rel trab grupo hplc rp uv

Bioquímica e Toxicologia

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA DE FASE REVERSA (CLAE-FR)

Docente: Professora Doutora Ângela Malcata

Gestão da Qualidade, Ambiente e Segurança – 2.º Ano Paulo Jorge Morais Pereira Martelo – n.º 21130 Sara Filipa Vieira Gomes – n.º 21356 07-12-2010

ISMAI – Instituto Superior da Maia Bioquímica e Toxicologia

Índice1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................4

2. METABOLISMOS DO BENZENO, TOLUENO E XILENO..............................................4

2.1. METABOLISMO DO BENZENO..................................................................................4

2.2. METABOLISMO DO TOLUENO..................................................................................5

2.3. METABOLISMO DO XILENO......................................................................................5

3. TÉCNICA INSTRUMENTAL DE ANÁLISE UTILIZADA...................................................6

3.1. DEFINIÇÃO....................................................................................................................6

3.2. SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS CONSTITUINTES DAS AMOSTRAS.............6

3.3. CARACTERÍSTICAS DA CLAE-FR............................................................................8

3.4. INSTRUMENTAÇÃO E EQUIPAMENTO AUXILIAR..............................................13

3.4.1. RESERVATÓRIO DE ELUENTE...........................................................................13

3.4.2. BOMBA......................................................................................................................13

3.4.3. INJECTOR.................................................................................................................13

3.4.4. COLUNA DE SEPARAÇÃO DE FASE REVERSA..............................................13

3.4.5. DETECTOR DE ABSORVÂNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL...........14

3.4.6. AUTO-SAMPLER.....................................................................................................18

4. CONCLUSÕES...................................................................................................................19

5. BIBLIOGRAFIA....................................................................................................................20

5.1. SÍTIOGRAFIA...............................................................................................................20

GQAS – 2.º Ano Página 2 de 20


Índice de figuras e tabelasFigura 1 - Metabolismo do Benzeno.............................................................................................5Figura 2 - Electronegatividade da molécula da água....................................................................7Figura 3 - Reservatório da fase móvel........................................................................................10Figura 4 - Bomba da alta pressão...............................................................................................11Figura 5 - Válvula de injecção.....................................................................................................11Figura 6 - Coluna cromatográfica de fase reversa......................................................................11Figura 7 - Detector de UV-VIS.....................................................................................................12Figura 8 - Esquematização da sequência das etapas na análise por CLAE-FR.............................12Figura 9 - Classificação das colunas de fase reversa...................................................................14Figura 10 - Célula do detector de UV de comprimento de onda fixo.........................................15Figura 11 - Detector espectrofotométrico de UV-VIS de comprimento de onda variável..........17Figura 12 - Equipamento de CLAE-FR compacto da actualidade................................................17Figura 13 - Pormenor de equipamento de CLAE-FR da actualidade...........................................18Figura 14 - Amostrador automático para CLAE-FR.....................................................................18

Tabela 1 - Características das colunas de fase reversa...............................................................14Tabela 2 - Vantagens/desvantagens da CLAE-FR........................................................................20



1. INTRODUÇÃONo âmbito das matérias leccionadas na disciplina de Bioquímica e Toxicologia,

foi disponibilizado pela sua Docente um estudo científico, com o título: “Evaluation of

genotoxicity in a group of workers from a petroleum refinery aromatics plant”, e

solicitada a realização de um trabalho em grupo sobre a técnica laboratorial de análise

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa – CLAE-FR) utilizada nesta

investigação científica.

O objectivo do estudo científico em questão foi avaliar os efeitos tóxico-

genéticos resultantes da exposição ocupacional ao Benzeno, Tolueno e Xileno (BTX)

de um grupo de 48 trabalhadores de uma unidade de produtos aromáticos,

pertencente a uma refinaria do Norte de Portugal, tendo-se para o efeito procedido à

recolha de amostras de urinas no final de um dia de trabalho.

