relatorio de hplc

7/21/2019 Relatorio de HPLC

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FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DE LISBOA

Doseamento da cafeína em

bebidas, por CromatografiaLíquida de Alta Eficiência(HPLC)

Bioquímica Experimental I

Docente: Carlos Cordeiro

26/11/2013

Trabalho realizado por:

-Ana Isabel Gouveia nº 44356

-Ana Rita Janela nº 43232

-Maria Beatriz Sousa nº 43193

-Patricia Sequeira nº 43242

-Violeta Railean nº 43219

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ÍndiceResumo .......................................................................................................................................... 3

Reagentes e materiais ................................................................................................................... 4

Tratamento de resultados ............................................................................................................. 5

Conclusão .................................................................................................................................... 11

Bibliografia .................................................................................................................................. 12

Anexos ......................................................................................................................................... 13



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Resumo

Com esta actividade experimental pretendia-se determinar o teor em cafeína de diversas

bebidas, neste caso foram a Coca-Cola e Pepsi por cromatografia líquida de alta

eficiência, HPLC.

Para determinar a quantidade de cafeína, aplicou-se o método do padrão externo às

amostras, que consiste na injecção de várias soluções padrão. A análise qualitativa

consistiu na avaliação e comparação dos tempos de retenção(tr ) dos vários picos obtidos

com os dos padrões de cafeína preparados anteriormente. O cálculo das concentrações foi

efectuado por interpolação da curva de calibração resultante da representação da área

obtida por cada pico de cafeína dos padrões em função das respectivas concentrações,

tendo-se obtido uma concentração de 0,073 mg/cm3 de cafeína na Coca-Cola e 0,0854

mg/cm3 de cafeína na Pepsi.



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Reagentes e materiais

Materiais e equipamentos:

Sistema de HPLC com bomba binária, injector com loop interno (20µdm3), coluna

de fase reversa, detector (UV/vis) e registador/integrador

Seringa Hamilton (100 µdm3)

Balões volumétricos (25, 50 e 500 cm3)

Pipetas graduadas (5 e 10 cm3)

Gobelets (50 e 500 cm3)

Balança analítica

Reagentes:

Padrão de cafeína

Eluente: Metanol para HPLC/água Milipore na porporção 30% / 70% (v/v)

Ácido Clorídrico (6 mol dm-3)

Amostras de bebidas (Coca-Cola e Pepsi)

Alterações ao Protocolo:

Uma vez que foram utilizados volumes fixos e o método utilizado apresenta uma altareprodutibilidade, não foram feitas medições duplicadas das amostras.



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Tratamento de resultados

A cromatografia líquida de elevada eficiência, HPLC, é a técnica cromatográfica mais

usada e versátil. Neste tipo de cromatografia a fase móvel é um solvente líquido que

contém a amostra a analisar e a fase estacionária contém partículas muito finas e dedimensões muito reduzidas. Para que as separações sejam eficientes é necessário que as

partículas sejam muito pequenas e regulares, uma fase móvel com bombas de alta pressão

para que o fluxo ao longo da coluna seja constante e ainda um sistema de detecção

eficiente.

A eluição de uma coluna cromatográfica pode ser realizada com um único sistema de

eluente, ou seja, a composição do solvente mantém-se constante e, neste caso aplica-se o

método da eluição isocrática. Alternativamente, para uma eluição onde há a alteração da

composição do eluente, esta é dita de eluição em gradiente.

Análise qualitativa das amostras

A análise qualitativa de amostras em HPLC é feita através dos tempos de retenção,

uma vez que o tempo de retenção (tR ) é único para cada substância.

Esta análise pode ser feita por duas vias: utilização dos tempos de retenção

ajustados, em que se ajusta o tempo de retenção da substância e do padrão correspondente

e, de seguida, comparam-se os dois valores; Co-cromatografia: adição de um composto

que su postamente está presente na amostra (“ spiking ”), em que se cromatograma

sucessivamente uma amostra sem adição e uma amostra com adição de quantidade

conhecida do composto que se supõe estar presente e, seguidamente, procede-se à

comparação dos dois cromatogramas.

Neste trabalho laboratorial, a análise é feita através dos tempos de retenção.

Através dos tempos de retenção das várias soluções padrão de cafeína, utiliza-se o valor

médio de tR e comparam-se os tR das várias substâncias presentes nas amostras de coca-

cola e pepsi com o valor médio do padrão.

