAfromBlood

QiAampDNAM ini andBloodMini QIAampDNAFFPE Tissue

Chemagic DNABloodKit Chemagic DNATissueKit Chemagic DNABuffy CoatKitspecial

Genomic DNA IsolationfromSaliva Chemagic Amniotic FluidKits pecial

Chemagic DNACell Kitspecial

TIPODEMUESTRA

sangreperifrica

P: A60/280:>1.9;A260/230:>2.1 P: A26 0/280: >1.7;A260/230:1-1.5 P: A26 0/280: >1.7; A260/230: >1.5 P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5

I: bandadefinida parte superiorgel I: bandadefinida partesuperiorgel I: bandadefinidapartesuperiorgel

F: PCR amplificacin>17kb F: PCR amplificacin>17kb F: PCR ampl i f icacin>17kb

CMSPsP: A260/280: >1.7-2.1; A260/230:>1 .5

I: bandadefinidapartesuperiorgel

F: PCR amplificacin>17kb

clulasP: A26 0/280: >1.7 A260/230:> 1 P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5

I: bandadefinida partesuperiorgel I: bandadefinida parte superiorgel

F: PCR amplificacin>17kb F: PCR ampl i f icacin>17kb

mdula sea

clulas fijadasenCarnoy

P: A2 60/280: >1.65; A260/230:> 1

I: banda enpartesuperiorgel consmear

F: PCR amplificacin>7 kb

salivaP: A26 0/280: > 1,7-2;A260/230:>1 P: A26 0/280: >1.7-2.1; A260/230:>1 .5

I: bandadefinidaconlevesmear I: bandadefinida partesuperiorgel

F: PCR amplificacin>7 kb F: PCR amplificacin>17kb

tejidofrescocongelado

P: A26 0/280: >1,7-2 P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5

I: bandadefinida partesuperiorgel I: bandadefinida partesuperiorgel


tejidos FFPE

P: 260 /280 : >1.7-2;A260/230: >2

I: smearpronunciado

F: PCR amplificacin300pb;qPCR:amplificacin 100-150pb

lquidoamniotico

P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5

I: bandadefinidapartesuperiorgel


coguloP: A26 0/280: >1,7;A260/230:>1.5

P:pureza

I:integridadF:funcionalidad

protocolos extracción adn

Documents