PRINCIPAIS MÉTODOS DE COLORAÇÃO

• Bactérias � afinidade por um grande no de corantes

• pp/ derivados básicos da anilina �(azul de metileno, violeta de genciana, tionina, fucsina

básica, etc.)

�coloração com apenas 1 corante �coloração simples.

�diferenciais � auxiliam na taxonomia bacteriana:

�Método de Gram

�Ziehl Neelsen,

�Albert-Laybourn

• Outros métodos também podem auxiliar na visualização:

�Fontana Tribondeau

Coloração de Gram

� Bactérias � coram-se por derivados da rosanilina(violeta genciana, cristal-violeta, metil-violeta, etc.)

� e depois tratadas pelo iodo (solução iodo-iodetada - Lugol)

� composto iodopararosanilina� retido pelas bactérias G+ �não pode ser facilmente

removível pelo tratamento subsequente com o álcool � Gram - � composto é facilmente descorado pelo álcool.� Após ação do álcool �coloração de fundo pela fucsina ou safranina

�Gram negativas � vermelhas (corante de fundo)

�Gram positivas � roxas (cor do corante inicial)

�Diferenciação � importante na sistemática bacteriana � Diferenças na parede celular das bactérias

�Podemos formular 2 regras gerais simples:

1-Cocos geralmente são Gram + � exceção do gênero Neisseria (gonococo e meningococo)

2-Bastonetes geralmente são Gram - �exceção das Corinebactérias, Listérias*, Bacillus e os Clostridios.

Método de Gram:

� área de segurança do bico de bunsen � esfregaço fino do material numa lâmina �limpa e desengordurada.

� Deixar secar na área de segurança� Fixar o esfregaço � face posterior da lâmina 3 x na chama � Corar 1 minuto com solução de cristal violeta fenicada� Escorrer o corante e cobrir durante 1’ c/ solução de Lugol

�Iodo – 1g, iodeto de potássio - 2g, água destilada – 300ml

� Lavar em água corrente� Diferenciar com álcool a 95° � tempo delicado� Lavar em água corrente� Corar o fundo ≅30s com fucsina

ou safranina diluída� Lavar e secar

Coloração de Ziehl Neelseen

� Baseada na propriedade das micobactérias de resistirem ao descoramento com uma solução de álcool-ácido após tratamento pela fucsina fenicada à quente.

� Micobacterium leprae e Micobacterium tuberculosis� permanecem coradas de vermelho� outras �não possuem esta propriedade

� tomam a cor do corante de fundo.� álcool-ácido-resistência �lipídeos

fortemente ligados �parede celular da micobactéria

Método de Ziehl Neelsen

� Proceder a técnica do esfregaço (como na coloração anterior)

� Corar a lâmina c/ fucsina de Ziehl concentrada � aquecer a lâmina até a emissão de vapores durante 5 minutos

(evitando a ebulição do corante)

� Escorrer o corante e diferenciar com álcool-ácido clorídrico a 1% (álcool 95° - 100ml, ácido clorídrico, dens. 1,19 – 1ml)

� Lavar em água corrente� Corar o fundo (≅30 seg.) com solução diluída de azul de

metileno (azul fenicado de Kühne ou azul alcalino de Loeffler a 1:10)

� Lavar e secar� Bacilos álcool-acido resistentes vermelhos� outros mos e núcleos celulares � azuis.

Coloração de Albert-Layborn

� Algumas bactérias � corpúsculos citoplasmáticos localizados nas regiões polares da célula bacilar � (corpúsculos metacromáticos ou corpúsculos de Babes Ernst)

� coram-se pelo Lugol forte � cor marrom� evidenciando-se em contraste com o corpo bacilar

�verde-azulado pela solução de Laybourn. �característico das Corinebactérias e Difteróides

� Possibilitam diagnóstico presuntivo �pela microscopia ótica.

Método de Albert-Laybourn

(Esfregaço homogêneo, delgado e fixado)

�Cobrir o esfregaço ± 5 min c/ a solução de Albert-Layborn.�Escorrer (sem lavar).�Cobrir com solução Lugol forte por ± 2 minutos.�Lavar e secar.�Observar em objetiva de imersão (100 x).

Obs-Solução de Albert:Azul de toluidina (0,15g), Verde de malaquita (0,2g), Ác.Acético glacial (1ml), Álcool 95o (2ml), Água destilada (100ml)

e

(a) cocos G+ em cadeias (estreptococos) (d) cocos G - (Neisseria)(b) bastonetes G+ (Listeria) (e) BAAR(c) bastonetes G - (E.coli)

Método de Fontana-Tribondeau

CORANTES:

1. Líquido de Ruge (fixador)

1. Mordente

• Dissolver o ácido fênico na água. • Colocar o ácido tânico em um balão e adicionar cerca de 10ml da

água fenicada e misturar bem para dissolver o máximo possível. • Acrescentar o restante da água fenicada para completa dissolução.• No dia seguinte, filtrar, se necessário.

3. Nitrato de Prata Amoniacal (solução impregnadora)

• Reservar 5 ml da solução acima. • Aos 95 ml restantes, adicionar amônia, gota a gota (misturando sempre)

até que o precipitado de cor castanho-acinzentada se dissipe.• Adicionar, então, gotas da solução de nitrato de prata reservada, até

desenvolver uma leve opalescência que persiste após agitação. • Armazenar em frasco escuro.

Ácido acético glacial…………… ..….1mlFormalina (40% v/v de H.CHO)…… .2mlÁgua destilada…………………… .100ml

Ácido tânico………………………… ..5gÁcido fênico (fundido)……………… 1mlÁgua destilada…………………… .100ml

Nitrato de prata……………………… ..5gÁgua destilada…………………… .100ml

TÉCNICA:

• Secar o esfregaço ao ar;• Colocar algumas gotas da solução fixadora (renova-la 3x

durante 30 segundos a fim de "desemoglobinizar" o esfregaço)

• Cobrir c/ mordente , aquecendo até emitir vapores �aguardar 30seg.

• Lavar em água corrente• Tratar c/ solução impregnadora de nitrato de prata

amoniacal, aquecendo ligeiramente (emissão de vapores)por 30 segundos (a preparação deve tomar a cor marrom) Lavar bem em água corrente

• Secar com papel de filtro• Examinar com objetiva

de imersão

FIM