MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM

INTRODUÇÃO

A coloração de Gram é a técnica de coloração bacteriana mais difundida em Microbiologia. A

técnica foi descrita em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram, quando este procurava

uma forma de caracterizar pneumococos do tecido pulmonar de pacientes mortos de pneumonia (Barbosa &

Torres, 1999). Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes

corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas

de Grampositivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas (Ministério da Saúde, 2001).

A técnica se baseia nas diferenças estruturais existentes entre os envoltórios celulares de bactérias

Gram positivas e Gram negativas, e originalmente consistia no tratamento sucessivo de um esfregaço

bacteriano fixado por calor com os reagentes violeta genciana, lugol, álcool-acetona e fucsina (Ministério da

Saúde, 2001). No entanto, a técnica sofreu algumas modificações ao longo do tempo: o reagente violeta

genciana foi substituído por outro tipo de cristal violeta: o violeta de metila; o álcool-acetona foi substituído

por álcool etílico 95% por ser mais seguro ao manuseio e não causar hiperdescoloração caso o operador

não fosse muito habilidoso; e a fucsina foi substituída pelo corante vermelho safranina devido à sua

distância do violeta no espectro de cores, o que permite diferenciar com maior nitidez tanto as bactérias

gram positivas das bactérias gram negativa quanto diferenciar ambos os tipos bacterianos da coloração de

fundo, que assume a cor vermelho-claro (Ministério da Saúde, 2001). A figura abaixo exemplifica o processo

de coloração de Gram.

Figura 1. Exemplificação do processo de coloração de Gram (extraído de

http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com.br/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html)

A coloração de Gram depende das particularidades estruturais do envoltório das bactérias Gram

positivas e Gram negativas. A parede das bactérias Gram positivas é formada principalmente por uma

camada espessa de peptideoglicano, que consiste em uma molécula única, gigante, formando um envoltório

completo ao redor da célula bacteriana (Barbosa & Torres, 1999). A parede celular das bactérias gram

negativas tem uma composição química mais complexa, sendo formada por uma camada fina de

peptideoglicano, que está firmemente ancorado à membrana externa por lipoproteínas. Entre o

peptideoglicano e a membrana externa situa-se o espaço periplasmático, região fundamental para a

sobrevivência da célula bacteriana Gram negativa, uma vez que age como tampão osmótico e também

apresenta muitas proteínas hidrolíticas, enzimas de degradação de substancias tóxicas, proteínas

especificas de ligação de solutos e proteínas respiratórias (Barbosa & Torres, 1999). As figuras 2 e 3

ilustram as diferenças estruturais entre bactérias Gram positiva e Gram negativas.

Figura 3. Parede de bactéria gram positiva (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of

Microorganisms, 2009)

Figura 2. Parede de bactéria gram negativa (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of

Microorganisms, 2009)

O mecanismo de coloração de Gram pode ser descrito da seguinte maneira: as bactérias Gram

positivas e as bactérias Gram negativas absorvem o corante primário cristal violeta de maneira idêntica,

tornando-se roxas. Quando o lugol é aplicado, com objetivo de fixar o corante primário nas células, forma-se

um complexo insolúvel violeta-iodo (complexo iodo-pararosanilina ou CV-I) no citoplasma das células

bacterianas. A etapa de descoloração é critica para a identificação bacteriana. A lavagem com álcool etílico

95% causa a desidratação das paredes celulares das bactérias Gram positivas, o que diminui a porosidade

e a permeabilidade do peptideoglicano, fazendo com que o complexo CV-I não possa sair das células, que

permanecem roxas. Já nas bactérias Gram negativas, a lavagem com álcool 95% causa a extração dos

lipídios da membrana externa, aumentando a porosidade, o que permite que o complexo CV-I seja removido

das células. A coloração com safrarina cora apenas as bactérias que foram descoradas com o álcool.

Portanto, as bactérias Gram negativas tornam-se vermelhas por serem coradas pela safranina, enquanto

que as bactérias Gram positivas permanecem violetas por não terem sofrido descoloração na etapa de

lavagem com álcool 95% (Departamento de Microbiologia ICB/UFMG).

MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização do experimento foram utilizadas 5 culturas de bactérias, sendo 4 delas contendo

espécies conhecidas, a saber: E. coli (A), S. aureus (B), B. subtilis (C) e S. mutans (D); a quinta cultura (E)

possuía composição desconhecida e era necessário realizar a identificação da espécie ou espécies contidas

na cultura através de diferenciação pelo método de Gram.

