relatorio sobre baculovírus

8/18/2019 Relatorio sobre baculovírus

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1. Introdução

A família Baculoviridae compreende vírus capazes de infectar diversas ordens

de insetos, principalmente Lepidoptera (Miller, 1997). No entanto, j foram descritos

!aculovírus em outras ordens, tais como "imen#pteros, dípteros e cole#pteros. Assim

eles t$m sido amplamente utilizados como !iopesticidas para o controle !iol#%ico

(&astro et al ., 1999). 'al família compreende dois %$neros os Nucleopolyhedrovirus ou

vírus da poliedrose nuclear (N*), e os Granulovirus ou vírus da %ranulose (+*) (un-

et al ., 1997). Nos N*, a replica/o viral apresenta dois fen#tipos distintos. *írus

e0tracelulares ou * (do in%l$s budded virus) s/o produzidos na fase inicial da infec/o

e s/o responsveis pela transmiss/o c2lula a c2lula. &om o avano da infec/o, passam

a ser produzidos vírus ocluídos ou 3 (do in%l$s occluded bodies, denominados de

poliedros nos N* e %r4nulos nos +*), os 5uais s/o responsveis pela transmiss/o

entre os insetos (6ummers, M. .8 6mit", +. , 197:).

No meio am!iente, a transmiss/o do vírus para o inseto ocorre pela via oral.

;uando o inseto in%ere um alimento contaminado por poliedros, esses atin%em o

intestino m2dio. 3 p< alcalino do intestino, leva = solu!iliza/o dos poliedros e =

li!era/o dos vírions. ssas partículas virais atravessam a mem!rana peritr#fica devido

= a/o de metaloproteases virais. Ap#s romper a !arreira da mem!rana peritr#fica, os

vírus entram nas c2lulas colunares no intestino, atrav2s de fus/o de mem!ranas ( fig 1).

3 vírus 2 ent/o transportado para o n>cleo atrav2s do citoes5ueleto (6lac- ? Arif,

@7).

Bnicialmente, s/o formados os *s, 5ue dei0am as c2lulas do intestino,

atravessam a mem!rana !asal, atin%em a tra5u2ia ou a "emolinfa e assim podem

infectar os demais tecidos do inseto, como o tecido adiposo, t>!ulos de Malpi%"i e

te%umento (Ceddie, 19:9). Numa fase tardia da infec/o, " intensa produ/o de

poliedrina e a forma/o dos poliedros no n>cleo. Ap#s al%uns dias, a la%arta morre e os

poliedros s/o li!erados no am!iente (Dilliams ? aul-er, 1997). Al%uns !aculovírus,

como o !aculovírus tipo AcMN*, possuem os %enes das proteases catepsina e

5uitinase, 5ue levam = li5uefa/o do inseto. 'al processo facilita a dispers/o do vírus no

am!iente (&orE et al , 1997).

m cultura de c2lulas, a infec/o 2 iniciada com os *s, 5ue entram na c2lula

via endocitose adsortiva. iferentemente, os 3s atin%em a c2lula atrav2s da fus/o

direta de mem!ranas (Fi!eiro, 1999).

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Figura 1: &iclo de infec/o oral do inseto pelo !aculovírus. Fepresenta/o es5uemtica de uma larva de

Lepdoptera. Ao in%erir um alimento contaminado pelos corpos de oclus/o (3), esses atin%em o intestino

m2dio do inseto, onde eles s/o dissolvidos pelo p< alcalino. A partícula viral 2 li!erada e atin%e as c2lulas

colunares do intestino, dando início = infec/o (Adaptado de 6lac- ? Arif, @7).

m cultura de c2lula 2 possível analisar em detal"es a re%ula/o da e0press/o

%$nica em !aculovírus, 5ue pode ser dividida em duas fases principais fase precoce

(early) e fase tardia (late). ssas fases podem ser su!divididas em fase precoce imediata

