Relatório referente à aula prática de Bioquímica I

Caracterização de lipídeos

Presidente Prudente 2012

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SUMÁRIO

1. OBJETIVOS..........................................................................................................................3

2. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................32.1. Lipídios...........................................................................................................................3

3. REAGENTES E PROCEDIMENTOS...............................................................................43.1. Esteróides: Caracterização e dosagem do colesterol.......................................................43.2. Reações para Lipídios saponificáveis.............................................................................5

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................................74.1 Esteróis: Caracterização e dosagem de colesterol............................................................74.2. Reações para lipídios saponificáveis...............................................................................84.3. Separação dos ácidos graxos.........................................................................................104.4. Propriedades dos sabões e ácidos graxos......................................................................10

5. CONCLUSÃO.....................................................................................................................12

6. REFERÊNCIAS..................................................................................................................13

1. Objetivos

Caracterizar um esterol através de suas reações de coloração; Caracterizar triacilglicerois através de hidrólise alcalina (saponificação); Evidenciar a formação dos produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades.

2. Introdução

Os lipídios constituem uma classe de compostos com estrutura bastante variada, caracterizados por sua alta solubilidade em solventes orgânicos e por serem praticamente insolúveis em água. Exercem diversas funções biológicas, como componentes de membranas, isolantes térmicos e reservas de energia; eles próprios ou seus derivados também participam em algumas funcões de vitaminas e hormônios. Muitos lipídios são compostos anfipáticos. ou seia. apresentam na molécula uma porção polar, hidrofflica, e uma porção apoiar, hidrofóbica [1].

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Os ácidos graxos são ácidos monocarboxílicos anfipáticos. Geralmente com uma cadela carbônlca longa, com número par de átomos de carbono e sem ramificações, podendo ser saturada ou conter uma insaturação ou duas ou mais insaturacões. O grupo carboxila constitui a região polar, e a cadeia carbônica, a parte apoiar. Ácidos graxos livres são poucos encontrados nos organismos, estes sendo mais frequentemente estão ligados a um álcool, que pode ser o glicerol ou esfingosina. Os lipídios resultantes no primeiro caso são os triacilglicerois e os glicerofosfolipidios; no segundo caso são os esfingolipideos (Hgura 1). Ostriacilgliceróis são uma forma de armazenamento de ácidos graxos: os glicerofosfolipídios e os esfingolipldeos, juntamente com o colesterol, fazem parte das membranas celulares [1].

Os triacilgliceróis constituem a maneira mais eficiente de armazenar energia nos seres vivos. O seu caráter fortemente hidrofóbico permite o armazenamento sob forma praticamente anidra, ou seja, sem moléculas de água adsorvida, as quais aumentam muito o peso da reserva de energia. Além disso, como são compostos altamente reduzidos, sua oxidação libera muito mais energia que a oxidação de quantidades equivalentes de carboidratos ou proteínas. Nos vertebrados, os triacilgliceróis são depositados no tecido adiposo, de localização visceral esubcutãnea. que atua também como isolante térmico e como proteção contra traumas mecânicos [1].

Ao contrário dos triacilglioeróis, todos os outros lipídios mencionados anteriormente são moléculas anfipaticas. Nos fostolipídios (glicerotosfolipídios e esiingomieiinas) a porção hidrofilica é constituida pelo grupo iosfato, que apresenta carga negativa em pH fisiológico. ligado a uma outra molécula. também polar. Que pode ter carga positiva (colina e etanolamina). carga negativa (serina) ou não apresentar carga (inositol). Os glicolipidios (oerebrosldios e gangliosidios) contem açúcares hidrofílicos. que podem não apresentar carga (glicose e galactose) ou apresentar carga positiva devido à presença de grupos amino. A porção hidrofílica do colesterol é representada por uma hídroxila, e o restante da molécula é apoiar. A região hidrotóbica do colesterol é representada por uma hidroxila, e o restante damolécula é apolar. A região hidroióbica dos demais lipídios anfifllicos mencionados é representada pelas cadeias de hidrocarboneto da esfingosina e/ou dos ácidos graxos. Os lipídios antipáticos são elementos estruturais importantes das membranas biológicas [1,2].

