CENTRO PAULA SOUZA

ETEC CONSELHEIRO ANTONIO PRADO

TÉCNICO EM QUÍMICA

ANÁLISE QUÍMICA INSTRUMENTAL

DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA (CLAE)

Ana Laura - Nº 02Arnaldo - Nº 04Hosana - Nº 15

Lucas Oliveira - Nº 22Lucas Stefano - Nº 23

3º TD - Noite

CAMPINAS – SP

Maio 2012

CENTRO PAULA SOUZA

ETEC CONSELHEIRO ANTONIO PRADO

TÉCNICO EM QUÍMICA

DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA (CLAE)

Requisito para a matériade Análise QuímicaInstrumental, Prof.Paulo Costa

Ana Laura - Nº 02Arnaldo - Nº 04Hosana - Nº 15

Lucas Oliveira - Nº 22Lucas Stefano - Nº 23

3º TD - Noite

CAMPINAS – SP

Maio 20122

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 4

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6

2.1 A Cafeína 6

2.2 O Café 8

2.3 A Coca-Cola 11

2.4 O Refrigerante de Guaraná 13

2.5 Curiosidades: Cafeína 15

2.6 Questão: Por que a cafeína estimula o cérebro humano? 17

2.7 CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) 20

3 PROCEDIMENTO 28

3.1 Determinação de cafeína em bebidas por CLAE 28

4 RESULTADOS 30

5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS 32

6 CONCLUSÃO 34

7 ANEXOS 35

7.1 Figuras e Imagens 35

7.2 Tabelas adicionais 37

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

3

1 INTRODUÇÃO:

De todas as drogas existentes, a cafeína é a mais consumida no mundo

atualmente. O ser humano aprecia tanto as bebidas que contém esse composto, que uma

das principais refeições diárias foi nomeada em sua homenagem: café da manhã.

As bebidas cafeinadas exercem um fascínio na raça humana desde os primórdios

da civilização. Seus efeitos estimulantes eram conhecidos antes mesmo da invenção da

escrita, e o estudo de seu uso nos remete a uma viagem que vai desde à Pré-História até

a sociedade contemporânea.

A cafeína pode ser encontrada, não somente no café, mas em muitas outras

bebidas como chás, refrigerantes do tipo cola, refrigerantes do tipo guaraná, bebidas

energéticas, chimarrão, milk-shakes, chocolate quente, achocolatados, entre muitas

outras. O consumo da cafeína está de tal forma difundido em nossa sociedade, que a

maioria dos brasileiros adultos consome doses diárias acima de 300 mg, e um grande

número deles são viciados.

Muito se tem discutido sobre o real efeito deste alcaloide no organismo, e muitos

mitos foram criados ao longo dos séculos, muitos advindos da sabedoria popular. Há

algumas questões fundamentais para quem deseja estudar o assunto. Algumas delas são:

o que a ciência sabe atualmente sobre a cafeína? Qual seu efeito no organismo? É

seguro ingerir cafeína? Ela pode causar dependência? Porque essa droga é tão popular?

Qual a quantidade de cafeína presente em alimentos que consumimos diariamente? Essa

quantidade pode causar algum efeito indesejável?

4

Buscar a resposta para essas e muitas perguntas, fornecer dados precisos através

da análise por HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) ou CLAE

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e lançar discussões pertinentes são os

objetivos deste relatório, bem como abordar o real papel da cafeína, descobrindo o

verdadeiro impacto na saúde do ser humano e desmistificando a imagem de vilã

absoluta que foi atribuída a esse composto nas últimas décadas pelos adeptos do viver

saudável, sem contudo subestimar o seu potencial de alcaloide vegetal.

.

5

2 REVISÃO BILBIOGRÁFICA

2.1 A CAFEÍNA

A Cafeína é um alcalóide vegetal presente em plantas do gênero Cola (Cola

nítida, Cola vera, Cola acuminata) plantas da família do café (Coffea arabica e a

Coffea canephora) entre outras.

Entre os vários alcalóides existentes na natureza, encontram-se as metilxantinas,

da qual a cafeína faz parte. Existem 3 metilxantinas particularmente importantes: a

1,3,7-trimetilxantina (cafeína), a 1,3-dimetilxantina (teofilina) e a 3,7-dimetilxantina

(teobromina). Todos são derivados da purina (o grupo xantina é a 2,6-dioxopurina) e

inibem a enzima fosfodiesterase. Teobromina e teofilina são duas dimetilxantinas, com

dois grupos metilas somentes, em contraste à cafeína, que possui três. Ambas têm

efeitos similares à cafeína, porém bem menos acentuados.

A teobromina é encontrada no chocolate, no chá, na noz moscada, mas não no

café. No cacau, a concentração de teobromina é 7 vezes maior do que de cafeína! A

teofilina possui mais efeitos no coração e na respiração, sendo, por isso, mais

empregada em medicamento para asma, bronquite e enfisemas do que a cafeína. É

encontrada, também, no café. No organismo, estes compostos são facilmente oxidados

para o ácido úrico e outros derivados.

