ii

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROTEÇÃO CONTRA A PERDA ÓSSEA INDUZIDA PELO DIABETES TIPO 1

ATRAVÉS DA SUPLEMENTAÇÃO COM ZINCO: ANÁLISES BIOMECÂNICA,

HISTOMORFOMÉTRICA E MOLECULAR EM RATOS DIABÉTICOS

INDUZIDOS POR STZ.

RAUL HERNANDES BORTOLIN

NATAL/RN

2015

iii

RAUL HERNANDES BORTOLIN

Proteção contra a perda óssea induzida pelo diabetes tipo 1 através da

suplementação com zinco: Análises biomecânica, histomorfométrica e

molecular em ratos diabéticos induzidos por STZ.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção

do título de Doutor em Ciências da Saúde

Orientadora: Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende

Co-orientadora: Profa. Dra. Luciana Augusto de Rezende

NATAL/RN

2015

ii

iii

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:

Prof. Dr. Eryvaldo Socrates Tabosa do Egito

iv

RAUL HERNANDES BORTOLIN

PROTEÇÃO CONTRA A PERDA ÓSSEA INDUZIDA PELO DIABETES TIPO 1

ATRAVÉS DA SUPLEMENTAÇÃO COM ZINCO: ANÁLISES BIOMECÂNICA,

HISTOMORFOMÉTRICA E MOLECULAR EM RATOS DIABÉTICOS

INDUZIDOS POR STZ.

Aprovada em 06/02/2015

Banca examinadora:

Presidente da Banca: Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende

Membros da Banca: Profa. Dra. Naisandra Bezerra da Silva

Prof. Dr. Danilo Alves Pinto Nagem

Prof. Dr. Francisco Jose Albuquerque de Paula

Prof. Dr. João Pizauro Júnior

v

DEDICATORIA

A Deus, que em sua infinita bondade me deu a vida e uma família maravilhosa.

Somente Nele por muitas vezes encontrei forças para vencer os desafios dessa

jornada.

Aos meus pais Ricardo e Eliete, a meus irmãos Ruan, Antonio e Pedro, a

minha madastra Livia e a minha namorada Renta, pelo amor incondicional,

pela presença em todos os momentos da minha vida, que mesmo em todos

meus estresses, decepções e vitorias, sempre se fizeram presentes e

essenciais. Amo vocês!!!

vi

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende, que ao longo destes 6 anos

de convivência tanto me ajudou, me orientando de tanto no âmbito profissional

quando pessoal e sempre abrindo caminhos para a realização deste e de outros

trabalhos. Ressaltando sua contribuição, integral e de forma única, para me

tornar um grande e vitorioso profissional.

À Profa. Dra. Luciana Augusto de Rezende por dar todo apoio do e

incentivo desde o primeiro momento em que estive em sua presença. Agradeço

também pelas portas na qual sempre abriu, e dentre elas a mais importante que

foi minha indicação, apoio e dedicação na pós graduação.

À Profa. Dra. Maria das Graças Almeida pela disponibilidade e

ensinamentos, contribuindo para a minha formação profissional.

Ao Prof. Dr. Bento Abreu, pela contribuição fundamental para a

realização deste trabalho e pelo amizade e conselhos sempre colocados em

momentos importantes. Obrigado meu amigo.

Ao Prof. Dr. André Ducati Luchessi, pela amizade e ensinamentos, sou

muito grato a você meu amigo, sempre apoiando e ensinando com um único

objetivo, meu crescimento e amadurecimento profissional e pessoal.

Ao meus dois grandes amigos Joao Felipe Bezerra e Francisco Paulo

Freire Neto, amigos para todos os momentos, presentes nas dificuldades e nas

alegrias. Devo muito desse sucesso a vocês meus amigos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde pela

contribuição na minha formação profissional.

À ao CNPq pelo apoio financeiro para a realização deste estudo.

Aos professores e alunos do departamento de Morfologia que me muito

auxiliaram na realização deste trabalho, tanto em ensinamento, quanto em

disponibilidade em ajudar nas metodologias propostas nos estudos, Flávio,

Dafiny, Romulo e Anderson.

À família LABMULT, meus amigos e companheiros de pesquisa, Ciele,

Felipe, Gustavo, Heglayne, João Felipe, Karla, Melina, Thamara, Thaynnan,

Vinícius e Yonara.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho.

vii

RESUMO

Diversos estudos tem estabelecido a associação entre diabetes e alterações no

metabolismo do osso; no entanto, os mecanismos subjacentes não são

totalmente elucidados. Embora o zinco seja reconhecido como um potencial

agente na prevenção contra a perda óssea induzida pelo diabetes, não há

evidência mostrando este efeito em condições crónicas da doença. Assim o

presente estudo avaliou os efeitos da suplementação com zinco em modelo

crônico de diabetes tipo 1 associado a perda óssea por 90 dias. Foram utilizados

ratos Wistar machos, igualmente distribuídos em três grupos (n=15): grupo

controle; grupo Diabetes mellitus tipo 1 (TDM1); e grupo T1DM suplementado

com zinco (T1DMS). Após o período de 90 dias de estudo, foram analisados:

parâmetros bioquímicos sérico, análises biomecânicas, histomorfométricas e

conteúdo de colágeno nas tíbias, bem como avaliação da expressão genica de

RNAm no fêmures dos animais. Em relação ao controle, TDM1 mostrou uma

perda óssea através de: diminuição de parâmetros histomorfométricos, como

espessura e área do osso trabecular, bem como aumento da separação do osso

trabecular; diminuição de parâmetros biomecânicos representados pela carga

máxima, rigidez, máxima deformação em flexão e módulo de elasticidade; e

diminuição do conteúdo de colágeno tipo 1. Além disso, uma expressão genica

aumentada dos genes: osteoprotegerina (OPG), colágeno tipo 1 (COL1A), e

metaloproteinase do tipo 9 (MMP9) foram observadas em TDM1. Estes

resultados representam uma menor resistência e flexibilidade óssea associada

ao TDM1. A suplementação com zinco mostrou um efeito protetor significativo

contra a perda óssea, uma vez que, valores semelhantes foram observados para

os parâmetros histomorfométricos e biomecânicos entre os grupos T1DMS e

controle. O zinco também apresentou uma manutenção nos valores de

expressão genica dos genes estudados, quando comparado com TDM1.

Adicionalmente, os efeitos anabólicos do zinco foram evidenciados através do

aumento da expressão genica da osteocalcina (OC) e atividade da fosfatase

alcalina sérica, ambos relacionados com osteoblastogênese, demonstrando,

assim, uma efeito positivo na formação óssea. Em conclusão, o zinco mostrou

um efeito positivo sobre a manutenção da arquitetura óssea e parâmetros

biomecânicos. Em relação aos parâmetros moleculares, a suplementação

mostrou um importante efeito anabólico através do aumento na expressão da

viii

OC, e um efeito protetor evidenciado pelo controle na expressão dos genes

OPG, COL1A, e MMP9 em condições crônicas de hiperglicemia. Os resultados

sugerem ainda que o zinco pode representar uma terapia adjuvante na perda

óssea associada ao Diabetes mellitus tipo 1 em condições crônicas.

Palavras chaves: Diabetes mellitus tipo 1 crônico; modelo animal; perda óssea;

suplementação com zinco; biomecânica óssea; histomorfometria óssea,

expressão genica do RNAm dos genes MMP9, COL1A, OPG e OC.

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

18S – Gene que codifica o RNA ribossomal 18S

ADA – American Diabetes Association

AGEs – Advanced Glycation End-products

ALP – Fosfatase Alcalina

Ca++ – Íon cálcio

CB/UFRN – Centro de Biociências da UFRN.

CCS/UFRN – Centro de Ciências da Saúde da UFRN

cDNA – DNA complementar

CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CNS – Conselho Nacional de Saúde

COL1A – Gene que codifica a proteína COL1A

COL1A – Colágeno do tipo 1

Ct – Ciclo threshold

DEPC – Diethyl dicarbonate

DKK1 – Gene que codifica a proteína dickkopf 1

DM – Diabetes mellitus

DM1 – Diabetes tipo 1

DM2 – Diabetes tipo 2

DMO – Densidade mineral óssea

DNA – Ácido desoxirribonucleico

DP – Desvio padrão

DXA – Dual-energy X-ray Absorptiometry

x

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

ALP – Enzima fosfatase alcalina

GAPDH – Gene que codifica a proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GSK-3β – Protein Glycogen Synthase Kinase 3

IGF-1 – Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

IGF1 – Gene que codifica o Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

LABIOMOL/UFRN – Laboratório de Biologia Molecular da UFRN

LABMULT/UFRN – Laboratório Multidisciplinar da UFRN

MOPS – Ácido 3-Morfolinopropanosulfônico

MMP9 – Gene que codifica a proteína Metaloproteinase 9

MMP9 – Metaloproteinase 9

MMP2 – Gene que codifica a proteína Metaloproteinase 2

MMP2 – Metaloproteinase 2

NCBI – National Center for Biotechnology Information

NOD - Camundongos não-obesos diabéticos

OPG – Gene que codifica a proteína osteoprotegerina

OPG – Proteína osteoprotegerina

OC – Osteocalcina

OC – Gene que codifica a proteína Osteocalcina

PCR – Reação em cadeia da polimerase

PPgCF/UFRN – Programa de pós-graduação em ciências farmacêuticas da

UFRN

RANK – Gene que codifica a proteína RANK

xi

RANK – Receptor Ativador do fator nuclear kappa B

RANKL – Gene que codifica a proteína RANKL

RANKL – Receptor Ativador do fator nuclear kappa B Ligante

RNA – Ácido ribonucleico

RNAm – RNA mensageiro

STZ – Estreptozotocina

T1DM – Diabetes mellitus tipo 1 (induzido por estreptozotocina)

T1DMS – Diabetes mellitus tipo 1 suplementado com zinco

TGFB1 – Gene que codifica o Fator de transformação do crescimento beta 1

TGF-β1 – Fator de transformação do crescimento beta 1

TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa

UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte

VIGITEL – Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas

por Inquérito Telefônico

Wnt – Wingless-ints

xii

SUMÁRIO

1.0 INTRODUÇÃO ______________________________________________ 13

1.1 Diabetes mellitus e metabolismo ósseo ................................................. 13

1.2 Metabolismo ósseo e Suplementação .................................................... 16

2.0 JUSTIFICATIVA ____________________________________________ 18

3.0 OBJETIVOS _______________________________________________ 19

3.1 Objetivo ..................................................................................................... 19

3.2 Objetivos específicos ............................................................................... 19

4.0 METODOLOGIA ____________________________________________ 20

4.1 Aspectos éticos e biossegurança ........................................................... 20

4.2 Animais ..................................................................................................... 20

4.2.1 Formulação da Ração ........................................................................... 21

4.2.2 Indução do Diabetes mellitus ............................................................... 22

4.3 Amostras biológicas ................................................................................ 22

4.3.1 Sacrifício ................................................................................................ 22

4.3.2 Dosagens bioquímicas ......................................................................... 23

4.3.3 Análise Histomorfométrica ................................................................... 23

4.3.4 Análise do conteúdo de colágeno ....................................................... 24

4.3.5 Análise biomecânica ............................................................................. 25

4.4 Estudo da expressão gênica ................................................................... 25

4.4.1 Extração e quantificação do RNA total dos fêmures dos animais .... 25

4.4.2 Análise da expressão de RNAm por PCR em tempo real .................. 26

4.5 Análise estatística .................................................................................... 28

5.0 ARTIGOS PRODUZIDOS ____________________________________ 29

6.0 COMENTÁRIO, CRITICA OU SUGESTÃO _______________________ 30

REFERÊNCIAS _______________________________________________ 79

ANEXOS _____________________________________________________ 85

13

1.0 INTRODUÇÃO

1.1 Diabetes mellitus e metabolismo ósseo

O Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica crônica, que está

afetando a população de forma crescente, tornando-se um sério problema de

Saúde Pública. Sua incidência e prevalência vêm aumentando em todos os

países, alcançando proporções epidêmicas. (1,2).

