1 tÉcnica de confecÇÃo dos esfregaÇospeople.ufpr.br/~microgeral/arquivos/pdf/pdf/fundamentos...

Prof. Dra. Andréa E. M. Stinghen Disciplina – Fundamentos de Microbiologia

Março 2009

COLORAÇÃO DE GRAM (FONTE: Coloração de Gram: Como fazer, interpretar e padronizar. STINGHEN, A. E. M.; ALBINI, C. A. ; SOUZA, A. P. H. M, 2002)

1 TÉCNICA DE CONFECÇÃO DOS ESFREGAÇOS

No cotidiano utilizam-se diferentes formas já consagradas pelo uso para realização dos esfregaços, entretanto alguns cuidados básicos devem ser tomados para obter-se uma lâmina adequada. As figuras a seguir ilustram as diversas maneiras recomendadas para confecção do esfregaço a partir de diferentes amostras clínicas Figura 1 - Preparação de esfregaço a partir de amostras coletadas com swab.

FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995 O Swab deve ser rolado para frente e para trás, a fim de depositar uma fina camada do material sobre a lâmina.


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Figura 2 – Preparação de esfregaço a partir de materiais espessos ou semi-sólidos.

FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995

Na preparação de esfregaços de materiais espessos ou semi-sólidos, como por exemplo fezes, pode-se utilizar um swab, para auxiliar para espalhar o material de maneira homogênea sobre a lâmina. Figura 3 – Preparo de esfregaços a partir de amostras espessas, granulares ou mucóides

Colocar a amostra sobre a superfície da lâmina

Colocar uma segunda lâmina sobre a primeira contendo o material


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Pressionar o material, e rolar as duas lâminas uma contra a outra

Puxar as duas lâminas para espalhar FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995 Figura 4 – Preparo de esfregaços a partir de amostras líquidas

FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995 Esfregaços de materiais líquidos podem ser preparados depositando-se uma gota do material ou do sedimento ressuspenso sobre a lâmina em um circulo previamente demarcado. Este procedimento aplica-se a materiais como urina e LCR.


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Figura 5 – Esfregaços a partir de amostras concentradas por citocentrífugação.

FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995

Se o depósito for muito espesso na área delimitada, uma porção do material pode ser posteriormente espalhado com auxílio de um palito de madeira para obter uma área mais delgada. 2 FIXAÇÃO DO ESFREGAÇO Os esfregaços devem ser fixados ao calor ou com metanol Fixação pelo calor: - Secar os esfregaços ao ar em uma superfície plana ou colocá-los a 60 ºC em um secador de lâminas até que sequem por completo: - Se o esfregaço secar ao ar, passar duas a três vezes pela chama, tomando cuidado para evitar distorções, pelo superaquecimento; - Deixar esfriar o esfregaço antes de corar. OBS: Quando amostra é muito sanguinolenta, a qualidade dos esfregaços pode ser melhorada cobrindo-os com água destilada durante cinco minutos após secar e fixar à chama. Após enxaguar e corar pelo método habitual; os eritrócitos serão lisados e eliminados deixando um fundo mais claro (GARDNER e PROVINE, 1978).


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Fixação pelo Metanol: A fixação por metanol previne a lise de eritrócitos e resulta em um fundo limpo. Também previne que esfregaços de materiais líquidos límpidos sejam retirados da lâmina. - Deixar os esfregaços secarem ao ar em uma superfície plana; - Cobrir o material com metanol, por aproximadamente 1 minuto; - Retirar o excesso de metanol sem lavar a lâmina e deixar secar ao ar; - Não usar calor antes de corar. 3 VARIAÇÕES DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM Método de Gram clássico A coloração clássica de Gram foi originalmente desenvolvida por Christian Gram em 1884, conforme consta em anexo. O trabalho original empregava marrom de Bismarck ou Vesuvina como corante de fundo. Descrevemos a seguir a formulação mais similar à original consagrada em nosso meio conforme BIER (1985). As soluções utilizadas nesta metodologia estão descritas a seguir. CRISTAL VIOLETA FENICADA Cristal violeta............................................................1 g Álcool a 95º..............................................................10 ml Fenol fundido............................................................2 g Água destilada..........................................................100 ml LUGOL Iodo metálico............................................................1 g Iodeto de potássio.....................................................2 g Água destilada..........................................................300 ml FUCSINA BÁSICA Fucsina básica..........................................................0,1 ou 0,2 g Água destilada.........................................................100 ml a) Cobrir o esfregaço por 1 minuto com solução fenicada de cristal violeta; b) Escorrer o corante e cobrir o esfregaço, durante 1 minuto com solução de lugol fraco; c) Lavar em água corrente; d) Descorar com álcool 95 ºGL, até o descorante fluir límpido; e) Cobrir o esfregaço com solução de fucsina básica por 30 segundos. Modificação de Hucker A coloração de Gram modificado por Hucker em 1921 é amplamente utilizada na rotina, e segundo alguns autores permite uma melhor diferenciação dos microrganismos