A cafeína é um pó branco cristalino muito amargo. Na medicina, esse composto

é utilizado como um estimulante cardíaco e também como um diurético.

A cafeína é conhecida popularmente por fornecer energia rápida, ou uma

acentuação no estado de alerta. Graças a essa fama, milhares de profissionais que

6

travam batalhas contra o sono - motoristas e estudantes, por exemplo - tomam grandes

quantidades de café para permanecerem acordados.

A cafeína é uma droga que causa dependência tanto física como

psicológicamente. Ela opera através de mecanismos similares aos das anfetaminas e da

cocaína. Seus efeitos, entretanto, são mais fracos do que estas drogas, muito embora ela

aje nos mesmos centros receptores do sistema nervoso central (SNC). Sentir

necessidade diária de tomar café pode significar o início do vício.

7

2.2 O CAFÉ

A infusão realizada com as sementes do café torradas é uma das bebidas mais

consumidas no mundo todo. Só no Brasil foram consumidas mais de 17 milhões de

sacas de café em 2007. Mas nem sempre foi assim. No início, até o ano 1.000 d.C., o

café, originário da Etiópia, era usado somente para alimentar os rebanhos durante as

longas viagens, para reduzir a necessidade de descanso que o rebanho possuía. Estava

ali sendo descoberta sua poderosa ação estimulante, conseguida através (entre outros

compostos) da cafeína.

Diz uma das lendas sobre o café que um dia um pastor da Absínia (local que

atualmente chama-se Etiópia), chamado Kaldi, resolveu levar até um monge conhecido 

seu, o fruto de uma planta que, segundo ele, deixava o rebanho alegre e disposto quando

a ingeriam, permitindo-os locomover-se por longas distâncias sem descanso. O monge

intrigado resolveu experimentar uma infusão daqueles frutos amarelo-avermelhados e

percebeu que realmente a infusão dos frutos lhe ajudava a ficar mais tempo acordado

durante suas meditações. A partir daí o fruto começou a ser utilizado como alimento cru

e estimulante, mas ainda demoraria um pouco até que seu uso se disseminasse.

Não há corroboração histórica para esse mito, mas o fato é que o café começou a

ser cultivado pela primeira vez em monastérios islâmicos no Yêmen, Península Arábica.

Dali ele foi levado até Constantinopla pelo Império Otomano, local onde foi fundada a

primeira cafeteria do mundo, chamada de Kiva Han.

8

No século XIV, quando chegou ao continente europeu, o café era chamado de

“vinho da Arábia” pois os árabes lhe chamavam de qahwa, que em sua língua significa

“vinho”. Mas o “café torrado como consumimos hoje, só surgiu no século XVI.

O mundo árabe aceitou prontamente a disseminação da nova bebida. Uma vez

que sua religião não permite o consumo de bebidas alcoólicas, o café passou a ser

consumido até mesmo nos cultos religiosos. Desta forma, foram surgindo locais

especializados em servir a bebida, principalmente na cidade de Meca, onde logo foram

surgindo inúmeras Kaveh Kanes, as primeiras cafeterias.

Até o século XVIII o café era considerado uma preciosidade pelos árabes que

sabiam de seu potencial energético e eram os únicos que tinham ciência das técnicas

necessárias para cultivar a planta com sucesso e dominavam a produção da bebida a

partir das sementes.

Mesmo com tanto protecionismo, o café conseguiu romper as barreiras

geográficas e culturais e seu comércio (bebida e grãos) chegou à Europa levada pelos

vienenses que fundaram a Botteghe del Caffé, principal responsável pela popularização

do hábito de torrar e moer o café. Foram os vienenses também, que inventaram o

costume de beber o café coado, adoçado e com leite. Daí vem o nome recebido: café

vienense.

Os habitantes dos Países Baixos foram, contudo, os pioneiros ao levar a planta

até a Europa e a conseguir cultivar as primeiras mudas, vindas de Mokha na Península

Arábica, no jardim botânico de Amsterdã. É igualmente mérito dos holandeses, levar o

café para o novo continente (onde alcançaria sua maior popularidade), para a América

do Norte, na chamada Nova Amsterdã (atual cidade de Nova York) e para o estado da

9

Filadélfia. A partir de então, o café se alastrou rapidamente para o resto do mundo.

Primeiramente para as colônias holandesas em Java, depois, para Sumatra, e então para

as ilhas francesas de Sandwich e Bourbon, até chegar ao Brasil que se tornaria, mais

tarde, o maior produtor mundial de café e um dos maiores consumidores de seus grãos

torrados e moídos.

