hplc preparativa seminário letícia fracarolli

$: Hplc preparativa seminário letícia fracarolli$
HPLC PREPARATIVA

Letícia Fracarolli

Disciplina: Atualização em Técnicas de Análise Toxicológica:

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Eletroforese Capilar

Universidade de São Paulo

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

SUMÁRIO

1. Introdução

1.1. Principais diferenças entre HPLC

analítico e HPLC preparativo

2. Colunas

2.1. Fase estacionária

3. Fase móvel

4. Detectores utilizados em HPLC

preparativo

4.1. Splitter

4.1.1. Calibração do tempo de atraso

5. Coletor de frações

6. Preparação da amostra

7. Desenvolvimento de métodos 6.1. Scale-up

6.1.1. Scale-up otimizado

6.2. Sobrecarga da coluna

8. Sistema Reciclante

9. Avaliação do resultado de

uma corrida preparativa

10. Aplicações

11. Referências

1. INTRODUÇÃO

Separação de

misturas por

distribuição em

duas fases móveis

imiscíveis.

Cromatografia

Cromatografia

líquida de alta

performance

preparativa

É um processo de

purificação que

usa a

cromatografia

líquida.

1. INTRODUÇÃO

Esquema de um HPLC preparativo

1. INTRODUÇÃO

Parâmetros para otimizar o fator de separação e

resolução de picos:

Fase estacionária apropriada;

Fase móvel adequada;

Temperatura.

1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC

PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO

HPLC

preparativo ≠ HPLC

analítico

Objetivo de isolamento

ou purificação de

substâncias de alto valor.

Objetivo limitado a

determinação qualitativa

e quantitativa de um

composto.

HPLC

preparativo HPLC

analítico ≠

Quantidades de amostra

maiores (mg). Quantidades de amostra

menores (µg).

1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC

PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO

O objetivo de uma

purificação preparativa é a

produção máxima de

produto purificado por

injeção.

2. COLUNAS

O papel da coluna é fundamental no desenvolvimento de

um método;

Capacidade do material de embalagem: visando maior

rendimento, colunas com maior capacidade podem

suportar mais material por injeção.

O custo de colunas preparativas aumenta com o tamanho.

2. COLUNAS

Dimensões da coluna: de acordo com a quantidade de

material que se deseja injetar.

Diâmetro interno da coluna (mm) Utilidade

4,6 HPLC preparativo em pequena escala

7,8 HPLC semi-preparativo

>21,2 HPLC preparativo em maior escala

2. COLUNAS

http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC

http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC

2.1. FASE ESTACIONÁRIA

Componentes rígidos e porosos:

Sílica – C8

Sílica – C18

Mais utilizadas:


Sua escolha deve ser feita de maneira a proporcionar a

melhor seletividade para os componentes de interesse.


Tamanho de partícula:

HPLC

preparativo

Partículas de 1,8-3,5 µm não são

utilizadas. As partículas de 5 µm

são as mais utilizadas. Para as

amostras bem resolvidas, são

escolhidas partículas de 7-10 µm.

HPLC

analítico

Quanto menor o tamanho

da partícula maior será a

eficiência.

≠

3. FASE MÓVEL

Podem ser utilizados em modo gradiente ou isocrático.

Alguns fatores que influenciam na escolha do solvente

são os seguintes:

Fase estacionária e condições de fase móvel com melhor

seletividade para compostos de interesse;

Características espectroscópicas do solvente da fase móvel;

3. FASE MÓVEL

Volatilidade para facilitar a remoção a partir da fração

isolada;

Viscosidade;

Pureza;

Boas propriedades de solubilidade para cargas máximas de

amostra;

Custo dos solventes utilizados.

4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC

PREPARATIVO

Detectores destrutivos: Espectrômetro de Massas,

Detector Eletroquímico.

Detectores não destrutivos: Detectores UV VIS, DAD,

Detector de Índice de Refração, Detector de

Espalhamento de Luz, Detector de Fluorescência.