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(ISENBERG, 1992). Consiste na utilização de uma solução de violeta de metila acrescida de uma solução a 1% de oxalato de amônio, com função de fixação. O descorante utilizado pode ser etanol 95°GL, acetona ou álcool-acetona, e a sua escolha irá interferir no tempo de descoloração. As soluções utilizadas nesta modificação estão descritas a seguir (MINISTÈRIO DA SAÙDE, 1997). CRISTAL VIOLETA: Solução A Violeta de metila...........................................................2 g Álcool etílico (99,5 ºGL)..............................................100 ml Álcool metílico (99,57 ºGL)...........................................100 ml Solução B Oxalato de amônio.......................................................4g Água destilada.............................................................400 ml Misturar as soluções A e B. Deixar em repouso a temperatura ambiente por 24 horas ao abrigo da luz. Filtrar antes de usar e estocar em frasco escuro. LUGOL Iodeto de potássio.........................................................4,5 g Iodo metálico................................................................3,0 g Água destilada...............................................................450 ml Misturas o iodeto na água até completa dissolução, acrescentar o iodo metálico e misturar até dissolver completamente. Antes de usar diluir a 1/20 com água destilada. SAFRANINA Safranina........................................................................2,5 g Água destilada...............................................................500 ml Misturar bem até completa dissolução. a) Cobrir o esfregaço com solução de violeta de metila por 15 segundos; b) Adicionar igual quantidade de água sobre a lâmina. Deixar agir por mais 45 segundos; CUIDADO: Lavagem excessiva nesta etapa pode carrear o cristal violeta das células gram positivas. c) Escorrer o corante e lavar em água corrente; d) Cobrir a lâmina com solução de lugol diluído (1/20) e deixar agir por aproximadamente 1 minuto; e) Escorrer o lugol e lavar em água corrente; f) Descorar com álcool, deixando fluir lentamente sobre a lâmina, até o descorante fluir claro. CUIDADO: Ajuste o tempo de descoloração à espessura do esfregaço. g) Lavar em água corrente h) Cobrir a lâmina com safranina e deixar agir por 30 segundos;


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i) Lavar em água corrente; j) Retirar o excesso de água e deixar a lâmina secar ao ar, ou com auxílio de um papel absorvente; j. Examinar o esfregaço ao microscópio ótico em objetiva de imersão (1000 X). Contra coloração com carbol–fucsina ou fucsina básica: Esta modificação é recomendada para detectar microrganismos gram negativos fracamente corados. O procedimento é similar ao à modificação de Hucker, exceto que o descorante recomendado é etanol a 95% e o corante de fundo é a carbol–fucsina ou fucsina básica a 0,8%, cujas fórmulas estão descritas a seguir (ISENBERG, 1992). CARBOL FUCSINA Solução A Fucsina básica...............................................................0,3 g Etanol 95%....................................................................10 ml Solução B Cristais de fenol fundido.................................................5 ml Água destilada.................................................................95 ml Dissolver a fucsina em etanol em frasco de vidro âmbar (solução A). Adicionar o fenol à água destilada em um frasco separado (solução B). Misturar a solução B à A, filtrar antes de usar, e estocar em frasco escuro a temperatura ambiente. FUCSINA BÁSICA 0,8% Fucsina básica..................................................................0,8 g Água destilada.................................................................100 ml Colocar a fucsina em um frasco de vidro âmbar. Adicionar água vagarosamente, misturando bem após cada adição, para dissolver a fucsina. Estocar a temperatura ambiente. Modificação de KOPELOFF Esta modificação é recomendada para melhor visualização e diferenciação de bactérias anaeróbias que são facilmente muito descorados. As soluções utilizadas estão descritas a seguir (ISENBERG, 1992). CRISTAL VIOLETA ALCALINO Solução A Cristal violeta....................................................................10g Água destilada...................................................................1000 ml Dissolver em frasco de vidro e estocar em frasco com tampa de vidro à temperatura ambiente.