As amostras das urinas colhidas foram posteriormente submetidas a análises

quantitativas, pela técnica analítica da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de

Fase Reversa (CLAE-FR) com detector de ultra-violetas (UV), das concentrações dos

ácidos: t,t-mucônico (t,t-MA), hipúrico (HA), e metilhipúrico (MHA), considerados,

respectivamente, indicadores biológicos de exposição sensíveis a baixas

concentrações de Benzeno, Tolueno e Xileno para o organismo humano.

2. METABOLISMOS DO BENZENO, TOLUENO E XILENO

2.1. METABOLISMO DO BENZENOA taxa do metabolismo do Benzeno no corpo humano após a exposição

ocupacional é superior a 50%, sendo a primeira reacção metabólica que ocorre, a sua

transformação em Benzeno-epóxido (BE). Este é sucessivamente transformado em

metabolitos fenólicos que representam cerca de 30% da dose de Benzeno absorvida

(fenol – 15%; quinol – 12%; catecol – 2%; 1,2,4-benzenotriol – 2%). O BE também

reage com a glutationa formando o ácido fenil-premercaptúrico, que transformando-se

no ácido s-fenilmercaptúrico, é eliminado na urina. Apesar do anel aromático do trans-

di-hidro-di-hidroxibenzeno (formado a partir de reacção secundária) ser quimicamente

estável, cerca de 2% acaba por sofrer uma abertura para formar um metabolito de

estrutura linear – o t,t-muconaldeído, que por fim dá origem ao t,t-MA, que também é

eliminado na urina. O valor de referência da concentração do t,t-MA na urina de um

não-fumador é <0,3 mg/g creatinina.



2.2. METABOLISMO DO TOLUENONo corpo humano o Tolueno é absorvido mais rapidamente através dos

pulmões e, mais lentamente pela pele, sendo detectado em primeiro lugar na corrente

sanguínea e depositando-se em seguida nos tecidos adiposos, ocorrendo que, 20% da

dose do Tolueno absorvida pelo organismo humano é expirada (eliminada) pelo

aparelho respiratório, sem sofrer qualquer alteração. Os restantes 80% da dose do

Tolueno absorvida são metabolizados pelo organismo humano, resultando como

principais metabolitos desse processo o ácido hipúrico, o o-cresol e o ácido benzóico.

2.3. METABOLISMO DO XILENOAs principais vias de absorção (entrada) do Xileno no organismo são em

primeiro lugar as vias respiratórias superiores e, em segundo, a pele. No corpo

humano o processo da metabolização do Xileno absorvido é semelhante ao

mecanismo do metabolismo do Tolueno e, o metabolismo do Xileno tem a sua origem

na oxidação de um grupo metílico, resultando como produto da reacção o ácido

metilbenzóico que por sua vez reage com a glicina dando lugar à formação do ácido

metilhipúrico. Este metabolito que corresponde a 95% da dose do Xileno absorvida é

posteriormente eliminado na urina, verificando-se que uma pequena fracção do Xileno

absorvido é eliminada pelo organismo humano como xilenol.


Figura 1 - Metabolismo do Benzeno


3. TÉCNICA INSTRUMENTAL DE ANÁLISE UTILIZADA

3.1. DEFINIÇÃOA cromatografia é uma técnica instrumental de análise química que é utilizada

para realizar a separação das substâncias contidas em misturas complexas,

baseando-se no princípio da adsorção selectiva (que não se deve confundir com

absorção). Esta técnica foi descoberta em 1906 pelo botânico italiano naturalizado

russo, Mikahail Tswett, mas não foi muito utilizada até aos anos 30. Tswett separou

pigmentos de plantas (clorofilas) adicionando um extracto de folhas verdes em éter de

petróleo a uma coluna vertical construída com um tubo de vidro preenchido com

carbonato de cálcio em pó. Enquanto a solução do extracto de folhas verdes percolou

através do interior da coluna as substâncias componentes migraram para baixo com

taxas de velocidades diferentes, e a coluna no final apresentou-se manchada com

gradientes horizontais de cores. A esse gradiente colorido deu-se o nome de

cromatograma.