4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC

PREPARATIVO

Detectores destrutivos: necessitam de um splitter para

desviar uma pequena parte da amostra para o detector e o

restante para o coletor de frações.

4.1. SPLITTER

Divisor de fluxo tradicional: divisor passivo.

4.1. SPLITTER

Divisor ativo: tem dois caminhos de fluxo separados e

uma válvula de troca rápida, que transfere o composto a

partir do fluxo principal para o fluxo de make-up.

4.1. SPLITTER

Possibilidade de selecionar diferentes proporções de

divisão, alterando a frequência de troca da

válvula;

Proporções exatas e constantes, divisão não é afetada pela viscosidade,

temperatura e comprimento da tubulação;

Dois caminhos de fluxo independentes, permitem o

uso de diferentes modificadores;

Contra-pressão mínima, não há o perigo de danificar a

célula detectora.

Vantagens do divisor ativo

4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO

A troca da válvula tem de ser atrasada até que o

composto passe da célula detectora para a entrada da

válvula de desvio. Este tempo é chamado de tempo de

delay (tempo de atraso) (TD1) e deve ser determinada de

antemão:

Procedimento de

calibração de

atraso

4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO

Procedimento de

calibração de

atraso

Usado para determinar o

tempo de atraso entre o

detector e o coletor de

frações.

Injetar um corante concentrado

sobre o sistema e controlar o

sinal do detector no visor on-

line do software de controle.

Começar com um volume de

atraso estimado ou

calculado.

5. COLETOR DE FRAÇÕES

HPLC

preparativo ≠

HPLC

analítico

Amostra vai direto

para o descarte.

Amostra vai para o

coletor de frações.


Disponíveis em diferentes tamanhos e modelos.

Exemplos:

Coletor de micro fração: é projetado para vazões abaixo de

100 µL / min;

Coletor de fração em escala analítica: é projetado para vazões

abaixo de 10 mL / min;

Coletor de fração em escala preparativa: é projetado para

vazões de até 100 mL / min.


O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente de

fração através da agulha de coleta de fração.

Utilizando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por

exemplo, através de programação de tempo, ou em função de

um sinal do detector.

6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

A preparação da amostra é de especial atenção ao realizar

HPLC preparativa sobre colunas caras e, embora os

objetivos não são necessariamente os mesmos, muitos

dos procedimentos utilizados são idênticos aos

encontrados em HPLC analítica.

Correta dissolução;

Filtração de amostra, etc.

HPLC

preparativo

HPLC

analítico ≠


maiores (mg).


menores (µg).

1. Scale-up (ampliação) do

sistema de análise;

2. Sobrecarga da coluna.

7. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS

7.1. SCALE-UP

Scale-up do sistema de análise: colunas de diâmetro

maior, maior vazão e maior volume da amostra com o

comprimento da coluna e concentração da amostra

permanecendo constante.

Os picos permanecem nítidos e simétricos.

Uso de colunas grandes e volumes elevados de solventes, portanto, o

método não seria econômico.

7.1. SCALE-UP

Dois parâmetros devem ser ajustados quando se passa de uma

coluna com D.I menor para uma coluna com D.I maior:

1. Quantidade de amostra aplicada à coluna;

2. Vazão.

Considere uma ampliação de uma coluna de 4,6 × 150 mm para uma de 19 × 150

mm:

Sendo assim, podemos

dizer que pode ser aplicado

aproximadamente 17-135

mg de amostra nesta

coluna preparativa.

7.1. SCALE-UP

Vazão:

Duração do Gradiente:

7.1. SCALE-UP

Carregamento (massa) razoável para colunas

preparativas de acordo com o tamanho, no modo

gradiente:

7.2. SCALE-UP OTIMIZADO

Otimização e scale-up de uma análise de um método preparativo é feito em

três passos:

Desenvolver e otimizar a

separação inicial sobre uma coluna

de tamanho analítica

Sobrecarregar a coluna, mantendo a separação adequada de componentes de

interesse

• Como otimizar?