Estimativas realizadas no ano de 2010 indicaram que 285 milhões de

pessoas em todo o mundo foram diagnosticados com DM, atingindo

principalmente grupos etários mais jovens (3,4). Além disso, o crescimento

vegetativo, a urbanização e os crescentes casos de obesidade e sedentarismo

são fatores que podem contribuir a um provável aumento de 54% no número de

pessoas com DM em 2030 (2,4,5). Pesquisa recentemente realizada em todas

as 26 capitais brasileiras e no Distrito Federal, verificou que a capital com maior

número de pessoas que relatam diagnóstico de diabetes foi Fortaleza, com 7,3%

de casos, enquanto em Natal esse número foi de 5,8% (6).

O DM é definido como um grupo de alterações metabólicas, caracterizado

por hiperglicemia crônica resultante de defeitos na secreção e/ou ação da

insulina. O DM é classificada em quatro categorias clínicas: diabetes tipo 1

(DM1), decorrente da destruição das células beta pancreáticas, que acarreta a

deficiência absoluta de insulina; diabetes tipo 2 (DM2), caracterizado por um

defeito progressivo na secreção de insulina; outros tipos específicos de diabetes,

promovidos por defeitos genéticos nas células beta pancreáticas, no gene da

insulina e devido à doenças do pâncreas exócrino e induzido por substâncias

químicas ou medicamentos (como por exemplo, medicamentos utilizados no

tratamento do vírus da imunodeficiência humana (HIV, do inglês Human

Immunodeficiency Virus); e diabetes gestacional, diagnosticado durante a

gravidez (1).

A exposição prolongada às altas concentrações de glicose decorrente

do diabetes provoca efeitos cumulativos afetando a função de vários tecidos e

órgãos. As principais complicações do diabetes incluem retinopatia, neuropatia

14

periférica, neuropatia autônoma, doenças cardiovasculares e osteopenia com

progressão a osteoporose (7–9).

A perda óssea em pacientes portadores de DMT1 foi identificada na

década de 90. Aproximadamente 50% destes pacientes desenvolviam perda

óssea quando comparados com sujeitos de mesma idade, sendo, portanto

considerada como uma complicação importante do diabetes(10). Estudos

envolvendo pacientes pediátricos com DM1, identificaram o controle glicêmico

não satisfatório associado ao tempo de doença e ao hipoinsulinismo como

fatores importantes associados às complicações precoces evidenciadas nos

pacientes, entre elas a manifestação de osteopenia e provável redução do pico

máximo de massa óssea (11,12).

Objetivando o melhor entendimento da fisiopatologia e suas

complicações, modelos animais vêm sendo propostos para comprovar o papel

da hiperglicemia diabética e a regulação da formação óssea durante a evolução

da doença, dando suporte ao risco de desenvolvimento de osteopatia diabética

(7,13–16). Existem uma grande variedade de modelos animais que desenvolvem

DMT1, ou de forma espontânea, como os camundongos não-obesos diabéticos

(NOD) ou modelos induzidos farmacologicamente por aloxana e

estreptozotocina (STZ). Nesses modelos, a análise da histologia óssea,

biomecânica, molecular e marcadores bioquímicos de formação e reabsorção

óssea têm demonstrado uma diminuição da atividade osteoblástica associada

com atividade normal ou diminuída dos osteoclastos, além de uma diminuição

na força óssea quando comparada com grupos controles, e uma diminuição do

conteúdo mineral ósseo femoral e área mineral óssea nos animais diabéticos

(7,13,15,17–20).

A regulação da massa óssea é um processo dinâmico e ativo mediado

por osteoblastos e osteoclastos. Os osteoblastos são responsáveis pela

formação óssea secretando a maioria das proteínas da matriz extracelular do

osso e também expressando genes necessários para mineralização desta

matriz. Além disso, os osteoblastos possuem um importante papel na

diferenciação dos osteoclastos, que por sua vez são responsáveis pela

reabsorção óssea (21).

Na avaliação do metabolismo ósseo associado ao diabetes, os

marcadores de formação óssea avaliam tanto a atividade de síntese de

15

osteoblastos como o metabolismo de liberação do pró-colágeno. Já os

marcadores de reabsorção óssea refletem a atividade osteoclástica e/ou a

degradação do colágeno. Para a avaliação da remodelação, sugere-se associar

um marcador de formação e reabsorção de acordo com as características do

paciente e dos ensaios disponíveis (22,23).

Em relação ao colágeno, sua formação é afetada pelo aumento de

marcadores como as metaloproteinases (MMPs) em condições diabéticas,

especialmente a MMP9, na qual é considerada um fator diabetogenico e

hiperexpresso no diabetes tipo 1, contribuindo assim para a degradação do

colágeno e resultando em baixo conteúdo de colágeno ósseo e diminuída

integridade biomecânica (24–27).

Dentre os marcadores clássicos utilizados na avaliação da formação

óssea pode se destacar a fosfatase alcalina (ALP) e a OC. A ALP tem sido

utilizada por ser um importante marcador sérico e tecidual associado a atividade

dos osteoblastos e formação óssea. Além disso, ela é necessária na

mineralização e desenvolvimento das estruturas do colágeno (28). Em relação a

OC, tem sida avaliada tanto quanto sua forma circulante quanto na forma

expressa e, é empregada como marcador de formação óssea, uma vez que é

primariamente expresso na proliferação osteoblastica e pelos osteoblastos

diferenciados e ativos (29–32) regulando a mineralização da matriz extra celular

(33–35).

Adicionalmente ao marcadores clássicos, recentes avanços relacionados

à ativação e diferenciação dos osteoclastos têm sido originados de análises de

uma família de fatores de necrose tumoral (TNF) biologicamente relacionados,

no qual juntos regulam a função dos osteoclastos. Essa família de fatores inclui

o sistema RANK/RANKL/OPG (receptor ativador NF-κB/receptor ativador de NF-

κB ligante/ osteoprotegerina) os quais tem sido reconhecido a estarem também

envolvidos no surgimento de alterações ósseas as quais são caracterizadas pelo

aumento da diferenciação e ativação dos osteoclastos, com consequente

aumento da reabsorção óssea (ANEXO 1) (36–39).

Na última década, os marcadores moleculares tem ganhado importância

clínica nos estudos das doenças, como por exemplo em modelos animais

diabéticos, visando o melhor entendimento dos possíveis mecanismos

envolvidos em complicações diabéticas. Nesse sentido, a análise molecular

16

associada a parâmetros não moleculares podem auxiliar na busca da elucidação

das causas envolvidas na osteopenia diabética tanto em humanos como em

modelo animal.

1.2 Metabolismo ósseo e Suplementação

O osso é um órgão com funções estruturais como suporte e proteção,

bem como reservatório para minerais essenciais como cálcio e fósforo, que são

importantes para inúmeros sistemas corpóreos (23). Está bem estabelecido na

literatura que uma ingestão adequada de cálcio é necessária para o

desenvolvimento e a manutenção do tecido ósseo (40–42).

Evidências mostram que as mudanças que ocorrem no metabolismo de

alguns nutrientes no DM podem ter uma função na patogênese e complicações

desta doença (43). Neste sentido, tem sido relatado que a excreção urinária de

cálcio, fósforo e zinco estão aumentados em pacientes diabéticos, causando

uma diminuição dos níveis sanguíneos destes elementos, comprometendo o

metabolismo ósseo e suas defesas antioxidantes (43,44).

Em relação ao zinco, o diabetes provoca alterações na homeostase do

zinco e consequentemente hipozincemia sérica, resultado provavelmente da

hiperzincúria e/ou diminuição da absorção gastrointestinal do zinco (8,44,45).

O zinco, elemento-traço essencial envolvido em diversas vias de

sinalização metabólicas e celulares, está envolvido na modulação da expressão

de genes para proteínas e fatores de transcrição, tendo como papel vital a

promoção do crescimento esquelético e formação óssea, e controversamente,

sua deficiência retarda o crescimento esquelético (46).

Além disso, a suplementação com zinco tem sido utilizada pelo seu efeito

terapêutico e preventivo na perda óssea através da estimulação dos

osteoblastos e inibição dos osteoclastos (45,47).

Estudos relacionados ao metabolismo mineral e ósseo frente a uma

suplementação com zinco revelaram uma ação anabólica através da proliferação

e diferenciação osteoblástica. Os mecanismos moleculares sugeridos para a

ação do zinco (ANEXO 2) envolvem a estimulação da expressão gênica de

várias proteínas, bem como o aumento da atividade da aminoacil-RNAt sintetase

17

nos osteoblastos, a qual está envolvida no primeiro passo da biossíntese

protéica. Entre as proteínas estão o Runx2/Cbfa1 (centro de ligação do fator alfa-

1), colágeno tipo 1, IGF-I, TGF-β1, ALP e OC (45,48–50).

Além da ação anabólica o zinco segundo Yamaguchi (2012) (50)

apresenta uma ação inibitória na osteoclastogênese, que seria induzida pelo

RANKL de forma direta e/ou indireta. A ação direta do zinco no controle da

osteoclatogenese foi sugerida como sendo ou através da inibição de pré-

osteoclastos, não ocorrendo assim à diferenciação dos mesmos, ou que poderia

atuar indiretamente através do aumento da formação de OPG, que inibe a

ligação do RANKL com seu receptor (ANEXO 3).

Assim, o estudo de marcadores moleculares, como a expressão do

mRNA dos genes do sistema RANK/ RANKL/ OPG, bem como dos genes OC,

COL1A, MMP9 e MMP2 nos fêmures dos animais, associados a marcadores

bioquímicos, medidas histomorfométricas, analise do conteúdo de colágeno e

testes biomecânicos das tíbias dos animais, em modelo crônico de osteopenia

diabético induzida por STZ suplementado com zinco poderá contribuir no avanço

da elucidação dos mecanismos envolvidos na perda de massa óssea associados

ao Diabetes mellitus e a busca de um novo agente de terapia adjuvante no

controle da complicação osteopenia.

18

2.0 JUSTIFICATIVA

O DM é uma doença crônica metabólica que atinge cerca de 200 milhões

de pessoas em todo mundo, sendo o DM1 responsável por cerca de 10% dessas

pessoas. Devido a prolongada exposição a altas concentrações de glicose, o

DM1 é comumente associado a diversas complicações em diferentes órgãos e

tecidos, muitas vezes comprometendo a qualidade de vida das pessoas

acometidas.

Dentre as complicações, a perda óssea tem mostrado uma alta incidência

e apesar dos avanços científicos até o momento, os possíveis mecanismos

envolvidos no desencadeamento da complicação não estão bem esclarecido.

Adicionalmente, como alternativa para o melhor esclarecimento sobre os

mecanismos envolvidos tanto na patologia quanto nas complicações associadas,

o uso de modelos animal vem contribuindo de forma efetiva, uma vez que

possibilita a utilização de tecido ósseo em análises moleculares de genes

envolvidos na reabsorção (ex.: MMP-2 e 9 o sistema RANK/RANKL/OPG), bem

como os genes envolvidos no processo de formação (Ex.: COL1A, OC), que em

associação com parâmetros biomecânicos e histomorfométricos representam

uma importante alternativa na busca do melhor entendimento das complicações

associadas ao DM1.

Apesar de a terapia insulínica representar a principal forma de controle

glicêmico, ampla literatura tem mostrado, que os pacientes diabéticos não

apresentarem um controle glicêmico satisfatório em cerca de 50% dos casos,

sendo observados os aparecimentos das complicações de forma precoce.

Assim, o uso de zinco, um importante agente anabólico e protetor contra a perda

óssea excessiva, pode representar uma importante alternativa de terapia

adjuvante na perda óssea associada ao DM1. O presente estudo apresenta

como contribuições o efeito de uma suplementação com zinco como agente

protetor contra a perda óssea associada ao DM1 em condições crônicas de

doença e seu possível uso como alternativa terapêutica. A priori este é o primeiro

estudo demostrando o efeito do zinco, através de parâmetros moleculares e não

moleculares em modelo animal de diabetes crônico (90 dias) induzido por STZ.

19

3.0 OBJETIVOS

3.1 Objetivo

O presente estudo tem por objetivo avaliar o efeito de uma

suplementação com zinco na perda óssea associada ao DM1 em modelo animal

induzido por STZ em condições crônicas de doença através da análise de

marcadores bioquímicos, histomorfométricos, biomecânicos e moleculares.

3.2 Objetivos específicos

Realizar dosagens séricas de glicose, concentração de zinco e atividade da

fosfatase alcalina total (ALP) em todos os grupos de animais.

Realizar medidas histomorfométricas (distancia, espessura e volume do osso

trabecular) nas tíbias dos grupos de animais utilizando o método de de coloração

por hematoxilina-eosina.