3.2. SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS CONSTITUINTES DAS AMOSTRASNa técnica instrumental de análise do t,t-MA por CLAE-FR (cromatografia

líquida de alta eficiência de fase reversa) utilizada, uma das maiores dificuldades na

análise de amostras biológicas, é a presença de substâncias que possam ser

confundidas com a própria substância objecto da análise. Para evitar que tal possa

acontecer, é necessário proceder, ou ao isolamento da substância a analisar, ou à

remoção/separação da(s) substância(s) interferente(s) antes de se prosseguir com a

análise, porque até a presença na amostra de outras substâncias bastante diferentes

daquela que se pretende analisar pode afectar negativamente a qualidade dos

resultados analíticos obtidos.

Por esse motivo, muitos métodos analíticos incluem nos seus procedimentos

uma etapa preliminar de separação das substâncias presentes nas amostras a

analisar. Por exemplo, as proteínas são substâncias interferentes presentes

frequentemente em amostras biológicas, que têm de ser separadas (removidas),

utilizando-se para o efeito técnicas como á diálise, ultra filtração e a cromatografia de

permeação em gel. A separação, ou remoção, de substâncias interferentes das

amostras a analisar é na realidade uma importante aplicação dos métodos de

separação nesta técnica instrumental de análise por CLAE-FR e, a título

exemplificativo, a necessidade da realização da quantificação de um determinado

aminoácido numa amostra com a presença de um grupo de outros aminoácidos muito

similares é demonstrativa da complexidade do problema que é necessário ultrapassar.



Todos os processos de separação dependem primordialmente de algumas

propriedades físicas das substâncias constituintes das amostras, sendo facilmente

reconhecível a facilidade de separar substâncias com propriedades físicas muito

diferentes aplicando-se técnicas simples como a extracção de solvente. No entanto, se

algumas substâncias têm propriedades físicas similares a outras, torna-se essencial

explorar qualquer pequena diferença que possa existir nessas propriedades para se

poder obter a desejada separação entre elas.

Também é verdade que se pode maximizar o efeito de uma pequena diferença

entre as propriedades físicas de substâncias repetindo-se várias vezes a manipulação

no processo de separação, nomeadamente, em extracções de solvente sequenciais,

mas é a polaridade da molécula de uma substância a característica que afecta mais

significativamente as suas propriedades, e em particular, a sua solubilidade e

volatilidade. As moléculas dizem-se polares quando possuem um dipolo, cuja definição

é uma distribuição desigual, ou assimétrica, de electrões numa molécula originada

pelas diferenças das electronegatividades dos átomos que a constituem. Por exemplo,

a água é uma substância polar porque o oxigénio tem uma electronegatividade maior

do que o hidrogénio. Na molécula da água o átomo do oxigénio apodera-se dos dois

electrões dos átomos dos hidrogénios ficando com uma carga eléctrica negativa, e

deixa os átomos dos hidrogénios com uma carga eléctrica positiva (ver figura n.º 2,

seguinte).

Figura 2 - Electronegatividade da molécula da água

Devido à sua natureza iónica, ou polar, a molécula da água tende a ligar-se a

outra formando uma estrutura de treliça estabilizada pelas interacções mútuas destas

forças iónicas. As moléculas de outras substâncias de natureza parcialmente iónica,

ou polar, encaixam-se mais facilmente nessa estrutura de treliça do que as de

natureza apolar, e dissolvem-se na água, mas a força de atracção entre duas

moléculas polares produz outros efeitos além de afectar a solubilidade da substância.

Se uma das substâncias for um sólido a sua ligação a outras substâncias polares é

conhecida como adsorção, sendo a força desta ligação o reflexo directo das

interacções das forças iónicas entre as duas moléculas envolvidas. Nas técnicas



analíticas envolvendo separação, tais como, cromatografia de gás-líquido,

cromatografia de líquidos e cromatografia de adsorção depende-se em larga escala

das interacções de natureza polar entre moléculas, podendo aproveitar-se ligeiras

diferenças de polaridades existentes entre as moléculas das substâncias para facilitar

a sua separação.

