pÓs-graduaÇÃo em microbiologia e parasitologia … · talita, marília, e ao aluno de...
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PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
APLICADAS
BÁRBARA BIANCA DO NASCIMENTO PEREIRA
ESTUDO DA Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet
& Henry, 1911 EM Felis catus (Linnaeus, 1758) NA
REGIÃO OCEÂNICA DE NITERÓI-RJ/ BRASIL
Orientadora: Drª Beatriz Brener de Figueiredo
NITERÓI
2016
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BÁRBARA BIANCA DO NASCIMENTO PEREIRA
ESTUDO DA Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet
& Henry, 1911 EM Felis catus (Linnaeus, 1758) NA
REGIÃO OCEÂNICA DE NITERÓI-RJ/ BRASIL
Orientadora: Drª Beatriz Brener de Figueiredo
Niterói
2016
Dissertação apresentada ao Curso de Pós
Graduação Strictu Sensu em Microbiologia
e Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do título de mestre em
Parasitologia.
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BÁRBARA BIANCA DO NASCIMENTO PEREIRA
ESTUDO DA Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet
& Henry, 1911 EM Felis catus (Linnaeus, 1758) NA
REGIÃO OCEÂNICA DE NITERÓI-RJ/ BRASIL
Orientadora: Drª Beatriz Brener de Figueiredo
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Drª. Adriana Pitella Sudré - UFF
____________________________________________________
Drª Teresa Cristina Bergamo do Bomfim - UFRRJ
____________________________________________________
Drº. Rodrigo Caldas Menezes - Fiocruz
Niterói
2016
Dissertação apresentada ao Curso de Pós
Graduação Strictu Sensu em Microbiologia
e Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do título de mestre em
Parasitologia.
4
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Rose e João e ao meu irmão
Bernardo, que por meios diferentes,
contribuíram na minha educação e paixão
pelos gatos. Por me criarem rodeados deles,
em meio a muito amor e carinho.
Ao Lucas Motta, meu companheiro de todas as
horas e gateiro incondicional, obrigada por ser
a perfeita metade que me completa.
5
Agradecimentos
À Deus, por me dar saúde e a oportunidade de vivenciar tamanho aprendizado.
À Profª. Drª. Beatriz Brener, pela orientação.
Ao Bernardo, que se saiu um excelente irmão mais velho cuidando da caçula com
tanto esmero, me acolhendo e tratando a dissertação como se fosse sua.
À Bethânia Bastos, pelos ensinamentos de como escrever um artigo. Não estaria
aqui neste momento sem a sua orientação.
Às professoras da Parasitologia da Universidade Federal Fluminense por serem
exemplos profissionais e colaborarem com o trabalho.
À Professora Drª Daniela Leles, por todo ensinamento da análise molecular e
orientações. O trabalho ganhou outro peso após a sua correção.
À Professora Ana Beatriz Fonseca, do Instituto de Matemática da Universidade
Federal Fluminense, pelo suporte estatístico do presente estudo.
À Vivian Pinho pela amizade e companheirismo. Sem você eu estaria até agora
coletando amostras.
Aos proprietários dos gatos, pela confiança no trabalho e todo o carinho durante
esses dois anos, em especial os gateiros de colônias como Alice e Nadia, Ana Maria
e Maria José, Rose e Sylvio, Stela, Cristina, Daniela, Scheila, Marlene, Rosa,
Marlene e Francisco, o tutor “premiado”.
Às Clínicas Veterinárias colaboradoras: Vet Calazans e Vetmar, em especial o Dr.
Laélio Ronconi por ceder amostras dos pacientes felinos e principalmente ao Dr.
Leonardo Chads por separar pacientemente os tubos. “Tamu junto!”
Aos alunos de graduação que participaram da fase prática do trabalho: Magda,
Talita, Marília, e ao aluno de iniciação científica Lucas Keidel.
À Juliana Torres. Sua amizade foi um dos dois prêmios que ganhei durante o
mestrado. Sem você e sem a Dani teria pesadelos até hoje com a Estatística.
À Kamilla Xavier, meu clonazepam em forma de gente nesta reta final.
À turma “Luluzinha” das mestrandas UFF 2014.
Ao Dr. Roberto Fabri, por todo apoio e suporte nos momentos difíceis.
À Maria Fernanda (Nanda), pela amizade, cumplicidade e companheirismo desde a
Graduação.
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À Claudinha e Evelyn pela ajuda em coletivo e parceria não apenas nas subidas e
descidas das montanhas, mas também nas descidas e subidas da vida.
À todos que de alguma forma contribuíram para o trabalho.
À comedorme. Gatinha “premiada” e protagonista deste trabalho.
À espécie Felis catus, grande inspiração do trabalho. Seres com os quais devemos
aprender a levar a vida de maneira mais leve, delicada, sutil e bela.
À CAPES, agência de fomento que colaborou na realização do presente trabalho.
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“Qual presente é melhor que o amor de um gato?”
Charles Dickens
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Resumo
A dirofilariose é uma doença causada pelo nematoide Dirofilaria immitis
(Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911, que acomete cães, gatos e humanos, dentre
outros animais. O mecanismo de infecção se dá pelo repasto sanguíneo de
mosquitos da família Culicidae. Os hospedeiros definitivos são os canídeos aos
quais esse helminto é mais bem adaptado devido a presença de microfilaremia
durante a infecção, colaborando, desta forma, para a manutenção da transmissão.
No entanto, os relatos da infecção em felinos têm sido cada vez mais frequentes,
principalmente em regiões onde existem cães microfilarêmicos e hospedeiros
intermediários. Partindo desta premissa, decidiu-se investigar a ocorrência de
Dirofilaria immitis na região de em uma população de gatos dos bairros da Região
oceânica da cidade de Niterói – Rio de Janeiro/ Brasil, por diferentes métodos
diagnósticos: parasitológico pelo Knott modificado e pesquisa em esfregaço
sanguíneo, imunológico através de kit imunocromatográfico e molecular pela PCR.
