UNESP –

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

MEDICINA

Disciplina de Microbiologia Humana

AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA

2013

ÍNDICE

LEMBRETES IMPORTANTES ..................................................................................... 3

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS .......................................................................... 3

MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA................................ 4

MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO .... 7

CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS ..................................................... 9

GENÉTICA BACTERIANA (CONJUGAÇÃO) ............ Error! Bookmark not defined.

DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS ................... 15

STREPTOCOCCUS ..................................................................................................... 16

STAPHYLOCOCCUS .................................................................................................. 19

PSEUDOMONAS ......................................................................................................... 23

ENTEROBACTÉRIAS ................................................................................................. 25

3

LEMBRETES IMPORTANTES

1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o

uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em

uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do

ambiente fora do laboratório.

2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são

realizados.

3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente

(derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de

qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.).

4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.

5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.

6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que

deixe os pés expostos.

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório

individual da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso

da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente

deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo

menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em

seu relatório, mesmo que o entregue.

Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de

forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos

experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais

que duas folhas.

4

MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA

Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das

lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram

coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas

pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração

(como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco

ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a

observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando

bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e

corada pelo método de Ziehl-Neelsen.

Coloração de Bactérias pelo Método de Gram

1) Material

- Lâminas contendo o esfregaço de bactérias

- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool

95%, fucsina.

2) Técnica

a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1

minuto.

b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol.

Esperar 1 minuto.

c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto,

deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a

inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados

quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos.

d) Lavar a lâmina em água corrente.

e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30

segundos a 1 minuto.

f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de

filtro.

g) Observar ao microscópio e desenhar.

5

Observar e Desenhar:

Lâmina B (Staphylococcus aureus)

Forma:________________

Gram: ________________

Lâmina A (Escherichia coli)

Forma:________________

Gram:_________________

Lâmina C (Streptococcus agalactiae)

Forma:________________

Gram: ________________

6

Lâmina E (Neisseria sp.)

Forma:________________

Gram:_________________

Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR)

(Mycobacterium tuberculosis)

Lâmina D (Bacillus cereus)

Forma:________________

Gram: ________________

7

MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO

BACTERIANO

A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias

Material

- Cultura A (Escherichia coli)

- Cultura B (Staphylococcus aureus)

- Cultura C (Streptococcus agalactiae)

- Caldo sintético

- Caldo comum

- Caldo glicosado (caldo comum mais glicose)

- Alça de níquel cromo

Técnica

1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.

2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.

3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).

4. Anotar os resultados.

Cultura Crescimento em:

caldo sintético Caldo comum caldo glicosado

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae

8

B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano

Material

- Meio de Tiogel

- Caldo simples

- Cultura A (Escherichia coli)

- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)

- Cultura F (Clostridium sp.)

- Pipeta Pasteur

- Alça de níquel cromo

Técnica

Com a pipeta Pasteur, semear cada uma das culturas em tubos de tiogel.

Em seguida, semear a cultura F (Clostridium sp.), com alça de níquel

cromo, em caldo simples. Colocar todos os tubos na estufa. No dia

seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a localização do

crescimento e, no caldo simples, se houve ou não crescimento.

Culturas Local de crescimento no meio de tiogel

Superfície Toda extensão Base do Meio

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Clostridium sp.

9

CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS

A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias

Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada

ou não.

Material

- Cultura A em ágar inclinado (bactéria não esporulada)

- Cultura E em ágar inclinado (bactéria esporulada)

- Tubo contendo 1 ml da solução salina esterilizada

- Placas de Petri contendo ágar nutriente

- Banho-Maria a 60º C

- Alça de Níquel cromo

Técnica

1. Divida uma placa de ágar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes

períodos de tempo em cada um: 0’, 5’, 10’ e 15’.

2. Coletar com a alça de níquel cromo, um pouco do crescimento da cultura A e

passar para o tubo contendo solução salina. Homogeneizar a suspensão.

3. Inocule (com a alça de níquel cromo) a suspensão no quadrante

correspondente ao tempo 0’.

4. Coloque o tubo com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 10', 20' e 30',

retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri

(proceda exatamente como no item 2).

5. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.

6. Fazer o mesmo com a cultura E

6. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do

tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++,

conforme a intensidade de crescimento).

Cultura Tempo de aquecimento

0’ 5’ 10’ 15’

Escherichia coli

Bacillus cereus

10

B) Efeito de agentes químicos (antisséptico para enxague bucal)

Material:

03 zaragatoas estéreis

Anti-séptico bucal de uso comercial

01 placa de ágar-nutriente

Procedimento:

1. Divida uma placa de ágar nutriente em 3 quadrantes, marcando A (antes

do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo

tratamento).

2. Friccionar uma zaragatoa estéril na mucosa da buchecha e semear no

quadrante A em zigue-zague.