10

2.3 A COCA-COLA

A Coca-Cola foi lançada em 1886, em uma criação de John Pemberton,

farmacêutico de Atlanta, quando ele criou uma bebida com o intuito de curar dores de

cabeça. Levou a bebida a uma farmácia, a Jacob’s Pharmacy, onde o xarope era

misturado com água carbonatada e oferecido pelos clientes pelo valor de US$ 0,05.

Frank Robinson, contador de Pemberton, batizou a bebida de Coca-Cola escrevendo o

nome à mão mesmo.

Cem anos depois, Pemberton vendeu a empresa para Asa Gringgs Candler, sem

ter idéia do sucesso que sua bebida faria. Candler batizou a empresa de “The Coca-Cola

Company” tornando-se o primeiro presidente e o primeiro a dar visibilidade à marca.

Asa Candler rapidamente popularizou a Coca, fornecendo aos farmacêuticos relógios,

balanças e calendários com a marca.

Em 1894, Joseph Biedenharn, tem a brilhante idéia de colocar a bebida em

garrafa, no começo Candler não coloca muita fé, mas anos depois a novidade veio para

ficar até que uma empresa de Indiana inicia a fabricação de garrafas contour

(embalagem de vidro), possibilitando ao consumidor reconhecer a marca até de olhos

vendados.

Robert Woodruff assumiu a presidência da “The Coca-Cola Company” em 1918

quando Candler a vendeu. Ele era um gênio do marketing e fez a bebida se tornar ainda

mais conhecida. Durante a Segunda Guerra Munidal, Woodruff determinou que a Coca-

Cola fosse vendida para todo combatente norte-americano onde quer que ele estivesse a

US$ 0,05. Europeus também experimentaram a bebida, resultando na explosão da

bebida na Europa, logo após a Guerra.

11

Até os dias de hoje a Coca-Cola é um sucesso de vendas, com tantas parcerias,

encontra-se em qualquer canto do mundo todo e ainda busca perfeição a cada nova

invenção que cria.

A Coca-Cola tradicional tem em sua composição aromatizantes naturais, água

gaseificada, açúcar, cafeína, extrato de noz de cola, corante caramelo IV, acidulante

ácido fosfórico (INS 338). Não contem glúten e não contém quantidades significativas

de proteínas, gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans e fibras alimentares.

12

2.4 O GUARANÁ:

O guaraná, de nome científica Paullinia cupana, é uma fruta típica do estado do

Amazonas. A árvore que dá essa fruta pode chegar à 10m de altura e seus frutos

assumem a forma de cachos.

Desde da época dos índios o fruto era apreciado pelas suas características

estimulantes. Moíam as sementes até virar uma pasta, moldavam em forma de bastão,

deixavam secar até ficar duro e depois raspavam. Obtendo um pó, usado para a

produção de uma bebida. Acreditava-se que essa bebida garantia vida longa.

Refrigerante é produzido industrialmente, a partir de água mineral e açúcar,

podendo conter edulcorantes, extrato ou aroma sintetizado de fruta ou outros vegetais e

gás carbônico.No século XVI, a fabricação e elaboração do mesmo só podia ser feita

por farmacêuticos, pois eram os únicos que tinham conhecimento de química e

medicina.

O processo de processamento de xarope de fruta teve inicio em 1905, e em 1906

foi lançado, pela F. Diefenthaller, uma fábrica de refrigerantes de Santa Maria, no Rio

Grande do Sul, o Guaraná Cyrilla.Em 1921 foi lançado no Brasil Guaraná Champagne

Antártica atualmente o Guaraná Antártica.

 Com o passar do tempo os métodos foram aperfeiçoados desde o plantio até a

produção do refrigerante.

13

 Informação Nutricional: Porção de 200 ml (copo)

Quantidade por porção

% VD*

Valor

Energético80 KCal = 336 KJ 4

Carboidrato 20 g 7

Sódio 11 mg 0

  * Valores diários de referência com base em uma dieta de 2000 Kcal ou 8400

KJ. Seus valores diários podem ser maiores ou menores, dependendo de suas

necessidades energéticas.

Não contém quantidades significativas de proteínas, gorduras totais, gorduras

saturadas, gorduras trans e fibra alimentar.

Pesquisas feitas mostram que o venda de refrigerantes cresce a cada ano.

Famílias passaram a consumir os mesmos de forma irregular, causando doenças como

diabetes, aceleração cardiovascular entre outras prejudicando a saúde.

Guaraná Antártica é a segunda marca mais vendida no Brasil  e está entre a 15

marcas mais vendidas no mundo.

14

2.5 CURIOSIDADES: CAFEÍNA

Retirado do banner “15 Things You Should Know About Caffeine”*

(15 coisas que você deveria saber sobre cafeína – ver anexos)

*Tradução nossa

Isolada do café pela primeira vez em 1820, cafeína é a droga escolhida por um

grande número de pessoas, visto que pode ser encontrada em vários tipos de bebidas e

medicamentos. Não são todos, entretanto, que param para analisar o que ela é e faz ao

nosso organismo.