Foram coletadas 387 amostras de sangue total de gatos residentes nos bairros de
Piratininga, Cafubá, Jacaré, Camboinhas, Itaipu, Itacoatiara e Engenho do Mato,
bairros onde a prevalência da infecção em cães é de cerca de 25%. Foi encontrado
um nematóide pela técnica de Knott modificado, que em sua análise morfométrica,
verificou-se que estava fora do intervalo métrico de microfilárias. O teste
imunocromatográfico bem como a análise molecular desta amostra obtiveram
resultado negativo. Uma amostra foi positiva no teste imunocromatográfico. Após a
confirmação diagnóstica, o felino cuja amostra foi positiva em técnica imunológica
veio a óbito. Durante a sua necrópsia, um parasito fêmea de 27,5 centímetros foi
coletado da artéria pulmonar. A amostra sanguínea bem como o parasito foram
submetidos à técnica de biologia molecular, confirmando o resultado do teste
imunológico. Outras 30 amostras foram analisadas pelo diagnóstico molecular e
sequenciadas, porém todas deram resultado negativo. O presente estudo encontrou
uma ocorrência de 0,2% da população felina da região infectada por D. immitis.
Palavras-chave: Felinos, dirofilariose, Dirofilaria immitis, diagnóstico.
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Abstract
The heartworm disease is caused by the Dilofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet &
Henry, 1911, that affect dogs, cats and humans, among other animals. The infection
mechanism is due to the blood's repast of the Culicidae family mosquitos. The final
hosts are the canids which this helminth is better adapted due to the presence of the
microfilaremia while the infection, collaborating, in this way, to the transmition's
maintenance. Although, the reports amongst felines are becoming more frequent,
mainly in regions where there is presence of microfilaremic dogs and intermediary
hosts. Starting from this premise, it was decided to investigate the occurrence and
the mol=ecular profile of the Dirofilaria immitis in the cats' population of oceanic
region of Niteroi - Rio de Janeiro/Brasil, through the cox1 and 12s gene's fragments.
For so, were collected a total of 387 blood samples of cats that are living in the
neighborhoods of Piratininga, Cafubá, Jacaré, Camboinhas, Itaipu, Itacoatiara and
Engenho do Mato, neighborhoods where the infection's prevalence amongst dogs is
about 25%. The diagnoses were made through laboratorial tests for the parasitologic
and immunologic research, being: microfilaria's research in blood smear;
microfilaria's research through the modified Knott's technique on all the blood
samples and immunochromatography's antigen research on the 205 firsts collected
samples. It was found a nematode through the modified Knott's technique, that in it's
morphometric analysis, was found that it was out of the microfilaria's metric gap. This
immunochromatic test, as well the molecular analysis of this sample got negatives
results. One sample was positive in the immunochromatography's test. After the
diagnoses confirmation, the feline which had a positive in the immunologic sample,
came to death. In the necropsia, a female parasite of 27,5 centimeters was collected
in the pulmonary artery. The blood sample, as well as the parasite were submitted to
the molecular biology technique, confirming the immunologic test result. The present
study found a 0,2% occurence in the cats population infected by D. immitis.
Key-words: Cats, dirofilariosis, D. immitis, diagnostic.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01: Parasitos adultos de D. immitis. Em seta vermelha, parasito fêmea, maior que o macho (seta verde). Macho apresentando cauda espiralada.
p.17
Figura 02: Microfilária encontrada em sedimento pela técnica de Knott
modificada, sem a coloração pelo azul de metileno.
p.18
Figura 03: Ciclo biológico da infecção por D. immitis. p.23
Figura 04: Mapa do Estado do Rio de Janeiro, com evidência (seta) para a cidade de Niterói.
p.42
Figura 05: Mapa da cidade de Niterói com evidência (círculo) para a
Região Oceânica.
p.43
Figura 06: Mapa da Região Oceânica de Niterói e seus principais bairros.
p.43
Figura 07: Larva encontrada pela técnica de Knott modificada em uma
amostra sanguínea de gata.
p.48
Figura 08: Sorologia positiva obtida de uma amostra sanguínea de gato residente do bairro de Piratininga, Niterói/ Rio de Janeiro.
p.49
Figura 09: Parasito fêmea (seta) após a abertura do ventrículo direito de
felino.
p.50
Figura 10: Parasito fêmea após remoção da artéria pulmonar. Seta
verde aponta a porção anterior do parasito enquanto a seta
branca indica a porção posterior.
p.50
Figura 11: Amplificação para o alvo cox 1 (500 pb): de um a 13: amostras; p.51
14: controle positivo; 15: controle negativo; 16: marcador
molecular conhecido de 1kb (500pb seta).
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 01: Porcentagem de felinos positivos em diferentes estudos sobre a infecção por D. immitis, o número de amostras (N), método utilizado e referências.
p.39
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Sumário
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 14
2. REFERENCIAL TEÓRICO.............................................................................. 16
2.1. O PARASITO .................................................................................................. 16
2.2. CLASSIFICAÇÃO SISTEMÁTICA .................................................................. 16
2.3. MORFOLOGIA ............................................................................................... 17
2.4. HOSPEDEIROS ............................................................................................. 18
2.4.1. HOSPEDEIRO DEFINITIVO ........................................................................... 18
2.4.2. HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO .................................................................. 19
2.5. HABITAT......................................................................................................... 20
2.6. Wolbachia sp. ................................................................................................. 21
2.7. CICLO BIOLÓGICO ........................................................................................ 22
2.8. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ............................................... 23
2.9. DIAGNÓSTICO ............................................................................................... 25
2.9.1 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL .................................................................. 25
2.9.1.1 PESQUISA PARASITOLÓGICA ..................................................................... 25
2.9.1.2 IMUNODIAGNÓSTICO ................................................................................... 26
2.9.1.3 ENSAIO MOLECULAR ................................................................................... 26
2.9.2. DIAGNÓSTICO POR IMAGEM ...................................................................... 27
2.10. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA ...................................................................... 27
2.11. PROFILAXIA ................................................................................................... 29
2.12. INFECÇÃO HUMANA ..................................................................................... 30
2.13. INFECÇÃO EM FELÍDEOS ............................................................................ 32
2.14. DIAGNÓSTICO EM FELÍDEOS ...................................................................... 33
2.15. EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO POR D. immitis EM FELÍDEOS ............... 34
3. OBJETIVOS .................................................................................................... 41
3.1. OBJETIVOS GERAIS ..................................................................................... 41
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 41
4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 42
4.1. LOCAL DE ESTUDO ........................................................................................ 42
4.2. AMOSTRAGEM .............................................................................................. 44
4.3. MATERIAL BIOLÓGICO ................................................................................. 44
4.4. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO ...................................................................... 45
4.4.1. PARASITOLÓGICO ........................................................................................ 45
4.4.1.1 ESFREGAÇO SANGUÍNEO ........................................................................... 45
4.4.1.2 KNOTT MODIFICADO .................................................................................... 45
4.4.2. IMUNOLÓGICO .............................................................................................. 46
4.4.3 MOLECULAR ................................................................................................. 46
5. ASPECTOS ÉTICOS ...................................................................................... 47
6 RESULTADOS ............................................................................................... 49
7. DISCUSSÃO ................................................................................................... 53
8. CONCLUSÃO ................................................................................................. 60
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9. PRODUÇÕES ................................................................................................. 61
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 62
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1. INTRODUÇÃO
O nematoide Dirofilaria immitis (Leidy, 1856), é o agente etiológico da
dirofilariose, podendo infectar principalmente canídeos em diversos países do
mundo, bem como felídeos, furões e humanos. É transmitida por culicídeos, sendo
estes os hospedeiros intermediários da infecção. Os canídeos são os hospedeiros
definitivos aos quais esses helmintos são mais bem adaptados e neles a
microfilaremia é marcante, favorecendo a infecção do hospedeiro intermediário e
manutenção da transmissão.