Aumentar a escala de acordo com uma

coluna preparativa com base na

quantidade de composto necessária

para purificar.

Coluna: Shim-pack PREP-

ODS(H) Kit

A) 250 mm x 4.6 mm D.I., 5 μm

B) 250 mm x 20 mm D.I., 5 μm

Fase móvel: 0.1% ácido fórmico/

metanol = 1/9 (v/v)

Vazão:

A) 0.8 mL/min

B) 15 mL/min

Temperatura ambiente

Detecção em 254 nm

Picos: 1: Ácido Benzóico

2: 2-naftol

3: Benzeno

4: Naftaleno

5: Bifenilo

6: Fenantreno

7: Antraceno

8: Fluoranteno

Shimadzu Catalogue

7.2. SOBRECARGA DA COLUNA

Aumento da quantidade de amostra aplicada nas mesmas

condições de análise;

Geralmente é o método de escolha;

Permite separar amostras na gama de mg mesmo em

colunas analíticas.

Pode ser feito de duas maneiras:

Sobrecarga de concentração;

Sobrecarga de volume.

Sobrecarga de concentração: a concentração da

amostra é aumentada, mas o volume de amostra injetada

permanece o mesmo;

Sobrecarga de volume: quando o composto tem baixa

solubilidade.


Ambas as técnicas de

sobrecarga são

usadas em

combinação.

8. SISTEMA RECICLANTE

A reciclagem em circuito fechado é um método de

purificação que melhora a separação;

Reduzir os custos com colunas de grandes

comprimentos.


A amostra é reintroduzida na coluna repetidamente, de

modo que é possível acomodar a separação e purificação

de compostos que são normalmente difíceis de separar;

Não há necessidade de ligar um número de colunas em

série, de modo que é possível controlar o custo das

colunas, e reduzir o consumo de solvente utilizado como

fase móvel.

9. AVALIAÇÃO DO RESULTADO DE UMA CORRIDA

PREPARATIVA:

Três parâmetros importantes: pureza do produto, o

rendimento e produtividade;

São dependentes uns dos outros, não sendo possível

otimizar um método de HPLC preparativa com respeito a

todos os três parâmetros.

10. APLICAÇÕES

Variam de escala para laboratório até escala industrial:

Separações quirais;

Purificação de misturas sintéticas complexas;

Isolamento extrato natural;

Purificação de peptídeos.

“Estudos epidemiológicos têm mostrado que o aumento

do consumo de vegetais, como brócolis e couve, pode

reduzir o risco de desenvolvimento de câncer no

pâncreas, pulmão, colo-retal e próstata”.

Brassica oleracea var. Italica:

As cultivares de brócolis

brigadeiro foram cultivadas

até a maturidade de colheita

Sementes foram

selecionadas devido ao

alto teor de glicorafanina

Foram moídas com

água da torneira.

Desengorduradas 3 x com

excesso de hexano e

deixadas a secar durante a

noite numa coifa.

Os glicosinolatos foram

hidrolisados por adição de água

(03:01 de água/semente

desengordurada), e a

mistura foi deixada em autólise

durante 8 h à temperatura

ambiente.

Foram misturados

cloreto de sódio, a

farinha molhada e

sulfato de sódio

(1:1:0,75).

A pasta formada foi

extraída 3 x com iguais

volumes de cloreto de

metileno em excesso, a

qual foi combinada e

secou-se a 32 ° C sob

vácuo num evaporador

rotativo.

O resíduo resultante foi

dissolvido em 120 mL

de acetonitrila 5% em

água (v /v) e lavado 3 x

com hexano para

remover o excesso de

contaminantes apolares.

A fase aquosa foi filtrada em

um filtro de membrana de

0,22 µm, e preparada para a

injeção em HPLC.

Foi injetado 2 mL da

amostra filtrada.

