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Área de Produção Editorial e Gráfica
Núcleo de Comunicação
Secretaria de Vigilância em Saúde
23 e 24 de junho de 2010
Capacitação
em Eventos
CGLAB/SVS/MS
27 de outubro de 2011
REDE
LABORATORIAL
DE DENGUE
ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DA CGLAB
Coordenação-Geral
Coordenação de Administração e
Planejamento
GT Administração
GT Planejamento, Monitoramento e Avaliação
GT Infraestrutura, Insumos e Tecnologia de Equipamentos
Coordenação de Laboratórios de Vigilância
em Saúde Ambiental, Ecologia e Saúde do
Trabalhador
GT Saúde Ambiental
GT Saúde do Trabalhador
GT Entomologia e Reservatórios de Interesse
da Saúde
Coordenação de Laboratórios de Vigilância
Epidemiológica
GT Virologia
GT Bacteriologia
GT Parasitologia
GT Micologia e Outras Etiologias
Coordenação de Desenvolvimento
Institucional
GT Tecnologia da Informação
GT Ações Estratégicas e Projetos Especiais
GT Biossegurança e Gestão da Qualidade
Coordenação-Geral Adjunta
COMPETÊNCIA DA CGLAB
Coordenar, normalizar e supervisionar as sub-redes de
laboratórios pertencentes ao Sistema Nacional de
Laboratórios de Saúde Pública , nas atividades de
Vigilância Epidemiológica e Vigilância Ambiental.
Portaria Ministerial nº 15, de 03 de janeiro de 2002
Republicada como Portaria nº 2031 em 2004
Dispõe sobre a organização do Sistema Nacional de
Laboratórios de Saúde Pública - SISLAB
É composto de um conjunto de redes de
laboratórios, organizadas em sub-redes, por :
agravos ou programas
grau de complexidade das atividades, de forma hierarquizada;
atividades relacionadas à vigilância epidemiológica, vigilância
ambiental em saúde, vigilância sanitária e assistência médica.
SISLAB
DE VIGILÂNCIA
EPIDEMIOLÓGICA
DE VIGILÂNCIA
AMBIENTAL EM
SAÚDE
DE VIGILÂNCIA
SANITÁRIA
DE ASSISTÊNCIA
Laboratórios de Referência Nacional
Laboratórios de Referência Regional
Centros Colaboradores
Laboratórios de Referência Estadual
Laboratórios de Referência Municipal Laboratórios de Fronteiras
Laboratórios Locais
REDES NACIONAIS
Controlar a
qualidade das análises
nas sub- redes
de laboratórios
Realizar
procedimentos
diagnósticos de alta
complexidade
Desenvolver estudos
diagnósticos
e pesquisas
Disponibilizar ao MS
relatórios técnicos
periódicos
Participar na
elaboração
de manuais e normas
técnicas
Capacitar
recursos humanos
Participar de
cooperações
internacionais
Laboratório de
Referência Nacional
Controlar a
qualidade das análises
LACEN da sua região
Realizar
procedimentos
diagnósticos de maior
complexidade
Disponibilizar ao LRN
relatórios técnicos
periódicos
Assessorar, acompanhar
e avaliar as atividades dos
LACEN da sua região
Capacitar
recursos humanos
Laboratório de
Referência Regional
Encaminhar ao LRN,
amostras inconclusivas,
e as de complementação
de diagnósticos
•
Laboratório de Referência Nacional
INSTITUTO EVANDRO CHAGAS-IEC
Região Norte + Piauí + Maranhão •
Rede de Laboratórios de Dengue no Brasil
Laboratório de Referência Regional
LACEN/PE- Região Nordeste
Laboratório de Referência Regional
LACEN/DF - Região Centro – Oeste
Laboratório de Referência Regional
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ -FIOCRUZ/RJ
Região Sudeste + Bahia
Laboratório de Referência Regional
INSTITUTO ADOLFO LUTZ-IAL
Região Sul + São Paulo
Laboratórios Estaduais - LACEN
Controlar a
qualidade das análises
na rede
de laboratórios
Complementar
diagnóstico
Encaminhar
amostras ao LRR
Disponibilizar
Informações ao MS
por meio
relatórios
Habilitar
laboratórios para
integrar
a rede estadual
Capacitar
recursos humanos
Coordenar a
rede de laboratórios