O movimento do analito é um recurso essencial das técnicas de análise que

englobam separação de substâncias, sendo possível definir, em termos gerais, as

intensidades das forças que originam esse deslocamento. Se se aplicar uma força

sobre uma molécula o seu deslocamento será condicionado por uma força contrária de

algum tipo, podendo ser simplesmente o efeito da fricção ao passar por moléculas de

solvente, ou poderá ser o efeito da adsorção numa fase sólida. Nos métodos de

análise com separação de substâncias não é a intensidade inicial da força utilizada

que é importante, mas sim as variações resultantes na força total aplicada nas

diferentes moléculas presentes que proporciona a base para a sua separação

eficiente.

3.3. CARACTERÍSTICAS DA CLAE-FREsta técnica analítica laboratorial requer somente que a amostra a analisar seja

solúvel na fase móvel (líquida). Assim, a CLAE-FR é um método ideal para a

separação e análise de substâncias iónicas ou macro moléculas de interesse biológico

e produtos naturais lábeis, bem como uma imensa variedade de outros compostos de

elevada massa molecular e/ou baixa estabilidade térmica.

A técnica da cromatografia líquida em coluna utiliza uma grande variedade de

materiais adsorventes sólidos aplicados na fase estacionária, nos quais se incluem a

sílica, a alumina e a sílica-gel. Os líquidos utilizados na fase móvel são adsorvidos

selectivamente por estes sólidos adsorventes – num processo designado por

cromatografia de separação – que permite o fabrico de colunas com propriedades

muito diferentes para cada aplicação particular. A Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE, ou HPLC do inglês High Performance Liquid Chromatography), é

uma variante desta técnica que efectua a adsorção selectiva dos líquidos em

partículas sólidas adsorventes extremamente pequenas e uniformes para proporcionar

uma elevada sensibilidade analítica, necessitando de recorrer à utilização de um

reservatório de eluente, uma bomba para transportar o líquido, passando pelo injector

onde é introduzida a amostra também líquida, até à coluna sujeita ou não a controlo da

temperatura, um detector de UV-VIS (ultravioleta-visível) e um integrador (onde é feito

o controlo, aquisição e tratamento dos dados).



A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de

cromatografia na qual a fase móvel é líquida. Esta fase móvel encontra-se sob pressão

e é forçada a passar através do interior de uma coluna (de vidro com parede espessa

ou metálica) que contém a fase estacionária (sólida). É um processo bastante eficiente

e rápido, podendo a eluição da amostra ser feita, ou com um único solvente, ou com

uma mistura destes. Se durante o processo de eluição a composição do eluente se

mantém constante está-se perante um processo de eluição isocrático, e se a

composição do eluente muda com o decorrer do tempo de eluição está-se perante um

processo de eluição de gradiente em que a composição da fase móvel varia de acordo

com a polaridade dos analitos, sendo necessário recorrer à utilização específica de

uma bomba binária ou quaternária, e de um sistema de programação de gradiente

para se poder obter uma variação contínua da composição do eluente.

A “Força” do solvente é uma designação da capacidade de um determinado

solvente eluir uma amostra, pelo que quanto maior for a força do solvente menor será

o tempo de retenção, ou de chegada, ao detector/quantificador do equipamento. A

introdução da amostra na fase móvel no topo da coluna é sempre uma operação

crítica devido à alta pressão a que o sistema funciona, recorrendo-se para o efeito à

utilização de uma válvula de injecção. Existem numerosas fases estacionárias

disponíveis para CLAE, podendo utilizar-se todas as diversas fases sólidas de

cromatografia de fase líquida em CLAE: adsorção, partição, permuta iónica, exclusão

molecular, incluindo permeação e filtração em gel. No âmbito da cromatografia de

partição há ainda a considerar dois tipos: CLAE de fase normal, e CLAE de fase

reversa. Na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa (CLAE-FR) a

fase estacionária sólida é apolar. Esta característica é pouco utilizada em

cromatografia “normal”, mas, no entanto, representa mais de 90% das aplicações em

