INTRODUO CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE OU HPLC)Marilena Meira

HistricoOrigem da Cromatografia Lquida: Em 1900 - Mikhail S. Tswett . Separao de pigmentos com uso de solvente em colunas de CaCO3 e alumina.

DEFINIOHPLC - tipo de cromatografia que emprega uma fase mvel lquida e uma fase estacionria finamente dividida e que, para ter um fluxo razovel, opera a presses elevadas.High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography

MECANISMO DA SEPARAO DA HPLCCC, CCD, HPLC Distribuio dos componentes entre a fase estacionria e a fase mvel lquida. Diferentes interaes com a fase estacionria. Diferenas de velocidade

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PARTES DO CROMATGRAFO (HPLC)Sistema de Solventes Bombas Injetor Coluna Detector Registrador.

SISTEMA DE SOLVENTESDegaseificao: Remoo de gases O2 e N2 Purga: a cada troca de solventes. Elimina bolhas na linha Bolhas na bomba e na FM: irreprodutibilidade do fluxo. Bolhas no detector: Baixa estabilidade da linha base, pico para baixo, O2 absorve em < 215 nm.

DEGASEIFICAOUltra-som: Muito lento, requer agitao, pouco eficiente. Vcuo: Lento, requer agitao, pode alterar a composio da FM preparada. Vcuo + ultra-som + agitao: Necessita reaplicar de 12 em 12 horas. Degaseificador: Contnuo, remove o ar ante da bomba. Melhor opo.

TIPOS DE ELUIESEluio isocrtica: Composio FM constante. Eluio por gradiente: Composio FM varia.

ELUIO ISOCRTICAA composio da fase mvel permanece constante durante a separao Vantagens: maior rapidez No necessita de recondicionar a coluna Menor consumo de solventes Desvantagem No resolve misturas complexas

ELUIO POR GRADIENTEA composio da fase mvel varia ao longo da separao Vantagem: Elevada resoluo Desvantagens: Maior tempo de anlise Maior consumo de solventes A variao da composio da FM pode ser por patamares ou de forma linear

Gradiente por patamares

PURIFICAO PRVIA DA AMOSTRAReteno irreversvel na fase estacionria. mais fcil limpar a amostra que comprar outra coluna. NO INJETAR EXTRATOS. PURIFICAO: submeter a amostra a CC antes da injeo no HPLC.

ESCOLHA DA FASE MVELA amostra deve se dissolver completamente na fase mvel ou acontecer sua precipitao no interior da coluna.

FLUXO DA FASE MVELFluxo timo depende do dimetro interno e comprimento da coluna: Consultar especificaes do fabricante. Menor fluxo, maior eficincia.

MODOS DE SEPARAO

FASE NORMAL:FM apolar, FE polar. FASE REVERSA: FM polar, FE apolar.

FASE NORMAL:Pouco utilizado, recomendado para compostos polares. A FM geralmente hexano com outro solvente mais polar. FE slica pura ou slicas modificadas com cianopropil ou aminopropil. Compostos mais polares tendem a ficar mais retidos na coluna. Mecanismo de interao: pontes de hidrognio ou interaes dipolo-dipolo.

TIPOS PRINCIPAIS DE RECHEIO EM FASE NORMALCIANOPROPIL

Si O Si

CN

AMINOPROPIL

Si O Si

NH2

FASE REVERSAGeralmente utilizado em mais de 70 % das aplicaes. FE: slica modificada com grupos octil (C-8) ou octadecil (C-18); Polmeros orgnicos (exemplo: Poliestireno) FM: Mistura de gua com: acetonitrila, metanol ou THF. Compostos apolares tendem a ficar mais retidos na coluna. Mecanismo de interao: Foras de Van der Waals.

TIPOS PRINCIPAIS DE RECHEIO EM FASE REVERSAR1 Si-OH + Cl-Si R2 R3 R1 SiO Si R2 R3

R1 e R3= CH3 ou OCH3, R2= C-18, C-8, C4, C2

DILUENTE DA AMOSTRAFase normal: dissolver a amostra na FM ou em um solvente mais apolar que FM. Fase reversa: dissolver a amostra na FM ou em um solvente mais fraco (menor % de orgnico)

FILTRAO DA AMOSTRAPara no entupir o filtro de entrada da coluna. Filtrao em filtro de seringa de 0,45 m. Os filtros so DESCARTVEIS. Uso nico.

VOLUME MXIMO DE INJEO1% DO VOLUME INTERNO DA COLUNA Vi = V. 0,01 Vi = .R2.L.0,01 Vi =Volume mximo de injeo Vi = Volume da coluna R= Raio L= Comprimento da coluna

Volume mximo de injeo para uma coluna 4,6mmx250mm1% DO VOLUME INTERNO DA COLUNA Vi = V. 0,01 Vi = .R2.L.0,01 Vi = 3,14.(2,3)2.(250).0,01 Vi = 41mm3 = 41l

SOBRECARGA DE AMOSTRAPeso mximo depende: da rea superficial do suporte e volume da coluna. No exceder 2mg/g de fase estacionria.

INJETORO loop usado deve ser adequado quantidade injetada pela microseringa.

ESCOLHA DA COLUNARecheio: Fase estacionria. Slido finamente dividido (Analtica e preparativa Fase normal e reversa Granulometria 3 a 10 m

VANTAGENS E DESVANTAGENS DA SLICAVantagens: Grande resistncia a altas presses; Tem grande rea superficial; diversas granulometrias, pode ser modificada. Desvantagens: silanois residuais podem causar adsoro excessiva de compostos bsicos. Estabilidade qumica limitada em pH 8.

DANOS COLUNAAcima de 8: A slica se dissolve. Abaixo de pH 2 A reao de silanizao se reverte.R1 Si-OH + Cl-Si R2 R3 R1 SiO Si R2 R3

R1 SiO Si R2 + R3

HCl

R1 Si-OH + Cl-Si R2 R3

SLICAS MODIFICADAS COM GRUPOS ORGNICOSC8

C18

SLICAS MODIFICADAS SEM SILANOL LIVRE (CAPEAMENTO)C8

C18

DETECTORDetector UV: Mede a capacidade da amostra para absorver luz em um ou mais comprimento de onda. Pode ser: Comprimento de onda fixo: Mede apenas um comprimento de onda. Comprimento de onda varivel: Mede um comprimento de onda por vez, mas pode detectar uma larga faixa. Arranjo de diodos: Mede um espectro de comprimentos de onda simultaneamente.

LIMPEZA DE COLUNA FNPassar a seqncia de solventes: Hexano/octano/heptano Diclorometano Isopropanol, acetetato de etila, THF Metanol Diclorometano Fase mvel

LIMPEZA DE COLUNAS FRCorrer acetonitrila:gua 80:20 como fase mvel e fazer injees grandes (200 l) de solventes fortes (THF, DMF, IPA, acetato de etila). Pode aquecer a coluna a 40-50 C. Para remoo de material orgnico o melhor solvente o THF Metanol no um solvente forte para limpeza de material orgnico lipoflico devido sua alta polaridade.

ARMAZENAGEM DE COLUNAS FNManter as colunas bem fechadas com os parafusos. Armazenar em hidrocarboneto saturado como iso-octano, heptano, hexano (menos voltil, melhor).

ARMAZENAGEM DE COLUNAS FRManter as colunas bem fechadas com os parafusos de compresso No armazenar com gua sem solvente orgnico: Pode criar fungos. Usar pelo menos 20% de orgnico. Se o recheio secar = coluna morta Se usar forno: Deixar a coluna esfriar antes de desconectar e guardar.