Realizar a quantificação do conteúdo de colágeno nas tíbias dos grupos de

animais utilizando o método de coloração por Picrosirius.

Realizar testes biomecânicos nas tíbias dos grupos de animais estudados

através do teste biomecânico de flexão de três pontos

Analisar a expressão do mRNA dos genes RANKL,OPG, MMP2, MMP9, OC e

COL1A nos fêmures dos grupos de animais.

Correlacionar os parâmetros bioquímicos, histomorfométricos, biomecânicos e

moleculares com o desenvolvimento da perda óssea associada ao DM1, bem

como o efeito da suplementação com zinco no metabolismo mineral e ósseo.

20

4.0 METODOLOGIA

4.1 Aspectos éticos e biossegurança

Os animais foram tratados e manipulados seguindo as recomendações

da comissão de ética no uso de animais, obedecendo aos preceitos da lei

11.794/2008 e ainda da resolução nº 879/2008. O projeto foi aprovado pela

Comissão de Ética de Uso de Animais – CEUA/UFRN, registrado sob número

023/2009 (ANEXO 4) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNAERP,

registrado sob o número 066/09 (ANEXO 5).

O estudo foi realizado através de um convênio entre a Universidade

Federal do Rio Grande do norte com a Universidade de Ribeirão Preto.

Os resíduos gerados durante os procedimentos foram descartados

segundo recomendações da ANVISA (RDC 33/2003), sendo o material

encaminhado para autoclavação e posteriormente descartado como resíduo do

grupo D do serviço de saúde.

4.2 Animais

Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, de peso entre 220-

250g, mantidos no Biotério da Universidade de Ribeirão Preto. Foram

obedecidos os critérios de ciclo de claro/escuro de 12 horas, temperatura

ambiente de 23oC ± 1 e umidade de 55% ± 5. Os animais receberam água ad

libitum e ração manufaturada de acordo com o Instituto Americano de Nutrição

(AIN-93).

Os animais (n=15) foram igualmente divididos em 3 grupos: Controle;

T1DM – Diabetes mellitus tipo 1 (STZ, 40mg/Kg, i.v); T1DMS – Diabetes mellitus

tipo 1 suplementados com 500 mg/Kg de zinco na dieta.

O estudo foi realizado por um período de 90 dias. Os cuidados com os

animais foram conduzidos de forma a minimizar o sofrimento e limitar o número

de espécimes necessário às investigações, de acordo com o “The guide for the

care and use of laboratory animals”, 1996 (51).

21

4.2.1 Formulação da Ração

As dietas balanceadas foram formuladas de acordo com as normas

estabelecidas pelo Instituto Americano de Nutrição em 1993 (AIN-93),

especificamente para roedores (52). A dieta básica foi composta por amido de

milho (673 g/Kg de ração), caseína (200 g/Kg de ração), óleo de soja (80 g/Kg

de ração), mistura salina (35 g/Kg de ração), mistura vitamínica (10 g/Kg de

ração), colina (2 g/Kg de ração). A ração suplementada com zinco foi formulada

a partir da dieta básica com um acréscimo de 500mg ou 17 vezes em zinco

(ZnCO3 na concentração de 0,85 g/Kg da dieta ou 10 mg Zn/animal/dia).

Para o preparo da ração básica, foi realizada a pesagem dos

ingredientes e posteriormente misturados manualmente em recipiente

apropriado. Após a mistura manual dos ingredientes, foi realizado um processo

de peneiração, onde a ração será passada em uma peneira por 10 vezes para

obter uma mistura homogenia e com partículas uniformes. A ração foi

armazenada imediatamente em recipientes adequados e mantida em

temperatura de 4°C, segundo recomendações do distribuidor dos ingredientes

(Rhoster Indústria e Comércio Ltda/SP), sendo somente retirada no momento do

uso para o trato dos animais.

Para o preparo da ração suplementada foi realizado um processo de

diluição geométrica dos ingredientes, para alcançar uma total homogeneidade

da ração. Para a realização da diluição geométrica os ingredientes de menor

quantidade na ração foram misturados aos poucos com os ingredientes base,

como amido e caseína. Após a diluição foram seguidos os mesmo

procedimentos da ração básica. Todo o procedimento foi realizado com a devida

paramentação e em condições adequadas. O preparo da ração foi realizado em

média a cada 30 dias.

Os ingredientes utilizados para as formulações das dietas foram

provenientes da Rhoster Indústria e Comércio Ltda/SP e fornecidas através de

um convênio entre a UFRN com a Universidade de Ribeirão Preto- UNAERP

22

4.2.2 Indução do Diabetes mellitus

Após jejum alimentar de cerca de 24 horas, não hídrico, ad libitum, os

ratos receberam via veia peniana a Estreptozotocina (Sigma-Aldrich, St. Louis,

MO, USA) dissolvida em tampão Citrato de Sódio (0,01 M, pH 4,5), na proporção

de 40 mg/Kg de peso corporal.

O décimo dia após a indução foi considerado o dia zero, sendo esse

período necessário para a instalação do diabetes experimental crônico. Foram

considerados diabéticos experimentais, os animais que apresentaram glicemia ≥

250 mg/dL, obtida por um monitor de glicemia (Accu-Check Instant, Boehringer

Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, USA), associados ao quadro de

poliúria, polifagia, polidpsia e a perda de peso corporal.

4.3 Amostras biológicas

4.3.1 Sacrifício

Após o término do período experimental de 90 dias, os animais em

estudo foram anestesiados com Tiopental Sódico (Thiopentax 1g, Cristália

Produtos Químicos Farmacêuticos LTDA., Itapira, São Paulo, Brasil) na

concentração de 40 mg/Kg, sendo posteriormente submetidos à laparotomia

para coleta de sangue por punção cardíaca e retirada dos fêmures e das tíbias.

As amostras de sangue foram utilizadas para realização das dosagens

bioquímicas no Laboratório Multidisciplinar (LABMULT-PPgCF). Os fêmures

foram armazenados em freezer – 80oC e em seguida utilizados para extração de

RNA total para ser utilizado no estudo de expressão gênica. As tíbias direitas

foram mantidas em solução fixadora de formol tamponado a 10% para em

seguida submetidas à análise histomorfométrica onde serão determinados a

espessura, a distância e volume ósseo trabecular, bem como o conteúdo de

colágeno. As tíbias esquerdas foram armazenadas em freezer – 80oC e

posteriormente utilizadas no testes biomecânicos seguindo metodologia de

flexão de 3 pontos.

23

4.3.2 Dosagens bioquímicas

Após a coleta, o sangue obtido dos animais foram submetidos à

centrifugação (centrifuga Modelo 5810 - Eppendorf, Germany) a 2.000 rpm,

durante 10 min., a 25°C.

O soro foi utilizado para as dosagens de glicose e atividade da fosfatase

alcalina total (ALP). As leituras foram efetuadas no espectrofotômetro RA 50

(Bayer Diagnósticos, Irlanda) no LABMULT da UFRN utilizando os kits

Biosystems Reagents and Instruments (Barcelona, Espanha). Todas as

determinações serão realizadas de acordo com a metodologia descrita pelos

fabricantes. As dosagens do zinco sérico foram realizadas utilizando o

espectrofotômetro de absorcao atomica Spectra AA-200 spectrophotometer

(Varian 210 Canada, Georgetown, Ontario, Canada)

4.3.3 Análise Histomorfométrica

As análises histomorfométricas foram realizadas de acordo com Duarte

et al. (2005) (7) com modificações na objetiva de análise e nos equipamentos

utilizados, como descrito a seguir. As tíbias direitas livre de todo tecido mole

aderente, foram imediatamente submersas em solução fixadora de formol

tamponado a 10%. Em seguida, realizou-se a descalcificação em ácido nítrico a

7,5%, seguida de desidratação em solução de xilol. Por fim, as tíbias foram

impregnada em parafina líquida, sendo utilizado um processador automático de

tecidos. O fragmento foi então incluído no bloco de parafina e seccionado em um

micrótomo rotativo em cortes de 4 micrômetros de espessura. As lâminas foram

levadas à estufa de secagem durante 30 minutos para em seguida serem

coradas com hematoxilina-eosina. Para a análise histomorfométrica, visando

determinar a espessura média das trabéculas ósseas da região metafisária, bem

como a distância trabecular, foi utilizado um microscópio olympus BX 51 com

uma câmera Q-Color 3 olympus (Japão) acoplada com auxilio do software Q-

Capture Pro (Surrey, BC, Canadá). Para análises dos parâmetros citados, foram

selecionadas três áreas ao acaso e em secções não adjacentes de cada

trabécula óssea.

24

A análise da porcentagem de área ocupada pelo osso trabecular e medula

óssea trabecular foi realizada utilizando microfotografias retiradas da região

metadiafisária das tíbias dos animais com aumento de 20X. Essas

microfotografias digitalizadas foram processadas através do programa

Photostudio 2.0 SE (Tiling 3D grid, com grade tamanho médio; ArcSoft, Fremont,

CA, USA). A planimetria foi feita por superposição de pontos observada na

secção. A contagem dos pontos foi realizada em todas as transecções incluídas

no osso trabecular, excetuando-se os pontos das bordas da imagem, utilizando

o princípio Delesse, o qual estabelece que a fração do volume Vvi (fração de

volume ocupada por i) de uma componente i (densidade volumétrica) em um

tecido, pode ser estimada pela medida da fração de área AAi (fração de área da

secção de i). A fração Ppi (fração de pontos testes incluídos em i) de pontos

localizados nas transecções de i dividida por PT (número de pontos testes) é

uma estimativa de Vvi.

𝑉𝑉𝐼 = 𝐴𝐴𝐼

𝑉𝑉𝐼 =𝑃𝑝𝑖

𝑃𝑇

O porcentual foi encontrado usando-se a média da fração de volume de

densidade de cada animal em cada grupo.

4.3.4 Análise do conteúdo de colágeno

As amostras incluídos em parafina anteriormente citadas no item 4.3.3

também foram também utilizadas para a quantificação de colágeno utilizando o

método de coloração por picrosirius red seguindo metodologia descrita por Rich

e Whittaker (53) com modificações. Para avaliar o conteúdo de colágeno nos

cortes corados com picrosirius vermelho, quatro campos da região metadiafisária

foram observados com uma lente ocular de ampliação de 10x em um

microscópio AxioImager M2 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Em cada campo, as

percentagens de área de tecido coradas de vermelho e verde em relação à área

25

total dos tecidos foram calculados de acordo com a fórmula descrita por Black et

al. [37]. Todas as análises foram realizadas utilizando ImageJ 1.48v.

4.3.5 Análise biomecânica

Foram realizadas análises biomecânicas nas tíbias esquerdas,

previamente armazenadas a -80°C, por meio de ensaio mecânico de flexão de

três pontos, conforme procedimento adaptado de Korres et al. (24). Os testes

mecânicos foram conduzidos com uma máquina de ensaio universal servo-

hidráulica (modelo AG-X, Shimadzu Corporation, Tóquio, Japão). De acordo com

o fabricante, a célula de carga possui capacidade de 5 kN e precisão de 1/500.

Cada tíbia foi colocada horizontalmente sobre dois pontos de apoio, com 30 mm

de distanciamento entre os mesmos, de modo que os espécimes foram

suportados pelas extremidades. Subsequentemente, foi aplicada sobrecarga

gradual sobre o osso, no ponto médio entre os pontos de apoio (região da

diáfise). A taxa do deslocamento foi de 5 mm/min, a fim de simular condições de

sobrecarga estática, e se deu de forma contínua até o momento da fratura.

Simultaneamente, um diagrama da carga em função do deslocamento, para

cada espécime, foi expresso no monitor do sistema de testes para obtenção dos

dados. A queda abrupta da curva carga-deslocamento, associada ao ruído

característico e à presença de um defeito na cortical óssea na face oposta ao

contato, indicaram a indução da falha e o fim do teste. O teste biomecânico

descrito foi utilizado para avaliar as propriedades mecânicas de carga máxima

(em N), rigidez (em N/mm), máxima resistência à flexão (em N/mm²), máxima

deformação em flexão (em %) e módulo de elasticidade (em N/mm²), a partir das

curvas carga versus deslocamento obtidas.