(immediately early), cujos %enes s/o e0pressos nas primeiras "oras de infec/o, e fase

muito tardia (very late), 5ue representa os %enes 5ue s/o e0pressos ap#s @G "oras de

infec/o (Marunia-, 19:H). A fase imediata se inicia a partir de apro0imadamente @

minutos at2 : "oras p#sIinfec/o (".p.i.) e corresponde !asicamente a fatores de

transcri/o, !em como proteínas pertencentes = ma5uinaria de replica/o viral. 3 NA

do vírus comea ent/o a ser transcrito, ocorre rearranjos do citoes5ueleto e a cromatina

da c2lula "ospedeira se dispersa no n>cleo (riesen, 1997). ;uando o NA viral

comea a ser replicado, iniciaIse a fase tardia. Nessa fase " intensa produ/o de

proteínas responsveis pela constru/o de partículas virais e0tracelulares (*), como a

proteína +HG, principal constituinte do envelope viral. ssa fase se estende at2 @G ".p.i.(Lu ? Miller, 1997). Na >ltima fase da infec/o (very late), 5ue se inicia a partir de 1:

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"oras, a poliedrina, uma proteína de apro0imadamente J-a, 2 lar%amente produzida

para 5ue "aja a forma/o dos corpos de oclus/o. Ao fim ocorre a lise celular

(Fo"rmann, 19:H).

A poliedrina 2 a principal constituinte do vírus ocluído (3*), 5ue ao ser in%erido

pelo inseto 2 dissolvido no intestino m2dio devido ao p< alcalino (un- et al ., 1997).

la compreende mais 9K de todas as proteínas virais na fase very late (arvis, 1997).

evido a sua alta produ/o, o l#cus da poliedrina 2 comumente utilizado para a

constru/o de !aculovírus recom!inantes como vetor de e0press/o (Fo"rmann, 19:H).

3 sistema de e0press/o em !aculovírus vem sido utilizado desde a d2cada de

19: (6mit" et al , 19:J). roteínas de diferentes or%anismos podem ser e0pressas

atrav2s desse sistema. ara isso, o %ene de interesse deve ser introduzido no l#cus de um

%ene n/o essencial para a replica/o viral, como o %ene da poliedrina, so! o comando de

um promotor forte (3FeillE et al , 199G). 3 promotor da poliedrina 2 um dos mais

utilizados para esse o!jetivo. Al2m dele, o promotor da proteína p1 tam!2m 2

amplamente empre%ado (Fo"rmann, 19:H).


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ara anlise de infec/o e produ/o de proteína "eter#lo%a foram utilizados os

vírus AcMN*, v6En+al (Lee ? Miller, 197:), v6En&rE1& (A%uiar, @H), v6EnPe

(Mac"ado, @7) e M7 (Foc"a, ., n/o pu!licado). 'ais vírus foram utilizados para

infectar uma placa de H poos de c2lulas 'NK o meio das c2lulas foi retirado, foi

adicionado KQL de vírus (cerca de 1: vírusRmL) e as c2lulas foram incu!ados por 1

"ora a temperatura am!iente. A se%uir, foi adicionado @KQL de meio '&I1 contendo

1 de 6. As c2lulas foram foto%rafadas diariamente em um microsc#pio de luz

invertida (Seiss A0iovert @), com um aumento de G vezes, para acompan"amento

dos efeitos citopticos causados pelo vírus.

9H "oras p#sIinfec/o o e0trato de c2lulas foi coletado. As c2lulas foram

coletadas e centrifu%adas por K minutos, J. rotaTes por minuto (FM). 3

so!renadante foi descartado e o pellet foi lavado tr$s vezes com 1 mL de 6, com o

intuito de eliminar o e0cesso de al!umina !ovina da amostra (proteína a!undante no

6). or fim, o pellet foi ressuspendido em KQL de 6. As amostras foram

analisadas em %el de poliacrilamida (66IA+).

#el de $olia!rila"ida desnaturante %&%'(A#)

3 %el de poliacrilamida 2 composto por um %el separador e um %el concentrador.