A infecção em felinos era considerada rara, no entanto, estudos recentes
mostram que a prevalência da infecção em felídeos silvestres e em domésticos não
é tão baixa quanto se imaginava.
Felídeos naturalmente infectados albergam poucos parasitos adultos na
artéria pulmonar e átrio direito, e muitas vezes, tais helmintos encontram-se ainda
imaturos, o que torna a microfilaremia neles rara ou inexistente, dificultando o
diagnóstico.
A dirofilariose felina pode levar os animais infectados a quadros mórbidos de
insuficiência respiratória, circulatória e muitas vezes à morte súbita, sendo o
diagnóstico geralmente um achado de necrópsia, fomentando a necessidade de
desenvolvimento de outras formas de diagnóstico.
O primeiro relato da infecção em gatos no mundo foi feita por Travassos em
1921, no Brasil. Apesar de ser um território com diversas regiões endêmicas e clima
favorável ao hospedeiro intermediário, foram publicados apenas três relatos do
parasitismo em felinos no país, diagnosticados por necrópsia após o trabalho
supracitado.
Até o momento, o único estudo sorológico em gatos no Brasil, foi uma
pesquisa de anticorpos anti-D. immitis em 55 animais no município de Niterói/Rio de
Janeiro, que não revelou positividade.
15
Diversos países realizam pesquisas da infecção por D. immitis em felinos, e
alguns destes mostram que a prevalência desta infecção é maior até do que as
infecções pelo vírus da Leucemia felina (FelV) e da imunodeficiência felina (FIV),
viroses que levam à grande preocupação na prática clínica, evidenciando que gatos
estão tão susceptíveis à dirofilariose como à FIV e FeLV.
Em função da deficiência de pesquisa em dirofilariose felina in vivo no Brasil,
o objetivo deste trabalho foi estudar a ocorrência e o perfil molecular de D. immitis
em gatos em uma região endêmica desta infecção em cães, onde a prevalência
nestes é de 25% da população.
16
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. O PARASITO
O Termo “Dirofilaria” é derivado da palavra latina Diro e Filum, que significa
"fio do mal". Cães, gatos, raposas, e outros mamíferos são os hospedeiros naturais
deste parasito. Os hospedeiros intermediários são os mosquitos, fundamentais para
infecção dos hospedeiros definitivos. O humano é considerado hospedeiro acidental
desta parasitose (BIELAWSKI; HARRINGTON; JOSEPH, 2001). Os parasitos vivem
normalmente no ventrículo direito e artéria pulmonar, mas também podem ser
encontrados em outras regiões do corpo. As fêmeas de D. immitis são vivíparas e as
microfilárias podem ser encontradas no sangue do hospedeiro definitivo (Georgis,
2010).
2.2. CLASSIFICAÇÃO SISTEMÁTICA
A classificação sistemática do parasito, segundo Anderson (2000)
corresponde a:
Reino Animalia
Filo Nemathelmintes
Classe Nematoda
Ordem Spirurida
Superfamília Filaroidea (Weiland, 1958) Stiles 1907
Família Oncocercidae (Leiper, 1911)
Gênero Dirofilaria Raillet & Henry, 1911
Espécie Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911
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2.3. MORFOLOGIA
Dirofilaria spp. são nematoides longos, de coloração esbranquiçada, com
boca sem lábios, circundada por papilas cefálicas muito pequenas, e esôfago
dividido em porção anterior muscular e posterior glandular. Possui asa caudal bem
desenvolvida suportada por papilas pré- anais.
Os parasitos apresentam acentuado dimorfismo sexual. Os machos medem
de 12 a 20 cm de comprimento, contando com dois espículos distintos, em tamanho
e forma, sem gubernáculo e cauda espiralada. (FIGURA 01) As fêmeas medem de
25 a 31 cm de comprimento, possuem extremidade caudal arredondada e vulva
ligeiramente abaixo da junção do esôfago com o intestino (ANDERSON, 1952,
WEBBER, 1955, SOULSBY, 1968, URQUHART et al., 1990, BOWMAN, LYNN,
1995, VICENTE, 1997).
Figura 01: Parasito adulto fêmea (♀) e parasito adulto macho (♂) de D.
immitis.
Fonte:http://research.vet.upenn.edu/Hosts/Dirofilariaimmitis/tabid/7791/
Default.aspx
♀
♂
18
O comprimento das microfilárias de D. immitis é de 308 µm (295-325 µm) em
comprimento e 7 µm (5-7,5 µm) em espessura, sendo encontradas em quantidades
variáveis na corrente sanguínea dos hospedeiros definitivos, e podem sobreviver por
até dois anos (SIMON et al., 2012) (FIGURA 02).
2.4. HOSPEDEIROS
2.4.1. Hospedeiro Definitivo
A dirofilariose afeta canídeos e felídeos, tanto domésticos quanto silvestres,
principalmente cães, gatos e furões, assim como outras espécies de mamíferos,
incluindo lobos, coiotes, raposas, leões. Em relação às espécies silvestres, tais
como raposas e coiotes, que vivem na proximidade de muitas áreas urbanas, podem
ser consideradas importantes portadoras da infecção (AHS, 2014).
FIGURA 02: Microfilária encontrada em sedimento
pela técnica de Knott modificada, sem a coloração
pelo azul de metileno. Arquivo pessoal.
17,6 µm
19
A presença de cães infectados depende das medidas de manejo aplicadas
aos animais, incluindo: correto diagnóstico, profilaxia, viagens para regiões
endêmicas e mudança de residência (SIMON et al., 2012).