CLAE. Nestas condições da CLAE-FR, as substâncias polares permanecem na fase

móvel líquida (também polar), sendo eluídas antes das substâncias apolares que têm

maior afinidade para a fase estacionária sólida (também apolar). A estrutura da fase

estacionária não polar, ou apolar, é constituída por uma substância ligada a uma

matriz de partículas de sílica, e um bom exemplo de coluna de fase reversa é a

habitual coluna C. Neste tipo de coluna, a uma matriz de suporte está ligado um n-

alcano com 18 átomos de carbono. Este tipo de cromatografia é extremamente

sensível à composição da fase móvel, mas o efeito da variação de fase estacionária

(relativamente ao número de átomos de carbono) na separação das substâncias

constituintes de uma dada mistura é também, assinalável. As fases móveis mais

utilizadas na CLAE-FR são compostas pela água, etanol, isopropanol, acetonitrilo e



tetrahidrofurano. As pressões das fases móveis utilizadas na CLAE-FR são as mais

elevadas da técnica de CLAE, podendo atingir o valor de 400 bar. Após a separação

efectuada na coluna de fase reversa, as várias substâncias constituintes da amostra

vão passar por um detector/quantificador com tempos de chegada (ou retenção) que

lhes são característicos, uma vez que estes dependem dos seus tipos de interacção

com a fase estacionária. Existem vários tipos de detectores que podem ser utilizados

na CLAE-FR, tais como: Adsorção UV, “Diode Array”, Fluorescência, Índice de

Refracção, Condutividade e Amperometria. No que respeita ao manuseamento de um

equipamento de CLAE-FR existem vários cuidados a observar, nomeadamente: não

exceder a pressão máxima de trabalho que depende das colunas de separação a

utilizar nas análises, utilizar reagentes de pureza elevada (supra-puros), evitar a

formação de bolhas de ar e o surgimento de corrosão.

Genericamente, um equipamento de CLAE-FR é composto pelos seguintes

elementos, pela ordem a seguir apresentada: reservatório de solvente (eluente) da

fase móvel, ligado através de tubagem própria a uma bomba de alta pressão (duplo

pistão) de caudal constante. A bomba encontra-se ligada a uma válvula injectora, que

por sua vez está conectada ao topo da coluna vertical de separação de fase reversa,

com ou sem controlo de temperatura. A base da coluna está ligada ao

detector/quantificador de radiações ultra-violetas (UV), e no fim este dispositivo

comunica com o computador (integrador) do cromatógrafo (ver figuras 3, 4, 5, 6 e 7,

seguintes):

Figura 3 - Reservatório da fase móvel


Integrador


Figura 4 - Bomba da alta pressão

Figura 5 - Válvula de injecção

Figura 6 - Coluna cromatográfica de fase reversa


Integrador

Integrador

Integrador


Figura 7 - Detector de UV-VIS

A execução da análise quantitativa ou qualitativa de uma amostra na CLAE-FR

compreende as etapas esquematizadas na figura 8, seguinte. Após a injecção do analito, a

separação e a eluição têm lugar no interior da coluna de separação de fase reversa.

Figura 8 - Esquematização da sequência das etapas na análise por CLAE-FR


Integrador

Espectro da substância analisada

A área dos picos é medida pelo integrador/quantificador e é proporcional

à concentração da amostra

Movimento Interior da coluna de fase reversa

CLAE-FR

Integrador/quantificador dos picos das substâncias

Amostra

Geração de sinais


3.4. INSTRUMENTAÇÃO E EQUIPAMENTO AUXILIAR

3.4.1. RESERVATÓRIO DE ELUENTEÉ a fonte de eluente (fase móvel). Habitualmente é constituído por 1 até 4

frascos de vidro, conforme a bomba de aspiração é isocrática, binária ou quaternária,

de capacidade compreendida entre 1 a 2 litros. O eluente antes de ser introduzido no

reservatório deve ser desgaseificado e a utilização de uma bomba binária ou

quaternária permite variar a composição do eluente em função da polaridade dos

analitos ao longo da separação cromatográfica.