O delicioso nome químico da cafeína é 1,3,7-trimetilxantina.

A cafeína é encontrada naturalmente em 60 tipos diferentes de plantas,

entre elas: sementes de café (a fonte mais comum na América), folhas de

chá, guaraná (fonte de cafeína para energéticos), erva-mate, noz-de-cola.

A cafeína é extraída através do cozimento das sementes e das folhas em

alta pressão com CO2 para obter o composto em pó.

90% dos americanos consomem cafeína de alguma forma todos os dias.

A cafeína aumenta seus níveis de dopamina, o que faz você se sentir mais

feliz, e bloqueia os receptores de adenosina, o que impede que você fique

sonolento.

A cafeína apresenta uma melhora temporária na capacidade de

aprendizagem. Isso inclui compreensão, memória, reflexos, clareza de

pensamentos.

A cafeína trabalha nas mesmas partes do cérebro que a cocaína, as

anfetaminas e a heroína. Ela apenas tem efeitos mais suaves.

Por outro lado, a cafeína também tem efeitos colaterais:

15

o Insônia: o efeito estimulante da cafeína mantém o cérebro,

evitando assim, o sono.

o Da mesma forma, as propriedades diuréticas da cafeína impedem

você de dormir, pois tem que urinar o tempo todo.

o Diarreia: A cafeína acelera o processo de digestão forçando o

alimento para fora do tubo digestório rápido demais.

A cafeína beneficia os atletas: 5 mg por kg melhora a resistência por

reduzir a queima de glicose e aumentar a queima de gordura.

O Comitê Olímpico Internacional baniu a cafeína das competições.

Uma dose alta de cafeína pode ser letal: a dose letal de cafeína para um

ser humano é algo em torno 150-200 mg por quilograma de massa

corporal. Isso corresponde a 100 xícaras de chá em 4 horas. Em 2007, um

homem morreu após uma overdose de pílulas No-Doz (suplementos de

cafeína. N. do T.).

A cafeína é completamente absorvida depois de 30 a 40 minutos, e seus

efeitos diminuem após 3 horas.

Estima-se que 12.000 toneladas de cafeína são consumidas todo ano,

sendo 54% proveniente de cafés, 43% de chás e 3% de alimentos e outras

fontes. A média de consumo dos americanos é de 280 mg de cafeína por

dia, 2 ou 3 xícaras de café.

A cafeína causa dependência física. O período de abstinência tem inicio

entre 12 e 24 horas e pode durar de 2 a 9 dias. Os sintomas incluem: dor

de cabeça, cansaço, depressão, irritabilidade e perda de energia.

Produtos descafeinados ainda possuem cafeína em sua composição. Nos

Estados Unidos, “Descafeinado” significa que menos de 2,5% do produto

é cafeína.

Hitler recebeu injeções de glicose e cafeína para manter a energia durante

os últimos dias da Segunda Guerra Mundial.

16

2.6 QUESTÃO:

POR QUE A CAFEÍNA ESTIMULA O CÉREBRO HUMANO?

Um neurotransmissor natural chamado adenosina, ao ligar-se aos seus

receptores, diminui a atividade neural, dilata os vasos sanguíneos, entre outros. A

cafeína se liga aos receptores da adenosina e impede a ação da mesma sobre o Sistema

Nervoso Central. A cafeína estimula a atividade neural e causa a constrição dos vasos

sanguíneos, pois bloqueia a ação da adenosina. Muitos medicamentos contra a dor de

cabeça, tal como a Aspirina Forte, contém cafeína, que por provocar a constrição dos

vasos sanguíneos, aliviará a dor. Com o aumento da atividade neural, a glândula

pituitária "pensa" que algum tipo de emergência está ocorrendo, e libera grandes

quantidades de adrenalina, que causa uma série de efeitos no corpo humano, como a

taquicardia, aumento da pressão arterial, abertura dos tubos respiratórios (por isso

muitos medicamentos contra a asma contém cafeína), aumento do metabolismo e

contração dos músculos, entre outros.

Outro mecanismo de ação da cafeína atua através do bloqueio da enzima

fosfodiesterase, responsável pela quebra de mensageiros AMP cíclico (monofosfato

cíclico de adenosina) do cérebro, fazendo com que os sinais responsáveis pela excitação

da adrenalina persistem por muito mais tempo, ou seja, demorem mais para serem

degradados pelo organismo. A cafeína, a adenosina e o monofosfato cíclico de

adenosina possuem fórmulas estruturais extremamente similares (ver anexos).

A ingestão da cafeína também é responsável pelo aumento da concentração de

dopamina no sangue (de modo análogo ao das anfetaminas e da cocaína), por provocar

uma diminuição da recaptação desta no Sistema Nervoso Central. A dopamina também

17

é um neurotransmissor (relacionado com o prazer) e médicos e pesquisadores suspeitam

que seja justamente este aumento dos níveis de dopamina que leve o individuo a viciar-

se em cafeína.