2.4.2. Hospedeiro intermediário
Os hospedeiros intermediários da dirofilariose são mosquitos da família
Culicidae, com aproximadamente 70 espécies dos gêneros Aedes, Anopheles, e
Culex, receptivas à infecção pelo parasito, ainda que a capacidade de transmissão
tenha sido demonstrada em menos de 12 espécies. Para que o mosquito seja
considerado um vetor, deve suportar o desenvolvimento do parasito até o estádio
larvar L3, capaz de infectar o hospedeiro definitivo (BAUTISTA et al., 1998).
A presença dos estádios L1/L2 (não infectantes) no mosquito, não implica
necessariamente em competência vetorial (VEZZANI E CARBAJO, 2006). A
influência do clima na distribuição e abundância dos insetos e na epidemiologia das
infecções por eles veiculadas é bastante conhecida. Têm ampla distribuição em
regiões de clima tropical e subtropical. Outro fator climático importante é a
precipitação pluviométrica que influi principalmente na densidade de criadouros,
devido ao aumento de acúmulo de água no peridomicílio, em períodos e locais com
maior frequência de chuvas (GLASSER et al., 2002).
A transmissão da Dirofilaria immitis em uma determinada região, depende
de um número mínimo de cães infectados com parasitos adultos liberando
microfilárias, e da presença de uma ou mais espécies de mosquitos capazes de
transmitir o parasito. Ela também está relacionada a dois fatores que afetam o ciclo
de vida do parasito: o comportamento humano em relação aos animais, quando os
transportam de regiões não endêmicas para regiões endêmicas, bem como os
fatores climáticos, que permitem a presença de mosquitos e consequente
desenvolvimento das filárias nesses hospedeiros (SIMON et al., 2012).
O desenvolvimento e a atividade dos mosquitos são influenciados pela
temperatura e umidade, fatores que interferem no desenvolvimento da larva de
20
terceiro estádio (L3) dentro deles. Já foi experimentalmente demonstrado, que o
desenvolvimento da larva L3 ocorre em oito a 10 dias em temperaturas de 28° a 30°
C, 11 a 12 dias a 24°C, 16 a 20 dias a 22°C. Abaixo de 14°C o desenvolvimento
larvar é interrompido, podendo retornar quando a temperatura voltar a subir
(GLASSER et al., 2002).
2.5. HABITAT
No hospedeiro definitivo, fêmeas e machos adultos habitam artéria pulmonar
e o ventrículo direito (VICENTE, 1997). Embora seu habitat esteja bem esclarecido,
diversos autores relataram a presença do parasito em localizações não usuais, tais
como Brener e colaboradores (2012), que descreveram a presença de um verme
imaturo em bolsa escrotal de um cão, além de parasitos adultos em cavidade
abdominal em uma cadela. Relatos de infecção intraocular também são encontrados
em literatura (PEREIRA et al., 1982).
Selene e colaboradores identificaram morfometricamente em 2015, um verme
adulto coletado após o vômito de um cão. Na análise molecular realizada em
seguida, foi confirmado que o parasito era D. immitis, com sequência idêntica à
várias outras já depositadas no banco de dados do GenBank.
Hodges e Rishniw (2008) analisaram dois cães, residentes de áreas
endêmicas para dirofilariose, com artropatias causadas pela presença de
microfilárias em líquido sinovial.
Em gatos, diversos estudos revelam a migração ectópica para o cérebro,
gerando sintomatologia clínica em sistema nervoso central (DONAHOE &
HOLZINGER, 1974; LABERTHE, 2003 apud DILLON, 1998).
21
2.6. Wolbachia sp. HERTIG, 1936.
O Gênero Wolbachia compreende espécies pertencentes ao Reino Bacteria,
Filo Proteobacterias, Classe Alphaproteobacterias, Ordem Richettsiales, Família
Anaplasmataceae (HERTIG, 1936). Caracterizam-se como bactérias gram-
negativas, possuem uma relação de simbiose com diversos filarídeos humanos e
animais, dentre eles a D. immitis (TAYLOR, 2005). Esta relação está associada à
capacidade reprodutiva do nematoide e por isso, têm sido alvo de terapias e controle
das infecções por filárias (HOERAUF et al., 2002).
O interesse direcionado à Wolbachia sp. está relacionado às patologias
inflamatórias, caracterizadas nas infecções por filárias. Este gênero de bactérias
pode induzir respostas pró-inflamatórias in vitro (BRATTING et al., 2001) e in vivo
(SAINT ANDRÉ et al., 2002).
Todos os parasitos de D. immitis albergam uma bactéria do gênero Wolbachia
(KRAMER 2003; KOZEK, 2005) e o microorganismo pode ser encontrado em todos
os estádios do ciclo biológico do parasito (BANDI et al., 1999).
Wolbachia sp. está presente nos vacúolos citoplasmáticos das células
hipodérmicas, localizadas nos cordões laterais dos parasitos adultos de Dirofilaria
immitis (KRAMER, 2005), nos ovários de parasitos fêmeas adultas e no
desenvolvimento embrionário desde oogonia à fase de microfilárias (HOERAUF et
al., 1999; SACCHI et al., 2002; KRAMER 2003; KOZEK, 2005) .
Durante a fase reprodutiva da D. immitis onde ocorre microfilaremia e nos
casos de morte dos parasitos, a Wolbachia sp. tem sido encontrada em grande
quantidade nas amostras sanguíneas dos hospedeiros infectados (BANDI et al.,
1999). Em contrapartida, estudos realizados com nematoides livres de Wolbachia
sp. mostram que a morte destes parasitos induz uma resposta inflamatória muito
menor no hospedeiro, quando comparados com as alterações inflamatórias dos
vermes que albergam a bactéria (KRAMER et al., 2005; KOZEK et al., 2005;
McCALL et al., 2005).
22
2.7. CICLO BIOLÓGICO
Na artéria pulmonar, e nos casos de altas cargas parasitárias ventrículo
direito, os parasitos adultos irão copular. A fêmea irá liberar microfilárias (L1) na
corrente sanguínea (SOULSBY, 1968). Durante o repasto sanguíneo, as fêmeas de
culicídeos suceptíveis ingerem as microfilárias, juntamente com o sangue do
canídeo infectado (TAYLOR, 1960; BRADLEY; NAYAR, 1987). No interior do
hospedeiro intermediário, as microfilárias migram até os túbulos de Malpighi. Em
seguida ocorrem, consecutivamente, as mudas para larva de segundo e terceiro
estádio (forma infectante do parasito para o hospedeiro definitivo) medindo cerca de
1300µm de comprimento. As larvas então migram até a região cefálica do mosquito,
localizando-se na probócide (TAYLOR, 1960; BRADLEY; NAYAR, 1987).