4.4 Estudo da expressão gênica

4.4.1 Extração e quantificação do RNA total dos fêmures dos

animais

Para as extrações de RNA total foram utilizados os fêmures esquerdo de

cada rato. Após a completa pulverização do fêmur com o auxílio de nitrogênio

26

líquido, gral e pistilo, foi realizada a extração do RNA total pelo kit de extração

RNeasy Plus Mini Kit® (Qiagen, Alemanha). As amostras foram analisadas

quanto à integridade em eletroforese em gel de formaldeído-agarose a 2%,

corado e revelado sob a luz ultravioleta e fotodocumentadas em sistema de

captura de imagens Gel Logic 100 Imaging System (Carestream Health Inc.

Rochester, NY, EUA) utilizando o software Molecular Imaging Kodak 4.5.

O RNA total extraído foi quantificado (A260nm) e teve seu grau de pureza

(A260/A280) avaliado através de espectrofotometria no ultravioleta utilizando

espectrofotômetro ND-1000 (NANODROP technologies Inc, Wilmington, DE,

EUA).

4.4.2 Análise da expressão de RNAm por PCR em tempo real

A medida quantitativa da expressão do mRNA nos fêmures foi realizada

pela RT-PCR em tempo real utilizando o sistema de amplificação TaqMan® RT-

PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O sinal de fluorescência

emitido pelo fluoróforo da sonda TaqMan® foi detectado em tempo real no

equipamento ABI Prism 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

A análise da expressão gênica foi realizada por método de quantificação relativa

utilizando o gene GAPDH como gene de referência.

Para a amplificação pela PCR em tempo real foram selecionados ensaios

TaqMan de iniciadores e sondas marcadas com fluoróforo para os genes RANKL

(Rn00589289_m1), OPG (Rn00563499_m1), OC (Rn00566386_g1), COL1A1

(Rn01463848_m1), MMP-2 (Rn01538170_m1), MMP-9 (Rn00579162_m1) e

GAPDH (Rn00579162_m1) (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

A síntese do cDNA a partir do RNA total foi realizada utilizando-se o kit

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems, de acordo

com a metodologia descrita pelo fabricante (Foster City, CA, EUA) em

termociclador MyCycler (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA). O cDNA

obtido foi armazenado a –20°C até a realização da PCR em tempo real.

Na etapa de PCR em tempo real, além dos ensaios TaqMan, demais

reagentes foram fornecidos em solução 2x concentrada denominada Master Mix

27

contendo dNTPs com dUTP, AmpErase® UNG, enzima AmpliTaq Gold® DNA

Polimerase, uma referência passiva e tampão de reação Gold PCR (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foi utilizado volume final de 10 µL por reação

em duplicata sendo utilizado 2 µL de cDNA por reação.

O programa da PCR em tempo real utilizado foi constituído de: 1- um ciclo

2min a 50ºC, (ativação da Uracil N-glicosilase - UNG); 2- um ciclo de 10min a

95ºC, (inativação da UNG); 3- 40 ciclos de 15s a 95ºC (desnaturação) e 1min a

60ºC (hibridização e extensão). Os sinais de fluorescência emitidos pelos

fluoróforos das sondas TaqMan® foram detectados pelo equipamento ABI Prism

7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os dados foram analisados

utilizando-se o programa Sequence Detection Software v 1.2.3 (Applied

Biosystems, Foster City, CA EUA) que gera curvas semi-logarítmicas dos sinais

de amplificação.

Esse programa fornece o parâmetro ciclo em que o sinal de fluorescência

é significativo, denominado cycle treshold (Ct) (54). Para cada amostra, o Ct de

cada gene é registrado e comparado com o do gene GAPDH que é utilizado com

gene de referência.

Os valores de Ct obtidos nesses ensaios foram utilizados para o cálculo

da expressão relativa de mRNA de cada gene alvo em relação à do GAPDH

(gene de referência). Essa relação é denominada Delta Ct (DCt) e é calculada

pela fórmula:

ΔCt = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)

Com objetivo de avaliar a variação de expressão após a suplementação

com zinco, foi utilizado o parâmetro Delta Delta Ct (DDCt) que é calculado pela

fórmula:

ΔΔCt = (ΔCt amostra – ΔCt calibrador)

Foi considerado como calibrador a média dos ΔCt’s basais. Os dados de

ΔΔCt foram transformados em escala logarítmica (2-ΔΔCt) para comparar dados

de expressão entre as fases de tratamento com zinco. A expressão é

interpretada pelo seu aumento ou diminuição após o tratamento.

28

4.5 Análise estatística

Para o tratamento dos dados foi elaborado um banco de dados para

devidas correlações e tabulação das variáveis, utilizando o programa Microsoft

Excel for Windows versão Vista e para o tratamento de testes estatísticos, o

programa GraphPaf Prism 5. Em todos os dados o teste de normalidade foi falho,

sendo assim usado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido de pós

teste de comparação múltipla de Dunn’s versos o controle. Para estas análises

foi estabelecido o nível de significância de p<0,05.

29

5.0 ARTIGOS PRODUZIDOS

O artigo “Protection against T1DM-induced bone loss by zinc

supplementation: biomechanical, histomorphometric, and molecular

analyses in STZ-induced diabetic rats” foi aceito para publicação no periódico

Plos One que possui fator de impacto 3.53 e é classificado no sistema Qualis-

Capes como A1 para área de Medicina II

30

Protection Against T1DM-Induced Bone Loss by Zinc

Supplementation: Biomechanical, Histomorphometric, and Molecular

Analyses in STZ-Induced Diabetic Rats

Raul Hernandes Bortolin,1 Bento João da Graça Azevedo Abreu,2 Marcela Abbott

Galvão Ururahy,1 Karla Simone Costa de Souza,1 João Felipe Bezerra,1 Melina

Bezerra Loureiro,1 Flávio Santos da Silva,2 Dáfiny Emanuele da Silva Marques,2

Angélica Amanda de Sousa Batista,4 Gisele Oliveira,4 André Ducati Luchessi,1

Valéria Morgiana Gualberto Duarte Moreira Lima,3 Carlos Eduardo Saraiva

Miranda,5 Marcus Vinicius Lia Fook,6 Maria das Graças Almeida,1 Luciana

Augusto de Rezende,4 Adriana Augusto de Rezende1*

Author Affiliations:

1Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

2Department of Morphology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,

Rio Grande do Norte, Brazil

3Department of Pharmacy, State University of Paraiba, Campina Grande,

Paraiba, Brazil

4Department of Chemistry, University of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, São

Paulo, Brazil

5Department of Pharmacy, University of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, São

Paulo, Brazil

6Laboratory of Evaluation and Development of Biomaterials, Federal University

of Campina Grande, Campina Grande, Paraiba, Brazil

*Corresponding author:

Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

Av. General Gustavo Cordeiro de Faria S/N, Petrópolis, 59012-570 - Natal - RN,

Brazil

Tel. +55 84 3342 9807, Fax +55 84 3342 9833,

e-mail: adrirezende@yahoo.com

31

ABSTRACT

Several studies have established an association between diabetes and

alterations in bone metabolism; however, the underlying mechanism is not well

established. Although zinc is recognized as a potential preventive agent against

diabetes-induced bone loss, there is no evidence demonstrating its effect in

chronic diabetic conditions. This study evaluated the effects of zinc

supplementation in a chronic (90 days) type 1 diabetes-induced bone-loss model.

Male Wistar rats were distributed in three groups: control, type 1 diabetes mellitus

(T1DM), and T1DM plus zinc supplementation (T1DMS). Serum biochemical

analysis; tibia histomorphometric, biomechanical, and collagen-content analyses;

and femur mRNA expression were evaluated. Relative to T1DM, the zinc-

supplemented group showed increased histomorphometric parameters such as

TbWi and BAr and decreased TbSp, increased biomechanical parameters

(maximum load, stiffness, ultimate strain, and Young’s modulus), and increased

type I collagen content. Interestingly, similar values for these parameters were

observed between the T1DMS and control groups. These results demonstrate

the protective effect of zinc on the maintenance of bone strength and flexibility.

In addition, downregulation of OPG, COL1A, and MMP-9 genes was observed in

T1DMS, and the anabolic effects of zinc were evidenced by increased OC

expression and serum ALP activity, both related to osteoblastogenesis,

demonstrating a positive effect on bone formation. In contrast, T1DM showed

excessive bone loss, observed through reduced histomorphometric and

biomechanical parameters, characterizing diabetes-associated bone loss. The

bone loss was also observed through upregulation of OPG, COL1A, and MMP-9

genes. In conclusion, zinc showed a positive effect on the maintenance of bone

architecture and biomechanical parameters. Indeed, OC upregulation and control

of expression of OPG, COL1A, and MMP-9 mRNAs, even in chronic

hyperglycemia, support an anabolic and protective effect of zinc under chronic

diabetic conditions. Furthermore, these results indicate that zinc supplementation

could act as a complementary therapy in chronic T1DM.

Key words: chronic type 1 diabetes mellitus; animal model; bone loss; zinc

supplementation; bone biomechanical test; bone histomorphometric analyses;

MMP-9, COL1A, OPG and OC mRNA expression.

32

INTRODUCTION

Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic disease in which pancreatic

beta cells are selectively destroyed, leading to chronic hyperglycemia [1], and

several consequential long-term vascular complications such as retinopathy,

neuropathy, and nephropathy have been reported [1-3]. Although skeletal

abnormalities and bone disease represent an overlooked complication of

diabetes, the relationship is well established and recognized as a complex

pathogenesis including mechanical, hormonal, and vascular factors involving an

imbalance between bone formation and resorption.

Diabetes-induced bone-loss mechanisms are not fully understood [4-7]

although a variety of bone-related changes are known to be influenced by

hyperglycemia such as bone mineral density, femoral neck geometry,

microarchitecture (trabecular, cortical thickness, and bone area), and

biomechanical markers of bone turnover (ultimate strain, strength and load,

stiffness, and Young’s modulus) [3,8-11]. In addition, formation of the collagen

network is affected by an increase in matrix metalloproteinase (MMP) expression

in diabetic conditions, especially for MMP-9, which is considered a diabetogenic

factor and is upregulated in T1DM, contributing to collagen degradation and

resulting in low bone collagen content and poor bone biomechanical integrity [12-

15]. One study showed a decrease in bone mineral content (BMC) associated

with an increase in urinary calcium excretion in diabetic rats. Moreover, low BMC

in diabetic conditions has been associated with low osteocalcin (OC) levels, as

this small non-collagenous protein is produced by osteoblasts and is directly

involved in bone inorganic matrix development [16].

Several studies have reported controversial alterations in the

RANK/RANKL/OPG (receptor activator of nuclear factor kappa β/receptor

activator of nuclear factor kappa β ligand/osteoprotegerin) system in

hyperglycemic conditions [2,4,8,17-28]. Some studies have shown an increase in

RANKL mRNA expression in diabetic bone [2] and decreases in a high-glucose

in vitro model [18] and diabetic bone [20]. OPG expression has been shown to

increase in young T1DM patients [8], whereas a decrease in gene expression

was also observed in T1DM patients [4], in a T1DM animal model [19], and in an

in vitro study [17].

33

As an alternative, investigators have used zinc supplementation for bone-

loss prevention in both healthy and hyperglycemic conditions because it is an

essential element in bone metabolism, acting as a cofactor for several enzymes

and stimulating gene expression of various proteins necessary for bone

mineralization and collagenous structure development [10,21-25].

Studies involving in vitro and in vivo models have evaluated the efficacy of

zinc supplementation in preventing bone loss [22,23,26-28]. In vitro results have

shown a stimulatory effect on osteoblastogenesis through increases in DNA,

collagen, calcium, insulin-like growth factor 1 (IGF-I), transforming growth factor

beta 1 (TGF-β1), alkaline phosphatase (ALP) activity, and OC [21-22].

Furthermore, an in vivo study involving acute T1DM-induced bone loss and zinc

supplementation showed a significant effect of zinc on bone formation associated

with an increase in OC mRNA expression [23].

A positive effect of zinc on the recovery of bone architecture has been

reported in acute diabetic conditions [23], and bone biomechanical tests in rats

showed that zinc maintained overall bone quality and increased fracture

resistance [24-25]. Moreover, the effects of zinc on the RANK/RANKL/OPG

system has been reported by Yamaguchi [22], who demonstrated the inhibition

of RANKL expression in pre-osteoclasts and the stimulation of OPG gene

expression in osteoblastic cells, which could act as a decoy receptor by binding

to RANKL and preventing RANK signaling.