3 %el separador contendo 1@ de acrilamida foi preparado em tamp/o trisI


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uas placas contendo cerca de 1H c2lulas 'NK cada foram infectadas com o

vírus v6En+al. 6ete dias p#s infec/o (dpi) o material foi coletado, centrifu%ado por K

minutos a J. FM para remover o e0cesso de c2lulas e o so!renadante coletado. 3

so!renadante 2 o esto5ue viral e nele encontramIse os budded vírus (*). 1,K mL do

so!renadante foram coletados para uma miniIprepara/o de NA. 3 material restante

(JJ mL) foi utilizado para uma purifica/o de * em lar%a escala. @: mL do esto5ue

viral foram colocados em tu!os para ultracentrífu%a (ec-man 6D@:).

&uidadosamente, foi colocado no fundo do tu!o, com uma pipeta de vidro, J mL do

colc"/o de sacarose (@K de sacarose, pesoRvolume, em K mM de Na&l e 1 mM de

'A). 3s KmL restantes do esto5ue viral foram adicionados sem pertur!ar o colc"/o.

A amostra foi centrifu%ada a @G. FM, por 7K minutos, a GZ&. 3 so!renadante foi

descartado e o pellet ressuspendido em @ mL de 6.

)tração de &/A de +, Anlise )letroforéti!a do &/A ,iral (urifi!ado e &igerido

oi e0traído NA viral do so!renadante da infec/o com v6En+al e do *

v6En+al purificado. ara a miniIprepara/o, utilizando o so!renadante, a amostra foi

centrifu%ada a 1G. FM por @K minutos, o so!renadante descartado e o pellet

(concentrado viral) ressuspendido em 1QL de tamp/o de disrup/o viral (1mM trisI


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de restri/o. As reaTes de restri/o foram @QL de tamp/o 1V, @QL de 6A 1m%RmL,

,JQL de enzima 1@ unidadesRQL e NA (@QL do NA do * purificado e KQL do

NA de so!renadante). 3 volume final das reaTes foi @QL e as mesmas foram

analisadas em %el de a%arose ,:.

0ransfor"ação &1+a! e (C de !ol4nia

&2lulas


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reviamente, c2lulas


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transfec/o foi o!servada ao lon%o de uma semana. 3 NA viral utilizado n/o possui o

%ene da poliedrina. &aso ocorra a recom!ina/o "om#lo%a, o %ene da poliedrina

presente no plasmídeo 2 inte%rado ao %enoma viral. essa forma, somente os vírus

recom!inantes apresentar/o forma/o poliedros.

9H "oras p#sIinfec/o "avia uma contamina/o por fun%o na placa. 3

so!renadante foi recol"ido, filtrado em um filtro de ,@@ Qm e o material o!tido foi

utilizado para infectar uma nova placa de c2lulas 'NK. As c2lulas foram o!servadas

em microsc#pio de luz invertida para o!servar a presena ou aus$ncia de poliedros.

Figura 2: Mapa do plasmídeo p6En6s'0 produzido no pro%rama *ectorN'B (Bnvitro%en). 3 %ene

da to0ina de aran"a cont2m um peptídeo sinal e um pr2Ipeptídeo sinal e est so! o comando dos

promotores pVB (promotor da poiedrina modificado) e p6En. 3 plasmídeo cont2m ainda o %ene da

poliedrina do vírus AcMN* e as re%iTes de recom!ina/o "om#lo%a (3F 1H@9 e 3F HJ).

)nsaio da atividade da lu!iferase

&2lulas 'NK foram infectadas com o vírus vA%ie1luc, 5ue possui o %ene da

luciferase do va%alume so! o comando do promotor de !aculovírus ie1. As c2lulas e o

so!renadante foram coletados e centrifu%ados a J. FM, por K minutos. 3

so!renadante (esto5ue viral) foi coletado para titula/o. 3 pellet de c2lulas foi

ressuspendido em GQL de tamp/o de lise (1M 'ris


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0itulação

&2lulas \LIA+ foram diluídas em meio '&I1 com 1 de 6 para

o!ten/o de uma concentra/o de 1K c2lulas RmL. 3 esto5ue do vírus vA%ie1luc foi

diluído em meio '&I1 com soro. oram preparadas diluiTes seriadas de 1 I1, 1I@,

1IJ, 1IG, 1IK, 1IH, 1I7 e 1I:. As diluiTes 1I1, 1I@, 1IJ e 1IG foram descartadas, pois,