Durante seu repasto sanguíneo, as L3 alojadas no aparato bucal do
hospedeiro intermediário, são depositadas na pele do hospedeiro definitivo quando o
mosquito infectado realiza um novo repasto sanguíneo. A larva penetra ativamente
através da solução de continuidade, por onde migra pela região subcutânea, e sofre
maturações durante alguns meses. Após esse processo, a forma adulta chega ao
habitat, fechando o ciclo. Os parasitos adultos podem sobreviver por até sete anos
nos cães (BORTHAKUR; MUKHERJEE, 2010) e as microfilárias por dois anos
(SIMON et al., 2012). Nos gatos, os parasitos sobrevivem no habitat entre dois e três
anos (AHS, 2014).
O período pré-patente é de aproximadamente sete meses em cães (FIGURA
03) (SILVA; LANGONI, 2009). Em felinos, o mesmo período pode variar entre sete e
oito meses, e se houver período de patência, ocorre por até dois meses (BOWMAN,
2009).
23
2.8. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A dirofilariose é causa importante de doença cardíaca em cães, tendo sua
gravidade determinada pelo número de vermes adultos e pela interação do
hospedeiro com o parasito.
A maioria dos cães parasitados só apresenta sinais clínicos meses ou anos
após a infecção. Esses sinais dependem da reação de cada animal e da carga
parasitária, comumente relacionado à problemas cardíacos. (BORTHAKUR;
MUKHERJEE, 2010).
Em infecção experimental em camundongos, foi demonstrado que as
populações de eosinófilos e neutrófilos aumentam quando o sistema imune deste é
estimulado por antígenos da L3 ou pelo parasito adulto. Os neutrófilos se acumulam
nos rins e nas paredes das artérias pulmonares. Há a formação de reação
granulomatosa, iniciada quando há parasitos nos ramos arteriais pulmonares
(THEIS, 2005).
Figura 03: Ciclo biológico da infecção por D. immitis. Fonte:
https://www.heartwormsociety.org/ Janeiro, 2014.
24
D. immitis se desenvolve na artéria pulmonar do cão e, posteriormente, no
ventrículo direito, em casos de altas cargas parasitárias. Pode ocorrer um
enovelamento com inúmeros parasitos (AHS, 2014).
Em infecções mais intensas e duradouras as filárias, vivas ou mortas, causam
estenose dos vasos pulmonares e dificulta o fluxo sanguíneo, o que provoca, com o
tempo, deficiência funcional do ventrículo direito. Os sinais clínicos no cão podem
estar ausentes, ou se manifestar por tosse, intolerância a exercícios, dispnéia,
ruídos, cardíacos e pulmonares, hepatomegalia, síncope, tosse crônica e/ou, perda
de vitalidade (AHS, 2014).
A doença pode afetar diferentes órgãos, incluindo pulmões, coração, fígado e
rins. As lesões causadas pelos parasitos iniciam-se quando o endotélio das artérias
pulmonares é traumatizado, mecanicamente, pela movimentação dos vermes
adultos (BENGAS, 2008). As alterações endoteliais, parenquimatosas e a própria
presença dos vermes na artéria pulmonar, geram aumento progressivo das
alterações cardíacas (BENGAS, 2008). Lesões pulmonares ocorrem pela morte
natural do parasito ou induzida por fármacos. Há alterações significativas na
microcirculação e perfusão nos rins (LUDDERS et al., 1988).
Sabe-se que os cães infectados com vermes podem desenvolver lesões
renais associada com proteinúria. Evidências sugerem que tais lesões ocorram
devido a deposição do complexo antígeno-anticorpo nos glomérulos renais (AIKAWA
et al., 1981).
Nas formas graves, podem ocorrer manifestações de insuficiência cardíaca
direita, como ascite, congestão aguda do fígado e rins, hemoglobinúria e morte em
24 a 72 horas (ACHA & SZYFRES, 2003).
25
2.9. DIAGNÓSTICO
2.9.1. Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da infecção por D. immitis em cães é feito em rotina, pela
pesquisa parasitológica de microfilárias na circulação sanguínea ou por pesquisa
imunológica buscando anticorpo produzido pelo hospedeiro ou antígenos de verme
adulto no soro, plasma ou sangue total (LOMBARD, 1987). Com os avanços das
técnicas de biologia molecular, este método também pode ser utilizado como
diagnóstico desta infecção (ROCHA, 2010).
2.9.1.1 Pesquisa Parasitológica
Para pesquisar microfilárias, pode-se utilizar diversos métodos parasitológicos,
como o exame direto e os de concentração: técnicas de Knott modificada por
Newton e Wright (1956), e o método de filtração. As técnicas de concentração são
as mais sensíveis na determinação da presença de microfilárias (NEWTON &
WRIGHT, 1956).
Quando amostras sanguíneas de animais com microfilaremia são submetidas
à técnica de Knott modificado, as microfilárias apresentam-se com o corpo e
extremidade caudal estendidas e a extremidade cefálica afilada (HAHN, 1999).
Em felinos, a microfilaremia é transitória ou inexistente, devido à baixa carga
parasitária ou infecção por apenas um sexo (McCALL et al., 1992).
26
2.9.1.2 Imunodiagnóstico
Testes para pesquisa de anticorpos estão disponíveis para comercialização.
Estes detectam tanto os parasitos machos quanto fêmeas, pois ambos geram uma
resposta imunológica após dois meses de infecção. No entanto, um teste de
anticorpo positivo não é indicativo de infecção, apenas que o animal já entrou em
contato com o parasito (AHS, 2014). Diversos estudos mostram casos de gatos com
resultados falso-positivos, tais como Luria e colaboradores (2004), onde viram que
somente sete gatos, dos 64 positivos para anticorpo anti D. immitis, eram positivos
também no teste de antígeno para pesquisa do parasito.
Os testes para diagnóstico de antígenos detectam aqueles originados por
fêmeas adultas do parasito D. immitis. Um resultado positivo é confiável, todavia,
resultados falso-negativos são frequentes. Há vários motivos para esta baixa
sensibilidade, dentre eles: 1) infecções com baixa carga parasitária, dificultando a
detecção pelos testes, em virtude do baixo número de parasitos adultos fêmeas; 2)
infecções somente com parasitos machos; 3) quando a infecção é recente, mesmo
que o paciente já apresente sintomatologia, o antígeno pode não ser detectável
(LABARTHE, 2003).