3. Bochechar com parte do o anti-séptico bucal fornecido por 1 minuto.

4. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material

semeando no quadrante B.

5. Bochechar novamente com o anti-séptico bucal por 1 minuto.

6. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante

C.

7. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.

Resultados:

Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento microbiano com cruzes

(de + a ++++) na tabela abaixo.

A B C

Crescimento

Microbiano

A (antes do tratamento),

B (depois do primeiro tratamento)

C (depois do segundo tratamento).

11

C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias (álcool iodado a 0,1% de

acordo com o tempo)

Técnica

1. Umedeça uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Após retirar o excesso

de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a

vigorosamente no dorso de uma das mãos;

2. Passe a zaragatoa em área correspondente à metade de uma placa com ágar

nutriente;

3. Umedeça uma segunda zaragatoa em álcool iodado a 0,1% e esfregue no

dorso da outra mão;

4. Aguarde 2 minutos para que haja ação do antisséptico;

5. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando

cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Inocule, passando a

zaragatoa na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente;

6. Incube a placa na estufa, durante uma noite.

7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo.

Sem álcool-

iodado 0,1%

Com álcool-iodado

0,1%

Crescimento

Microbiano

12

GENÉTICA BACTERIANA

CONJUGAÇÃO

Material:

01 Placa de MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal), Cloranfenicol

(Clo), e 01 placa de ágar MacConkey contendo Nal + Clo

Culturas A (Escherichia coli C600, lac-) e B (Escherichia coli J53, lac+) em

meio líquido

01 tubo contendo 01 mL de caldo nutriente estéril

02 pipetas descartáveis e estéreis

Alça de níquel cromo

Procedimento:

1. Transfira para o tubo de ensaio contendo caldo nutriente estéril 1 mL da

cultura A e 1 mL da cultura B.

2. Incube a mistura a 37ºC durante aproximadamente 01 hora.

3. Após o período de incubação, semeie as amostras A, B e a mistura (M) nas

placas contendo meio seletivo MacConkey, com antibóticos (Nal + Clo), conforme

o esquema abaixo.

4. Para controle das culturas A e B, semeie cada uma das culturas recebidas

para essa aula prática em placas de ágar MacConkey contendo Nal e Clo

(separadamente), visando definir a capacidade das amostras em fermentar da

lactose e o perfil de resistência.

5. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte.

13

Resultados:

Registre os resultados obtidos na tabela abaixo:

Bactéria

Crescimento em ágar

MacConkey: Fermentação

da lactose

Padrão

de Resistência Nal Clo Nal + Clo

A

B

M

Nal (ácido nalidíxico, 50 g/mL), Clo (cloranfenicol, 50 g/mL )

Quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido?

Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos

moleculares?

14

Análise Molecular do Experimento de Conjugação

Eletroforese do DNA em gel de agarose das amostras A, B e da resultante da

mistura M

Atividade:

Identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras empregadas

nessa aula prática no gel apresentado acima.

Perfil

Plasmidial

Amostra

1

2

3

15

DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS

Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby

Material

- Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos

contendo drogas distintas

- Régua

- Tabela de referência

1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.

2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no

quadro abaixo.

Droga Concentração

(g/ml)

Diâmetro do halo de inibição do

crescimento

Interpretação*

1

2

3

4

5

* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário.

16

STREPTOCOCCUS

EXERCÍCIOS

A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E. Verificar

o tipo de hemólise.

Cultura Hemólise

C

D

E

B) Observar a coloração de Gram das culturas C e E.

Cultura C Cultura E

17

C) Prova da catalase.

Colocar sobre a cultura C (em caldo) e sobre uma cultura controle positivo

(Staphylococcus aureus) algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e

anotar o resultado (Positivo = formação de bolhas).

Catalase

Cultura C

Staphylococcus aureus (Controle +)

D) Prova da bilesolubilidade

Princípio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactéria à lise por sais biliares

Técnica: Adicionar 0,1 ml de uma solução a 10% de desoxicolato de sódio a 1

ml da cultura D. Incubar a 37o C e examinar após 15 minutos. Anotar o

resultado. Fazer o mesmo com a cultura E.

Leitura. Resultado positivo (suspensão solúvel) - a cultura fica transparente.

Resultado negativo (suspensão insolúvel) - a cultura permanece turva.

Cultura Bile-solubilidade

D

E

E) Prova de sensibilidade à bacitracina.

Princípio: O princípio desta prova baseia-se na inibição de crescimento do

Streptococcus pyogenes (-hemolítico, grupo A) frente a uma pequena

quantidade de bacitracina.

Técnica: Verificar se ocorre uma zona de inibição de crescimento ao redor do

disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C.

Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento.

resistente: ausência de zona de inibição de crescimento.