como a 5uantidade de vírus presente 2 alta, todos os poos apresentariam infec/o. ez

microlitros de cada dilui/o viral (1IK, 1IH, 1I7 e 1I:) com @ QL de c2lulas foram

distri!uídos na placa de 9H poos. ;uatro poos foram reservados como controle,

contendo apenas c2lulas. A placa foi incu!ada a @HZ& por sete dias. 6e%undo esta

metodolo%ia, o título viral 2 e0presso em '&BKRmL (Tissue Culture nfectious !ose

K), ou seja, a 5uantidade de vírus necessria para produzir efeito citoptico em K

das c2lulas inoculadas. 3 clculo foi feito conforme descrito por 3FeillE et al (199G).

. esultados e dis!ussão

Anlise da infe!ção viral e" !ultura de !élula

As c2lulas infectadas com os vírus AcMN*, v6En+al, v6En&rE1&, v6EnPe e

M7 foram foto%rafadas ao lon%o de 7 "oras de infec/o para o!serva/o dos efeitos

citopticos (fig 3 e ). &om @@ "oras de infec/o n/o 2 possível o!servar efeitos nas

c2lulas, com GH "oras de infec/o foi possível o!servar pe5uenas alteraTes nas c2lulas

infectadas com os vírus AcMN*, v6En&rE1& e v6EnPe. No entanto, apenas com 7

"oras de infec/o os efeitos citopticos tornaramIse evidentes.

As c2lulas n/o infectadas (moc-) se dividiram ao lon%o do tempo e com 7

"oras de cultivo, a placa estava completamente preenc"ida por uma monocamada dec2lulas (fig 3C). 3 vírus AcMN* selva%em (fig 3&; ); F) provocou morte celular,

"ipertrofia nuclear e 7 "oras p#s infec/o ("pi) "ouve forma/o de poliedro (fig 9A).

3 vírus v6En+al n/o causou efeitos citopticos e 7"pi a morfolo%ia das c2lulas era

semel"ante =s c2lulas moc- (fig 3I). rovavelmente "avia al%um pro!lema com o

esto5ue viral usado inicialmente.

Al%umas c2lulas infectadas com o vírus v6En&rE1& apresentaram n>cleo

"ipertrofiado ap#s 7 "oras de infec/o (fig C) e "ouve forma/o de cristais (fig 9+),

uma vez 5ue a proteína &rE1& se cristaliza. 3 vírus v6EnPe e0pressa a proteína do

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envelope do vírus da fe!re amarela. 'al proteína induz a forma/o de sincício em

c2lulas de mos5uitos e em c2lulas "umanos. 3 mesmo efeito citoptico foi o!servado

nas c2lulas de lepid#ptero (fig 9C). 3 vírus M7 cont2m o %ene da poliedrina, mas n/o

foi o!servada a forma/o de poliedros 7"pi (fig I).

Figura 3: Anlise dos efeitos citopticos em c2lulas 'NK infectadas por diferentes vírus. &2lulas 'NK

com (A) @@ "oras, () GG "oras e (&) 7 "oras de cultivo. &2lulas 'NK infectadas com cerca de 1 G

vírus de AcMN* selva%em () @@ "oras, () GG "oras e () 7 "oras p#s infec/o ou do vírus v6En+al

(+) @@ "oras, (


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A B C

Figura : Anlise dos efeitos citopticos em c2lulas 'NK infectadas por diferentes vírus. &2lulas 'NK

infectadas com cerca de 1G do vírus v6En&rE1& com (A) @@ "oras, () GG "oras e (&) 7 "oras de

infec/o8 do vírus v6EnPe com () @@ "oras, () GG "oras e () 7 "oras de infec/o ou do vírus

v6En+al com (+) @@ "oras, (


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1 2 3

4 5 6

7

1 2

34 5

%&%'(A#)

3 e0trato das c2lulas infectadas com os vírus AcMN*, v6En+al, v6En&rE1&,

v6EnPe e M7 foi coletado 9H"pi e analisado em um %el de poliacrilamida ( fig


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1 2 3 4 5

6 7 8 9

10 11 12 13

1 2 3 4 5

6 7 8 9

10 11 12

Figura =: Anlise eletrofor2tica em %el de a%arose ,: do NA de * intacto e di%erido com a enzima

coFB. (1) 1-! NA Ladder (ermentas), (@) NA e0traído a partir do * purificado, (J) di%est/o com

coFB, (G) NA e0traído a partir do so!renadante de infec/o, (K) di%est/o com coFB.