2.9.1.3 Diagnóstico Molecular
A reação em cadeia da polimerase ("polymerase chain reaction" - PCR) é
uma ferramenta bastante sensível e precisa na identificação das microfilárias de
diferentes espécies, capazes de infectar cães e gatos. Existem muitos casos de
infecção por outros filarídeos, inclusive infecções com D. immitis, que produzem
microfilaremias persistentes com testes antigênicos negativos, sendo esta mais uma
das aplicações dos métodos moleculares (Rocha, 2010).
27
2.9.2. Diagnóstico por imagem
Radiografias de tórax podem fornecer evidencias do parasitismo além de
serem utilizadas para prognóstico e monitoramento do paciente (BRAWNER et al.,
1998). O sinal radiográfico mais evidente é o aumento do calibre das artérias
pulmonares (DONAHOE et al., 1976). Pode apresentar tortuosidade das artérias
pulmonares, hiperinsuflação dos pulmões, efusões pleurais e pneumotórax
(CHAFER et al., 1995). Tais alterações podem mudar rapidamente ou mesmo
desaparecem quando os hospedeiros definitivos são gatos, visto que podem debelar
a infecção (ATKINS et al., 1999).
Em gatos, se os sinais clínicos ocorrerem devido a chegada do parasito no
habitat, pode não haver tempo suficiente para gerar alterações perceptíveis em
exames radiográficos. O achado mais comumente observado é um padrão pulmonar
anormal e difuso (VENCO et al., 2008). Pode ocorrer quilotórax e pneumotórax,
contudo, segundo Atkins e colaboradores (1999), são poucas vezes observados.
O exame ecocardiográfico é capaz de detectar população adulta de D.immitis
em sistema cardiovascular de gatos, cerca de 8 a 12 meses após infecção (ATKINS,
et al., 2008)
2.10. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
D. immitis é cosmopolita, havendo casos registrados na Europa, Américas
do Sul e do Norte, África, Austrália e Ásia, porém, estão presentes, inicialmente, em
climas tropicais e temperados, próximos à costa e em meses mais quentes (SIMON
et al., 2012), que favorecem o desenvolvimento dos hospedeiros intermediários.
Morchón e colaboradores (2012), afirmam que a prevalência de dirofilariose
canina e felina está em expansão no Nordeste e centro da Europa, locais onde
então não haviam descrito a ocorrência da infecção. Novos casos estão sendo
relatados com maior frequência onde só havia casos importados. Esse aumento
28
pode ter relação com as mudanças climáticas e alterações no ecossistema feitas
pelo homem, emergência de novas espécies de hospedeiros intermediários
susceptíveis e também ao comportamento da população e globalização.
Da mesma forma, pode-se atribuir o crescente interesse da comunidade
científica nesta infecção, segundo Simon e colaboradores (2012), onde se faz
necessária para que medidas profiláticas e tratamento adequado sejam realizados
nos animais infectados. Recentemente foi relatado por Pereira e colaboradores
(2013), o primeiro caso canino na República de Cabo Verde e no mesmo ano foi
realizada a primeira publicação de um caso canino de D. immitis em Bangladesh,
aonde a infecção vinha sendo reportada pela população, mas nunca tinha sido
publicada (FUEHRER et al., 2013).
Labarthe e colaboradores (2014) mostraram que a prevalência desta
parasitose é de 23,1% em cães domiciliados de 15 diferentes regiões do Brasil.
Selene e colaboradores (2015) obtiveram uma prevalência de 24,9% de
cães infectados na região oceânica do Município de Niterói, Rio de janeiro, Brasil.
A presença de cães infectados vai depender das medidas de manejo
aplicadas aos animais, o correto diagnóstico e profilaxia, viagens dos animais para
regiões endêmicas e mudança de residência (SIMON et al., 2012).
Quando cães infectados residentes de áreas endêmicas viajam com os
donos para outras áreas, podem se tornar fontes de infecção para os mosquitos
locais e o parasito pode vir a se estabelecer em nova áreas antes conhecidas como
livres da infecção (LABARTHE et al., 1997).
29
2.11. PROFILAXIA
Atualmente a profilaxia é feita através de medicamentos que combatem o
hospedeiro intermediário ou por substâncias que atuam repelindo o mosquito do
animal. Apesar da eficácia, o uso de telas como medida profilática para dirofilariose
é raramente utilizado principalmente em cães que residem em casas com quintais,
locais onde a colocação de telas não seria muito dispendioso e pouco prático sob o
ponto de vista dos proprietários.
Nos cães de regiões endêmicas, a quimioprofilaxia deveria iniciar após oito
semanas de vida (AHS, 2014b).
Há uma variedade de opções para a quimioprofilaxia da infecção nos cães,
incluindo tabletes e gomas a base de milbemicina oxima e ivermectina, em
formulações de 6 a 10µg/kg mensais, e soluções tópicas a base de selamectina,
mensalmente, seguras e econômicas (AHS, 2007).
As ivermectinas orais foram os primeiros medicamentos aprovados pelo Food
and Drug Administration (FDA), e, assim como a milbemicina, bloqueiam o
desenvolvimento das larvas. Podem ser usadas ainda a selamectina topicamente e
a moxidectina, com benefícios similares às ivermectinas (AHS, 2014). Todos os
produtos quimioprofiláticos administrados por via oral ou tópica são indicados com
um intervalo de dosagem de 30 dias. Após esse período, a eficácia contra o quarto
estágio larvar diminui (AHS, 2014b).
A quimioprofilaxia mensal é uma opção segura e eficaz em gatos que vivem
em áreas onde dirofilariose é considerada endêmica em cães. Gatos vivem mais
abrigados que maioria dos cães pois muitas vezes residem dentro dos domicílios,
sendo denominados como gatos in door, o que não impede a infecção nestes,
apesar de serem menores as chances quando comparados com os gatos out door,
que possuem 3 vezes mais chances de se infectarem com o verme do coração, por
aumentar o seu contato com o hospedeiro intermediário. (AHS, 2014c).
Dentre as medidas profiláticas, também utiliza-se o tratamento dos cães
infectados. De acordo com a Sociedade Americana do verme do coração, a única
droga liberada para o tratamento adulticida segundo a FDA é o cloridrato de
melarsomina. Apesar dos riscos relacionados à administração da droga, ela possui
30
uma ação adulticida de 90 a 98% dependendo do protocolo instaurado, assim como
a carga parasitária individual canina (AHS, 2014b).
