conceitos fundamentais de hplc

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CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP) Ministrante: Ayrton Argenton CEP Curso Contatos: [email protected] São José do Rio Preto, 29 de maio de 2010 Conceitos fundamentais de Cromatografia a líquido de Alto Desempenho (HPLC) Apoio Observação: A versão original desta apresentação, com slides coloridos, no formato PDF, está disponível na seção downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)

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CONSELHO REGIONAL DEQUÍMICA - IV REGIÃO (SP)

Ministrante: Ayrton ArgentonCEP CursoContatos: [email protected]

São José do Rio Preto, 29 de maio de 2010

Conceitos fundamentais deCromatografia a líquido deAlto Desempenho (HPLC)

Apoio

Observação: A versão original desta apresentação, com slides coloridos, no formatoPDF, está disponível na seção downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)

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Conceitos fundamentais de HPLC

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CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LÍQUIDODE ALTO DESEMPENHO(HPLC)

AYRTON ARGENTON

Prof. Ayrton Argenton: Químico formado pela USP. Pesquisador Sênior pelaREPUSA – Petrobrás, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe dePesquisas e Laboratório da CGS Instrumentação Ltda. Ministroutreinamentos técnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20anos de experiência e especialização em treinamento de Cromatografia aLíquido e a Gás em Inds. Químicas, Farmacêuticas, Alimentícias,Destilarias e Usinas de Açúcar e Álcool e Empresas relacionadas.Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS – Centrode Educação Profissional – www.cepcursos.com

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Nas indústrias químicas, farmacêuticas,alimentícias, refinarias, petroquímicas,laboratórios de análises clínicas,ambiental e forense entre outras,frequentemente é necessário separar,isolar, purificar, identificar e quantificaros componentes de misturas muitasvezes bastante complexas.

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SEPARAÇÃO•Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições.•É obtida por meios físicos embora reações químicas podem ser envolvidas no processo.•Os métodos físico-quimicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas.

Exemplos:

TIPO DE SEPARAÇÃO PROPRIEDADE FÍSICA

Destilação fracionada Diferença de ponto de ebulição

Extração com solventeDiferença na constante de distribuição (partição) dos componentes em dois

solventes

Cromatografia Diferença de afinidade das substâncias por um material ativo ou adsorvente

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IMPORTÂNCIA DA CROMATOGRAFIA

• Velocidade

• Poder de resolução

• Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 – 10-15g)

• Simplicidade da técnica

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EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS

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EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS

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VISÃO GERAL DE CROMATOGRAFIA

O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversosconstituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação,quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

Tal separação dá-se através da migração da amostra através de uma faseestacionária por intermédio de um fluido (fase móvel).

Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, oscomponentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam maislentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da faseestacionária.

O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cadacomponente migra através do sistema.

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COLUNA CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL

DETECTOR

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DETECTORCOLUNA CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL

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DETECTORCOLUNA CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL

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DETECTORCOLUNA CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL

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DETECTORCOLUNA CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL

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CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFIA

PLANAR EM COLUNA

LÍQUIDO

LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA

GÁS FLUIDOSUPERCRÍTICO LÍQUIDO

LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA

FASEMÓVEL

FASEESTACIONÁRIA

TÉCNICA

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High Performance Liquid Chromatography

CLAD = Cromatografia a Líquido de Alto DesempenhoCLAE = Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência

DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC

•A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE)•Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades•As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.•Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

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EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC

Mistura de aminoácidos

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High Performance Liquid ChromatographyAPLICAÇÃOHPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente onde acromatografia a gás não pode ser utilizada.Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas características, o campo de aplicação de HPLCé extremamente vasto.

Indústria Analitos

AlimentosAçúcares, ácido ascórbico, ácido benzóico, parabenos, vitaminas, proteínas, peptídeos,

aminoácidos

Tintas Resinas, Tensoativos, biocidas

Química Polímeros

Clínicas Metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos

Farmacêutica Princípios ativos

ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAÇÕES E ANALITOS

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COMPARATIVO HPLC / CG

Fator CG HPLC

Requisitos da amostraAmostra ou derivado volátil

estável termicamente na temperatura de trabalho

Amostra solúvel na fase móvel

Tipo de AmostraGases, líquidos e sólidos

baixo peso molecular

Líquidos e sólidosIônicos ou covalentes

Baixo e alto peso molecular

Tempo de análise relativo Em geral mais rápidas que HPLC Em geral mais lentas que CG

Pratos teóricos por coluna Até 300000 Até 30000

Capacidade preparativa Pobre Boa

Sensibilidade 10-12 g (DIC / DCE)10-9 g (UV)

10-15 g (coulométrico)

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RESERVATÓRIOFASE MÓVEL

BOMBA

INJETOR COLUNA DETECTOR

AQUISIÇÃODE DADOS

INSTRUMENTAÇÃO EM HPLCDIAGRAMA DE UM CROMATÓGRAFO A LÍQUIDO

O cromatógrafo a líquido é constituído dos seguintes componentes:

1. Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel2. Sistema de introdução de amostra3. Sistema analítico: coluna cromatográfica e termostato4. Sistema de detecção (um ou mais detectores)5. Sistema de registro e tratamento de dados.

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DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC

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FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC

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RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL

A figura abaixo ilustra o reservatório da fase móvel e seus componentes:

tampa de teflon

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CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 1:

A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor ecoluna, logo é necessário filtração antes de armazenar a fase móvel noreservatório.

A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC:

A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel. Usualmente utiliza-semembranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5m)

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CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 2:

A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de bolhas no processode separação o que pode interferir no desempenho da análise.

As técnicas de degaseificação são:

Ultrasom

Refluxo com resistência de aquecimento

Vácuo (trompa d’água)

Purga com Hélio

Uso de membrana semipermeável e vácuo online.

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CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES

Vazão constante é essencial para qualquer separação por HPLC. Alta pressão é necessária paraimpulsionar o solvente através da coluna cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela faseestacionária.

•Normalmente se utiliza bombas recíprocas com um ou preferencialmente dois pistões o que minimizapulsação.

•Preferencialmente devem operar com programação de vazão e deve ser possível a interrupção doprocesso em pressões fora dos limites máximos e mínimos pré-estabelecidos.

•É importante introduzir fatores de correção de compressibilidade para a fase móvel utilizada ainda que oslíquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrário, a vazão real pode diferir da selecionada.

BOMBACARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS

• Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna• Alta reprodutibilidade e exatidão• Vazão contínua sem pulso de 0,01ml /min - 10ml /min• Vazão constante independentemente da pressão• Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns• Opera a altas pressões (6000 psi)

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BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE

BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO

A composição da fase móvel é mantida constante durante toda análise cromatográfica.Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamentonecessário para uma análise isocrática.

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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE

Alguma análises necessitam alteração da composição da fase móvel, sem alteração davazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise e/ou melhorar a separação doscomponentes da amostra.

O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão.

No caso de baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a seleção do solvente a serutilizado dá-se através de válvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema.

Já no caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem uma bomba específica.A figura abaixo ilustra o equipamento necessário para o a análise por gradiente a baixa ealta pressão.