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3. Reagentes e Procedimentos

3.1 Esteróides: Caracterização e dosagem do colesterol

a) Reação de Salkowski (qualitativa)

Reativos: Solução clorofórmica de colesterol 1% Ácido sulfúrico concentrado.

Técnica:Em um tubo de ensaio bem seco colocar 1 mL de solução clorofórmica de colesterol eacrescentar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado.

b) Reação de Liebermann-Burchard (quantitativa)

Reativos: Solução padrão de colesterol a 0,2% em ácido acético glacial. Reagente cromogênico : anidrido acético 220 mL + ácido acético glacial 200 mL +

ácido sulfúrico concentrado 30mL Soro humano

Tubos 1 2 3 4 5 6Padrão de colesterol 0,2 % (mL) - 0,1 0,2 0,4 0,5 - Ácido acético glacial (mL) 0,5 0,4 0,3 0,1 - 0,4Amostra de soro (mL) - - - - - 0,1Reativo cromogênico (mL) 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0

Técnica:Misturar e levar os tubos ao banho-maria a 37°C por 20 minutos e ler as absorbâncias emfotocolorimetro com filtro vermelho (660 nm).

3.2 Reações para Lipídeos saponificáveis

1. Solubilidade:

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Técnica:Colocar em 3 tubos de ensaio numerados, respectivamente, 1mL de água destilada, 1

mL de álcool etílico e 1 mL de éter. Juntar a cada tubo 5 gotas de óleo vegetal de soja e notar a solubilidade do Óleo em cada um dos solventes. Em um 4° tubo de ensaio, coloque 5 mL de água destilada e transfira cuidadosamente pelas paredes deste tubo, a solução etérea contida no tubo 3, de maneira a formar uma camada de separação água-éter. Agitar suavemente e observar o aparecimento de emulsão (camada constituída por gordura cuja parte polar liga-se à água e a parte apolar ao Óleo) de óleo em água na interface. Em um 5° tubo de ensaio, prepare o tubo controle, colocando 5mL de água destilada e 1 mL de éter, para servir de comparação com o quarto tubo.

2. Saponificação:

Técnica: Colocar em um tubo de ensaio grande 1 mL de óleo vegetal de soja. Adicionar 2 mL

de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 10%. Aquecer cuidadosamente em banho de água fervente durante aproximadamente 8 minutos. Adicionar 10 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro, continuando o aquecimento em banho-fervente por 10 minutos.

3. Separação de ácidos graxos:

Técnica: Transferir metade do conteúdo do tubo contendo sabões (obtido no ensaio 2, de saponificação) para outro tubo de ensaio. Verificar o pH desta solução mergulhando um bastão de vidro e testando com papel tornassol. Juntar a solução contida no tubo, HCl 1:2 gota a gota até pH ácido, observado pela mudança de cor no papel de tornassol. Verificar a separação da mistura em duas camadas, Deixar o tubo em banho-fervente até a fusão da camada superior. Conservar o tubo em banho fervente para ensaios posteriores e colocar também um outro tubo de ensaio contendo 5 mL de água destilada para aquecer neste banho fervente.

4. Propriedades dos sabões e ácidos graxos:

Técnica:a) Solubilidade dos sabões:

Ao tubo contendo a solução restante do sabão (obtido no ensaio 2 de saponificação), adicionar 5 mL da solução saturada de cloreto de sódio.

b) Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos:

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Com auxílio de uma pipeta de vidro transferir 3 gotas do óleo obtido no ensaio 3 (separação de ácidos graxos), para um tubo contendo cerca de 5 mL de água destilada quente (conforme experimento 3). Adicionar gotas de solução KOH 1M até a solubilidade da fase oleosa. Agitar suavemente o tubo e verificar a formação de espuma. Conservar esse tubo para ensaios posteriores. Não o despreze.

c) Formação de sabões insolúveis:

Dividir o tubo contendo os sabões obtidos no ensaio 4-b em duas partes, numerando os tubos 1 e 2. Dobrar visualmente o volume de cada tubo com adição de água destilada. Ao primeiro tubo adicionar 4 gotas de cloreto de cálcio a 5% e ao segundo adicionar 4 gotas de acetato de chumbo a 1%. Agitar os tubos.