3.4.2. BOMBAA bomba tem por objectivo movimentar o eluente (fase móvel) e pode-se

apresentar em três versões: isocrática, binária e quaternária. É constituída por dois

pistões com movimentos recíprocos, cuja movimentação alternada permite obter um

fluxo de eluente constante e estável. Apesar do fluxo usado habitualmente ser da

ordem de 0,5 – 4 ml/minuto, as bombas têm capacidade para produzirem fluxos

estáveis no intervalo compreendido entre 0,001 e 10 ml/minuto. Dado o eluente ter de

se movimentar através de uma coluna empacotada com uma fase estacionária sólida,

a bomba tem de trabalhar a pressões elevadas durante períodos prolongados de

tempo. As bombas mais comuns podem atingir pressões máximas de 250 a 300 bar,

estando a pressão de trabalho normalmente compreendida entre 60 – 150 bar.

3.4.3. INJECTORA elevada pressão a que a separação cromatográfica tem lugar faz com que a

injecção da amostra não possa ser efectuada directamente sobre a cabeça da coluna,

tal como acontece na cromatografia em fase gasosa. Para ultrapassar esta dificuldade

criou-se a chamada válvula de injecção, sendo a injecção da amostra feita à

temperatura ambiente e o volume injectado compreendido geralmente entre 1 a 500

µl.

3.4.4. COLUNA DE SEPARAÇÃO DE FASE REVERSANeste tipo de coluna de fase reversa (ou inversa) a fase estacionária é apolar,

pelo que se usa uma fase móvel de elevada polaridade (por exemplo: água, metanol,

acetonitrilo ou tetrahidrofurano). No que respeita ao material utilizado no

empacotamento do seu interior são usados grupos apolares funcionalizados à

superfície da sílica, como por exemplo: octadecil (C18), octil (C8), etil (C2), ciclo-hexil

(CH) e fenil (PH). Quanto à sua dimensão, agrupam-se, em:



Figura 9 - Classificação das colunas de fase reversa

Tipo de coluna Comprimento Diâmetro interno Fluxo fase móvel

Coluna convencional 10 - 25 cm 4,6 mm 0,5 – 3 ml/minuto

Coluna empacotada de pequeno diâmetro 1 – 10 cm 0,2 – 1 mm 1 – 2 µl/minuto

Coluna capilar empacotada

1 – 100 cm 40 – 80 µm 0,5 – 2 µl/minuto

Coluna tubular aberta 1 – 100 cm 15 – 50 µm <1 µl/minuto

Tabela 1 - Características das colunas de fase reversa

É necessário observar o cuidado de efectuar o condicionamento correcto da

coluna para garantir um equilíbrio perfeito entre a fase estacionária e a fase móvel.

Para colunas novas o período de condicionamento recomendado é de 4 – 8 horas,

para colunas não utilizadas há alguns dias o tempo é de 2 horas e para colunas

utilizadas diariamente, 15 minutos. Quando não são utilizadas, as colunas devem ser

guardadas em solvente orgânico, ou em alternativa, fase móvel.

3.4.5. DETECTOR DE ABSORVÂNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL O princípio do funcionamento de um detector de absorvância no ultravioleta e

no visível baseia-se no fenómeno da absorção de luz por parte da amostra orgânica

quando esta é atravessada por radiação electromagnética, e na medição subsequente

da perda de intensidade da luz transmitida (absorvância) que é proporcional à

concentração da amostra. Normalmente, a absorção ocorre nas regiões dos

ultravioletas e infravermelhos do espectro electromagnético, num dado intervalo de

comprimentos de onda (210-380 nm – UV, e 380-800 nm – VIS), sabendo-se de

antemão, que aproximadamente 90% dos compostos orgânicos absorvem luz nas


Colunas de fase reversa

Colunas convencionais

Micro colunas

Coluna capilar empacotada

Coluna tubular aberta

Coluna empacotada de pequeno Ø

diâmetro


regiões dos UV-VIS do espectro electromagnético. Existem dois tipos de detectores de

luz ultravioleta, a distinguir: o detector de comprimento de onda variável

(espectrofotómetro), de aplicação mais vasta e sensível, mas também mais caro, e o

detector fotométrico que mede a intensidade de um ou dois comprimentos de onda

fixos. O detector fotométrico é sensível, económico, e mais do que suficiente para se