públicos e privados
Laboratório Estadual
de
Saúde Pública
AM
RS
SC
PR
SP
PA
RR
RJ
AP
AC
RO
MT
MS
TO
MA
PI
CE RN
PE
GO
DF
BA
MG
ES
SE
AL
PB
Laboratório Central de Saúde Pública - LACEN
Rede de Laboratórios Estaduais
Supervisionar e
assessorar a rede
de laboratórios
Realizar análises
básicas
Encaminhar
amostras ao LACEN
Disponibilizar
Informações ao LACEN
por meio
relatórios
Habilitar
laboratórios para
integrar
a rede municipal
Capacitar
recursos humanos
Definir, organizar
e coordenar a rede
de laboratórios
Laboratórios de
Referência
Municipal
Colaborar no
desenvolvimento
científico e
tecnológico das
unidades da rede
Realizar
procedimentos
diagnósticos de alta
complexidade
Disponibilizar ao MS
relatórios técnicos
periódicos
Capacitar
recursos humanos
Centro Colaborador
Desenvolver estudos,
pesquisas e ensino de
interesse do gestor
nacional
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
LRN e CC:
Exames de alta complexidade
LRR:
Confirmação das amostras,
técnicas mais avançadas
LACEN:
Sorologia (27), Isolamento (19), RT-PCR (10)
Laboratórios Municipais:
Sorologia
Obs: As metodologias desenvolvidas em cada estado podem variar, conforme a condição técnica
instalada nos laboratórios.
Em caso de surto, 10 % das amostras devem ser processadas no laboratório, e o fechamento das
outras amostras será critério epidemiológico
SITUAÇÃO ATUAL DA REDE DE DENGUE
• 1 Laboratório de Referência (IEC/PA) e 5 Laboratórios de Referência
Regional (IAL/SP, FIOCRUZ/RJ, LACEN/DF, LACEN/PE e IEC/PA)
• 27 LACEN e 117 Laboratórios Municipais realizam sorologia para
dengue
• 17 LACEN e 2 Institutos realizam Isolamento Viral
(GO, MS, DF, CE, PE, BA, AL, MG, RJ, SP, TO, PR, RR, RN, AP, ES,
RO, IEC/PA e FIOCRUZ/RJ)
• 8 LACEN e 2 Institutos realizam RT-PCR
(CE, GO, PE, RS, RJ, DF, MG IAL/SP, IEC/PA e FIOCRUZ/RJ)
Área de Produção Editorial e Gráfica
Núcleo de Comunicação
Secretaria de Vigilância em Saúde
23 e 24 de junho de 2010
Capacitação
em Eventos
PRINCIPAIS
TÉCNICAS
LABORATORIAIS
PARA DENGUE
SOROTIPOS DE DENGUE ISOLADOS
POR UF, 2011
VIGILÂNCIA LABORATORIAL
* Dados atualizados até setembro 2011
Diagnóstico Sorológico Diagnóstico Virológico
UF Examinados Positivos % positividade Inoculados Positivos % positividade DEN 1 DEN 2 DEN 3 DEN 4
GO 13042 6628 50,8 1701 313 18,4 302 10 1 0
DF 4089 1512 37,0 271 92 33,9 89 2 1 0
MS 8135 3400 41,8 496 62 12,5 60 2 0 0
MT 1717 313 18,2 90 4 4,4 3 1 0 0
RS 2372 600 25,3 125 53 42,4 50 1 0 2
PR 39467 17375 44,0 499 243 48,7 228 12 0 3
SC 783 133 17,0 4 1 25,0 1 0 0 0
SP 73907 36496 49,4 3161 1707 54,0 1623 46 7 31
RJ-FIOCRUZ 288 126 43,8 1031 363 35,2 264 85 0 14
RJ 12540 7049 56,2 762 188 24,7 172 16 0 0
MG 30621 12893 42,1 847 85 10,0 77 5 1 2
ES 24324 15826 65,1 1118 582 52,1 511 63 8 0
AC 5035 2065 41,0 125 45 36,0 44 0 1 0
AP 1330 566 42,6 1 0 0,0 0 0 0 0
AM 7316 4336 59,3 349 128 36,7 31 53 0 44
PA 8561 3346 39,1 588 110 18,7 70 29 0 11
RO 1915 731 38,2 103 3 2,9 2 1 0 0
RR 1.120 298 26,6 56 7 12,5 2 3 0 2
TO 6856 3152 46,0 243 26 10,7 16 10 0 0
AL 966 366 37,9 81 6 7,4 6 0 0 0
BA 39063 17708 45,3 2534 786 31,0 595 86 3 102
CE 34097 18656 54,7 1149 290 25,2 283 1 4 2
MA 3678 1802 49,0 198 29 14,6 24 2 0 3
PB 6136 3895 63,5 183 9 4,9 6 1 1 0
PE 7179 4646 64,7 1225 58 4,7 31 21 4 2
PI 3564 1830 51,3 394 68 17,3 63 1 0 4
RN 5992 3919 65,4 647 240 37,1 184 48 0 8
SE 2963 1388 46,8 8 4 50,0 4 0 0 0
TOTAL 347056 171055 49,3 17989 5502 30,6 4741 499 31 230
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Pesquisa de Vírus
Isolamento: Cultura de células C6/36 ou Inoculação em
camundongos recem-nascidos.