d) Formação da acroleína:

Colocar em um tubo de ensaio uma “ponta de espátula” de bissulfato de potássio sólido e 5 gotas de óleo de soja. Aquecer cuidadosamente em chama direta, segurando o tubo com uma garra de madeira, até desprendimento de acroleína, detectável pelo odor característico.

e) Adição de iodo:

Colocar em 3 tubos de ensaio enumerados, respectivamente, 1 mL de óleo de canola, 1 mL de óleo de soja e 1 mL de óleo de girassol. Diluir o conteúdo de cada tubo com 2 mL de clorofórmio. Preparar um controle representado pelo tubo número 4, com 2 mL de clorofórmio. Adicionar 3 gotas de solução de iodo clorofórmica a 1% em cada tubo, agitar. Deixar em repouso na estante, SEM AGITAR OS TUBOS e acompanhar a descoloração das soluções , anotando o tempo inicial de descoloração para cada tubo.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Esteróides: Caracterização e dosagem do colesterol

a-Reação de Salkowski (qualitativa)

Tabela 01- Dados experimentais Reação de SalkowskiReativos ObservaçõesSolução clorofórmica de colesterol 1% + Ácido sulfúrico concentrado

Foi observado o desenvolvimento de uma coloração vermelha devida ao colesterol

b-Reação de Liebermann-Burchard (quantitativa)

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Tabela 02- Dados experimentais Reação de Lieberman-BurchardTubos 1 2 3 4 5 6Padrão de colesterol 0,2 % (mL) - 0,1 0,2 0,4 0,5 - Ácido acético glacial (mL) 0,5 0,4 0,3 0,1 - 0,4Amostra de soro (mL) - - - - - 0,5Reativo cromogênico (mL) 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0Absorbância 0,0 0.103 0,125 0,221 0.255 0.264

Gráfico da curva padrão de colesterol.

Cálculo dos Resultados

Camostra = CP x ΔA amostra (mg/mL) ΔApadrão

ΔAamostra/P = (Aamostra/P - Abranco)

Fator de conversão: C (mg/mL) x 0,022586 = C (mmol/mL)

Obs: Nossa amostra apresentou um valor aproximado de 186,5mg% de colesterol séricos totais.

4.2 Reação para lipídeos saponificáveis

1-Solubilidade

Tabela 03- Solubilidade dos lipídios em água e em solventes orgânicosTubos Solubilidade1 insolúvel2 pouco solúvel3 solúvel

Ordem de solubilidade: tubo 3 > tubo 2 > tubo 1

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A solubilidade foi maior no tubo 3, que continha 1 mL de éter e cinco gotas de óleo de soja, pois apesar do éter ser polar ele é menos polar que á agua devido aos grupos metila presentes nas extremidades de sua cadeia. Estes grupos permitem ao éter solvatar as moléculas de lipídeos. A solubilidade do tubo 2, que continha 1 mL de álcool etílico e cinco gotas de óleo, foi

menor, pois apesar do álcool ser polar sua solubilização é parcial, formando uma emulsão que é quando gotas de uma fase permanecem em suspensão na outra fase, devido as densidades das soluções serem bastante próximas.No tubo 1, que continha 1 mL de água destilada e cinco gotas de óleo de soja, não houve solubilização, pois a água que é bastante polar não interage com as moléculas de lipídeo, formando duas fases, uma de água e outra de óleo.

Comparação tubo 4 com tubo 5 (controle):

Ao transferirmos a solução etérea do tubo 3 a um outro tubo de ensaio (tubo 4) que continha 5 mL de água destilada observarmos a formação de uma interface água-éter. Por ser pouco polar o éter não se mistura com a água que é bastante polar, formando duas fases. Quando agitada, a mistura forma uma emulsão, pois o óleo contido na solução etérea se deposita na forma de pequenas gotículas sobre a água.