conseguirem bons resultados analíticos com todas as substâncias e compostos que

absorvam luz no comprimento de onda cuja intensidade o fotomultiplicador medir. Este

tipo de detector é normalmente insensível a variações de fluxo ou caudal e de

temperatura. A maioria dos detectores de comprimentos de onda fixos disponíveis no

mercado mede dois comprimentos de onda, um de 254 nm e outro de 280 nm,

consequências da absorvância de luz nos 254 nm e da emissão de luz nos 280 nm por

uma substância fosforescente. Em condições óptimas, podem-se atingir sensibilidades

de 0,001 unidades de absorvância e, se o composto ou substância absorver

intensamente na gama dos comprimentos de onda dos UV, é possível detectar

quantidades de substâncias e compostos na ordem dos nanogramas (10-9 g). Quando

se utiliza gradiente na fase móvel da CLAE-FR e esta apresenta variação significativa

de absorvância para os UV, é necessário utilizar a célula como referência para

compensar esta flutuação. Se a fase móvel não absorver ou se a absorvância dos UV

for constante, pode-se deixar a célula, ou vazia, ou cheia com um dos componentes

da fase móvel. A Figura 10, seguinte, mostra a concepção de uma célula para CLAE.

Figura 10 - Célula do detector de UV de comprimento de onda fixo

O detector de comprimento de onda variável de UV-VIS (espectrofotómetro),

capaz de abranger a gama dos 190 aos 800 nm através de um monocromador que

isola o comprimento de onda pretendido do feixe de luz policromático emitido pelas

lâmpadas de deutério (UV) ou tungsténio (VIS), permitindo a sua incidência nas

amostras e a recepção, após a absorvância, pelo fotomultiplicador do dispositivo (ver



figura 11), apresenta várias vantagens relativamente ao outro detector de comprimento

de onda fixo, tais como:

a) Mede absorvâncias elevadas em várias substâncias ou compostos devido à

selectividade de comprimento de onda e, consequentemente, tem mais

sensibilidade;

b) Permite maior selectividade analítica a partir do momento em que um

determinado comprimento de onda pode ser escolhido, por exemplo, para o

qual o soluto de interesse absorve significativamente e os outros não;

c) Promove a eficiência da eluição por gradiente através da possibilidade de se

seleccionar um comprimento de onda para o qual os componentes da fase

móvel não tenham variação de absorvância para concentrações diferentes;

d) Permite a obtenção do espectro da absorvância de cada substância ou

componente em separado depois de terminar o escoamento da fase móvel.

As execuções de análises em diferentes comprimentos de onda também são

possíveis recorrendo ao uso de detectores espectrofotométricos de UV-VIS providos

de um conjunto de fotodíodos. Estes fotodíodos, selectivos a determinados

comprimentos de onda, e em grande número, cerca de 250, permitem construir o

espectro da substância ou composto durante a eluição. Este detector é denominado,

detector de rede de díodos (díode array detector). Os detectores de rede de díodos

eram, até há alguns anos, pouco sensíveis, mas na actualidade, com a evolução dos

computadores e softwares dedicados a este fim, com o aumento da sensibilidade dos

próprios díodos e, com as correcções das aberrações das redes de difracção,

aumentou-se significativamente a sensibilidade e a aplicabilidade das redes de díodos

nos detectores espectrofotométricos de UV-VIS utilizados nos equipamentos de CLAE-

FR. A figura 11, seguinte, ilustra o princípio do funcionamento de um detector

espectrofotométrico de UV-VIS de comprimento de onda variável.



Figura 11 - Detector espectrofotométrico de UV-VIS de comprimento de onda variável

Nas figuras 12 e 13, seguintes, apresentam-se imagens de equipamentos

analíticos de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, da actualidade.

Figura 12 - Equipamento de CLAE-FR compacto da actualidade


FotomultiplicadorLâmpada de D2 (UV) ou W (VIS)

Isolamento do comprimento

de onda pretendido

Absorvância da luz

Absorvância da luz

Feixe de luz policromático

Linhas de luz monocromática


Figura 13 - Pormenor de equipamento de CLAE-FR da actualidade

3.4.6. AUTO-SAMPLERNa figura 13, seguinte, apresenta-se uma imagem de um amostrador

automático (auto-sampler) que é um acessório dos cromatógrafos de CLAE-FR actuais

que faz automaticamente as injecções dos analitos das amostras (soluções) nas

válvulas dos injectores dos equipamentos.