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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE BAIXA PRESSÃO

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSÃO

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BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE

A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por análises isocrática e por gradiente.

ISOCRÁTICA GRADIENTE

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INJETORSISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA

Em HPLC, a injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais quepermitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de5 a 20l. A figura abaixo, mostra um esquema de uma válvula típica nas posições de cargae de injeção.

A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem pontae a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição deinjeção.

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COLUNAS CROMATOGRÁFICASCOLUNAS ANALÍTICAS E PRE-COLUNAS

A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço e resistentes a altas pressões(até 500 atm)Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmentesílica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, até de1 m) de diâmetro médio.Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são relativamente curtas e deparedes espessas.COMPRIMENTO: 3 – 60 cmDIÂMETRO INTERNO: 0,2 – 8 mmAs colunas normais apresentam diâmetro interno variando de 4 – 6 mm e comprimentoque depende da granulometria da fase estacionária como mostra a tabela abaixo.

Granulometria (m) Comprimento (cm)3 - 5 10 – 15

7 – 10 Até 25 cm (em casos especiais, até 60 cm)

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COLUNAS CROMATOGRÁFICASCOLUNAS ANALÍTICAS – CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES:

•Como o tempo de retenção depende da temperatura, as colunas devem ser mantidastermostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para aseparação.•Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficiência, estão sendo introduzidascolunas de diâmetro interno de 1 – 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxosmenores o que resulta em diminuição substancial do custo de operação e aumento desensibilidade como ilustrado na figura abaixo.

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COLUNAS CROMATOGRÁFICASPRÉ-COLUNAS (GUARD COLUMNS)SEMPRE USE PRÉ-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA

ANALÍTICA

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS:•Protege a coluna analítica contra contaminações químicas•Mesmo material de empacotamento da coluna•Comprimento Típico: 25 mm•Descartáveis

O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil da coluna analítica. A filtração dafase móvel e da amostra nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezasprejudiciais à coluna. Dependendo das características da fase estacionária e da natureza daamostra, pode acontecer o que se chama de “retenção irreversível”, ou seja, a afinidade docontaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiroscentímetros do empacotamento. Retido na cabeça da coluna, o contaminate pode provocarperda da eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, ocontaminante não atingirá a coluna analítica. Ao perceber os sintomas de contaminação (osmais comuns são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), o analista substitui apré-coluna, que em média custa 10 vezes menos que a coluna analítica.

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DETECTORES

O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado.

Um detector ideal deve possuir as seguintes características:

•Alta Sensibilidade•Estabilidade

Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem alterar o sinal•Reprodutibilidade•Resposta Linear

A resposta do detector deve variar linearmente com a concentração do analito numa extensa faixa de concentração•Resposta rápida aos analitos•Não contribuir para o alargamento do pico

O volume da cela do detector deve ser o menor possível para evitar a perda de eficiência do sistema. Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade.•Confiabilidade•Facilidade de manuseio•Não destrutivo

Condição necessária para cromatografia preparativa•Seletividade

Habilidade relativa de um detector medir um composto e não outro.

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DETECTORES

TIPOS DE DETECTORES

Os principais detectores utilizados em HPLC são:

•Índice de refração

•Espectrofotometira UV-Visível

•Fluorescência

•Eletroquímico

•Espectrometria de massa LC/MS

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DETECTORESÍNDICE DE REFRAÇÃO

No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alteração do índicede refração. Essa alteração em relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada.

A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente do IR da fasemóvel.

Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não absorvem na região decomprimento de onda do UV-VIS.

Apresenta as seguintes desvantagens:

•baixa sensibilidade•não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a composição dafase móvel)•temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura)

APLICAÇÃOAnálises de carbohidratos e açúcares em geral.

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DETECTORESESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)

Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo detector.É um detector seletivo pois só detecta os compostos que absorvem no comprimento de ondaem que o detector for ajustado.É o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substâncias absorvem radiaçãoUV. Exemplos de substâncias são: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações C=O,C=S, N=O.

CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES:

•A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda selecionado•A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de impurezas podem absorverintensamente no comprimento de onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC

TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:

•Fotométricos – comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm•Espectrofotométricos – comprimento de onda variável: 00nm a190nm

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DETECTORES

ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)

TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:

•Espectrofotométricos

•O comprimento de onda é variável entre 190nm e 800nm selecionado através domonocromador (UV = lâmpada de deutério e VIS = lâmpada de tungstênio).•Possui maior aplicação pois permite selecionar o comprimento de onda maisadequado para os componentes a serem analisados.•Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbância.•Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesseabsorve e outros não.•Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de onda ondeos constituintes da fase móvel não apresentam variação de absorbância.•Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separadointerrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor comprimento deonda.

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DETECTORESESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)

Como mostra o esquema do detector, o comprimento de onda é selecionado através do monocromador do feixe de luz emitido pela lâmpada de deutério ou tungstênio e incide na cela por onde passam os componentes da amostra que absorve parte da luz dependendo de sua absortividade molar e concentração. A quantidade de luz não absorvida é detectada pela fotomultiplicadora.

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DETECTORES

TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:

•Espectrofotométricos (REDE DE DIODOS – DIODE ARRAY)

Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente é dispersada em uma gradeholográfica e os comprimentos de onda resultantes são focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o auxílio de um computador,pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir umasérie de espectros em intervalos de tempo fixos.

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DETECTORESREDE DE DIODOS: VANTAGENS EM RELAÇÃO AO DETECTOR UV-VISNo detector UV-VIS, seleciona-se ocomprimento de onda que pode não ser omais adequado para todos oscomponentes da amostra. Isso resulta naperda de sensibilidade de algunscomponentes da amostra.A figura ao lado ilustra a diferença deintensidade do pico para um compostoem função do comprimento de onda.

Com o DAD, pode-se selecionar o melhorcomprimento de onda para cada um doscomponentes, otimizando dessa forma asensibilidade. Isso é extremamenteimportante na determinação deimpurezas nas sínteses e controle dequalidade de princípios ativos deprodutos farmacêuticos.

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DETECTORESELETROQUÍMICOS

Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando seaplica um potencial elétrico.

Em um processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e um potencialsuficientemente elevado é aplicado provocando uma reação de oxidação ou reduçãogerando uma corrente que é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada éproporcional a concentração do composto.

TIPOS DE DETECTORES•Amperométrico

O elemento flui pela superfície do eletrodo onde uma fração das espécieseletroativas é oxidada ou reduzida (15-20%).

•CoulométricoO elemento flui através de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente

100% das espécies eletroativas são oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade émuito maior (10-15 mol = fentomol) .

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DETECTORES

ELETROQUÍMICOS – COULOMÉTRICO

A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulométrica:

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DETECTORESELETROQUÍMICOS – COULOMÉTRICO – COULARRAY

É possível montar um conjuntos de detectores coulométricos em série o que permite aplicar umpotencial crescente em cada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componenteem cada uma das celas. Assim, compostos que eluem juntos podem ser quantificados apesar denão terem sidos separados.É possível o arranjo de 4 a 16 celas eletroquimicas obtendo-se cromatogramas tridimensionais.Tais detectores tem grande aplicação na análise de produtos farmacêuticos, bebidas ealimentos, análises ambientais e em neurociência (neurotransmissores, drogas).