Em gatos o tratamento não encaixa-se como profilaxia da infecção, pois
estes hospedeiros apresentam microfilaria inexistente ou rara e por isso não são
considerados reservatório. (AHS, 2014c). A melarsomina é considerada tóxica e por
isso não é indicada como droga de escolha para tratamento. Além disso, existem
poucos estudos sobre o uso da droga em felinos (AHS, 2014c).
Nos casos de gatos sintomáticos, o indicado é a estabilização do paciente
através de tratamento intensivo e uso de corticosteroides, no entanto, foi observado
que o uso mensal de ivermectina na dose de 24µg/kg durante dois anos pode
reduzir em até 65% da carga parasitária quando comparados com gatos não
tratados (AHS, 2014c).
2.12. INFECÇÃO HUMANA
Onde a dirofilariose canina existir, existe o risco da infecção humana. A
distribuição mundial da dirofilariose humana não coincide exatamente com a canina,
principalmente devido à falta de dados. Existem países com casos humanos
relatados, mas sem dados de infecção canina e vice e versa (SIMON et al., 2012).
A dirofilariose humana caracteriza-se por comprometimento do parênquima
pulmonar ou nódulos subcutâneos. Neste, o ciclo de vida do parasito não se
completa, impossibilitando assim a transmissão da infecção (BORTHAKUR;
MUKHERJEE, 2010). Segundo Bielawski; Harrington e Joseph (2001), humanos
funcionam como hospedeiros acidentais da dirofilariose, nos quais o mosquito
infectado, ao realizar o repasto sanguíneo em sua pele, deixa a larva L3, que
através da circulação venosa chega ao ventrículo direito e morre, formando um
êmbolo que pode chegar até a artéria pulmonar onde é organizado dentro de um
nódulo com aspecto necrótico e fibroso. A maioria dos casos humanos é
assintomático (BIELAWSKI; HARRINGTON; JOSEPH, 2001).
Dentre todas as espécies do gênero Dirofilaria, as mais relevantes são D.
immitis e D. repens, devido a sua alta prevalência e, também, por causarem severas
31
patologias. D. immitis produz doença cardiopulmonar em cães e gatos e pode
causar dirofilariose pulmonar em humanos, já D. repens causa dirofilariose
subcutânea em cães, gatos e humanos. Nestes, também pode gerar dirofilariose
ocular (OTRANTO, 2011).
A imagem tradicional da dirofilariose humana inclui três conceitos: i) D. immitis
está associada a nódulos pulmonares e D. repens a nódulos subcutâneos e a
localização ocular; ii) infecção humana é causada apenas por parasitos imaturos; iii)
infecções humanas são esporádicas e acidentais. Este último paradigma está sendo
modificado devido ao aumento dos relatos relatos nos últimos 10 anos (SIMON et
al., 2012).
No relato de Foissac e colaboradores (2013), em março de 2012, próximo a
Marseille, França, houve um caso de uma mulher de 48 anos, que nunca havia
viajado para fora da França, que foi diagnosticada com dirofilariose subcutânea
causada por D. immitis. O nódulo apresentava-se na coxa direita e após a remoção
cirúrgica do parasito, foi erroneamente diagnosticado como D. repens pela analise
histopatológica, mas, a análise molecular pela PCR para os alvos 12S e cox 1, a
espécie causadora foi a D. immitis. Esse dado sugere que o diagnóstico por
histopatologia pode não ser confiável quando se analisa o parasito imaturo. Em
setembro de 2008 no Pará, Brasil, foi relatado um caso de dirofilariose ocular em um
paciente de 16 anos, os testes moleculares para os alvos 12S e cox1, apresentaram
similaridade com D. immitis, porém, houve diferenças nucleotídicas quando
comparadas as sequências depositados no GenBank e essa diferença foi
considerada maior que a faixa de variação intraespecífica relatada para essa
espécie nos EUA, Japão e Itália (OTRANTO et al., 2011). Em 2011 um caso de
dirofilariose conjuntival foi relatado em uma mulher de 51 anos na Itália, através da
biologia molecular a espécie causadora foi identificada como D. immitis (AVELLIS et
al., 2011).
32
2.13. INFECÇÃO EM FELÍDEOS
A importância clínica da infecção em gatos é grande, porque um pequeno
número de vermes é potencialmente letal. Apesar dos parasitos adultos vivos nas
artérias pulmonares causarem uma arterite local, alguns gatos nunca manifestam
sinais clínicos. Quando os sinais são evidentes, eles geralmente se desenvolvem ou
com a chegada dos parasitos na vascularização pulmonar, ou com a morte de
vermes adultos (AHS, 2014).
A primeira fase da doença ocorre aproximadamente três a quatro meses
após a infecção, acompanhado de resposta inflamatória vascular e parenquimatosa
agudas, ocasionada pela chegada dos parasitos, com posterior morte da maioria
deles. Esta fase inicial é, muitas vezes, diagnosticada como asma ou bronquite
alérgica, mas, na realidade, faz parte de uma síndrome conhecida como doença
respiratória associada à dirofilariose (Heartworm Associated Respiratory Disease -
HARD) (AHS, 2014).
Uma vez com infecção pulmonar estabelecida, evidências atestam que os
parasitos vivos podem suprimir o sistema imune, permitindo que muitos gatos
tolerem a infecção sem sinais clínicos, até que os vermes maduros comecem a
morrer, iniciando a segunda fase da doença. Os parasitos podem causar inflamação
e degeneração pulmonar, assim como tromboembolismo, que frequentemente gera
lesão pulmonar aguda fatal. Essas reações podem ocorrer mesmo naquelas
infecções com um único parasito, como resultado da sua morte (NELSON, 2007).
O Período pré-patente da dirofilariose em gatos é mais longo que em cães,
os vermes adultos encontrados são menores, a carga parasitária é menor, e a
microfilaremia é rara e/ou transitória. Apenas um parasito pode causar doença grave
com possibilidade de óbito em felinos, enquanto uma carga parasitária de
intensidade muito maior é necessária para causar as mesmas lesões ou fatalidades
em cães (DONAHOE, 1975).
Quando comparados com cães, a partir de infecções experimentais, gatos
mostraram-se relativamente mais resistentes. Também foi observado que o número
de larvas que se desenvolve à fase adulta, é menor. O número de gatos que se
recupera dos parasitos maduros é alto; o curto tempo de vida do parasito (dois a
33
três anos), a carga parasitária baixa (média de um a três vermes), a microfilaremia
inexistente, rara e/ou transitória, e a capacidade dos gatos de eventualmente
realizarem cura espontânea, reforçam essa teoria (McCALL et al., 1992).