O ajuste dos tempos de retenção não é efectuado, uma vez que não se observa o

pico de eluição nos cromatogramas, cujo tempo de retenção é necessário ao ajuste.



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As soluções padrão de cafeína foram preparadas por diluição de uma solução de

cafeína já preparada. Assim, a amostra padrão 1 é a mais diluída e a padrão 5 menos

diluída.

Amostra Tempo de retenção (tR )Padrão 1 4.904

Padrão 2 4.838

Padrão 3 4.783

Padrão 4 4.745

Padrão 5 4.725

Tabela 1. Tempos de retenção para as várias amostras padrão de cafeína.

Assim, o tempo de retenção médio do padrão de cafeína é:

tR (médio) =.+.+.+.+.

= 4.799

Foram analisadas, seguidamente, duas amostras: coca-cola e pepsi, cujos

cromatogramas obtidos foram os seguintes, dados em intensidade por tempo, em minutos:

Amostra de coca-cola

Ilustração 1. Cromatograma obtido para amostra de coca-cola, por HPLC.

Os tempos de retenção das diferentes substâncias presentes na amostra para este

cromatograma são, por ordem sequencial dos picos:



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Pico Tempo de retenção (tR )

1 2.423

2 2.652

3 3.107

4 3.384

5 3.587

6 3.717

7 4.770

Tabela 2. Tempos de retenção dos picos observados no cromatograma da amostra de coca-cola.

Por comparação com o valor de tR médio do padrão de cafeína (4.799), conclui-se que o

pico correspondente à cafeína, na amostra de coca-cola, é o pico 7, pois apresenta umtempo de retenção semelhante (4.770).

Amostra de pepsi

Ilustração 2. Cromatograma obtido para amostra de pepsi, por HPLC.

Os tempos de retenção das diferentes substâncias presentes na amostra para este

cromatograma são, por ordem sequencial dos picos:

Pico Tempo de retenção (tR )

1 2.426

2 2.696

3 3.105



8

4 3.708

5 4.298

6 4.755

Tabela 3. Tempo de retenção para os picos observados no cromatograma da amostra de pepsi.

Por comparação com o valor de tR médio do padrão de cafeína (4.799), conclui-se que o

pico correspondente à cafeína, na amostra de pepsi, é o pico 6, pois apresenta um tempo

de retenção semelhante (4.755).

A resolução dos cromatogramas não foi perfeita uma vez que os valores de tR das amostras

padrão de cafeína divergiram todos e os valores de tR das amostras de pepsi e coca-cola

também divergiram em relação ao padrão. Isso significa que as condições experimentaisde realização da cromatografia foi diferente, pois não houve reprodutibilidade nos tR..

Obteve-se, portanto, uma maior resolução na amostra de pepsi, uma vez que os valores

de tR foram mais precisos do que na amostra de coca-cola.

Contudo, foi possível observar que ambas as amostras possuíam cafeína, por análise

qualitativa dos seus cromatogramas em relação aos de uma amostra padrão de cafeína.

Análise Quantitativa das Amostras:

Para uma análise quantitativa numa cromatografia pode-se recorrer a dois métodos: o

método do padrão interno ou o método do padrão externo. Nesta actividade experimental

recorreu-se ao método do padrão externo que nos permite estabelecer uma recta de

calibração com o composto padrão (cafeína) através da injecção de diferentes quantidades

de padrão na coluna. Assim define-se a relação entre a área/altura do pico e a quantidade

de composto padrão injectado. Não se realizaram as amostras em duplicado porque como

se estavam a usar volumes fixos, devido à técnica do loop ,o processo apresenta uma alta

reprodutibilidade.

Para tal é necessário calcular-se a concentração de cafeína em cada uma das 5 amostras

padrão preparadas.

Os cálculos vão ser exemplificados para o padrão 1, no entanto o mesmo raciocínio foi

aplicado para os restantes padrões:



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Sabe-se que a amostra inicial de cafeína continha 15mg e fora diluída para um balão

volumétrico de 25 cm3. Assim a concentração inicial de cafeína era:

[cafeína] =m

Vsolução

⇔ [cafeína] =15 mg

25 cm

= 0,6 mg/cm

Desta solução inicial, cuja concentração de cafeína era 0,6mg/cm3, retirou-se 1 cm3 para

um balão de 25 cm3 para preparar o padrão 1. Portanto a massa de cafeína retirada para o

padrão 1 da solução inicial era 0,6 mg.