18

F) CAMP Teste

Princípio: A atividade da hemolisina do S. aureus é aumentada pela atividade

hemolítica do S. agalactiae (-hemolítico do grupo B).

Técnica: Verificar zona de hemólise, em placa de ágar sangue (feito c/ sangue

de carneiro), semeada com S. agalactiae e S. aureus.

Leitura: resultado - positivo: formação de uma zona de hemólise semelhante à

"ponta de flecha" na união das duas hemolisinas.

negativo: não formação de "ponta de flecha".

G) Identificação das culturas

Cultura C

Cultura D

Cultura E

19

STAPHYLOCOCCUS

A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever

as características das colônias e verificar hemólise.

Cultura Características das Colônias

Hemólise

A

B

B) Observar esfregaço da cultura A, corada pelo método de Gram e desenhar.

Observar ao microscópio e desenhar.

Cultura A

20

C) Prova da Catalase

Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle algumas gotas de

água oxigenada. Observar a reação e anotar o resultado.

Cultura Prova da Catalase

A

B

D) Prova da Coagulase

Princípio:

A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguíneo.

Técnica:

Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho

a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura

B e anotar os resultados.

Resultado positivo - formação de coágulo.

negativo - suspensão inalterada

Cultura Prova da Coagulase

A

B

E) Compilação dos resultados e Identificação das culturas

Hemólise Catalase Coagulase Identificação

Cultura A

Cultura B

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ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS Staphylococcus e Micrococcus (família Micrococaceae)

Cocos Gram positivos Isolados ou agrupados

Catalase +

O OF

Micrococcus sp Staphylococcus sp

Coagulase

22

ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO

Família: Streptococcaceae Gênero: Streptococcus

(cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia)

Catalase (-)

Tipo de hemólise

Optoquina Bilesolubilidade Letalidade em camundongos Bacitracina

S R (+) (-) (+) (-) S* R*

S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pyogenes (g. A) Streptococcus (quaisquer dos grupos de Lancefield,

exceto o A)

S = sensível; R = resistente provas sorológicas

(grupos de Lancefield)

23

PSEUDOMONAS

1. Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.

Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar, também,

a pigmentação verde do crescimento em ágar simples – uma característica

peculiar da espécie.

Cultura Característica das colônias

P. aeruginosa

2. Corar, pelo método de Gram, esfregaço da cultura de Pseudomonas

aeruginosa. Observar ao microscópio e desenhar.

Pseudomonas aeruginosa

24

3. Teste de fermentação de Glicose

Observar uma cultura de Pseudomonas aeruginosa e uma de Escherichia

coli em caldo glicosado contendo vermelho fenol ou indicador andrade. Interpretar

a diferença de cor das culturas bacterianas e anotar os resultados na tabela

abaixo.

Cultura Cor da Meio Fermentação da Glicose

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

4. Prova da Citrocromo-oxidase

Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com

uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado.

Cultura Prova da citocromo-oxidase

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

25

ENTEROBACTÉRIAS

1. Observar a coloração das colônias das bactérias A, B e C cultivadas em placas

de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de lactose.

Cultura Coloração da colônia em

Lactose MacConkey SS

A

B

C

D

2. Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e citrato

de Simmons (conforme orientação nas páginas 26 e 27) Anotar abaixo os

resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.

Prova Cultura

A B C D

Citrato

Glicose

Gás

Urease

H2S

LTD*

Motilidade

Lisina

Indol

Lactose**

*LTD = L-triptofano desaminase

** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)

Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 28, identificar

cada uma das culturas.

Culturas: A________________________

B________________________

C________________________

D________________________

26

3. Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação

bioquímica.

Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os

soros anti - S. Flexneri e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou

negativo).

Soro Cultura

B C

Anti - Shigella flexneri

Anti – Salmonella

27

28

29

Perfil Bioquímico e Motilidade de Algumas Enterobactérias

Prova E. coli Shigella

flexneri

Edwardsiella

tarda Salmonella

sp

Citrobacter

freundii

Klebsiella

pneumoniae

Enterobacterc

loacae Serratia

marcescens Proteus

mirabilis

Proteus

vulgaris

Morganella

morganii

Providencia

rettigeri

Citrato - - - + ou - + + + + + ou - + ou - - +

Glicose + + + + + + + + + + + +

Gás + ou - - + + + + + + ou - + + ou - + ou - + ou -

Urease - - - - + ou - + + ou - + ou - + ou - + + +

H2S - - + + + - - - + + - -

LTD* - - - - - - - - + + + +

Motilidade + ou - - + + + - + + + + + ou - +

Lisina + ou - - + + - + - + - - - -

Indol + + ou - + - - - - - - + + +

Lactose + - - - + ou - + + ou - - - - - -

*LTD = L-triptofano desaminase