Although a few reports have shown positive effects of zinc

supplementation, all of these studies were performed during an acute period

between 7 and 21 days [23,29]. Our aim was to evaluate the effect of zinc under

long-term diabetic conditions to provide proof-of-concept for the potential use of

zinc supplementation in preventing chronic T1DM-induced bone loss. To the best

of our knowledge, this is the first study to evaluate the effects of zinc

supplementation over a period of 90 days, which represents a chronic model of

diabetes, and provide evidence that zinc ingested as dietary supplement can

prevent bone loss through anabolic and osteo-protective effects. We show that

this in vivo action results from the stimulation of bone formation and decreased

bone resorption as detected by histomorphometric, collagen-content,

biomechanical, and quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) analyses.

Together with prior evidence showing a relationship between supplementation

34

and bone metabolism, our data provide compelling evidence for the therapeutic

potential of zinc supplementation as a complementary therapy against chronic

T1DM-induced bone loss.

METHODS

Experimental Protocol

All animal experiments and protocols were approved by the Committee on

the Ethics of Animal Use and Care of the Federal University of Rio Grande do

Norte (permit number 022/2009) and the Committee on the Ethics in Research of

the University of Ribeirão Preto (permit number 066/09). All procedures were

carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the

Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health [30]. All

surgery was performed under thiopental anesthesia, and all efforts were made to

minimize suffering.

Fifteen male Wistar rats weighing 220 ± 20 g were obtained from the

Laboratory Animal Facility of the University of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto,

Brazil. During the study period, the animals were housed in standard conditions

(12 h light/dark cycle, 22–24 °C, and 50–60% humidity) with food and water ad

libitum. After one week of acclimatization prior to the experimental procedures,

the rats were randomly assigned and equally distributed (five rats per group) to

three groups: control, T1DM, and T1DM plus zinc supplementation (T1DMS).

Experimental diabetes was induced by a single intravenous injection of

streptozotocin (STZ, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dissolved in freshly

prepared Na citrate buffer (0.1 M, pH 4.5) at a dose of 40 mg/kg of body weight.

Equal volumes of vehicle were injected in the control rats. On day 0, i.e., day 5

after induction, blood samples were collected by tail bleeding, and glycemia was

assayed using an ACCU-CHEK Advantage glucometer (Roche Diagnostics,

Indianapolis, IN, USA). Animals with blood glucose concentrations ≥250 mg/dL

were considered diabetic and started receiving a standard (control and T1DM) or

supplemented diet (T1DMS). The blood glucose concentrations and body weight

were monitored fortnightly for 12 weeks. Clinical diabetic signs such as

35

polyphagia, polydipsia, polyuria, and body weight loss were also monitored

[31,32].

Standard diets were formulated in accordance with rodent-specific rules

established by the American Institute of Nutrition in 1993 (AIN-93) [33]. Dietary

ingredients were provided by Rhoster Industry and Trade Ltd. (São Paulo, Brazil).

The control and T1DM groups were fed daily with 20 g of standard diet for 12

weeks. Because the AIN-93 standard diet contains 30 mg zinc/kg diet, we

supplemented the diet with 500 mg zinc/kg diet; thus, the T1DMS group was fed

a standard diet supplemented with 17-fold geometrically diluted ZnCO3. All

animals in the T1DMS group consumed 20 g of the supplemented diet daily

during the 12 weeks of study, totaling 10.6 mg ZnCO3 ingestion daily.

Blood and tissue collection and routine biochemical analyses

All animals were euthanized by a lethal dose of thiopental (100 mg/kg),

and blood samples were obtained from the abdominal aorta. To prevent possible

daily cyclic variations of the measurements, all animals were euthanized between

7:00 am and 9:00 am. The femurs and tibias were harvested and stored for

subsequent total RNA extraction and histomorphometric, biomechanical, and

collagen-content analyses.

Serum glucose concentration and ALP activity were determined in

triplicate using routine methods (BioSystems Reagents and Instruments,

Barcelona, Spain) and performed in an RA 50 spectrophotometer (Chemistry

System Bayer Diagnostic, Dublin, Ireland). Serum zinc was measured by atomic

absorption spectroscopy using a Spectra AA-200 spectrophotometer (Varian

Canada, Georgetown, Ontario, Canada).

Histomorphometric analyses

The right tibia of each animal was fixed in a solution of 10% buffered

formalin and processed after decalcification in 7.5% nitric acid and embedding in

paraffin following standard procedures as described by Duarte et al. [34] with

modifications. Longitudinal 7-µm sections were stained with hematoxylin and

eosin. The histomorphometric results are presented as the means of four

36

measurements of trabecular separation (TbSp, μm), trabecular width (TbWi, μm)

and trabecular bone area (BAr, %) obtained from the metadiaphyseal region

using a Nikon Lobophot microscope equipped with a 10× magnification ocular

lens (Nikon, Tokyo, Japan). After analysis using ImageJ 1.48v (National Institutes

of Health, Bethesda, MD, USA), the results were reported in µm. All parameters

complied with the guidelines of the Nomenclature Committee of the American

Society of Bone and Mineral Research [35].

Collagen content

Paraffin-embedded samples were also used for collagen quantification by

picrosirius red staining according to the procedure described by Rich and

Whittaker [36] with modifications. To evaluate the collagen content in sections

stained with picrosirius red, four fields of the metadiaphyseal region were

observed with a 10× magnification ocular lens in an AxioImager M2 microscope

(Carl Zeiss, Jena, Germany). In each field, the percentages of tissue area stained

in red and green relative to the total tissue area were calculated according to the

formula described by Black et al. [37]. All analyses were performed using ImageJ

1.48v.

Biomechanical testing

Biomechanical analysis was performed on the left tibias previously stored

at −80 °C using three-point bending mechanical tests according to the procedure

described by Korres et al. [12], with modifications. We used a servo hydraulic

high-precision universal testing machine, model AG-X 10 kN (Shimadzu

Corporation, Tokyo, Japan). Tibias were placed horizontally on the frame with

rounded edges at a distance of 30 mm. The load was applied at the mid-shaft of

the diaphysis using a punch with a rounded notch. The rate of the imposed

displacement was selected as 5 mm/min to simulate static loading conditions.

The displacement was imposed continuously until fracture. Failure in the load-

displacement curves was defined and observed by the propagation of a nearly

vertical fracture starting almost universally at the lower cortical bone surface.

37

Ultimate load, stiffness, ultimate stress, ultimate strain, and Young’s modulus

were recorded.

RNA extraction and RT-qPCR

The right femurs of the animals, previously stored at −80 °C, were

pulverized, and total RNA was extracted using an RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen,

Valencia, CA, USA). The RNA integrity was assessed by electrophoresis in 1.0%

agarose gels with MOPS buffer, concentrations were measured using a

Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE,

USA), and RNA was stored at −80 °C. Synthesis of cDNA was performed with 1

µg total RNA using a High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA), according to the manufacturer’s protocol in a

MyCycler Thermal Cycler (Bio-Rad, Philadelphia, PA, USA). The cDNA was

obtained in a final volume of 50 µL and stored at −20 °C until it was used for the

RT-qPCR expression assays.

RT-qPCR was performed on the following genes using the TaqMan Assay:

RANKL (Rn00589289_m1), OPG (Rn00563499_m1), OC (Rn00566386_g1),

COL1A1 (Rn01463848_m1), MMP-2 (Rn01538170_m1), MMP-9

(Rn00579162_m1), and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH,

Rn00579162_m1) (Applied Biosystems). PCR assays were carried out in 96-well

plates using a 7500 Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems). Relative

expression was calculated using the 2-ΔΔCT method [38], and results are

presented as fold-change versus the control group mean values, normalized to

GAPDH; Ct did not show significant variation between the control and T1DM

groups.

Statistical analyses

Statistical analyses were performed with GraphPad PRISM version 5.0

(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). In all data, the normality test

failed, and we therefore used the nonparametric Kruskal-Wallis ANOVA on

Ranks and Dunn’s post-hoc method of multiple comparisons versus control. p-

values < 0.05 were considered statistically significant.

38

RESULTS

Biochemical analyses and body weight

Biochemical analyses and body weight results are shown in Table 1. As

expected, blood glucose concentrations in T1DM and T1DMS rats were than

those in control rats (p < 0.001). Hyperglycemia was associated with polyphagia,

polydipsia, and polyuria (data not shown) in the diabetic rats, indicating that

experimental diabetes was successfully induced. The baseline body weight at the

beginning of the study was similar in control and diabetic groups (average 220 ±

20 g). However, after 90 days of the experimental period, which represents a

chronic condition, T1DM and T1DMS groups showed significantly reduced body

weight (p < 0.001).

No significant difference was observed in serum ALP activity between the

T1DM and control groups. However, ALP activity was significantly higher in the

T1DMS group than in the control and T1DM groups (p < 0.001).

Serum zinc concentration was decreased in T1DM rats compared to

control rats (p < 0.05), and we observed the expected increase in serum zinc

concentration in T1DMS rats compared to the control and T1DM groups (p <

0.01).

Histological and histomorphometric analyses

Histological and histomorphometric results are shown in Figures 1 and 2,

respectively. Increased TbSp (Figure 2A) and decreased TbWi (Figure 2B) and

BAr (Figure 2C) were observed in the T1DM group compared to the control group

(p < 0.001, p < 0.001, and p < 0.01, respectively). The T1DMS group showed

reduced TbSp and increased TbWi and BAr compared to the T1DM group (Figure

1, p < 0.001, p < 0.001, and p < 0.05, respectively). In addition, T1DMS rats

exhibited similar results when compared to control rats. Representative

histological data are shown in Figure 1.

39

Collagen content

The collagen analysis results are shown in Figure 3. We observed a

decrease in total collagen in T1DM rats compared to control rats (Figure 3A, p <

0.05), whereas there was no difference between T1DMS rats and control rats.

We also found a decrease in type I collagen in T1DM rats compared to controls

(Figure 3B, p < 0.05), and T1DMS results were increased 1.2-fold compared to

the T1DM group; however, this increase was not statistically significant. No

differences were observed for type III collagen (Figure 3C).

Biomechanical testing data

Biomechanical parameters are shown in Table 2. Significantly decreased

values for ultimate load, stiffness, ultimate strain, and Young’s modulus in the

T1DM group was observed relative to control values (p < 0.01, p < 0.01, p < 0.05,

and p < 0.05, respectively). Interestingly, the values of these parameters were

higher (2-, 1.5-, 1.2-, and 1.2-fold, respectively) in the T1DMS group than in the

T1DM group. In addition, we observed that ultimate load, ultimate strain, and

Young’s modulus values in the T1DMS group were similar to the control values.

The stiffness was uniquely decreased in T1DMS rats compared to controls (p <

0.05) but showed a 1.2-fold increase compared to T1DM rats. No significant

difference was observed in the ultimate stress parameter.

mRNA expression data

Molecular bone metabolic parameters are summarized in Figure 4. The

mRNA expression levels of OPG, COL1A, and MMP-9 (Figures 4B, 4D, and 4F,

respectively) were increased 37.8-, 17.3-, and 344.4-fold, respectively (p < 0.05,

p < 0.01, and p < 0.01, respectively) in T1DM rats compared with control rats.

Interestingly, the T1DMS group showed decreased expression of these genes

(31.1-, 8.3-, and 313.9-fold, respectively) in comparison to T1DM rats, although

this result was not statistically significant. In addition, no alterations were

observed in these genes between the control and T1DMS groups (Figures 4B,

4D and 4F) except the OC mRNA expression, which showed a 17.9-fold increase

40

(p < 0.05) compared with the control group (Figure 4C). No significant difference

was found for MMP-2 mRNA expression between the groups.

DISCUSSION

Several studies have shown that bone turnover and skeletal integrity are

affected by diabetes; however, the underlying mechanism of diabetes-induced

bone loss remains elusive, as does the influence of disease stage in its

development [3,4,17,34].

The STZ-induced diabetes model has been extensively used, making it

particularly useful for building upon and comparing study results

[2,10,23,29,37,39-42]. The benefits of the STZ-induced diabetic model include

the ability to induce diabetes in a genetically altered animal, maintain the model

in a controlled environment, regularly monitor and directly measure serum and

bone factors, obtain bone samples for high-resolution analyses, and choose the

time of diabetic induction (compared to waiting for diabetes to occur in

spontaneous models) [2]. Indeed, STZ induction of diabetes causes a bone

phenotype consistent with human studies [8,43-49] and with spontaneous mouse

models such as NOD mice [50], confirming the utility of the STZ model for

studying mechanisms of T1-diabetes-induced bone loss.