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DETECTORESELETROQUÍMICOS – COULOMÉTRICO – COULARRAY

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COMPARAÇÃO DE DETECTORES HPLC

Índice de RefraçãoEspectrofotometria UV-

VIS Fluorescência Eletroquímico

Princípio de operação Mudança do IR da fase móvel

Absorbância de luz UV-VIS

Excitação com luz produz emissão fluorescente

Oxidação ou redução em um potencial fixo

Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo

Quantidade mínima detectável Micrograma Nanograma < picograma Fentograma

Faixa de linearidade 103 – 104 104 – 105 103 – 105 105

Volume da cela (microlitro) 3-15 1-20 8-25 5-10

Sensibilidade a temperatura Alta Baixa Baixa Média

Aplicações GeralCompostos que

absorvem na região UV-VIS

Compostos ou derivados que fluorescem

Espécies que oxidam ou reduzem

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ELSD – EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR

• Detector universal para compostos não voláteis.• Baseado na habilidade das partículas causarem espalhamento(scattering) de

fótons, quando elas atravessam um feixe de luz policromática.• O líquido efluente do HPLC é primeiro nebulizado e a mistura aerosol

resultante contendo as partículas dos analitos é dirigida a um feixe de luz. As partículas causam espalhamento da luz. É gerado um sinal, que é proporcional à massa presente, e independe da presença ou ausência de grupos cromóforos, fluoróforos ou eletroativos.

• Qualquer analito não volátil pode ser detectado.• Pode ser usado acoplado a um espectrômetro de massa, para fornecer uma

análise completa da amostra.• Aplicações para o elsd:• Lípidios, acidos graxos, carbohidratos, polímeros, esteroides, aminoácidos,

aditivos de plásticos, produtos farmacêuticos, etc.

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ELSD – EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR

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CHARGED AEROSOL DETECTORCORONA

• Este detector oferece os benefícios de desempenho que cada um dos detectores: índice de refração, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescência de nitrogênio num único detector.

• O eluente é primeiro nebulizado com nitrogênio, e as gotas são secas para remover a fase móvel, produzindo as partículas dos analitos.

• Uma corrente secundária de nitrogênio passa por um sistema de alta voltagem e é carregado positivamente.

• Esta carga é transferida para as partículas do analíto, que flue em sentido oposto.• A carga é transferida para um coletor onde é medida por um eletrômetro altamente

sensível, gerando um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de analito presente.

• O fator de resposta do analito é independente da estrutura química.• Aplicações do CAD:• Ideal para uma larga faixa de aplicações de compostos não voláteis e semi-voláteis:

drogas, carbohidratos, lipídios, esteróides, peptídios, proteínas, polímeros.• Indústrias farmacêuticas, alimentícias, químicas, pesquisa life science,etc.

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QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES

Sensibilidade Faixa Dinâmica Consistência de Resposta

Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade Cromatográfica

Facilidade de Uso

Charged Aerosol ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻

UV ☻☻☻ ☻☻☻ ☻ ☻☻ ☻☻☻ ☻☻ ☻☻☻

Evaporative Light Scattering ☻☻ ☻ ☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻

Chemiluminescence Nitrogen ☻☻☻ ☻☻ ☻☻ ☻☻ ☻☻ ☻ ☻

Refractive Index ☻ ☻☻ ☻ ☻☻ ☻☻ ☻ ☻☻☻

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AQUISIÇÃO DE DADOS

Atualmente utilizam-se softwares que permitem:

•Processar os dados de cromatograma

•Armazenar e registrar

•Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna

•Realizar cálculos para “System Suitability Test” (SST)

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

Em função da fase estacionária utilizada tem-se os seguintes mecanismos de separação:

•Adsorção

•Partição

•Troca iônica

•Exclusão

•Bioafinidade

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

ADSORÇÃOA fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios ativos) que podem adsorver certassubstâncias.Na adsorção tem-se o seguinte equilíbrio:

Compostos com diferentes constantes de adsorção são separados.

Kads = [adsorvido na FE]

[desorvido na FM]

FM FE

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

PARTIÇÃO

A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte sólido.

As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionárialigada e a fase móvel líquida de acordo com sua afinidade relativa:

Compostos com diferentes constantes de partição são separados.

Kpart = [dissolvido na FE]

[dissolvido na FM]

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

PARTIÇÃO

FM FE

A FM carrega as moléculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilíbrio,moléculas na FE passam para a FM e são arrastadas. Tem-se um equilíbriodinâmico em cada segmento da coluna. Como a FM está em contínuo movimento,esta acaba retirando todas as moléculas da coluna.

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

TROCA IÔNICA

A fase estacionária é uma resina catiônica ou aniônica.

O esquema abaixo ilustra o processo:

-+

+

-

+

+

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

POR EXCLUSÃO

O esquema abaixo ilustra o processo:

•A separação é efetuada de acordo com o tamanho das moléculas.•A fase estacionária tem poros de tamanho controlado•Moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de retenção•Moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna pois não entram nos poros•A técnica é utilizada na análise de compostos de alta massa molecular•O mecanismo da exclusão forma a base da cromatografia gel (permeação de gel e filtração de gel) utilizada na determinação de distribuição de peso molecular de polímeros e proteínas

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

BIOAFINIDADE

O esquema abaixo ilustra o processo:

Nessa técnica somente componentes que possuem bioafinidade com a fase estacionária são retidos.

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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem utilizados naidentificação dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatográfico e auxiliar naotimização do processo de separação.

Os parâmetros cromatográficos a serem discutidos são:

• TEMPO DE RETENÇÃO• FATOR DE RETENÇÃO• FATOR DE SEPARAÇÃO• NÚMERO DE PRATOS• RESOLUÇÃO

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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

TEMPO DE RETENÇÃO

Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, tr, de uma substância ao tempodecorrido do instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico.

Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase móvel e a temperatura dacoluna, o tempo de retenção é constante.

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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

A partir da figura acima, definimos os seguintes parâmetros cromatográficos de acordo com as equações abaixo:

Parâmetro Cromatográfico Definição

Fator de retenção k = t’r / to

Fator de separação = t’r2 / t’r1

Número de pratos N = 16 ( tr / Wb )2

Resolução Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSNÚMERO DE PRATOSN = 16 ( tr / Wb )2

Número indicativo da performance da coluna. É a medida da largura do pico em relação ao seu tempo de retenção. É o parâmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatográfico.

Outra medida da eficiência da coluna é dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um prato teórico.

onde L = comprimento da colunaN = número de pratosH = L

N

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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSRESOLUÇÃO

Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

Fornece uma medida quantitativa da

habilidade da coluna em separar duas

substâncias.