[cafeína] =m

Vrtirdo

⇔ m = [cafeína] × Vrtirdo = 0,6 × 1 = 0,6 mg

Como essa massa de cafeína foi transferida para um balão volumétrico de 25 cm3

, aconcentração no padrão 1 era de 0,024g/cm3.

[cafeína]pdrão =m

Vpdrão

⇔ [cafeína]pdrão =0,6

25 = 0,024 mg/cm

Procedeu-se da mesma forma para os restantes padrões e obteve-se a Tabela 4:

Padrão Massa de

cafeína(mg)

Volume da

solução(cm3)

[Cafeína]

(mg/cm3)

Área do pico

(cm3)

1 0,6

25

0,024 1864029

2 1,2 0,048 4292674

3 1,8 0,072 6822136

4 2,4 0,096 7985578

5 3 0,120 9360273

Tabela 4 Concentração da cafeína nas várias soluções padrão preparadas

Deste modo construi-se a recta de calibração que relaciona a área dos picos do padrões

preparados com a sua concentração em cafeína:



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Gráfico 1- Gráfico que relaciona a concentração de cafeína em função da área do pico dos diferentes padrões

Assim, pode calcular-se a concentração a concentração em cafeína de cada uma das

amostras, procedendo do seguinte modo (exemplificado para a Coca-cola):

y = 80000000 45932 ⇔ 1920963 = 8000000 45932

⇔ =1920963 − 45932

80000000 ⇔ = 0,0234 mg/cm

Este valor corresponde à concentração de cafeína na solução de 25 cm 3, na qualse colocaram 8 cm3 de coca-cola. Desta forma, para obter a concentração original de

cafeína na coca-cola, faz-se o seguinte cálculo:

[cafeína]solução =mí

Vsolução

⇔ mí = 0,0234 × 25 = 0,585 mg

[cafeína]oriil =mí

Vrtirdo

⇔ [cafeína]oriil =0,585

8 = 0,073 mg/cm

Concentração de cafeína na coca-cola: 0,073 mg/cm3

Concentração de cafeína na Pepsi: 0,0854 mg/cm3

y = 8E+07x + 459320

R² = 0,9723

1500000

2500000

3500000

4500000

5500000

65000007500000

8500000

9500000

10500000

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

Á r e a d o p i c o e m

c m 3

Concentração de cafeína em mg/cm3



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Conclusão

Como já foi dito, com este trabalho experimental pretendia-se realizar o doseamento da

Cafeína em bebidas comerciais, que neste foram a Coca-Cola e a Pepsi, aplicando a

técnica cromatográfica HPLC( Cromatografia Líquida de Alta Eficiência).´

Para a realização de uma análise quantitativa aplicou-se o método do padrão externo,

preparando-se várias amostras padrão que continham a substância a analisar (cafeína)

diluída no eluente. Para a análise qualitativa fez-se uma comparação dos tempos de

retenção, tr , dos vários picos obtidos e das suas áreas com os valores obtidos dos padrões.

Assim, foi possível identificar se as bebidas analisadas continham ou não cafeína e se

tinham então em que quantidade.

Concluiu-se que ambas as amostras continham cafeína e, após identificar, através de uma

análise qualitativa, a que picos do cromatograma de cada amostra, correspondia a eluição

desta substância, foi possível recorrer a uma análise quantitativa para saber a

concentração de cafeína em cada amostra.

A Coca-Cola continha 0,073 mg/cm3 de cafeína, enquanto a Pepsi continha 0,0854

mg/cm3.

Verificou-se, então, que a Pepsi apresenta uma concentração superior de cafeína do quea Coca-Cola.

Assim, pode-se concluir que a actividade correu como esperado e, portanto, foi um

sucesso.



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Bibliografia

David. L. Nelson, Michael. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry , 5ª ed.,

W. H. Freeman, 2009.

Skoog, D. A., West, D.M., Holler, F.J. e Crouch, S.R., Fundamentals of Analytical

Chemistry, 7ª ed., Thomson-Brooks/Cole, Belmont, 2004

Holme, D.J. e Peck, H., Analytical Biochemistry, 3ª ed., Longman, London,1998



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AnexosCromatograma obtido para o padrão de cafeína (0,024 mg/cm3)

Cromatograma obtido para o padrão de cafeína (0,048 mg/cm3)



15

Cromatograma obtido para o padrão de cafeína (0,120 mg/cm3)

Cromatrogama obtido para a Amostra de Coca-Cola



16

Cromatograma obtido para a Amostra de Pepsi

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