A cafeína, em curto prazo, impede que você durma porque bloqueia a recepção

de adenosina; lhe dá mais "energia", pois causa a liberação de adrenalina, e traz uma

sensação de bem estar, devido à manipulação da produção de dopamina.

Os únicos problema decorrentes do consumo de cafeína (excetuando-se os de

grau alérgico) só podem ser observados a longo prazo. O mais importante é o efeito que

a cafeína tem sobre o sono. A recepção de adenosina é muito importante para o sono,

principalmente para o sono profundo. O tempo de meia-vida da cafeína no organismo é

de 6 horas. Portanto, quando uma pessoa bebe uma quantidade x de café (200 mg de

cafeína, por exemplo) por volta das 15:00h, cerca de 100 mg desta cafeína ainda estarão

em seu corpo às 21:00h. Isso não impede que o sono aconteça, mas provavelmente não

haverá proveito integral dos benefícios que somente o sono profundo traz. No dia

seguinte, a quantidade de cafeína necessária para que aconteça o mesmo efeito será

maior, e assim gradativamente, este círculo vicioso continua, dia após dia. Ao tentar

parar o consumo de cafeína, poderão ser observados sintomas de depressão e, em alguns

casos, cefaleia intensa - causada pela excessiva dilatação dos vasos sanguíneos no

cérebro. Estes efeitos colaterais negativos fazem com que o corpo procure consumir

mais cafeína. Esta é a principal razão que leva os fabricantes de refrigerantes a adicionar

cafeína aos seus produtos - o consumidor, caso não controle a ingestão deste tipo de

bebida, se torna viciado, sente necessidade constante de ingerir cafeína, passa a fazer

disto um hábito e, consequentemente, as vendas aumentam exponencialmente.

18

Existem alguns estudos indicam que o consumo de cafeína durante a gravidez

pode ser prejudicial para o feto, porém os cientistas garantem que os males só aparecem

se o consumo for exagerado. A cafeína pode ser letal, se ingerida em grande quantidade.

A dose necessária para matar 50% de certo grupo de indivíduos é de 75mg/kg. As

estatísticas são muitas, e variam bastante, mas para matar um adulto de cerca de 80 Kg,

seriam necessárias mais de 40 xícaras de café.

19

2.7 CLAE (CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA)

ou HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)

INTRODUÇÃO

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um tipo de cromatografia

líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente

preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Ela tem a capacidade de

realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos

presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta

resolução, eficiência e sensibilidade. Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um

avanço considerável da cromatografia líquida moderna que até então era essencialmente

subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no

inicio do século, foi o tipo que é hoje chamado cromatografia líquida clássica. O avanço

foi gradual e atingiu o atual nível de sofisticação que a CLAE apresenta, devido ao

revolucionário desenvolvimento tecnológico da prática deste tipo de cromatografia.

Desde 1968 tornou-se possível rechear colunas com partículas de pequeno tamanho,

necessárias para alta resolução e, também, adquirir equipamentos que funcionam nas

altas pressões necessárias para obter uma boa velocidade de eluição. Nos últimos dez

anos ocorreu o desenvolvimento de vários detectores espectrofotométricos que operam

em comprimentos de onda variável até 190 nm, e houve um aumento na utilização dos

detectores por fluorescência, eletroquímicos, e por fluorescência induzida por laser, bem

como acoplamento com o espectrômetro de massas. Com estes, tornou-se possível a

detecção da maioria dos compostos e a análise de traços em amostras complexas, como

sangue, urina, solo, alimentos, petróleo, etc.

20

Hoje em dia são comuns estudos com partículas pequenas, a execução da CLAE

com fase reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluição

com gradiente, bem como de métodos especiais, tais como a formação de pares iônicos.

Como resultado, dificuldades anteriores ou separações difíceis de compostos como

corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabólitos são agora rotina.

O PROCESSO CROMATOGRÁFICO

O processo cromatográfico consiste na partição dos componentes de uma

mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia gasosa o

fluido é um gás e na cromatografia líquida o fluido é um solvente. Na cromatografia

líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma

coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. São as forças físicas e químicas que atuam

entre os solutos e as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a

coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas forças que determina a

resolução e portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que

agem sobre as moléculas são de cinco tipos:

Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;

Interações de dipolo induzido;

Ligações de hidrogênio;

Interações dielétricas;

Interações eletrostáticas e coulombianas.

As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares iram influenciar o grau

de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.

CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS EM CLAE

21

Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para CLAE podem ser

classificados de acordo com os seguintes aspectos:

a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos;

b) Partículas porosas ou peliculares;

c) Partículas esféricas ou irregulares;

d) Partículas com diferentes diâmetros.

Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Esses

recheios podem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento

estável e colunas eficientes de partículas pequenas.