Several studies have used zinc supplementation to preserve bone

structure and metabolism, as zinc is an essential nutrient for human and animal

growth [22,25,26,51,52]. Zinc deficiency during adolescence may increase the

risk of bone disease later in life due to reduced mineralization during the

consolidation phase of bone mineral acquisition [53]. The protective effect of zinc

on bone is suggested primarily by its stimulatory effect on cell proliferation,

differentiation, and mineralization in osteoblasts, thereby promoting bone

formation [21,22]. Additionally, zinc may stimulate the expression of various

cellular proteins, including Runx2/Cbfa1 (Runt-related transcription factor 2/Core

binding factor alpha 1), type I collagen, ALP, and OC. Zinc also increases cellular

production of IGF-I and TGF-β1. Moreover, this ion also suppresses the

osteoclast-like cell formation induced by various bone-resorbing factors in bone

marrow culture (e.g., RANKL in pre-osteoclasts) and stimulates OPG gene

41

expression in osteoblastic cells, which can inhibit the binding of RANKL to RANK

in pre-osteoclastic cells [21].

Herein, we chose to evaluate the zinc protective effect for a period of 90

days of T1DM because chronic high glucose exposure may present an extreme

condition for studying key aspects of bone alteration such as architecture,

biomechanics, and gene regulation.

Although the beneficial influence of zinc is recognized in T1DM-related

bone loss, few studies have evaluated the effect of zinc supplementation in

chronic conditions [23,27,29,42,54,55]. The majority of studies have shown a zinc

protective effect in short-term T1DM animal models, restoring calcium content,

ALP activity, and DNA content after 14 days of T1DM onset [29,42]. Furthermore,

zinc prevented diabetes-induced osteoclastogenesis and decreased

osteoblastogenesis two weeks after diabetes onset, as evaluated by

histomorphometric, biochemical, and molecular parameters [23].

Our results demonstrate significant bone loss associated with long-term

T1DM and, because zinc supplementation was initiated following diabetes onset,

suggest an important protective effect of zinc against excessive bone loss in

chronic T1DM.

The protective effect of zinc was supported through histomorphometric

parameters, which showed decreased TbSp and increased TbWi and BAr in

T1DMS rats relative to T1DM rats. These results emphasize the importance of

supplementation as an anabolic and protective agent against reduction in bone

architecture. Similarly, in a T1DM-induced bone loss model over 14 days, Iitsuka

et al. [23] showed recovery of BAr, TbWi, and the number of osteoclasts and

osteoblasts in the supplemented group, suggesting that zinc restored diabetes-

induced osteopenia by acting on both bone formation and resorption through

regulation of osteoclast and osteoblast numbers. Furthermore, in normal rats,

Ovesen et al. [24] found that alimentary zinc deficiency in growing rats reduced

distal femoral metaphysis and femoral diaphysis during four weeks of study.

The protective effect of zinc supplementation was highlighted by altered

trabecular structures (increased TbSp and diminished TbWi and BAr) in the

T1DM group, evidencing negative effects of hyperglycemia on bone structure and

leading to significant bone loss. These results corroborate a previous 120-day

study in our laboratory [34] in which we observed a significant increase in TbSp,

42

a decrease in TbWi, and a progressive ~77% reduction in BAr accompanied by

a proportional expansion of the marrow space. Other investigators observed

alterations in TbWi and TbSp two and eight weeks after the onset of experimental

diabetes, respectively [39,56]. Moreover, our results are consistent with µ-CT

analyses by Thrailkill et al. [3] and Martin and McCabe [57], even though these

studies employed a short-term diabetes model.

In addition to histomorphometric analyses, the biomechanical integrity of

bone is an important factor affecting the risk of fracture. Diabetes-induced

structural abnormalities that predispose bone to fractures may occur

spontaneously or with minimal trauma in patients [58].

In the present study, zinc supplementation prevented diabetes-induced

alterations: the T1DMS group showed increased mineralization content (stiffness

parameter) and bone strength (ultimate stress parameter), which may reflect the

bone resistance to fracture, compared to the T1DM group, and values were

similar between the T1DMS and control groups [59]. Furthermore, maintenance

of the inorganic matrix may preserve the bone flexibility observed through

increased ultimate strain and Young’s modulus in T1DMS rats compared to

T1DM rats. Young’s modulus is a basic material property that is independent of

geometry, represents the ability of bone to resist deformation, and is associated

with ultimate strain in reflecting important parameters related to bone flexural

conditions [59].

Only few studies have investigated the effect of zinc on bone

biomechanical parameters, however in a non-diabetic rodent model [24,25]. To

the best of our knowledge, the present study is the first to evaluate the effect of

zinc supplementation on chronic T1DM-induced bone loss through bone

biomechanical parameters.

The zinc protective effect was supported through reduced values for

biomechanical parameters (stiffness, ultimate stress, ultimate strain, and Young’s

modulus) in the T1DM group. These results suggest that the bone integrity

changes observed under conditions of high glucose exposure may be attributed

to interrelated factors such as macroscopic structure (size and shape),

architecture (cortical and tissue), and bone substance (organic and inorganic

components), all of which may influence mechanical strength.

43

Additionally, the reduction in biomechanical parameters in T1DM rats

agrees with studies using similar tests at seven [11] and eight weeks after

diabetes confirmation [10,12].

Interestingly, the increase in biomechanical parameters was associated

with increased collagen content in the zinc supplementation group, further

suggesting an important role for zinc in maintenance of the organic matrix during

this long-term (90 days) study. However, for the T1DM group, the reduction in

type I collagen content supports the low biomechanical properties found after 90

days of study.

Finally, we analyzed mRNA expression levels of key genes associated

with bone metabolism. To the best of our knowledge, this is the first study to

evaluate the effects of zinc supplementation in a chronic model of diabetes-

induced bone loss (90 days) through the analysis of RANKL, OPG, OC, COL1A,

MMP-2, and MMP-9 mRNA expression.

MMP-9 was downregulated in the T1DMS group relative to the T1DM

group, indicating maintenance of bone type I collagen and correlating with the

greater flexural strength observed in zinc-supplemented rats. On the other hand,

the upregulation of MMP-9 and the low biomechanical and histomorphometric

properties of the T1DM group suggest bone loss under the hyperglycemic

condition. This hypothesis is supported by the association between MMP-9 and

degradation of bone collagens in the subosteoclastic microenvironment and its

potential role in normal bone remodeling and pathologic bone resorption [60].

MMP-9, a proteolytic member of the metalloproteinase family also named

92-kD type IV collagenase (gelatinase B), can degrade the components of the

bone organic matrix and process both helical and denatured forms of type I

collagen [13,60]. It is expressed at high levels in rabbit and human osteoclasts

and in multinucleated cells of giant-cell tumors of bone [14]. Okada et al. [61]

reported that MMP-9 has relatively broad substrate specificity, hydrolyzing

collagen types I, III, IV, and V, and gelatins, and 50–80% of its full activity is

retained at acidic pH. Grigoriadis et al. [62] showed that the expression of this

enzyme is altered by bone-resorption activity.

Studies in non-diabetic osteoporotic bone demonstrated that osteoclasts

can synthesize MMP-9 and exocytose it to degrade bone matrix components,

especially type I collagen. Interestingly, some cells lining the surface of the bone

44

matrix also express MMP-9, which is indirectly involved in bone resorption by

removing the osteoid layer in this context, thereby exposing mineralized bone

matrix and facilitating the adhesion of osteoclasts [63]. Although the

hyperexpression of MMP-9 may contribute to collagen degradation, an important

role for MMP-9 in healthy bone was reported by Nyman et al. [13] using MMP-

9−/− mice, which showed changes in the trabecular architecture and cortical

structure compared with wild-type mice, suggesting that bone quality is

influenced by the MMPs expressed by osteoblasts and osteoclasts.

Thus, the reduced expression of MMP-9 associated with maintenance of

histomorphometric and biomechanical parameters in the zinc-supplemented

group suggests that zinc prevents bone resorption. In comparison, the high-level

of MMP-9 expression in bone tissues of T1DM rats and reduced collagen content

reinforce the association of MMPs with collagen in osteoporotic bone.

Furthermore, the increases in collagen density, trabecular spaces,

Young’s modulus, and ultimate strain parameters and the reduced MMP-9 gene

expression in the T1DMS group compared to the T1DM group and the similarity

of these values to the control group suggest that zinc supplementation protects

against organic matrix degradation and bone loss.

The expression of COL1A in bone tissues of T1DMS rats was lower than

that in T1DM rats, suggesting a positive effect on zinc on maintenance of bone

metabolism through bone architecture (histomorphometric parameters) and bone

strength and flexibility (biomechanical parameters) similar to the control group.

Several studies have previously observed similar results regarding the protective

effect of zinc supplementation against collagen degradation in in vitro studies

[28,64], clinical studies in patients [55,65], and animal models [23,51].

COL1A expression in bone tissues of T1DM rats was upregulated,

possibly indicating an increase in bone loss associated with a chronic diabetic

condition. These results indicate high bone turnover as an alternative mechanism

to maintenance of bone homeostasis that was not necessary for the T1DMS

group, providing further support for the protective effect of zinc on the bone

metabolism. Similar to our T1DM results, the COL1A response was also

observed in in vitro studies, suggesting that hyperglycemia can affect bone tissue

by inducing excessive production of osteoid matrix [17]. This observation may

also be explained by the increase in MMP-9 mRNA that possibly leads to

45

degradation of the organic matrix in hyperglycemic conditions. Moreover,

McCabe et al. [66] reported that the chronic exposure of osteoblasts to

hyperglycemic cell culture media increased collagen production and altered the

cellular phenotype toward that of osteocytes [67].

The discovery of RANK, RANKL, and OPG, factors involved in the control

of osteoclast differentiation and osteoporosis, has advanced bone research into

a new era. The RANK/RANKL/OPG system is an important signal transduction

pathway that regulates bone resorption, modeling, and remodeling. The binding

of OPG to RANKL inhibits binding between RANKL and RANK, thereby

preventing osteoclast precursor differentiation and fusion to form mature

osteoclasts. Thus, the relative concentrations of RANKL and OPG in bone are a

major determinant of bone mass and strength.

OPG expression was downregulated in the T1DMS group, suggesting that

bone homeostasis is maintained by zinc supplementation even in chronic

hyperglycemic conditions. Moreover, the zinc effect on OPG mRNA expression

is controversial. Iitsuka et al. [23] showed unaltered OPG mRNA expression

during zinc supplementation for 14 days in a T1DM-induced bone loss animal

model, and Fong et al. [68] reported similar OPG mRNA expression between

postnatal and control groups. However, a review by Yamaguchi [22] showed that

zinc plays an important role in bone growth by stimulating the expression of OPG

mRNA in osteoblastic cells.

We observed upregulation of OPG in a chronic hyperglycemic condition,

suggesting an attempted protective response against excessive bone loss

induced by diabetic conditions. When OPG expression is increased relative to

RANKL expression, the latter is expected to become unavailable to bind RANK

in pre-osteoclasts, resulting in reduced bone resorption [17]. OPG upregulation

in T1DM was also reported in T1DM patients in a previous study in our laboratory,

indicating that diabetes during pubertal growth, which is associated with

proinflammatory processes, may cause deficient bone-mass gain [8]. Moreover,

an in vitro study has demonstrated excessive OPG synthesis at different glucose

concentrations [17]. Thus, the upregulation of OPG expression in T1DM rats

suggests that this increase protects the bone against resorption by inhibiting

osteoclast differentiation mediated by RANK-RANKL binding. Although the

present results show that the upregulation of OPG in T1DM rats did not result in

46

detectable protection against trabecular structures, the loss of bone mass may

have been more pronounced without this increased expression.

These results suggest an important role for zinc on bone protection in

chronic T1DM and are supported by maintenance of bone architecture

(histomorphometric and collagen content) and biomechanical proprieties and

downregulation of genes involved in organic matrix degradation (MMP-9 and

COL1A).