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EFICIÊNCIA DA COLUNA

• A introdução da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilíbrioentre FE e FM é muito rápido, a largura dos picos também deveria seraproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso não ocorre devido a processos detransporte de massa que altera a velocidade das moléculas de um mesmo compostodentro da coluna. Estatisticamente algumas moléculas viajam mais rapidamente eoutras mais lentamente que a média das moléculas, atingindo o detector em temposdiferentes. Consequentemente, o pico registrado é alargado.

• Além dos processos de transporte de massa, causas externas à coluna, tambémcontribuem para o alargamento dos picos.

• Quanto maior o valor de N maior a eficiência da coluna.

• A altura equivalente a um prato teórico é outra maneira de considerar a eficiência dacoluna. Quanto menor H, maior a eficiência da coluna.

• H é o resultado da somatória das contribuições de cada um dos processos dealargamento intra-coluna(Hi) e extra-coluna(He).

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EFICIÊNCIA DA COLUNA

Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos:

1-Difusão caótica(Eddy diffusion) – caminhos preferenciais diferentes H=Ce.dp, onde Ce é uma constante do processo e dp o diâmetro da particula.

2- Transferência de massa na fase móvel – ao passar no interstício das partículas, as moléculas que viajam perto das paredes da FE terão velocidades menores das que viajam no centro – H= Cm.dp2.u/Dm, onde u é a velocidade da fase móvel, Dm é o coeficiente de difusão da substância na fase móvel.

3- Contribuição da FM estagnada.Dentro dos poros das partículas, algumas moléculas são mais retidas do que outras. H = Csm.dp2.u/Dm

4- Influência de transferência de massa com a FE – após a difusão das moléculas dentro dos poros, elas penetram na FE. As que penetram mais profundamente dentro da FE, também demorarão mais para sair e se atrasarão em relação a outras, consequentemente, o pico se alargará. H = s.u.df2/Ds, onde df é a espessura do filme e Ds o coeficiente de difusão da substância da fase estacionária.

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EFICIÊNCIA DA COLUNA

Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos (cont.):

5- Difusão longitudinal na fase móvel – H = Cd.Dm/u

A somatória desses fatores contribuem para aumentar o valor de H e portanto diminuição da eficiência da coluna.

De modo geral as seguintes variáveis contribuem para o alargamento do pico: Substância i, FM, FE, u, Dm. Ds, 1/u, dp, dp2, df2, diâmetro do poro, área superficial, Tcoluna).

A velocidade da fase móvel tem efeito prejudicial para alguns fatores e benéficos para outros. Portanto, a avaliação de H em função da velocidade da FM passa por um mínimo.

Entre as causas externas, podemos citar: comprimento e diâmetro interno dos tubos que ligam a válvula de introdução da amostra à coluna, volume das conexões envolvidas, volume da cela do detector, etc.

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EFICIÊNCIA DA COLUNA

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EFICIÊNCIA DA COLUNAOTIMIZANDO EFICIÊNCIA DA COLUNAOs seguintes fatores devem ser considerados na otimização da eficiência da coluna:•Tamanho de partícula•Viscosidade da fase móvel•Temperatura•EmpacotamentoA equação de Van Deemter mostra que quanto menor a partícula, menor H e menor ainfluência da vazão na eficiência da coluna:

3

5

10

Vazão

H

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FASES ESTACIONÁRIAS

As FE são constituídas de material sólido, granulado, finamente dividido e densamenteempacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente aço. O material sólidopode estar revestido ou ligado quimicamente a um líquido.

TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAFE SÓLIDAFE POR EXCLUSÃOFE POR TROCA IÔNICAFE POR BIOAFINIDADEFE QUIMICAMENTE LIGADA

NORMALREVERSA

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FASE ESTACIONÁRIA SÓLIDASeparação realizada por mecanismo de adsorção

•Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra•Indicada para compostos com peso molecular menor que 2000 Daltons•Solventes mais utilizados são de média e baixa polaridade•Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente sílica

SÍLICAA sílica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si-OH vicinal e germinal. Os grupos silanol são os mais importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o composto, maior a retenção.A ordem de eluição em sílica é: hidrocarbonetos saturados < olefinas < aromáticos < éteres< ésteres < aldeídos ≈ cetonas < álcoois < aminas < amidas < ácidos carboxílicos.Dependendo do procedimento de produção da sílica, suas características, como volume de poro, diâmetro de poro, área superficial, número de grupos silanol, variam resultando em retenção variável.

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FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO

A separação baseia-se no tamanho das moléculas dos componentes da amostra em relaçãoao diâmetro dos poros da fase estacionária.

As fases estacionárias podem ser sílica ou polímeros de poliestireno-divinilbenzeno,poliacrilamidas e outros, com distribuição de diâmetro dos poros controlada.

Moléculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as moléculas grandes nãoconseguem entrar nos poros. Desta forma elas são permeadas seletivamente.

A técnica é denominada cromatografia de exclusão por tamanho.

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FASES ESTACIONÁRIASFASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃOA figura abaixo ilustra o processo de separação:

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FASES ESTACIONÁRIASFASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO

APLICAÇÕES:

PERMEAÇÃO EM GEL(FM orgânica)

FILTRAÇÃO EM GEL(FM aquosa)

Resinas alquídicas Peptídeos

Epóxidos Proteinas

Poliestirenos Enzimas

Borracha natural Ácidos Nucleicos

Silicones Lipídios

Colunas de permeação de gel fabricadas com sais de cálcio ou chumbo de resinas sulfônicascom diâmetro de poro controlado, são usadas nas análises de dextrana, oligossacarídeos eaçúcares.

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FASES ESTACIONÁRIAS

FASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA

A separação baseia-se na interação eletrostática dos componentes da amostras comgrupos iônicos da FE.

A FE é normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual estão ligadosgrupos iônicos, ou a FE é sílica recoberta com uma fina camada de poliestireno-divinilbenzeno onde grupos iônicos estão ligados.

Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de troca iônica são:

SO3- : trocadores fortes de cátions

CO2- : trocadores fracos de cátions

NR3+ : trocadores fortes de ânions

NH2R+ : trocadores fracos de ânions

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FASES ESTACIONÁRIASFASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA

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FASES ESTACIONÁRIAS

FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADASão as fases mais importantes da cromatografia líquida Obtidas pela reação dosgrupos silanois da sílica com compostos contendo grupos polares(Fase Normal)ou nao polares(Fase Reversa).

Na Fase Quimicamente Ligada, a sílica gel, através dos grupamentos Si - OH, seliga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidadequímica.

A “Cromatografia de Fase Ligada” é subdividida em Fase Normal e Fase Reversade acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados à sílica gel.

As notáveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de FaseLigada a mais utilizada em todo o mundo.

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FASES ESTACIONÁRIASFASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA

-Si-O-Si- (R)-Si-O-Si- (R)

-Si-O-Si- (R)

-Si-O-Si- (R)

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

Grupos silanóis são responsáveis por retenções não específicas que provocam alargamento dos picos.

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FASES ESTACIONÁRIASFASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA

Para a produção das Fases Quimicamente Ligadas, a sílica gel é submetida a umprocesso de hidrólise formando grupos silanóis SiOH, grupo quimicamente ativono qual se ligará o grupo funcional através de reações de silanização, utilizandoorganosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais,dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fasemonomérica ou polimérica.