Sólidos semi-rígidos são geralmente constituídos de partículas porosas de

poliestireno entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rígido tem sido usado para

pressões até 350 bars. O maior interesse no semi-rígido atualmente é para aplicações na

CLAE por exclusão com fase móvel orgânica; contudo eles também são usados na troca

iônica.

Sólidos não rígidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por

exclusão, são aplicados exclusivamente para a separação de moléculas grandes, solúveis

em água, como as proteínas. Contudo, estes sólidos não rígidos não podem resistir as

pressões usadas na CLAE. Os dois tipos de materiais, peliculares e porosos, diferem em

algumas de suas propriedades e têm muitas outras em comum. Ambos podem ser

introduzidos na coluna com certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas

podem ser utilizadas em cromatografia líquido-sólido, dependendo da atividade da sua

superfície ou pode ser recoberto com alguma fase líquida e obter-se uma coluna para

CLAE com fase quimicamente ligada. Além destes tem-se os materiais de recheio do

tipo pelicular ou poroso para cromatografia por troca iônica.

22

Os adsorventes peliculares, com diâmetro de partícula entre 30 e 45 μm,

apresentam eficiência, rapidez, reprodutibilidade e custo similar aos adsorventes

porosos (5 - 10 μm), mas têm menor capacidade e, por isto, o seu emprego tem

diminuído notavelmente nos últimos anos.

Figura 1- Formas mais comuns de partículas para cromatografia de líquidos.

Figura 2- Diferentes formas e tamanhos dos materiais para empacotamento de colunas.

Para obter distribuição homogênea do recheio em toda extensão da coluna, o que

aumenta a eficiência da separação, as partículas devem ter a menor variação de diâmetro

possível. As partículas esféricas são melhores do que as irregulares, mas estas têm

menor custo.

23

O tamanho da partícula controla o processo de difusão das moléculas da amostra

ao penetrar e sair dos poros da partícula. Quanto maior o tamanho da partícula porosa,

mais lento o processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a transferência de

massa entre a fase estacionária e a fase móvel. Isto acontece porque, à medida que

aumenta o tamanho da partícula, aumenta também a profundidade dos poros e

conseqüentemente a amostra demora mais tempo para sair destes poros profundos. Ao

mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazão da fase móvel, para obter-

se análises rápidas, faz com que as moléculas da amostra nesta fase migrem

rapidamente, em comparação com as da fase estacionária (independente dos poros). Isto

resulta no alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partícula, a

profundidade dos poros diminui e a saída dos poros acontece mais rapidamente,

permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência.

Estas explicações justificam porque na CLAE utilizam-se somente materiais

porosos cujas partículas tem tamanho menor do que 30 μm, com exceção da troca

iônica. Outros tipos de materiais utilizados são partículas esféricas, geralmente vítreas,

não porosas, recobertas por uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo

de material e denominado de película de camada porosa, de porosidade superficial ou de

centro não poroso.

AS TÉCNICAS DA CLAE

Há cinco tipos de fases estacionárias com diferentes mecanismos que regem as

separações cromatográficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase móvel

é possível utilizar um deles.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO OU POR ADSORÇÃO

24

O mecanismo de separação da cromatografia líquido sólido (CLS), ou adsorção,

se baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em

ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária).

Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro

uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o

adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina), grupos

apolares (por ex.; hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão

deslocar a molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais

polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e

serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por ex.: moléculas aromáticas) irão

apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a superfície do adsorvente e, portanto,

também serão retidas; o grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou

grupo funcional. É importante que as partículas da fase estacionária apresentem uma

grande área de superfície, isto é, um grande número de sítios ativos.

A atividade da superfície de muitos sólidos (incluindo a sílica e alumina) se

encontra com freqüência afetada pela retenção de certas moléculas de alta polaridade

como álcoois, fenóis, água, etc., e, devido a eles, em determinadas ocasiões, é difícil

reproduzir os resultados obtidos nas análises, porque as propriedades da superfície

sofrem mudanças. Em conseqüência, a superfície da sílica empregada na CLAE é

habitualmente submetida a determinados processos de desativação com o propósito de

diminuir a retenção de moléculas muito polares e, assim, se mantém a superfície em

condições uniformes, o que contribuirá para melhorar a reprodutibilidade das análises.

Muitas vezes, devido a uma forte adsorção ou retenção de alguns componentes da

amostra no sólido ativo, é necessário aumentar a polaridade da fase móvel de uma

25

maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade

dos componentes da amostra na fase móvel. A essa variação dá-se o nome de eluição

por gradiente ou programação da fase móvel.

Para a maioria das separações realizadas por adsorção (CLS) usa-se partículas

porosas, na faixa de 5-10 μm, alem de se empregar, às vezes, os materiais maiores (30-

40 μm), como película porosa. Quase todas estas separações são limitadas a alguns tipos

de adsorventes: sílica e alumina. A retenção e a separação nestes adsorventes são

geralmente similares, os componentes mais polares da amostra serão retidos

preferencialmente.