Detecção de ácido nucléico: RT-PCR
Pesquisa de Anticorpos
Ensaio imunoenzimático: MAC-ELISA, Elisa IgG, Elisa IgM
Inibição da hemaglutinação (IH)
Kits Comerciais
Exame Histopatológico e Detecção de Antígeno por Imunohistoquímica
ISOLAMENTO VIRAL
É a técnica padrão ouro (gold standard) para diagnóstico virológico.
Permite a identificação do sorotipo viral (DEN 1, DEN 2, DEN 3 e DEN 4).
A replicação do vírus é evidenciada pela produção de efeito citopático, ou
seja, alterações na morfologia celular.
A técnica possui grande sensibilidade (capaz de detectar quantidades
mínimas do vírus).
A coleta do material deve ser feita na fase aguda da doença ou seja no
período de viremia.
ISOLAMENTO VIRAL EM CULTURA DE
CÉLULAS C6/36
A – Sangue, soro (fase aguda) B – suspensão de tecido (óbito)
A B
Imunofluorescência direta
(A) células não inoculadas
(B) células infectadas - VFA
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
TRANSCRIPTASE REVERSA (RT-PCR)
• É uma técnica de biologia molecular altamente específica e
sensível.
• Permite a detecção e a amplificação gênica sequencial de
fragmentos de DNA do vírus. .
Identifica os sorotipos virais da dengue.
REVERSE TRANSCRIPTASE - POLIMERASE
CHAIN REACTION (RT-PCR)
IDENTIFICAÇÃO
1
2
3
4
5
6
7
8 VISUALIZAÇÃO
1 - Negativo
2 - Dengue 1
3 - Dengue 2
4 - Dengue 3
5 - Dengue 4
6 - Negativo
7 - Água
8 - Peso molecular
Fonte: Lanciotti et al., 1991
FATORES QUE INTERFEREM NO SUCESSO DAS
TÉCNICAS DE ISOLAMENTO VIRAL E RT-PCR
Coleta do material feita fora do período de viremia.
Manipulação inadequada da amostra (contaminação).
Termolabilidade do vírus
Armazenamento fora das condições ideais.
Longo período de transporte da amostra até o LACEN
Ausência de informações importantes para o direcionamento da técnica a
ser executada: data de início dos sintomas; data da coleta
KITS COMERCIAIS
1. KIT ELISA IGM
- Ensaio imunoenzimático
- Amostras de soro coletadas após o 5º dia de início dos
sintomas
2. KIT ELISA NS1
- Ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa do
antígeno NS1
- Amostras de soro até o 3º dia de início dos sintomas
- Triagem para o isolamento viral
MAC - ELISA
Considerada técnica padrão-ouro para captura de Anticorpos IgM
Anticorpos IgM são capturados do soro do paciente para a parede
dos poços da placa por um anticorpo “anti IgM humana”
O anticorpo IgM capturado é colocado para reagir com antígeno do
VDEN.
Se a IgM investigada estiver presente, o respectivo antígeno se liga
à mesma. A presença do complexo antígeno-anticorpo é
demonstrado pelo sistema revelador do teste (conjugado e
substrato)
Permite realizar o diagnóstico presuntivo de infecções recente ou
ativa
MAC ELISA
Anti-IgM humana IgM humana (soro do paciente) Antígeno
Conjugado ( peroxidase)
Substrato (Sistema ABTS)
Microplaca para teste de ELISA
FATORES QUE INTERFEREM NO SUCESSO
DA TÉCNICA DE MAC ELISA
Coleta do material feita no período de viremia ocasionando
resultados falso-negativos.