O experimento de coloração consistiu dos seguintes procedimentos, que foram realizados com

todas as culturas bacterianas:

1. Cinco lâminas foram devidamente identificadas com uma letra (A,B,C,D e E). Foi, então,

feito um esfregaço com cada cultura separadamente e cada lâmina foi fixada pelo calor;

2. Cada esfregaço foi, então, coberto com violeta genciana durante 1 min, e posteriormente

lavado com água corrente;

3. O passo seguinte consistiu-se da aplicação de lugol sobre os materiais corados, e espera

de 1 min, com posterior lavagem com água corrente;

4. Foi, então, feita a lavagem com álcool até que não mais se observasse a saída de corante;

lavaram-se as lâminas, então, com água corrente.

5. As laminas foram contra coradas com fucsina por 20 seg. e depois lavadas com água.

Foram, então, secas e observadas ao microscópio óptico.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Os resultados encontrados para cada cultura em relação à coloração de Gram e à

morfologia das células foram os seguintes:

A: E. coli é Gram negativa e possui forma de cocos;

B: S. aureus é Gram positiva e possui forma de cocos, mas foram encontrados

alguns poucos estafilococos;

C: B. subtilis é Gram positivo e possui forma de bacilo;

D: S. mutans é Gram positivos e possui forma de cocos;

E: A cultura desconhecida é uma mistura de cocos Gram positivos e Gram

negativos;

Os resultados encontrados para as culturas A, B, C e D testadas pelo Método de Gram estavam de

acordo com a literatura (Anvisa, 2008). Na cultura E, composta por bactérias desconhecidas, foi encontrado

um mistura de bactérias Gram positivas e Gram negativas, sendo que as Gram positivas estavam em maior

número. Pela coloração apresentada e pela morfologia celular foi possível identificar as bactérias

desconhecidas como sendo E. coli (coco Gram negativo) e S. mutans (cocos Gram positivos).

Em relação à morfologia celular, o esfregaço de B subtilis e S. mutans estavam de acordo com a

literatura em relação à morfologia (Anvisa, 2008; Souza, T.M.P.A). Para as outras culturas foram

encontradas algumas discrepâncias em relação à literatura:

Para E. coli o esfregaço feito mostrou cocos Gram negativos. A literatura aponta que E. coli

possui morfologia de bacilo (Anvisa, 2008).

Para S. aureus o esfregaço mostrou cocos Gram positivos. No entanto, a literatura aponta

que a espécie possui morfologia de estafilococo (Anvisa, 2008), gênero ao qual pertence.

As discrepâncias observadas entre a morfologia encontrada e aquela apontada pela literatura se

devem principalmente à falta de habilidade na preparação dos esfregaços no caso de S. aureus, o que

rompeu os cachos, mostrando células separadas e dando, portanto, a indicação errônea da morfologia

dessa espécie. Para E. coli a identificação errônea da morfologia se deve à dificuldade de discernimento

dos bacilos, uma vez que eles são bacilos mais arredondados e podem também ser classificados como

cocobacilos (Rangel, P.M, 2007), o que pode facilmente confundi-los com cocos.

BIBLIOGRAFIA

Anvisa. Curso de Capacitação dos Laboratórios de Microbiologia dos Hospitais Sentinelas e Lacen: Identificação bioquímica e avaliação do perfil de resistência microbiana. 2007. Disponivel em <http://s.anvisa.gov.br/wps/s/r/EL> Acesso em 07 mar. 2013.

Barbosa, Heloiza Ramos; Torres, Bayardo Baptista. Microbiologia Básica. 1 edição. São Paulo:Atheneu, 2001.

Departamento de Microbiologia. Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade Federal de Minas Gerais. Material de apoio coloração diferencial de Gram. Disponível em http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=19> Acesso em 07 mar. 2013.

MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., DUNLAP, P.V., CLARK, D.P. Brock: Biology of Microorganisms. 12th. ed. Pearson: Benjamin Cummings, San Francisco, Estados Unidos, 2009. 1061 p.

Microbiologia online. Microbiologia online com foco em coloração de Gram. 2010. Disponível em http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com.br/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html Acesso em 07 mar. 2013

Ministério da Saúde. Técnicas de coloração de Gram. Brasília: 2001. Disponível em <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf> Acesso em 07 mar. 2013.

Rangel, Patrícia Merenda. PERFIL GENÉTICO E MICROBIOLÓGICO DE CEPAS DE Escherichia coli ISOLADAS DE LEITE MASTÍTICO BOVINO. Jaboticabal: UNESP, 2007. 73p. Tese (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Jaboticabal, 2007.

Souza, Tricia Murielly Pereira Andrade de. ADERÊNCIA IN VITRO DE Streptococcus mutans À SUPERFÍCIE DE DOIS TIPOS DE BRAQUETES ORTODÔNTICOS. João Pessoa: UFPA, 2007, 57 p. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Odontologia, da Universidade Federal da Paraíba em cumprimento às exigências para conclusão.