Infelizmente, devido a efeitos estéricos, muitos grupos SiOH não reagempermanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos.

Ligação química tradicional usando silano monofuncional alcança um máximo de50% ou uma densidade de ligante de ~4µmol/m2.

Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como“Endcapping”.

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FASES ESTACIONARIASENDCAPPING

• Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais é necessário um passosecundário de ligação para cobrir esses grupos ainda presentes na sílica.

• O processo denominado endcapping efetua-se em geral comtrimetilclorosilano(TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres

• As sílicas usuais só podem ser utilizadas na faixa de pH 2 – 8, pois osgrupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a sílica se dissolve emfase móvel contendo água em pH maior que 8.

• Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos básicos, limitaçãode pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizadosatravés de desenvolvimentos mais recentes, tais como: sílica de altapureza, partículas hibridas, sílica tipo C(sílica hidreto) e novas “quimicasligantes”.

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ENDCAPPING

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FASES ESTACIONÁRIAS - NOVOS DESENVOLVIMENTOS

• SÍLICA DE ALTA PUREZA(sílica tipo B) – maior que 99.995%, com menos de 50ppm de metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente ácidos).

• PARTÍCULAS HÍBRIDAS – desenvolvido pela Waters, essas partículas são um híbridoorgânico/inorgânico.Contém ambos sílica e organosiloxane.ë produzida pela mistura de dois monomeros de alta pureza: (RO)4Si + (RO)3SiR. O produto da reação contémunidades de SiO2 e unidades RSiO1.5 combinados a nível molecular. O teor de carbono é cerca de 7%, antes de modificações da superfície. Colunas Xterra são produzidas com essas partículas.

Permitem uso na faixa de pH 1 a 12, sem perda de eficiência ou capacidade e devido aoteor reduzido de grupos silanol, fornecem excepcional forma de picos para analitosbásicos.

sílica TIPO C – sílica HIDRETO – desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de sílicaultra pura(baixo teor de metais), através de uma tecnologia própria, a sílica tipo B é convertida em sílica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contém menos de 3% de grupos SiOH. Por isso não forma ligações fortes com água o que permite utiliza-la comofase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e até Agua/Acetonitrila com excelenteprecisão.

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FASES ESTACIONARIAS – NOVOS DESENVOLVIMENTOS

SÍLICA MONOLÍTICA – MONOLITHIC sílica

GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS – Grupos di-isopropil e di-isobutil incorporados aos reagentes ligantes para proteger as ligações Si-O contra hidrólise ácida.

• QUÍMICA SILANO POLIFUNCIONAL – O uso de silanos di-funcional ou tri-funcional para criar grupos ligados com dois ou tres pontos conduzindo a fases com maior estabilidade em baixo e alto pH e menor sangramento para LC/MS. Porém os silanos polifuncionais são de controle mais difícil.

• GRUPOS POLARES EMBEBIDOS – A incorporação de um grupo polar( ex. Carbamato, amida, urea, eter, sulfonamida) na cadeia hidrofílica de reagentes ligantes tem conduzido a uma nova classe de fases populares com diferente seletividade e melhor forma de pico para analitos básicos devido a “blindagem” dos silanois pelo grupo polar embebido. Essas colunas são geralmente menos retentivas do que as C18 e C8 comuns, para analitos neutros e básicos. Estão se tornando muito populares para o desenvolvimento de métodos de difíceis separações.

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SÍLICA DE ALTA PUREZA

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PARTICULAS HIBRIDAS

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SÍLICA MONOLITICA – MONOLITHIC SÍLICA

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SÍLICA FUSED CORE PARTICLE

• Tecnologia de partícula fused core, desenvolvida para cromatografia hiper rápida.

• Uma camada de sílica porosa é fundida na superfície de sílica sólida.

• A particula tem diametro total de 2.7µm e a camada porosa 0.5µm, área superficial de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de pH: 2 – 9.

• As ligações da fase estacionária são monoméricas e endcapped maximinizado.

• Como o passo de difusão é de apenas 0.5µm, reduz a dispersão axial e minimiza o alargamento de pico.

• Possui eficiência de particulas sub-2µm sem a queda de pressão que estas particulas apresentam e portanto não necessita de equipamento uhplc.

• www.sigmaaldrich.com/supelco/the_reporter/207002-ascentis-express.Pdf

• www.mac-mod.com/pb/halo -pb.Hmtl

• Site da sigmaaldrich – supelco – the report volume 25.2

• Colunas ascentis express particle e colunas halo

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GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS

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ADSORVENTES DE HPLC E

CARACTERÍSTICAS

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FASES ESTACIONÁRIAS

FASE ESTACIONÁRIA NORMAL

Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de sílica. A técnica, emgeral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsorção.

GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS:

DIOL

CIANO

AMINO

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FASE ESTACIONÁRIA REVERSAEm Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados à base de sílica são apolares. Osanalitos são atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais não polares. O analito mais polar eluiprimeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil efenila são os mais utilizados. O grupo octadecil é responsável pela maioria das separações emfase reversa.

Si- O - Si -

Si- O - Si -

Si- O - Si -

Si- O - Si -

O

O

O

O

O

O

C18

C18

C18

C18

Si- O - Si -

Si- O - Si -

Si- O - Si -

Si- O - Si -

O

O

O

O

O

O

C8

C8

C8

C8

Si- O - Si -

Si- O - Si -

Si- O - Si -

Si- O - Si -

O

O

O

O

O

O

CH2-

CH2-

CH2-

CH2-

OCTADECIL OCTIL FENIL

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FASE MÓVEL

ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC

O sucesso da separação cromatográfica só é possível se for aplicada uma FMcorreta a uma FE conveniente.

A escolha da composição da FM leva em conta vários fatores, tais como:

• Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, partição e adsorção e,portanto, a separação

• Propriedades físicas que afetam a possibilidade de detecção dos componentes

• Propriedades físicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna

• Propriedades que afetam a segurança (toxidez e inflamabilidade)

• Custo

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FASE MÓVEL

SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS

Os seguintes parâmetros devem ser considerados para uma escolha adequada daFM:

• Viscosidade• Compressibilidade• Pressão de vapor• Toxidez• Índice de Refração• Corte de UV (cut off) – espectro de absorção UV-VIS• Miscibilidade de solventes e outras características importantes• Força dos Solventes

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FASE MÓVELSELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICASVISCOSIDADEA viscosidade do solvente ou misturas de solventes tem importância fundamentaldurante o bombeamento isocrático ou por gradiente. A figura abaixo apresenta aviscosidade de alguns solventes.

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FASE MÓVEL

SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS

VISCOSIDADE

•P da coluna depende da vazão, temperatura, viscosidade da FM e empacotamento dacoluna.

•Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no bombeamento e elevam o P.