Zinc supplementation also showed an anabolic effect, as evidenced by OC

mRNA upregulation and increased serum ALP activity after the 90-day

experimental period. OC mRNA is primarily expressed by post-proliferating and

terminally mature osteoblasts [69-72] and regulates mineralization of the

extracellular matrix [73-75]. ALP is an important serum marker associated with

osteoblast activity and bone formation and is necessary for bone mineralization

and development of collagenous structures [76]. Thus, the upregulation of OC

and increased serum ALP activity are consistent with the hypothesis that zinc

regulates osteoblastogenesis, suggesting a possible induction of bone formation

and mineralization [22]. Furthermore, these results are consistent with Young’s

modulus values showing a high resistance to fracture, supporting the suggestion

that zinc supplementation may protect the bone architecture in both mineral and

non-mineral content, leading to greater biomechanical strength.

In conclusion, zinc supplementation prevented bone loss in chronic T1DM

rats as demonstrated by the maintenance of bone homeostasis and bone

architecture, strength, and flexibility. In addition, zinc-induced OC upregulation

and RANKL, OPG, COL1A, and MMP-9 downregulation, even in chronic

hyperglycemia, support a protective role for zinc in long-term diabetic conditions

through stimulating expression of the mineralizing phenotype in osteoblasts and

reducing expression of the resorptive phenotype in osteoclasts. Moreover, the

protective zinc effect is supported after chronic hyperglycemia in T1DM leads to

bone loss, as evidenced by alterations in bone structures associated with poor

bone quality.

Thus, these results suggest the therapeutic potential of zinc

supplementation as a complementary therapy to prevent bone loss in patients

with diabetes or other related chronic diseases, resulting in better bone protection

during growth as well as in adult and advanced ages.

47

ACKNOWLEDGMENTS

We acknowledge UNAERP for supporting this experimental study,

including animal maintenance and biochemical analyses. We are also grateful to

the students and technicians from LABMULT/UFRN/RN.

48

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56

Figure legends

Figure 1. Histological analyses of the right tibias. Hematoxylin and eosin

staining of longitudinal sections of tibias of the control (A), type 1 diabetes mellitus

(T1DM) (B), and T1DM plus zinc supplementation (T1DMS) (C) groups. TB,

trabecular bone; MS, medullary space; magnification 20X, scale bar: 50 μm.

Figure 2. Histomorphometric analyses of structural bone architecture.

Trabecular separation (TbSP, µm) (A), trabecular width (TbWi, µm) (B), and

trabecular bone area (BAr, %) (C) of control, type 1 diabetes mellitus (T1DM),

and T1DM plus zinc supplementation (T1DMS) rats. All data are shown as means

± SEM. Comparisons between groups were analyzed with Kruskal-Wallis ANOVA

on Ranks and Dunn’s post-hoc.

p < 0.01*/## vs. control group.

p < 0.001*/### vs. control group.

p < 0.05 **/# vs.T1DM group.

p < 0.001**/### vs.T1DM group.

Figure 3. Assessment of collagen deposition by picrosirius red staining.

Tibia staining for collagen content (picrosirius red). Total collagen (A), collagen

type I (B), and collagen type III (C) contents of the control, type 1 diabetes mellitus

(T1DM), and T1DM plus zinc supplementation (T1DMS) groups. All data are

shown as means ± SEM. Comparisons between groups were analyzed with

Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks and Dunn’s post-hoc.

p < 0.05 */# vs. control group.

Figure 4. Relative mRNA expression quantification. RANKL (A), OPG (B), OC

(C), COL1A (D), MMP-2 (E), and MMP-9 (F) mRNA expression in bone tissue of

control, type 1 diabetes mellitus (T1DM), and T1DM plus zinc supplementation

(T1DMS) rats. All data are expressed as fold-change vs. control group values,

normalized to GAPDH. Comparisons between groups were analyzed with

Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks and Dunn’s post-hoc.

p < 0.05*/# vs. control group.

p < 0.01*/## vs. control group.

57

Tables

Table 1: Biochemical analyses and body weight of control, diabetic and diabetic

plus zinc supplementation groups.

T1DM, type 1 diabetes mellitus; T1DMS, T1DM plus zinc supplementation;

ALP, alkaline phosphatase. All data are shown as means ± SEM. Comparisons

between groups were analyzed with Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks and

Dunn’s post-hoc.

p < 0.05*/# vs. control group.

p < 0.01*/## vs. control group.

p < 0.001*/### vs. control group.

p < 0.01**/## vs.T1DM group.

Control T1DM T1DMS

Body Weight (g)

336.0 ± 20.74

153.4 ± 76.51*/###

157 ± 14.44*/###

Glucose (mg/dL)

97.40 ± 18.96

598.4 ± 76.51*/###

604.8 ± 165.8*/###

ALP (U/L)

174.8 ± 126.1

346.2 ± 208.4

1803 ± 474.7*/###

Zinc (g mL−1)

1.616 ± 0.3889

0.7934 ± 0.3299*/#

2.712 ± 0.4702*/## **/##

58

Table 2: Tibia biomechanical parameters of control, diabetic and diabetic plus

zinc supplementation groups

T1DM, type 1 diabetes mellitus; T1DMS, T1DM plus zinc supplementation. All

data are shown as means ± SEM. Comparisons between groups were analyzed

with Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks and Dunn’s post-hoc.

p < 0.01*/## vs. control group.

Property/Groups Control T1DM T1DMS

Ultimate load (N)

82.85 ± 8.395 48.42 ± 14.71*/## 66.80 ± 9.04

Stiffness (N/mm)

133.21 ± 4.21 86.95 ± 16.80*/## 102.21 ± 6.75*/#

Ultimate Stress (N/mm2)

413.5 ± 24.32 392.9 ± 122.6 379.6 ± 108.8

Ultimate Strain (%)

1.677 ± 0.24 1.236 ± 0.26*/# 1.528 ± 0.18

Young´s modulus (GPa)

24.04 ± 1.58 20.07 ± 1.83*/# 23.37 ± 3.21

59

Figure 1

60

Figure 2

61

Figure 3

62

Figure 4

70

6.0 COMENTÁRIO, CRITICA OU SUGESTÃO

O projeto inicial foi intitulado: “Avaliação do efeito da suplementação com

zinco na osteopenia diabética em modelo animal tratado com insulina através da

análise de marcadores bioquímicos, histomorfométricos e moleculares do

metabolismo ósseo”. O objetivo principal era estudar de forma comparativa o

efeito do zinco e da terapia insulínica em animal diabéticos induzidos por STZ.

Durante o primeiro ano de doutorado observamos que o projeto deveria

ser alterado em alguns parâmetros, como por exemplo o período de estudo, os

marcadores envolvidos e ainda a inserção de novas metodologias, objetivando

o aumento do poder de publicação em revistas de impactos altos e enquadradas

em classificação A1 no Qualis capes. Dessa forma o projeto foi intitulado

primariamente em “Intervenção terapêutica com zinco na busca de novos

biomarcadores de diagnóstico precoce da osteoporose associada ao diabetes

mellitus”. Esse estudo teve seu financiamento aprovado na chamada pública

Aviso ETENE/FUNDECI 06/2011, edital publicado pelo Banco do Nordeste(BNB)

e registrado sob o número de protocolo 4269. A priori teríamos a possibilidade

de realizar um trabalho de larga escala, utilizando as metodologias mais

avançadas em termos tanto moleculares como estudo transcriptômico

envolvendo a utilização da técnica de microarray através da plataforma

Affymetrix, bem como estudo histomorfometricos utilizando metodologias em 3D

de Tomografia Computadorizada denominada micro-CT. Porem após quase dois

anos da aprovação e nenhum deposito referente à aprovação no edital citado,

no dia 12/08/2013 recebemos o comunicado via FUNPEC que após mudanças

administrativas no BNB, estariam sendo implantadas novas diretrizes para

seleção de projetos e aplicação dos recursos dos fundos sob sua administração.

Sendo assim, o projeto por nos aprovado foi arquivado, uma vez que o

BNB/ETENE não daria continuidade a análise técnica/financeira e posterior

celebração de convenio.

Após diversas tentativas para o recebimento do fomento aprovado e

mediante as respostas negativas, o projeto de doutorado teve que mais uma vez

sofrer mudanças, sendo a versão final apresentada na atual tese intitulada

71

“Proteção contra a perda óssea induzida pelo diabetes tipo 1 através da

suplementação com zinco: análises biomecânica, histomorfométrica e molecular

em ratos diabéticos induzidos por stz”.

Vale ressaltar que mesmo não tendo sido recebido o financiamento

aprovado, mantivemos algumas alterações em relação ao primeiro projeto, como

por exemplo o período de estudo, onde foi considerada a importância de um

período crônico, além de algumas metodologias como a biomecânica óssea e o

uso de diferentes marcadores, aumentando a importância e a confiabilidade do

estudo.

Uma segunda mudança foi realizada uma vez que a participação e

avaliação de resultados em importantes congressos mostraram a não

necessidade do uso de grupos tratados com insulina, uma vez que o principal

objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da suplementação com zinco em

condições crônicas de diabetes utilizando modelo animal induzido por STZ.

A realização do trabalho somente foi possível através de um convenio

existente entre as Universidade de Ribeirão Preto e a Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, sob a coordenação das Professoras Luciana Rezende

Alves de Oliveira e Adriana Augusto de Rezende, e ainda pela parceria

envolvendo o grupo coordenado pelo Professo Bento João Abreu do

Departamento de Morfologia da UFRN através de um projeto aprovado no Edital

CNPq.

Apesar do estudo ter sido realizado dentro do prazo de doutorado, a

realização do manuscrito a ser submetido para publicação teve atrasos, sendo o

submetida no 01/12/2014, porem aprovado pelo editor chefe da revista PlosOne,

e sendo enviado aos revisores. Dado esse obtido ate o momento.

O nosso estudo contribuiu de forma importante para o entendimento dos

fatores que estão associados ao desenvolvimento da perda óssea associada ao

diabetes tipo 1, além de apresentar o uso de suplementação com zinco como

possível terapia adjuvante no controle da perda óssea excessiva, visto que há

um esforço mundial na busca da elucidação dos mecanismos envolvidos no

desenvolvimento da perda óssea no diabetes além de busca por novas terapias.

Em nível pessoal, o doutorado resultou em um aprofundamento científico

e intelectual, adquirido através do aprendizado de novas técnicas, como a

biomecânica e avaliação do conteúdo de colágeno; do estudo em disciplinas,

72

como Bioética e Redação de Trabalho Científico, entre outras que me

proporcionou um amadurecimento científico e da discussão de artigos em nosso

grupo de pesquisa.

Ao longo da realização deste estudo a substituição de técnicas e períodos

de estudo foram alcançadas devido ao comprometimento e dedicação dos

alunos de iniciação científica, mestrandos e doutorandos integrantes do

LABMULT/LABIOMOL da UFRN e de todos os nossos colaboradores. Nossa

perspectiva quanto ao projeto é continuar o estudo de associação de

suplementação com zinco na perda óssea no diabetes tipo 1, buscando a

utilização de metodologias como as dos estudos de microarranjo e analises de

proteicas por Western Blot.

Ainda no âmbito pessoal, quanto à graduação, fui professor substituto na

disciplina de Farmacologia Básica no departamento de Biofisica e farmacologia

da UFRN, o que me permitiu adquirir um pouco de vivência em sala de aula, no

preparo das aulas e de outras atividades relacionadas ao ensino, com a

segurança de ser um professor sempre presente. Quanto à graduação, pretendo

continuar lecionando, orientar alunos de iniciação científica, trabalhos de

conclusão de curso e participar de projetos de pesquisa e extensão. Com o

objetivo de ampliar os meus conhecimentos e experiência científica e concorrer

ao ingresso em uma instituição de ensino superior, estou buscando

oportunidades de desenvolver novos projetos com o auxílio de bolsas de pós

doutorado CAPES/PNPD disponíveis em nosso laboratório de pesquisa.

Segue a produção técnico-científica que foi gerada pelo projeto de

pesquisa:

- Participação em congressos

1. SILVA, F. S., ARAUJO, D. N., BORTOLIN, R. H., SILVA, J. P. M., REZENDE, A.

A., ABREU, B.J, DIAS, F.A. L. Impaired Extracellular Matrix Turnover is

Ameliorated by Exercise Training in Short Term Experimental Diabetic

Cardiomyopathy. In: American Heart Association Scientific Sessions, 2014,

Chicago. American Heart Association Scientific Sessions. 2014.