Na modalidade de cromatografia por partição com fase líquida, é preferível usar

suportes que sejam inertes; mas não existem suportes inertes com rigidez e

uniformidade requeridas pela CLAE. Usa-se a sílica, sabendo-se que tem pontos

adsorventes que necessitam ser completamente cobertos ou inativados, como em CG.

Os poros deverão ser suficientemente grandes para permitir total acesso das moléculas

do soluto à fase estacionária contida dentro da estrutura dos poros, mas suficientemente

pequeno para resistir a remoção do líquido estacionário pelo arraste mecânico da fase

móvel.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO OU POR PARTIÇÃO

A cromatografia líquido-líquido (CLL) foi desenvolvida por Martin e Synge em

1941 para separação de vários aminoácidos, usando fase estacionária de água em sílica e

clorofórmio como fase móvel. 0 mecanismo de separação neste tipo de cromatografia,

ou mecanismo de distribuição como também é chamado, baseia-se nas diferentes

solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase

estacionária. Então, os componentes mais solúveis na fase estacionária são

26

seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solúveis são transportados mais

rapidamente pela fase móvel. 0 maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da

fase estacionária na fase móvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não

reprodutibilidade nas separações repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A

primeira é saturando a fase móvel com a fase estacionária por meio de uma pré-coluna,

colocada antes do injetor, que contenha uma alta percentagem de fase estacionaria. A

segunda é utilizando materiais que contenham a fase estacionária, quimicamente ligada

a um suporte sólido.

27

3 PROCEDIMENTO

3.1 Determinação de cafeína em bebidas por CLAE

O procedimento para realização desse experimento tem início com a preparação

de 5 balões contendo uma quantidade x em mL da Solução de Estoque de Cafeína que

foi devidamente preparada pelo professor. Para cada balão volumétrico, adicionou-se

uma alíquota diferente da solução padrão. Segue abaixo uma tabela com as quantidades

adicionadas em mL e o valor teórico da cafeína contida nessas alíquotas utilizadas nessa

solução:

Padrão Concentração Teórica (μg/mL) mL da solução padrão utilizada

1 10 2

2 20 4

3 30 6

4 40 8

5 50 10

A preparações do padrões foi realizada da seguinte maneira:

Encheu-se uma bureta de 25 mL com a Solução de Estoque de Cafeína e

transferiu a quantidade já descrita na tabela acima para o primeiro balão, repetindo o

procedimento para todos os balões. Após isso, adicionou-se água destilada até atingir o

menisco e homogeneizaram-se as soluções. Com isso, a preparação dos padrões é

finalizada.

Adição dos padrões no HPLC (CLAE – Cromatografia Liquida de Alta

Eficiência).

28

Antes da injeção da primeira alíquota de solução padrão no equipamento foi

necessário criar uma pasta onde as informações de leitura do equipamento estariam

salvas, bem como conferir se as condições do equipamentos estavam corretas para a

analise da cafeína. As condições que devem estar em parâmetros corretos são:

Solução Isocrática – É uma solução que contem dois tipos de solventes mas com

a mesmas concentrações. A solução utilizada para a analise da cafeína é a

solução metanol/Água

Fluxo da fase móvel a 0,6 mL/min – É a quantidade da que o equipamento ira

injetar a solução durante cada minuto da analise.

Detecção em UV a 273 nm – É a onda de comprimento onde o pico da cafeína

ira sair.

Após isso era possível adicionar as alíquotas das soluções padrão no

equipamento, o que é feito através da utilização de uma seringa (de uso específico para

o equipamento). Aspirou-se um volume em torno de 2mL dos padrões e adicionou-se no

injetor. Após essa injeção, análise já poderia ser iniciada.

O mesmo procedimento foi repetido com as amostras diluídas de Coca-Cola,

Café e Guaraná Antártica. O pico das amostras e dos padrões (resultado da análise

pertinente ao nosso estudo) aparece após aproximadamente 9 minutos e com isso

podemos dizer que para cada amostra e padrões foram utilizado cerca de 5,4 mL da

solução Etanol/Água.

29

4 RESULTADOS

Tabela 1 – Resultados da curva de calibração utilizando o padrão cafeína.

Concentração em:

Tabela 2 – Concentração real das soluções padrão em mg

Tabela 3 – Concentração das amostras analisadas em mg/350mL.

(Volume de 1 Latinha)

30

Gráfico 1 –

Gráfico 2 – Curva de calibração do padrão cafeína

31

5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

Conforme esperávamos, o café apresentou os maiores índices de concentração

de cafeína, visto que a mesma é um composto muito solúvel em água a quente.

Durante a preparação do café por infusão, ocorre uma melhor dissolução do

composto devido à elevada temperatura da água (próxima ao ponto de ebulição, 100ªC).

Como todas as outras amostras de bebidas analisadas são preparadas e consumidas a

frio (entre 8°C e 20°C), o teor de cafeína é menor, já que a faixa térmica não permite

concentrações tão altas do alcaloide.