Figura 14 - Amostrador automático para CLAE-FR



4. CONCLUSÕESA técnica laboratorial analítica da CLAE-FR apresenta um elevado potencial de

aplicações, bastante diversificadas, proporcionando bons resultados, quer em análise

qualitativa, quer em análise quantitativa, com desvios na repetibilidade e

reprodutibilidade inferiores a 5%.

A CLAE-FR tem aplicações correntes na análise de substâncias químicas, de

natureza orgânica, nomeadamente: proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos,

corantes, polissacarídeos, pigmentos e metabolitos de plantas, e produtos de origem

farmacêutica.

Relativamente a áreas de aplicação a CLAE-FR é utilizada em diversas

actividades, tais como:

a) Pesquisa química/bioquímica em análises de misturas complexas, purificação

de compostos químicos, desenvolvimento de processos de síntese de produtos

químicos, e isolamento/separação de produtos biológicos naturais com

características benéficas;

b) Controlo de qualidade em análises da pureza de materiais brutos, análises

quantitativas de produtos finais (garantia do cumprimento de especificações), e

análises de avaliação de estabilidade e degradação de produtos;

c) Controlo ambiental em análises dos poluentes do ar e da água, monitorização

de produtos e substâncias perigosas no âmbito da saúde ocupacional, e

monitorização dos níveis agrotóxicos dos solos;

d) Entidades Reguladoras e Fiscalizadoras do Estado em análises de controlo de

medicamentos e alimentos, identificação de narcóticos apreendidos, e de

controlo da conformidade (reclamações de etiquetas).

Na tabela 2, seguinte, apresenta-se um quadro comparativo das vantagens e

desvantagens da CLAE-FR:



VANTAGENS DA CLAE-FR DESVANTAGENS DA CLAE-FR

A fase estacionária pode utilizar-se várias vezes;Versatilidade: o único requisito é a solubilidade do analito da amostra na fase móvel;Possui alta resolução;Boa aptidão para análise quantitativa e qualitativa;Boa detecção (sensibilidade);Boa aptidão para automatização;Tempos de análise rápidos (1 – 60 minutos).

Custo de aquisição do equipamento elevado;Custos de manutenção do equipamento elevados;Não existir um detector universal com boa detecção (sensibilidade);Complexidade de operação exigindo operadores com formação específica e experiência.

Tabela 2 - Vantagens/desvantagens da CLAE-FR

5. BIBLIOGRAFIATORRES, Joana Roma; TEIXEIRA, João P.; SILVA, Susana; LAFFON, Blanca; CUNHA, Luís M.; MÉNDEZ, Josefina; MAYAN, Olga (2005/2006). “Evaluation of genotoxicity in a group of workers from a petroleum refinery aromatics plant” in ELSEVIER – Available online at www.sciencedirect.com

CORRADINI, Danilo. (2010) Handbook of HPLC, Second edition. Roma: CRC Press

HAZEL, Peck; HOLME, David J. (1998) Analytical biochemistry, Third edition. Harlow: Pearson Education Limited

5.1. SÍTIOGRAFIAhttp://profesionseg.blospot.com/2009/01/tolueno-y-sus-derivados-metabolismo.html acedido em 7 de Novembro, 2010;

http://www.mednet.cl/link.cgi/Medwave/Enfermeria/mar2003/2771 acedido em 6 de Novembro, 2010;

http://www.farmabio.k6.com.br acedido em 16 de Outubro, 2010;

Imagens da CLAE-FR retiradas da internet utilizando-se o motor de busca “Google”.


http://www.farmabio.k6.com.br/

http://www.mednet.cl/link.cgi/Medwave/Enfermeria/mar2003/2771

http://profesionseg.blospot.com/2009/01/tolueno-y-sus-derivados-metabolismo.html

http://www.sciencedirect.com/

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