Em caso de infecção secundária o sistema imune do paciente
responde com uma quantidade de IgM muitas vezes indetectável.
Manipulação inadequada da amostra(contaminação).
Armazenamento fora das condições idéias (desnaturação de
proteínas).
Sensibilidade e Especificidade do kit.
SENSIBILIDADE DA TÉCNICA DE
ISOLAMENTO/SOROLOGIA
ELISA
Isolamento
Dias pós-infecção
0 2 4 6 8 10
INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO
É utilizado em infecções secundárias, onde a produção do IgM ocorre
em níveis baixos.
É um teste simples e rápido e pode ser utlizado para qualquer vírus
que cause hemaglutinação.
A técnica é baseada na capacidade que as proteínas (hemaglutininas)
existentes na superfície do DENV, tem de aglutinar hemácias de
ganso e humanas do grupo O. A presença de anticorpos específicos
na amostras de soro do paciente irá inibir a capacidade
hemaglutinante do vírus.
O teste deve ser realizado em amostras pareadas
O soro teste é incubado em diferentes diluições contra uma
quantidade fixa de vírus.
INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO
INIBIÇÃO DA
HEMAGLUTINAÇÃO HEMAGLUTINAÇÃO
Anticorpos anti-VDEN
Anticorpo não específico
Antígeno do VDEN
Hemácias de Ganso
IMUNOHISTOQUÍMICA
O objetivo principal é o encontro e localização
topográfica de antígenos nos tecidos ou
células.
Tem sua maior aplicação no estudo de
doenças infecciosas e neoplásicas.
CONCEITO
CONCEITO CONCEITO
CONCEITO
Paciente com Suspeita de Dengue
Coletar amostra
Sangue Total/Soro
Isolamento -Pesquisa do
vírus
Sangue Total/Soro
Sorologia –Pesquisa de
Anticorpos
Positivo IgM Negativo IgM
Descartado Confirmado por Lab.
A partir do 5º dia
1º ao 5º dia de doença
Conservar a –70ºC
Conservar a –20ºC
COLETA DE AMOSTRAS
CONCEITO COLETA, CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE
DE AMOSTRAS PARA PESQUISA DE VÍRUS
Espécime/Coleta
Tipo de
Análise
Sangue* (soro)/
até 5 dias após o início dos sintomas
Conservação/ Transporte
Isolamento viral
PCR
Tecidos (óbito)/
Ideal: 8 hs Máximo: 24 hs
-70 °C/ Gelo seco
-70 °C/ Gelo seco
Isolamento viral
PCR
* Retração do coágulo: 2 - 6 horas a 4° C.
COLETA, CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE DE
AMOSTRAS PARA PESQUISA DE ANTICORPOS
Espécime/Coleta
Tipo de Análise
Sangue* (soro)/ > 5 dias após o
início dos sintomas
Conservação/ Transporte
Detecção de
anticorpos IgM
(MAC-ELISA)
-20° C/ Gelo seco ou comum
* Retração do coagulo: 2 - 24 horas à temperatura ambiente.
Sangue* (soro)/
1ª amostra: até 7 dias
2ª amostra: 14° - 30° dias
(após o início dos sintomas)
Detecção de
anticorpos IgG
(IH, ELISA)
-20° C/ Gelo seco ou comum
EXAME HISTOPATOLÓGICO
Espécime/
Coleta
Tipo de
Análise Conservação/
Transporte
Tecidos (óbito)
Ideal: 8 hs Máximo: 24 hs
Histopatologia
Imunohistoquimica
Temperatura ambiente/
Formalina tamponada
FLUXO DE ENVIO DA AMOSTRA
FLUXO DE ENVIO DE INFORMAÇÕES
CGLAB Programa
Laboratórios de Referência Nacional
Vig. Epidemiológica Municipal
Laboratório de Referência Regional
Laboratório de Referência Estadual -
LACEN
Laboratório de Referência Municipal
Unidade Básica/Laboratório
Local/Unidades Hospitalares
Vig. Epidemiológica Estadual
Vigilância em
Saúde
Assistência em
Saúde
Ações em Saúde
Laboratório de
Saúde Pública