73

2. BORTOLIN, R. H., URARAHY, M. A. G., SILVA, F. S., BATISTA, A. A. S.,

OLIVEIRA, G., SOUZA, K. S.C., BEZERRA, M. L., DUARTE, V. M. G., ABREU,

B.J, ALMEIDA, M G, REZENDE, L. A., REZENDE, A. A. Protective effect of ion

zinc on bone strength and flexibility: Bone biomechanical and molecular analyses

in: type 1 diabetes model In: 2014 Annual Meeting of American Society for Bone

and mineral Research/ASBMR and Symposium: The Effects of Diabetes and

Disordered Energy Metabolism on Skeletal Health, 2014,Houston.J Bone Miner

Res 29 (Suppl 1). 2014.

3. MAGANHA, J. C. P., SEGURA, G. G., BONJOVANNI, M. C., OLIVEIRA, G.,

BATISTA, A. A. S., BORTOLIN, R. H., MEDLIJ, C. B., MIRANDA, C. E. S.,

REZENDE, A. A., ARCARO, C., LOPES, R. S.,REZENDE, L. A. Análise

comparativa da desmineralização de vidrarias utilizadas para determinação de

zinco no tratamento da osteopenia em modelo animal In: 13 congresso de

iniciação científica e pesquisa, 2013, Ribeirão Preto. Anais de Pesquisa da

Universidade de Ribeirão Preto. 2013. v.14. p.1 420

4. OLIVEIRA, G., BONJOVANNI, M. C., BORTOLIN, R. H., ARCARO, C.,

BATISTA, A. A. S., MEDLIJ, C. B.,MIRANDA, C. E. S., REZENDE, A. A.,

REZENDE, L. A. Análise comparativa da desmineralização de vidrarias utilizadas

para determinação de zinco no tratamento da osteopenia em modelo animal In:

XXVIII Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental

(FESBE), 2013, Caxambu. XXVIII Reunião Anual da Federação de Sociedades

de Biologia Experimental (FESBE). 2013.

5. SANTOS, F. M., BORTOLIN, R. H., FREIRENETO, F. P., BEZERRA, J. F.,

URARAHY, M. A. G., SOUZA, K. S. C., BEZERRA, M. L., MORAIS, L. V. F.,

BARBOSA, A. C. S., OLIVEIRA, Y. M. C., SILVA,, OLIVEIRA, A. M. L., HIRATA,

R. D. C., HIRATA, M. H., ALMEIDA, M G, REZENDE, L. A., REZENDE, A. A.

Evaluation of zinc and vitamin E supplementation on bone metabolism in diabetic

and osteopenic rat model In: 6th Congress of the International Society of

Nutrigenetics/Nutrigenomics, 2012, São Paulo. 6th Congress of the International

Society of Nutrigenetics/Nutrigenomics. 2012.

74

6. URARAHY, M. A. G., SOUZA, K. S. C., OLIVEIRA, Y. M., BEZERRA, M. L.,

SILVA,, FREIRENETO,F. P.,BEZERRA, J. F., BORTOLIN, R. H., DOIS, S. Q.,

ARRAIS, R. F., HIRATA, R. D. C., ALMEIDA, M G, HIRATA, M. H., REZENDE,

A. A. IL1B and TNFA Genes may be Associated with Microalbuminuria Onset in

T1DM Pediatric Patients from Brazil In: 72nd scientific sessions of American

Diabetes Association, 2012, Philadelphia. Diabetes (New York, N.Y.). , 2012.

v.61. p.1 884

7. BORTOLIN, R. H., HIMELFARB, S. T., SANTOS, F. M., OLIVEIRA, A. M. L.,

FREIRENETO, F. P., BEZERRA, J. F., MORAIS, L. V. F., URARAHY, M. A. G.,

BARBOSA, A. C. S., LEMOS, B. S., BRITO, F. A., ALMEIDA, M G, REZENDE,

L. A., HIRATA, R. D. C., HIRATA, M. H., REZENDE, A. A. Influence of high

glucose concentration on bone metabolism parameters on C57/BL6 mice fed with

high fat diet In: 72nd scientific sessions of American Diabetes Association, 2012,

Philadelphia. Diabetes (New York, N.Y.). , 2012. v.61. p.1 884

75

- Lista de trabalhos publicados, aceitos, prontos para submissão e em

preparação

- Artigos prontos para submissão

1. Effect of insulin therapy on bone formation is associated with the

upregulation of osteoprotegerin and osteocalcin gene expression in

streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.

Raul Hernandes Bortolina, Francisco Paulo Freire Netoa, Carlos Alberto Arcaro

Filhof, João Felipe Bezerraa, Marcela Abott Galvão Ururahya, Karla Simone da

Costa Souzaa, Valeria Morgiana Gualberto Duarte Moreira Limad, André Ducati

Luchessia, Francisco Pignataro Limab, Marcus Vinicius Lia Fookg, Bartolomeu

Jorge da Silvag, Maria das Graças Almeidaa, Bento João da Graça Azevedo

Abreuc, Luciana Augusto de Rezendee, Adriana Augusto de Rezendea*.

Author Affiliations:

aDepartment of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

bDepartament of Clinical Pathology, Federal University of Rio Grande do Norte,

Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

cDepartment of Morphology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,

Rio Grande do Norte, Brazil

dDepartment of Pharmacy, State University of Paraiba, Campina Grande,

Paraiba, Brazil

eDepartment of Chemistry, University of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, Sao

Paulo, Brazil

fDepartment of Clinical Analyses, São Paulo State University, Araraquara, São

Paulo, Brazil

gLaboratory of Evaluation and Development of Biomaterials, Federal University

of Campina Grande, Campina Grande, Paraiba, Brazil

*Corresponding author

76

Av. General Gustavo Cordeiro de Faria S/N, Petrópolis, 59012-570, Natal, RN,

Brazil.

Tel. +55 84 3342 9807, Fax +55 84 3342 9833

E-mail: adrirezende@yahoo.com

2. Association of Opg Gene Polymorphisms with Low Bone Mass for Cronological

Age in Children and Adolescentes with Type 1 Diabetes

Melina Bezerra Loureiroa, Marcela Abbott Galvão Ururahya, Karla Simone Costa

de Souzaa, Yonara Monique da Costa Oliveiraa, Heglayne Pereira Vital da Silvaa,

Raul Hernandes Bortolina, Francisco Paulo Freire-Netob, Rosário Dominguez

Crespo Hiratac, José Jorge Maciel-Netod, Ricardo Fernando Arraise, Maria das

Graças Almeidaa, Mario Hiroyuki Hiratac, Adriana Augusto de Rezendea*

(a) Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

(b) Department of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte,

Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

(c) Department of Clinical and Toxicological Analyses, University of São Paulo,

São Paulo, São Paulo, Brazil

(d) Department of Radiology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,

Rio Grande do Norte, Brazil

(e) Department of Pediatrics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,

Rio Grande do Norte, Brazil

*Corresponding author:

Av. General Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Faculdade de Farmácia,

Petrópolis, CEP: 59022-200 - Natal, Rio grande do Norte, Brazil.

Tel: +55 84 3342-9807/Fax: +55 84 3342-9833

e-mail: adrirezende@yahoo.com

77

3. Low bone mineral density in Type 1 diabetic patients: influence of reduced

IGF1, IGF1R, and TGFB1 expression

1Karla Simone Costa de Souza · 1Marcela Abbott Galvão Ururahy · 1Yonara

Monique da Costa Oliveira · 1Melina Bezerra Loureiro · 1Heglayne Pereira Vital

da Silva · 1Raul Hernandes Bortolin · 2Francisco Paulo Freire-Neto · 1João

Felipe Bezerra · 1André Ducati Luchessi · 3José Jorge Maciel Neto · 4Ricardo

Fernando Arrais · 5Rosario Dominguez Crespo Hirata · 1Maria das Graças

Almeida · 5Mario Hiroyuki Hirata · 1*Adriana Augusto de Rezende

1Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

2Department of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,

RN, Brazil.

3Radiology Center, Onofre Lopes University Hospital of Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

4Department of Pediatrics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN,

Brazil.

5Department of Clinical and Toxicological Analysis, University of São Paulo, São

Paulo, SP, Brazil

*Corresponding author:

Avenida General Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Faculdade de Farmácia

Petrópolis, Natal, RN, Brazil CEP: 59012-570

Tel: +55 84 3207-9807

Fax: +55 84 3342-9833

e-mail: adrirezende@yahoo.com and adrirezende@ufrnet.br

78

- Artigos em prepararo

1. Zinc Supplementation Effect on Bone Metabolism through RANK, RANKL

and OPG mRNA Expression in Ovariectomized and Streptozotocin-Induced

Diabetic Rats

Elaine Cristina da Silveira Ferreira1, Francisco Paulo Freire-Neto1, Raul

Hernandes Bortolin1, Karla Simone Costa de Souza1, João Felipe Bezerra1,

Marcela Abbott Galvão Ururahy1, Luciana Augusto de Rezende2, Ana Maria de

Oliveira Ramos3, Silvia Tchernin Himelfarb4, Thiago Vinicius Nadaleto Didone4,

Lucia de Fátima Campos Pedrosa5, Aldo da Cunha Medeiros6, Sonia de Quateli

Doi7, José Brandão Neto6, Rosario Domingues Crespo Hirata4, Maria das

Graças Almeida1, Mario Hiroyuki Hirata4, Adriana Augusto de Rezende 1*.

Author Affiliations

1Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

2Departament of Chemistry, University of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, São

Paulo, Brazil.

3Departament of Clinical Pathology, Federal University of Rio Grande do Norte,

Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

4Department of Clinical and Toxicological Analyses, University of São Paulo, São

Paulo, São Paulo, Brazil

5Departament of Nutrition, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Rio

Grande do Norte, Brazil.

6Department of Clinical Medicine, Federal University of Rio Grande do Norte,

Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

7Department of Medicine, Uniformed Services University of the Health Sciences,

Bethesda, Maryland, USA.

*Corresponding author: Adriana Augusto de Rezende

Av. General Gustavo Cordeiro de Faria, S/N, Petrópolis, 59012 -570 - Natal - RN,

Brazil. Phone. +55 84 3342 9807/ Fax +55 84 3342 9833.

79

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85

ANEXOS

86

ANEXO 1 – Via de sinalização mostrando a interação entre o sistema imune

e as células do tecido ósseo na osteoimunologia

Células envolvidas nos processos de imunidade inata e adaptativa expressando

molécula de RANK, RANKL ou OPG. RANKL é um mediador essencial da

formação, função e sobrevivência dos osteoclastos, e é produzido não apenas

pelas células do estroma da medula óssea e pelos osteoblastos, mas também

por células T. RANKL age por ligação ao receptor de RANK que é expresso em

monócitos e células dendríticas. O antagonista de RANKL é a OPG, que é

expressa por osteoblastos maduros e as células B e inibe a osteoclastogénese

induzida por RANKL. Adaptado de Ferrari-Lacraz S & Ferrari S, 2009 (39)

ANEXO 2 – Mecanismos moleculares envolvendo o zinco na estimulação

da formação óssea pelos osteoblasto e mineralização.

87

O zinco estimula a diferenciação e proliferação celular, bem como a

mineralização em osteoblastos. O zinco estimula a expressão do gene de várias

proteínas incluindo o colagénio tipo I, fosfatase alcalina, a osteocalcina. O zinco

aumenta a produção de IGF - I e TGF - β1 nas células. Além disso, aumenta a

síntese de proteínas devido à ativação d a síntese do aminoacil do RNA

transportador, uma enzima limitante da velocidade no processo de tradução em

células osteoblásticas. Adaptado de Yamaguchi (2012) (50).

ANEXO 3 – Papel do íon zinco na inibição da reabsorção óssea.

88

O zinco suprimi a osteoclastogénese, que é induzida por vários fatores de

reabsorção óssea em cultura celular de medula óssea. O zinco também estimula

a expressão genica de OPG, que inibindo a ligação de RANKL- RANK nos

receptores das células. O zinco tem um efeito estimulador sinérgico sobre a

síntese de proteínas e a expressão do gene de várias proteínas que estão

relacionadas com a apoptose osteoclástica do osso e atividade de reabsorção

óssea. Adaptado de Yamaguchi (2012) (50).

ANEXO 4 - Parecer consubstanciado final da avaliação do projeto pelo

Comitê de Ética no Uso de Animais - CEUA UFRN

89

90

ANEXO 5 - Parecer consubstanciado final da avaliação do projeto pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da UNAERP