(C de !ol4nia

N/o ocorreu a transposi/o do %ene Lap @ para o !acmídeo, conforme foi

confirmado utilizando os primers M1J e LAF (fig >A) ou M1J e M1JF (fig >+).

ara controle positivo da rea/o foi coletada uma colUnia azul e utilizados os primers

M1J e M1JF. &om isso, foi amplificado um fra%mento com cerca de J pares de

!ase (!p), correspondente ao fra%mento do !acmídeo sem a transposi/o do %ene de

interesse.

*A-

*+-

Figura >: &F das colUnias de


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1 2 3 4

5 6 7 8

9

!anda mais forte de H-a, o taman"o esperado para a protease LA. ara confirmar se

essa !anda se trata da proteína de interesse dever ser realizado um "estern blot .

Figura ?: Anlise dos efeitos citopticos em c2lulas 'NK transfectadas com o plasmídeo pastacLA

7 dias p#s transfec/o. Seiss A0iovert @, GV.

Figura 1: Anlise em 66IA+ do perfil de !andas prot2icas de c2lulas 'NK (@, J e G) transfectadas

com o plasmídeo pastacLA@, infectadas com (K) v6EnPe, (H) v6En&rE1&, (7) v6En+al, (:)

AcMN* ou (9) c2lulas n/o infectadas. No poo 1, marcador enc"mar- (Bnvitro%en). 6eta indica a

altura esperada para a protease LA.

Co'transfe!ção do &/A viral v%7n#al !o" o vetor de transfer8n!ia $%7n'(('(%'

+s0 e" !élulas 0/9+

&2lulas 'NK foram foto%rafadas 7@ "oras ap#s a coItransfec/o ( fig 11A).


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A B

Figura 11: *A- Anlise dos efeitos citopticos em c2lulas 'NK coItransfectadas com o NA viral

v6En+al e o vetor de transfer$ncia p6EnII6Is'0 ap#s 7@ "oras. GV *+- Anlise dos efeitos

citopticos em c2lulas 'NK infectadas com o so!renadante da coItransfec/o do NA viral e o vetor de

transfer$ncia 7@ "pi. @V. Seiss A0iovert @.

)nsaio da atividade da lu!iferase

A leitura da luminesc$ncia de fundo das c2lulas antes da adi/o do su!strato

luciferina foi de ,H: unidades luminosas (\L). Ap#s a adi/o do su!strato esse valor

foi superior a 9.999 \L, indicando a presena da luciferase na amostra.

0itulação

A dilui/o 1IG infectou todos os @G poos, as diluiTes 1 IK e 1IH

infectaram 7 e @ poos, respectivamente. A dose 5ue fornece K da resposta, '&BK

RmL, foi calculada em uma planil"a do 0cel (fig 12) de acordo com o descrito por

3FeillE et all (199G). 3 título encontrado foi de K,:@]H '&BKRmL, o 5ue

corresponde a G,1]H pfuRmL (unidade formadora de placa).

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Figura 12: &lculo da titula/o viral numa planil"a de 0cel.

9. Con!lus@es

Ao lon%o do curso foi possível comprovar 5ue os !aculovírus s/o ferramentas

!iotecn#%icas poderosas para o controle !iol#%ico, e0press/o "eter#lo%a e potenciais

vetores de terapia %$nica. 3s e0perimentos realizados permitiram compreender as

t2cnicas utilizadas para a constru/o de um !aculovírus recom!inante e como analisar

os par4metros desejados.


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FB6N, . . Fe%ulation of !aculovírus earlE %ene e0pression. The baculoviruses.

lenum rest, Ne^ Por-. 7IJ@, 1997.

\NC, &. .8 FA\NA+L, 6. &.8 F3


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and function. )irus research. H9 99I1HK, @7.

6MB'

relatorio sobre baculovírus

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