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Solução B Bicarbonato de sódio.........................................................50 g Água destilada...................................................................1000 ml Disssolver em frasco de vidro e estocar em temperatura ambiente. SOLUÇÃO DE IODO (Modificação de KOPELOFF) Hidróxido de sódio............................................................4 g Cristais de iodo..................................................................20 g Iodeto de potássio..............................................................1 g Água destilada...................................................................1000 ml Dissolver o NaOH em 25 ml de água destilada em um frasco de vidro âmbar. Adicionar o iodo e o iodeto de potássio e dissolver bem. Gradualmente adicionar o restante da água, misturando bem, após cada adição. DESCORANTE Álcool 95%........................................................................700 ml Acetona..............................................................................300 ml Mistura em frasco de vidro âmbar e estocar à temperatura ambiente. SAFRANINA Safranina O.........................................................................20 g Etanol 95 %..........................................................................100 ml Água destilada.....................................................................1000 ml Em um frasco de vidro adicionar etanol em quantidade suficiente para dissolver a safranina (aproximadamente 50 ml). Adicionar água destilada e estocar à temperatura ambiente. a) Cobrir o esfregaço previamente fixado com a solução A, adicionar aproximadamente 5 gotas da solução B. Deixar agir por 2 a 3 minutos, sem deixar a lâmina secar; b) Lavar a lâmina delicadamente com o LUGOL c) Aplicar após novo LUGOL por 2 minutos; d) Segurar a lãmina em posição inclinada e aplicar o descorante; e) Enxaguar imediatamente com água corrente; f) Contra corar com safranina de Kopeloff por 30 segundos; g) Retirar o excesso em água corrente e secar ao ar. h) Examinar ao microscópio ótico em objetiva de imersão.


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4 CONTROLE DE QUALIDADE O controle de qualidade é uma atividade essencial na rotina diária. Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da coloração de Gram, é necessário utilizar cepas bacterianas padrão, gram positivas e gram negativas, além de observar freqüentemente o aspecto dos reagentes utilizados. Aspecto dos reagentes Verificar o aspecto das soluções diariamente. Caso haja precipitação de algum dos reagentes, deve-se proceder a filtração. A evaporação pode interferir na eficácia dos reagentes, se não utilizados com freqüência; a troca deve ser efetuada. Uso de cepas controle Quando um novo lote de corantes for preparado ou adquirido, realizar esfregaços de cepas padrão como: S. pyogenes (ATCC 19615), E. coli (ATCC 25922). O resultado esperado é: - Bacilos Gram Negativos - rosa - Cocos Gram Positivos - violeta escuro Uma alternativa a este método, quando não se dispõe das cepas padrão pode ser realizada corando-se um esfregaço de raspado da mucosa bucal, que deverá conter organismos gram positivos e gram negativos, assim como células epiteliais (GARDNER e PROVINE; 1978). Nos exames bacterioscópicos com material contendo leucócitos e células epiteliais, é extremamente importante observar a coloração nuclear e citoplasmatica. A coloração de Gram adequada resultará na observação dos núcleos corados em vermelho e citoplasma corado em róseo. Uma tendendo para o violeta indicará que a descoloração não foi suficiente. Limitações da coloração de Gram

É inestimável o auxílio efetivo da coloração de Gram no diagnóstico microbiológico, entretanto em algumas situações é contra indicada a sua utilização, como por exemplo, na pesquisa de estruturas bacterianas como cápsulas e esporos, ou na pesquisa de micobactérias e fungos filamentosos.