MATERIAIS E

MÉTODOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Coluna: Waters Prep Nova-Pak (19 × 300 mm, 60 Å, 6 µm)

HR C-18 reversed-phase HPLC column (Waters, Milford,

MA);

Vazão: 9 mL/min;

FM: 10 % de acetonitrila em água durante 3 min; mudou

linearmente durante 2 min a 25 % de acetonitrila, e mantidas

isocráticamente durante 15 min. A porcentagem de acetonitrila

foi aumentada para 100% mais de 2 min e seguiu assim,

isocraticamente por 2 min para purgar a coluna.

Detectores: Detector por índice de refração para detectar o

sulforafano nitrila, e a absorvância a 254 nm foi utilizada para

detectar o sulforafano.

RESULTADOS E DISCUSSÃO


Rendimento: para cada pico sulforafano rendeu 3,5 mg

de sulforafano purificada, e a fração de eluato

correspondente a cada pico de sulforafano nitrila rendeu

3,3 mg de sulforafano nitrila purificada. Com base nestes

resultados, cada quilograma de semente extraída pode

produzir 4,8 g de sulforafano e 3,8 g de sulforafano

nitrila.


Concluindo: “Existem vários métodos de purificação ou

de síntese. Porém, estes métodos são concebidos apenas

para a produção de quantidades de mg destes compostos,

e não se prevê a produção de larga escala necessária para

estudos extensivos in vivo. Sulforafano está

comercialmente disponível, mas é muito caro, e

Sulforafano nitrila não está comercialmente disponível

no momento. As sementes de vegetais crucíferos

possuem níveis relativamente elevados de glucosinolatos

por grama, reduzindo a quantidade de material de partida

necessário para se obter um extrato aquoso concentrado

adequado para a separação por HPLC.”


“Além disso, a utilização de sementes de brócolis

brigadeiro facilitou a extração de grandes quantidades de

sulforafano e sulforafano nitrila, porque verificou-se que

contém níveis elevados de glicorafanina em comparação

com outros cultivares.”

“Embora não testado no artigo em questão, é provável

que as sementes de outras variedades de brócolis tendo

níveis elevados glicorafanina também proporcionarão

uma boa fonte para purificação de sulforafano e

sulforafano nitrila com o mesmo método.”

11. REFERÊNCIAS

AGILENT TECHNOLOGIES. Principles in preparative HPLC. Agilent Technologies Inc,

Printed in Germany, April 2007.

WELLINGS, D. A. A Practical Handbook of Preparative HPLC. Elsevier, 2006.

KAZAKEVICH, Y.; LOBRUTTO, R. HPLC for pharmaceutical scientists. Wiley, 2007.

MEYER, V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography, fourth edition. Wiley,

2004.

SHIMADZU CATALOGUE. Prominence Preparative HPLC System.

WATERS CATALOGUE. Preparative LC Columns and Consumables.

MATUSHESKI, N. V.; WALLIG M. A.; JUVIK, J. A.; KLEIN, B. P.; KUSHAD, M. M.;

JEFFERY, E. H. Preparative HPLC Method for the Purification of Sulforaphane and

Sulforaphane Nitrile from Brassica oleracea. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1867-1872.

11. REFERÊNCIAS

How Does High Performance Liquid Chromatography Work? Disponível em:

<http://www.waters.com/waters/pt_BR/How-Does-High-Performance-Liquid-

Chromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055&locale=pt_BR> Acessado em:

10/10/2013.

Scaling Up. Disponível em: <http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/prep/prep3.html>

Acessado em: 10/10/2013.

Recycling Preparative HPLC Instrument. Disponível em:

<http://www.columnex.com/chromatography/instruments/prep-hplc-recycling/> Acessado

em: 17/10/2013.

HPLC preparativo. Disponível em:

<https://pt.vwr.com/app/Header?tmpl=/chromatography/preparative_hplc.htm> Acessado

em: 17/10/2013.

Phenomenex Preparative Columns: Disponível em:

<http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC> Acessado em 24/10/2013.

hplc preparativa seminário letícia fracarolli

Documents