•Exemplo da influência da viscosidade em coluna fase reversa C8- 5 m – 25cm –4.6mm:

Solvente Viscosidade (cP) Vazão (ml/min) P (atm)

Metanol 1.1 1.00 102

Isopropanol 2.2 1.00 460

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FASE MÓVELSELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICASVISCOSIDADE

Água, metanol, hidrocarbonetos e outroscompostos com viscosidade menor que 1cPsão ótimos solventes no parâmetroviscosidade.A viscosidade influência na eficiência poisafeta o coeficiente de difusão acarretandoem perda de número de pratos teóricos dacoluna.A viscosidade de misturas de solventes nãovaria linearmente com a composição.

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FASE MÓVELSELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICASCORTE UV (CUT OFF)•O UV cut off é o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que umaunidade de absorbância em uma cela de 1cm de caminho óptico.

•É uma referência para a seleção do solvente da FM quando se usa detector UV.

•É importante determinar o espectro de absorção do solvente antes de usá-lo como FM, poiseventuais impurezas podem alterar muito o valor do cut off.

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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS

MISCIBILIDADE DE SOLVENTES E OUTRAS CARACTERÍSTICAS

Além das propriedades discutidas, outros cuidados especiais devem ser tomados na escolhados solventes:

• Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportadosatravés da coluna• Imiscibilidade com a FE• Inércia química com a FE e os componentes da amostra• Pureza condizente com o detector utilizado.• Mistura de solventes devem produzir soluções homogêneas – fator importantenas análises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca desolventes; em caso de troca de dois solventes imiscíveis, deve-se usar umsolvente intermediário solúvel em ambos).• Sistemas não miscíveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna einduzem ruídos no detector além de alterar os tempos de retenção e prejudicaranálises quantitativas.

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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS

FORÇA DOS SOLVENTES

• A interação das moléculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) econsequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes forças deinteração:

• Dispersão

• Interação dielétrica

• Dipolos

• Pontes de hidrogênio

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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS

Miscibilidade em água UV cut off IR 20°C Força do

SolventeViscosidade a 20°C, cP

Hexano não 200 1.3750 0.00 0.33

Isooctano não 200 1.3910 0.01 0.50

Tetracloreto de carbono não 263 1.4595 0.14 0.97

Clorofórmio não 245 1.4460 0.31 0.57

Cloreto de metileno não 235 1.4240 0.32 0.44

Tetrahidrofurano sim 215 1.4070 0.35 0.55

Éter dietílico não 215 1.3530 0.29 0.23

Acetona sim 330 1.3590 0.43 0.32

Acetato de etila pobre 260 1.3720 0.45 0.45

Dioxano sim 215 1.4220 0.49 1.54

Acetonitrila sim 190 1.3440 0.50 0.37

2-Propanol sim 210 1.3770 0.63 2.30

Metanol sim 205 1.3290 0.73 0.60

Água sim - 1.3328 >0.73 1.00

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FASE MÓVEL

RELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM

Ao variar a polaridade da fase móvel, varia o fator capacidade(k=t’r/to) e consequentemente a seletividade na separação.

Variação de tr e resolução com a composição do solvente em análise de metil, etil, propil e butil parabenos. coluna ODS (10cm x 0.6 cm), UV 254nm, 40°C, água/metanol

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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICASRELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FMVariação do fator capacidade com a composição da fase móvel

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FASE MÓVEL

SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO

Abaixo descreve-se um procedimento típico para seleção de FM em separações isocráticascom fase reversa:

•Escolher a coluna conveniente (C8 – C18)•Fixar a temperatura da coluna (40°C)•Para compostos ácidos ou básicos ajustar a FM água com ácido fosfórico 0.05M ajustandoo pH a 3.5 com hidróxido de sódio•Equilibrar a coluna com solvente orgânico puro (acetonitrila ou metanol, vazão = 1.5ml/min)•Injetar 10-20 l da amostra•Se os componentes eluírem perto de to, repetir as análises alterando a concentração deágua crescentemente até o obter separação satisfatória.•A figura abaixo ilustra esse teste utilizando acetonitrila:

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SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO

Constata-se a força do solvente na separação.

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FASE ESTACIONÁRIA REVERSAORIENTAÇÃO PARA OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO

Fase móvel 100% Orgânica

Adicione água (incrementos de 20%) até k’ = 5

Ajuste a > 1.2

Diminua vazãoAumente a coluna

Diminua as partículas

Tente outra Fase estacionária

picos muito rápidos

injete amostra

picos muito próximos

ainda não separa

Utilizar Fase Normal

picos muito lentos

Adicione pequenas quantidades de modificadores orgânicos fortes

Ajuste pH para os compostos parcialmente iônicos; força iônicaAjuste TemperaturaAltere o modificador

fator retenção : k = t’R / tMfator separação: = k2 / k1 = t’R2 / t’R1

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REAÇÕES PÓS-COLUNAS

Para a detecção de alguns componentes, principalmente a baixas concentrações, é precisotransformá-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinadodetector.

Isso é necessário quando o componente:

• Não é bom cromóforo• Não é bom fluoróforo• Não é eletroquimicamente ativo

Nestes casos efetua-se reações específicas, formando derivados que possam apresentaralgumas das seguintes propriedades:

• Alta constante de equilíbrio de formação• Rápida velocidade de formação• Espectro UV-VIS de alta sensibilidade• Fluorescência• Eletroquimicamente ativos

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REAÇÕES PÓS-COLUNASEXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO

• Característica original: É um mau cromóforo e um mau fluoróforo• Reação pós coluna: reação com hipoclorito e o-ftalaldeído (OPA) e mercaptoetanol(MERC)

Glifosato Glicina Isoindol

• Detecção: fluorimetricamente do isoindol (excitação a 230-240 nm, emissão a 420-450nm)

OCl- OCl-MERC

bomba

injetor 50°C

coluna

bomba

OCl-

bomba

OPA / MERC

reactor reactor

fluorímetro

registrador

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REAÇÕES PÓS-COLUNASEXEMPLO: BARBITÚRICOScaracterística original: baixa absorbância no UV•reação pós coluna: elevação de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, aabsorbância máxima de barbitúricos se desloca para comprimentos de onda mais altos,porém, nessa condição, a FM dissolve a sílica da FE, assim, o problema é resolvidoelevando-se pH somente após a coluna.)detecção: UV a 240 nm

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PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA

Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia.

Particularmente na separação de compostos básicos e portanto um problema constante na análise de produtos farmacêuticos.

Picos com cauda causam inúmeros problemas, incluindo baixa resolução, sensibilidade reduzida , precisão e quantificação inadequada.

A figura 1 ilustra como a resolução e sensibilidade da amostra é afetada por picos com cauda.

A figura 2 ilustra como a exatidão e precisão de uma análise pode sofrer devido a inabilidade dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.

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CAUSAS DE CAUDA NO PICO AÇÃO CORRETIVA

SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE MÓVEL

DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MÓVEL OU REDUZA A FORÇA DO SOLVENTE

EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA

REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADATABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES

COLUNAS.