Alguns microrganismos gram positivos em cultivos superiores a vinte e quatro horas podem se apresentar gram negativos. Microrganismos que sofreram ação de determinados antimicrobianos podem apresentar-se falsamente gram negativos; a recíproca não é verdadeira. Convém lembrar que a maioria das interpretações equívocas de esfregaços corados pelo Gram devem-se a falhas na preparação da lâmina, como um esfregaço demasiado espesso, excessiva fixação pelo calor, ou descoloração insuficiente ou prolongada (GARDNER e PROVINE, 1978).

O achado de microrganismos vermelhos próximos a elementos celulares corados fortemente como gram positivos em uma parte mais espessa do esfregaço, confirma que se tratam de organismos gram negativos e que não são bactérias gram positivas descoradas em excesso.


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Cuidados - Inspecionar diariamente os corantes, os quais devem ser estocados a temperatura

ambiente em local sem variações bruscas de temperatura, a fim de se evitar precipitação, e ao abrigo da luz;

- Comparar os resultados finais da morfologia pelo Gram com a cultura, caso resultados diferentes do esperado forem obtidos, revisar tanto a coloração quanto a cultura. OBS: Nem todos os microrganismos corados pelo Gram podem ser cultiváveis. Lâminas de referência são úteis para comparação e treinamento. 5 DESCRIÇÃO MORFOLÓGICA Exemplos de maneiras de caracterizar morfologicamente os microrganismos mais encontrados:

- Cocos gram positivos - Cocos gram positivos em cadeias (sugestivos de estreptococos) - Cocos gram positivos agrupados (sugestivos de estafilococos)

- Cocos gram positivos aos pares - Diplococos gram positivos lanceolados e/ou capsulados (sugestivos de pneumococos) - Cocobacilos gram positivos - Bacilos gram positivos - Bacilos gram positivos sugestivos de Döderlein - Bacilos gram positivos esporulados - Bacilos gram positivos filamentosos - Bacilos gram positivos corineformes - Cocobacilos gram variáveis (sugestivos de Gardnerella spp.) - Cocos gram negativos - Diplococos gram negativos intra e/ou extracelulares (sugestivos de Neisseria spp.) - Bacilos gram negativos - Bacilos gram negativos curvos (sugestivos de Mobiluncus spp.) - Bacilos gram negativos atípicos sugestivos de microbiota anaeróbia - Bacilos gram negativos espiralados - Bacilos gram negativos pleomórficos (sugestivos de Haemophilus

spp.) - Cocobacilos gram negativos - Células leveduriformes (com ou sem pseudo-hifas) - Filamentos ramificados gram positivos (sugestivos de actinomicetos) - Associação fuso espiralar


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6 ANEXO Artigo original sobre a coloração de Gram

Considerando a valiosa contribuição ao estudo da Microbiologia médica humana, prestada pelo físico e médico dinamarquês Hans Christian Joachin Gram (1853-1938), apresentamos a seguir o artigo original sobre a técnica de coloração que recebeu seu nome e até hoje é utilizada em grande parte dos laboratórios de Microbiologia.

Gram, C. Ueber die isolirte Farbung der Schizomyceten in Schnitt-und Trockenpräparaten. Fortschritte der Medicin, v. 2, p. 185-189, 1884.

"(I WISH TO THANK HERR DR. RIESS, Director of the General Hospital of Berlin for the facilities and equipment to perform the following studies).

The differential staining method Koch and Ehrlich for tubercle bacilli gives very excellent results either with or without counter-staining, since the bacilli stand out very clearly due to the contrast effect.

It would be very desirable if a similar method for the differential staining of other Schizomycetes were available which could be used routinely by the microscopist.

My studies-as associate of Herr Dr. Friedlander in the morgue of the city hospital in Berlin-have attempted to demonstrate cocci m tlssue sections of lungs of those who have died of pneumonia as well as in experimental animals. As Friedlander has already mentioned briefly in his paper on the micrococci of pneumonia, I have discovered by experimentation a procedure for the differential staining of pneumococci. In my procedure the nucleus and other tissue elements remain unstained, while the cocci are strongly stained. This makes them much easier to locate than previously, since in ordinary preparations from pneumonia patients, where such a large amount of exudate occurs, they are impossible to see.