Pensou-se na possibilidade de as indústrias informarem no rótulo dos produtos a

concentração de cafeína contida, para que o consumidor tenha conhecimento da

quantidade que está ingerindo, pois ainda que seja largamente consumido, o composto

ainda é um alcaloide que, se ingerido em grandes quantidades, trás malefícios à saúde.

Observou-se, porém, que as bebidas a base desse composto apresentam em suas

informações nutricionais, apenas quantidades de carboidratos, sódio, entre outros, não

fornecendo qualquer dado quantitativo ou alerta quanto ao efeito da cafeína no

organismo.

De acordo com estatísticas oficiais, o café está presente em 95% das residências

brasileiras. O consumo médio per capita de café em nosso país atingiu (em 2010) um

recorde de 4,81 kg/ano, o que representa cerca de 81 litros de café por habitante, marca

muito abaixo dos países escandinavos (nórdicos) mas já acima de grandes consumidores

da bebida, como Itália e Estados Unidos, de acordo com o Ministério da Agricultura.

32

Considerando o valor obtido em nossas análise por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) juntamente com estatísticas do Departamento de Química da

Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, observa-se que o brasileiro consome

cerca de 138 mg de cafeína por dia. Nível relativamente alto, embora não totalmente

danoso se considerarmos que está bem distante da quantidade necessária para causar

morte, que é vai de 5 a 10 g, dependendo da massa corporal do indivíduo. Seria

necessário, para isso, tomar mais de 40 xícaras de café em uma única ocasião.

Quando as concentrações de cafeína no plasma sanguíneo atingem níveis acima

de 15 mg/L de sangue podem haver reações tóxicas, e a ingestão de altas doses do

composto (overdoses de cafeína) são uma causa relativamente comum de emergências

de envenenamento, com 4.183 casos relatados em 2007 pela Associação Americana de

Centros de Controle de Venenos. Dentre todos esses casos, houve apenas uma morte.

Logo, concluímos que a cafeína realmente é um potente alcaloide vegetal que

pode trazer inúmeros problemas de saúde se, e somente se, consumido em excesso. O

consumo ocasional, ou mesmo diário em pequenas doses, aparentemente não causa

nenhum efeito colateral permanente, além da excitação temporária do sistema nervoso

central.

33

6 CONCLUSÃO

O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi

extremamente adequado e eficiente para separar e determinar a quantidade de cafeína

presente nas bebidas analisadas: refrigerante do tipo cola (a saber, Coca-Cola),

refrigerante do tipo guaraná (da marca Guaraná Antártica), e infusão de pó de café da

marca Pilão.

As principais vantagens do método são: a simplicidade, as amostras não

precisam ser tratadas e/ou purificadas de uma maneira especial, como na técnica de

Espectroscopia por UV/Visível, e uma certa rapidez: ocorre uma nítida separação em 11

minutos aproximadamente.

A cafeína atua sobre o sistema nervoso central, apresentando sintomas como

excitação, disposição, mas também irritabilidade e ansiedade, por isso é necessário um

controle da quantidade dessa substância nos alimentos e bebidas, como também a

indicação de suas quantidades nos respectivos rótulos. Entretanto, quando ingerida em

quantidade moderada não apresenta riscos à saúde.

34

7 ANEXOS

7.1 Figuras e Imagens

FIGURA 1 – Esquema de um cromatógrafo líquido como o utilizado no experimento.

FIGURA 2 – Estrutura molecular da cafeína

FIGURA 3 – Estrutura molecular da adenosina

35

FIGURA 4 - Estrutura molecular do Monofosfato cíclico de adenosina

FIGURA 5 - Estrutura molecular da dopamina

FIGURA 6 – Corte de uma semente de café

36

7.2 Tabelas Adicionais

37

38

39

40

41

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

http://g1.globo.com/economia/mercados/noticia/2012/01/consumo-de-cafe-no-

brasil-cresceu-311-em-2011-segundo-abic.html Acesso em 14/05/2012 às 23:53

http://noticias.r7.com/economia/noticias/consumo-de-cafe-no-brasil-bate-

recorde-historico-20110324.html Acesso em 14/05/2012 às 23:58

http://noticias.uol.com.br/ciencia/ultimas-noticias/redacao/2011/01/28/mito-ou-

verdade-cafeina-em-excesso-pode-matar.htm Acesso em 14/05/2012 às 12:17

http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/cafeina.html Acesso em 13/05/2012 às

17:42

http://www.infoescola.com/curiosidades/historia-do-cafe/ Acesso em 11/05/2012

às 10:30

http://analuciacava.files.wordpress.com/2011/04/cafc3a9.jpg Acesso em

13/05/2012 às 15:42

CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, Ed.

Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 1998

COLLINS, C. H. Fundamentos de Cromatografia. Editora Unicamp. Campinas –

SP. 2006

42