INTERAÇÃO DE SILANOL COM AMINAS

REDUZA O pH da FASE MÓVEL PARA <3 AUMENTE A FORÇA IÔNICA DA FASE MÓVEL,

25mM A 50mM É RECOMENDADO ADICIONE UMA AMINA COMPETITIVA NA FASE MÓVEL – 10mM DE

TEA É SUFICIENTE.SELECIONE FASE ESTACIONÁRIA COM MENOR

ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6

ADSORÇÃO DE ÁCIDOS NA sílica

AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MÓVEL.25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE.

REDUZA O pH da FASE MÓVEL PARA <3.ADICIONE UM ÁCIDO ORGÂNICO COMPETITIVO.

1% DE ACIDO ACÉTICO OU 0.1% DE TFA É USUALMENTE SUFICIENTE.

VAZIOS NA COLUNASUBSTITUA A COLUNA.

TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS RARAMENTE VALE A PENA.

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ANÁLISE DE COMPOSTOS BÁSICOS

Problemas com a forma do pico de compostos básicos são normalmente comuns. Mas há vários passos simples que podem melhorar significativamente a forma do pico de bases:

1- Selecione uma coluna base-sílica desativada.

2- Usar fase móvel com baixo ph.

3 – Aumento da concentração de sais na fase móvel.

4 – Selecione uma coluna “heavily endcapped”.

5 – Adicione uma base competitiva.

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ANÁLISE DE COMPOSTOS ÁCIDOS

1– Adicione um ácido orgânico competitivo.Adicionou-se 1% de ácido acético à fase móvel para minimizar as interações

soluto-silanol, pela ação de um ácido competidor.Os resultados foram notáveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente

gaussiano – fator cauda 1.0.

2- Substituindo o ácido acético por 0.1% de ácido trifluoracético – tfa.A concentração relativamente alta de ácido acético resulta em ruído da linha de

base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase móvel mais transparente, menos ruído, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda simétrica, fator cauda 1.09.

Em pH 3, a fase móvel está tamponada, porém a capacidade tamponante é baixa. aumento da concentração para 10 – 20mm melhorará a reprodutibilidade cromatográfica por mais tempo, além de melhorar ainda mais a forma do pico.

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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA

• Tempo de retenção não reprodutível é um problema comum quando se usa fase móvel altamente aquosa.

• Na separação de compostos muito polares, solúveis em água não é incomum usar fm com menos de 10% de modificador orgânico(metanol, acetonitrila, etc.) Para conseguir retenção suficiente.

• Entretanto, nestas condições a reprodutibilidade é ruim.

• Com o tempo, os picos eluirão com tempo de retenção cada vez menores e a resolução piora.

• A figura mostra cromatogramas de análise de vitaminas em coluna ymc ods-fm:5meoh – 95% 0.1M KH2PO4 –f:1ml/min

• Vitamina C – vitamina B1 – vitamina B6 -nicotinamida

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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA

COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA

• A mudança do tempo de retenção é causada pelo fenômeno denominado colapso de fase de fases alquílicas hidrofóbicas c18 ou c8 em condições de fase móvel altamente aquosas.

• A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com solutos diminui e o tempo de retenção decresce.

• Há também evidência que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da FE, reduzindo a área superficial acessível para os solutos e portanto reduzindo os tempos de retenção.

• Em condições normais a fase alquílica está extendida na FM e solvente e moléculas da amostra tem total acesso a fe.

• Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de retenção é afetado.

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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA

COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA

• A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base desativada;

• Após deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo de retenção de amoxicilina diminuiu de 5 min. Indicando colapso da fase;

• Purgando a coluna com solvente orgânico a fase alquilica é novamente extendida e o tempo de retenção é restaurado.

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HPLC REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSACOLUNAS QUE NÃO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE

Alguns fabricantes resolveram o problema usando silanos polares com fase ligada ou usando “endcapping” hidrofilico.

Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS quando se usa fase móvel 100% aquosa.

Colunas: AquaSep, HydroBond AQ, HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ

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CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÃO IÔNICAION PAIR CHROMATOGRAPHY

• A análise de compostos com carga tem sido obtida por supressão de ion (ajuste cuidadoso do pH da fase móvel para resultar em analito não ionizável.

• Determinação do pH ótimo da fase móvel em supressão de ion frequentemente requer trabalho extensivo no desenvolvimento do método.

• Para amostras contendo mais de um componente ionizável, o método frequentemente nao é adequado.

• As limitações da supressão de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma metodologia mais adequada para a separação de componentes ionizados: cromatografia por interação iônica – ion pair chromatography.

• A técnica envolve a adição de composto iônico na fase móvel para promover a formação de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes são constituidos de uma cadeia alquílica com terminal ionizável.

• Quando usado com colunas hidrofóbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem ser usados para aumentar seletivamente a retenção de analitos carregados.

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126

QUANDO UMA FASE MÓVEL DEVE SER TAMPONADA?Em HPLC com fase reversa, a retenção dos analitos está relacionada com sua hidrofobicidade. Quanto mais hidrofóbico o analito, mais ele será retido.

Quando um analito é ionizado, ele torna -se menos hidrofóbico e portanto sua retenção diminui.

Ácidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta.

Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce.

Portanto, nas separações contendo ácidos e/ou bases utilizando fase reversa, é necessário controlar o ph da faxe móvel, usando um tampão apropriado para se obter resultados reprodutíveis.

FASES MÓVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA

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128

A figura 2 mostra que metilamfetamina é totalmente protonada em pH menor que 3 e sua retenção não é afetada por pequena mudança no pH da fase móvel. Já a pH 7, próximo de seu pKa, uma mudança de apenas 0.2 unidades de pH desloca a retenção de quase 9% .

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ANÁLISE QUALITATIVA

A análise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificação dos analitos deinteresse.

Existem dois casos a serem considerados para análise qualitativa com HPLC:

•Análise Qualitativa em Controle de qualidade

•Análise Qualitativa em identificações não rotineiras

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ANÁLISE QUALITATIVA

Análise Qualitativa em Controle de qualidade

É normalmente efetuada através da comparação do tempo de retenção ouretenção relativa dos analitos de interesse com esses parâmetros de padrões. Taisanálises são realizadas com metodologias já estabelecidas.É fundamental o controle e monitoramento das condições analíticas para evitarconclusões errôneas.

Análise qualitativa em identificações não rotineiras

Neste caso é importante conhecer o máximo da história da amostra e utilizardetectores que auxiliam a identificação da estrutura do composto, como detectorde espectrometria de massa.

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ANÁLISE QUANTITATIVA

MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO

Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e sãodetectáveis

Existem dois procedimentos:

• Normalização de área (% em área)

• Normalização utilizando-se a área corrigida

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ANÁLISE QUANTITATIVA

MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO

Normalização de área (% em área)

Ai = área do composto iAi = somatória das áreas de todos componentes

Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a suaconcentração e que mesma concentração de diferentes compostos resulte emáreas iguais (o que dificilmente ocorre).