2- Saponificação

A reação de saponificação, realizada no experimento, consistiu da hidrólise alcalina das moléculas lipídicas, isto é, o processo de quebra das ligações éster existentes nas moléculas de triacilglicerol do óleo de soja vegetal, na presença de solução alcóolica de hidróxido de potássio 10 %, e mediante aquecimento (banho-maria), tendo como produtos sais de ácidos graxos e glicerol, conforme apresentado na equação química abaixo:

Triacilglicerol Potassa Glicerol Sabão alcoólica

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Inicialmente o líquido apresentou duas fases distintas, representando o óleo e o KOH. Com o passar do tempo, houve uma redução do volume de óleo, à medida que gotas deste iam dispersando-se sobre o KOH. Após o aquecimento, por 5 minutos, obteve-se por completa a

reação de hidrólise alcalina com a produção do sabão e do glicerol, que juntos formaram no tubo um sistema monofásico.Para conferir maior efetividade à reação, procedeu-se à agitação do tubo, uma vez que tal procedimento favorece o contato do triacilglicerol com a potassa alcóolica, permitindo a colisão de um número maior de moléculas de reagentes, e, portanto, uma maior concentração de produtos finais.

4.3 Separação de ácidos graxos

A adição de HCl a uma solução aquosa de sabão provoca a precipitação do ácido graxo, que é pouco solúvel em água e, em solução aquosa, tende a formar dímeros através de fortes ligações de hidrogênio, e, portanto a divisão da mistura em duas fases, sendo a fase sólida composta pelo ácido graxo. A equação química abaixo representa a reação:

4.4 Propriedades dos sabões e ácidos graxos

a- Solubilidade dos sabões

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O exemplo acima demonstra a formação de um sal de potássio. Os sabões constituídos por sais de potássio (K+) são solúveis. Em contrapartida, os sais de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+), formados a partir da reação do lipídeo com Ca(OH)2 e Mg(OH)2, respectivamente, são insolúveis e precipitam. A precipitação é muito útil no processo de purificação dos sabões e também pode ser feita por adição de NaCl(aq).

b- Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos

Estamos redissolvendo o precipitado que obtemos no item (a), após a adição da solução concentrada de cloreto de sódio houve a precipitação visto anteriormente (deslocamento do equilíbrio químico), ao acrescentar novamente a solução de hiroxido de potássio reestabelecemos o equilíbrio, e assim a dissolução “total” do sabão.

c- Formação de sabões insolúveis

Reações de sabões com cloreto de cálcio e acetato de chumbo formando

precipitados.

d- Formação de acroleína

Como a decomposição do óleo de soja gera glicerol, este reage com o bissulfato de

sódio formando a acroleína, que foi identificada pelo odor característico.

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e- Adição de Iodo

Pelo fato dos ácidos graxos insaturados nos triacilgliceróis terem ligações duplas, eles sofrem reações de adição típicas dos alquenos. A adição de iodo por exemplo, constitui-se em uma base para a determinação do grau de insaturação (quanto mais ligações duplas no ácido graxo, mais iodo pode ser adicionado), i.e., quanto maior o índice de iodo, mais insaturados são os ácidos graxos do lipídio.Portanto o óleo que possui mais ácidos graxos insaturados é o de soja, seguido pelo do canola e por fim o que é mais pobre em ácidos graxos insaturados é o óleo de girassol

5. Conclusão

Evidenciou-se que os lipídios são moléculas que, apesar de quimicamente diferentes entre si, tem a insolubilidade em água como característica comum; apresentando solubilidade em solventes apolares como, por exemplo, o éter. Através das reações foi possível compreender as propriedades físicas e químicas dos ácidos graxos e triacilgliceróis, bem como a formação de sabões e sua separação por adição de sais, analisando o aumento da saturação da solução e da tensão superficial do líquido. Portanto, sua compreensão é de fundamental importância para entender bioquimicamente os diversos processos que ocorrem na natureza.

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6. Referências Bibliográficas

CAMPBELL, M. K. Bioquímica. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2001.

NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: Princípios de Bioquímica. 4. ed. São Paulo:

Sarvier, 2006.

HIDRÓLISE- departamento de engenharia química. Disponível em: <http://www.dequi.eel.usp.br/~barcza/Hidrolise.pdf>. Acesso em: 23 maio 2012.

NELSON, L. N; COX, M. M. Lehninger princípios de bioquímica. 4.ed. São Paulo: SARVIER, 2006.

POLISSACARÍDEOS: Reação com o iodo. Disponível em <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/teste_amido.htm>. Acesso em: 23 maio 2012.

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