Further studies on the usefulness of this method for other Schizomycetes has gradually shown that this method is an almost general method for all tissue sections and dried preparations....

For staining the ordinary aniline-gentian violet solution of Ehrlich is used. The appropriate sections must be carried up to absolute alcohol and taken from this directly into the dye solution. They should remain in the dye for 1-3 minutes (except tubercle

bacilli, which should remain as usual 12-24 hours). Then they are placed in a solution of iodine-potassium iodide in water (iodine 1.0 part, potassium iodide 2.0 parts, water 300.0 parts) with or without a light rinse with alcohol and allowed to remain there for 1-


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3 minutes. During this time, a precipitate forms, and the previously dark blue-violet sections now become dark purple-red. (Footnote: This purple-red color is not soluble in water but dissolves very easily in alcohol. The chemical studies will be continued at a later time.) They are then placed in absolute alcohol until they are completely decolorized. It is well to change the alcohol once or twice during this step. Then the sections are cleared as usual in clove oil, in which the rest of the dye is dissolved. The nucleus and fundamental tissue is stained only a light yellow (from the iodine) while the Schizomycetes, if any are present in the preparation, are an intense blue (often almost black). The intensity of the staining has not been equaled by any of the current staining methods. This presents another great advantage of our method. It is possible after the decolorization in alcohol to place the sections for a moment in a weak solution of bismarck brown or vesunne, and then dehydrate again with alcohol, in order to achieve a counterstain. The nucleus will appear brown, while the Schizomycetes will remain blue.

In this way it is possible to prepare doubly-stained preparations that are just as excellent as those of the tubercle bacillus made after the method of Koch and Ehrlich. Permanent preparations in Canada balsam-xylene or gelatine-glycerol ren~ain unchanged after 4 months.

This method is very quick and easy. The whole procedure takes only a quarter-hour, and the preparations can remain many days in clove oil without the Schizomycete cells becoming decolorized.

It is also useful for dried preparations. It is performed exactly as for tissue sections, except that one treats the cover slip just like a section.

I have tried many times different aniline dyes (rubine-aniline, fuchsinaniline and simple gentian violet solution), but without success. In addition, tincture of iodine or potassium iodide solution, as opposed to iodinepotassium iodide solution, are also ineffective, since the Schizomycetes then are also decolorized. When the sections are treated with water or dilute alcohol, the results are variable…

I. After iodine treatment, the following forms of Schizomycetes are not decolorized by alcohol.

(a) The coccus of bronchial pneumonia ( 19 cases).

(b) Pyogenic Schizomycetes (9 cases)

(c) Cocci of a liver abscess . . . (1 case)

(d) Cocci and small bacilli in circumscriptive infiltration of the lungs ( 1 case). . . .

(e) Cocci of osteomyelitis (2 cases).

(f) Cocci of suppurative arthritis following scarlet fever ( 1 case)


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(g) Cocci of suppurative nephritis following cystitis (3 cases)

(h) Cocci of multiple brain abscesses following empyema (2 cases)

i. Cocci of erysipelas ( 1 case)

(k) Tubercle bacilli (5 cases)

(1) Anthrax bacilli (3 cases) (in mice ) .

(m) Putrefactive Schizomycetes (bacilli and cocci)....

II. The following forms of Schizomycetes are decolorized in alcohol after iodine treatment.

(a) 1 case of bronchial pneumonia with cocci that formed cap

(b) 1 case of bronchial pneumonia with cocci that did not form capsules.

(c) Typhoid bacilli (5 cases) are decolorizcd either with or without iodine treatment very easily by alcohol. I have attempted to leave the sections in the dye for as long as 24 hours but without any better results.

Iwould like to make one closing remark. The behavior of the cell nucleus and the Schizomycetes to aniline dyes in other methods are almost identical, whereas with the present staining method a very distinct difference IS visible.

Studies- on Schizomycetes have been significantly improved by the use of this method. It is because of this that I publish my results, although I am well aware that they are brief and with many gaps. It is to be hoped that this method will also be useful in the hands of other workers.

Editor's note. I would like to testify that I have found the Gram method to be one of the best and for many cases the best method which I have ever used for staining Schizomycetes."


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