100% xA

A

i

ii

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ANÁLISE QUANTITATIVA

MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO

Normalização com área corrigida

Ai = área do composto iFi = fator de resposta do componente iAiFi = somatória das áreas de todos componentes multiplicadas pelos respectivosfatores de resposta

É necessário conhecer todos os componentes da amostra para determinação dosfatores de resposta de cada componente

100% xxFA

xFA

ii

iii

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ANÁLISE QUANTITATIVAMÉTODOS ABSOLUTOS

Utiliza-se métodos absolutos quando:

• O objetivo da análise é quantificar um ou alguns dos componentes daamostra.

• Ao utilizar detectores específicos ou seletivos que detectam somente oscomponentes de interesse

• Existência de compostos na amostra que não são eluídos nas condições deanálise ou não são detectados e que não haja interesse de quantificá-los.

• Quantificação de componentes em baixa concentração.

• Existem dois procedimentos:

•Padronização externa•Padronização interna

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ANÁLISE QUANTITATIVAMÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização externa

1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturas padrõesinjetando-se um determinado volume.2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentração do analito através daurva dec calibração.

Nesta técnica, se o volume injetado não for exatamente o mesmo ou se houver alteração de algumparâmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variação da intensidadede luz do UV-VIS ou alteração na FM, as áreas dos picos poderão ser maiores ou menores daquelasobtidas na calibração e consequentemente os resultados serão incorretos.

Ai

Ci

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ANÁLISE QUANTITATIVA

MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna

Para minimizar os problemas da padronização externa, a amostra e a mistura padrão sãomodificadas pela adição de um composto considerado como padrão interno. O padrãointerno deve ter as seguintes características:

1. Não estar presente na amostra original, ser estável e não reativa.

2. Pico separado dos componentes da amostra

3. Eluir próximo dos componentes de interesse

4. Detecção semelhante dos picos de interesse

5. Concentração que produza área similar aos picos analisados

6. Pureza elevada ou conhecida (possíveis impurezas não devem eluir com ospicos de interesse).

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Conceitos fundamentais de HPLC

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ANÁLISE QUANTITATIVAMÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna

1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturaspadrões contendo o padrão interno. Nessa curva de calibração utiliza-se a relação entre áreado componente i e área do padrão interno em função das relações de suas concentrações.2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padrão interno (preferencialmente namesma concentração utilizada na calibração) e obtem-se a concentração do analito atravésda curva de calibração.

Ai / Api

Ci / Cpi

Se o volume de amostra injetado for diferente do utilizado na calibração, ou se algum parâmetro analítico for alterado resultando em áreas diferentes daquelas esperadas nas condições de calibração, a relação de área entre analito e padrão interno não será afetada.

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• UHPLC – ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPY

• A tecnica utiliza particulas menores que 2µm o que fornece colunas com maior eficiência( maior número de pratos) e consequentemente melhor separação, desde que os analitos tenham coeficiente de partição diferentes.

• Normalmente utiliza-se colunas com 1.7µm o que acarreta maior pressão no sistema, sendo necessário utilizar equipamento configurado para isso.

• O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com pressões maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela.

• Em analises rápidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de 0.05 seg.

• SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS• Waters Corporation – Acquity UPLC System – 6 FE BEH/sílica• Thermo Scientific – Accela High Speed LC – 3 FE Hypersil Gold• Agilent – 1200 Series – 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond• Restek(colunas) – Pinnacle DB 1.9µm• Grace/ Alltech - colunas

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V ERIFICAÇÃO DE EQUIVALÊNCIA DE COLUNAS HPLC

Dois grupos – projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parâmetros para caracterizar colunasHPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas.• PROJETO USP – Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersil-

Keystone, Waters• Parâmetros avaliados: • Hidrofobicidade• Quelação de metais• Atividade do grupo silanol• Seletividade• Densidade de ligaçõesProjeto Snyder/Dolan – Grupo de trabalho Impurezas PQRI – informação obtida em Wyeth, Eli Lilly, FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras• Parâmetros avaliados:• Hidrofobicidade• Seletividade• Acidez – pontes de H• Basicidade – pontes de H

Capacidade de troca iônica• Site: www.usp.org/USPNF/columns.html

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DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR

• Varios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de método de análise por HPLC.

• São softwares caros, mas o investimento permite uma economia para as Empresas, pois cada método é desenvolvido em pouco tempo.

• Dependendo da experiência em cromatografia e da complexidade da amostra, um método desenvolvido manualmente(método convencional), pode levar um mês ou mais.

• Com um desses programas eletronicos, o método pode ser desenvolvido em algumas horas ou poucos dias.

ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS:• DRY-LAB 2000 PLUS(Rheodyne) – www.molnar-institut.com/www.rheodyne.com• CHROMSWORD AUTO - (Hitachi – Agilent – Iris) – www.chromsword-auto.com• ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE – www.acdlabs.com• POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography – BISCHOFF

CHROMATOGRAPHY – www.poplc.def

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REFERÊNCIAS PARA CONSULTA

• HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis – George Lunn – Norman Schmulf –Wiley Interscience – 1997 (1632 pag.) – ISBN 0471181765

• HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals – George Lunn – Wiley –2005 (717 pag.) – ISBN 9780471669418

• HPLC for Pharmaceutical Scientists – Yuri Kazakevich – Rosario Lobrutto –Wiley –Jan 2007(1104 pag.) – ISBN 9780471681625

• HPLC Made to Measure – Stravos Kromidas – Wiley – 2006 –ISBN 352731377X

• Validation Chromatographic Methods – A Practical Guide – David M. Bliesner – Wiley 2006 – (304 pag.) – ISBN 9780471741473

• HPLC Practical and Industrial Applications – Joel Swadesh

• Modern HPLC for practicing scientists – Michael W.Dong – Wiley Interscience – 2006

• HPLC – A practical user’s guide – Marvin C. McMaster – John Wiley & Sons - 2007

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REFERÊNCIAS PARA CONSULTA

Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho – REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1a Ed.

Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Bulletin 826, HPLC Troubleshouting guide, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns,http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

The Reporter, Optimizing HPLC Separations, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, pág. 12

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• FONTES DE INTERNET• www.chem.agilent.com• www.alltech.web• www.dionex.com• www.esind.com• www.gls.co.jp• www.hamiltoncompany.com• www.macherey-nagel.com• www.mac-mod.com• www.merck.de• www.microlc.com• www.microsolvtech.com/• www.phenomenex.com• www.instruments.perkinelmer.com• www.polymerlabs.com• www.restekcorp.com/h• www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco• www.thermo.com• www.tosoh.com/• www.varianinc.com• www.vydac.com/• www.waters.com• www.zirchrom.com/

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CEP CURSOS - Centro de Educação Profissional

O Centro de Educação Profissional (CEP) é uma Empresa voltada para a Educação Continuada e Profissionalizante através de: Cursos de Extensão Presenciais;

Cursos a Distância (EAD); Cursos In-Company;Programas Especiais e Especializações; Assessoria e Consultoria Customizada;

Dentro das diversas áreas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentação e Desenvolvimento Analítico,Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, Assuntos Regulatórios, Pesquisa e Desenvolvimento,Microbiologia e Habilidades Gerenciais.

Informações: www.cepcursos.com / [email protected] Ayrton: [email protected]

Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: 11 50539755

Agradecimentos