2.14. DIAGNÓSTICO EM FELÍDEOS
O diagnóstico in vivo em felinos é um desafio em virtude das
particularidades desta infecção nos gatos. Existe uma variedade de sinais clínicos
que os gatos podem apresentar, tanto em estágios agudos como em estágios
crônicos da doença, dificultando o diagnóstico presuntivo (LITSTER; ATWELL,
2008; NELSON et. al. 2007), além de muitos casos assintomáticos de felinos
infectados (AHS, 2014c).
Pela microfilaremia ser incomum, transitória ou com baixas cargas
parasitárias, frequentemente a pesquisa parasitológica por técnicas de
concentração (Knott modificado e filtração) podem apresentar um resultado falso-
negativo (AHS, 2014c).
A American Heartworm Society relata que estudos realizados no norte da
Itália encontraram microfilárias de Dirofilaria repens em gatos. No Estado do Rio de
Janeiro, médicos veterinários relatam encontro acidental de microfilária em
esfregaço sanguíneo durante exame de rotina (informação pessoal).
A interpretação dos resultados nos testes para pesquisa de antígeno e
anticorpo nos gatos é limitado, quando comparada com a espécie canina. Em cães,
o teste para pesquisa de antígeno é considerado padrão ouro para o diagnóstico,
enquanto que em gatos, é mais comum a infecção por parasitos imaturos ou
parasitos masculinos. Mesmo com sintomatologia clínica, tal teste demonstra um
resultado falso-negativo (AHS, 2014,c).
A pesquisa de antígeno detecta infecção por parasito fêmea adulta, e um
teste negativo pode ocorrer devido a infecção por parasitos machos, ou infecções
por parasitos imaturos ou muito velhos (McCALL et al., 1995; PICHÉ et al., 1998).
34
A vantagem dos testes para pesquisa de anticorpo é o fato de conseguir
detectar o parasito após dois meses de infecção além de sua sensibilidade, que
independe do sexo do parasito. Contudo, os testes de pesquisa de anticorpo não
indicam a continuidade da infecção (AHS, 2014c).
No norte da Flórida, nos Estados Unidos da América, pesquisadores
demonstraram que dos 64 gatos positivos no teste de pesquisa de anticorpo, apenas
sete amostras foram positivas no teste de pesquisa de antígeno (LURIA et al., 2004),
o que indica que: ou os outros 57 gatos estavam na fase inicial da infecção e ainda
não se diferenciaram em parasito adulto, ou houve cura espontânea, já que gatos
são capazes de realizar com maior frequência do que cães (McCALL et al., 1992),
ou os parasitos adultos no habitat são do sexo masculino (LURIA et al., 2004).
Outra forma de diagnóstico da infecção por D. immitis em gatos é através da
pesquisa de anticorpos anti-proteína de superfície de Wolbachia sp , visto que gatos
produzem resposta imune contra a bactéria (KRAMER, 2005). No entanto, por mais
que o felino apresente anticorpos anti-proteína de superfície de Wolbachia sp, não
significa infecção ativa por D. immitis, apenas ilustra que este hospedeiro já entrou
em contato com o parasito (SACCHI et al., 2002; KOZEK et al., 2005).
A PCR também pode ser utilizada para confirmação diagnóstica nos casos de
amostras de gatos que apresentam larvas em sangue total. Liu e colaboradores
(2005), utilizaram em seus estudos o alvo 16S rRNA; Nuchprayoon e colaboradores
(2006), pesquisaram a infecção por D. immitis em gatos através dos alvos 18S e
5.8S; e Hyung e colaboradores (2013), obtiveram seus resultados a partir do alvo
Citocromo c oxidase subunit 1 (COI) .
2.15. EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO POR D. immitis EM FELÍDEOS
A ocorrência de dirofilariose em felídeos tem sua frequência intimamente
relacionada aos achados dessa infecção na população canina da mesma região.
Segundo Nelson e colaboradores (2008b), onde houver diagnóstico da parasitose
em cães, haverá casos desta infecção em gatos.
35
No entanto, Magi e colaboradores (2002), acreditam que a infecção por D.
immitis em gatos, não está diretamente relacionada à alta prevalência da infecção
em cães, pois o fator mais importante para a difusão da infecção é a abundância de
vetores.
Dillon e colaboradores (1996), e Atkins e colaboradores (1998), demonstram
que a frequência em gatos machos é maior do que em fêmeas, pois em ambos os
estudos, os machos eram mais infectados quando comparados com as fêmeas.
Atkins e colaboradores (1998) alegaram tal achado à diferença comportamental
entre os sexos, onde os machos possuem um hábito outdoor maior do que fêmeas,
tornando-se mais exposto ao hospedeiro intermediário. AHS (2014) indica que
animais com hábito outdoor, possuem três vezes mais chances de se infectarem em
relação aos gatos de hábito in door.
Diversos autores relacionam a prevalência da infecção em uma população
felina é de 5 a 20% à população de cães infectados por D. immitis, da mesma área
(RYAN & NEWCOMB, 1995; AHS, 2014; LEVY et al., 2003; VENCO et al., 2011).
A dirofilariose em gatos vem sendo cada vez mais diagnosticada em áreas
endêmicas para cães, com a prevalência de até 12%, de acordo com Tilley e
colaboradores (2004). Em Toscana, na Itália, Magi e colaboradores (2002)
encontraram uma prevalência de 24,9 % (87/349), de gatos infectados, utilizando o
método sorológico para pesquisa de antígeno.
Por técnicas sorológicas, Venco e colaboradores (2011) comentam em seu
estudo que anticorpos anti-D. immitis foram detectados em 10 gatos (4,7%) dos
felinos testados. No entanto, a necrópsia verificou que apenas seis dos 10 gatos
apresentavam parasito adulto. Estes seis gatos (2,8%) representavam cerca de 10%
da população canina (29%) infectada da mesma área na Itália.
Também por meio da sorologia, Veira e colaboradores (2014) pesquisaram
a prevalência da infecção na região central e norte de Portugal, onde encontraram
15,0% (65/434) de gatos que apresentavam anticorpo anti-D.immitis e anti-
Wolbachia.
36
Na região sul de Portugal foi detectado 4,8 % (13/271) de gatos positivos
para D. immitis, após diagnóstico por teste para pesquisa de antígeno (MAIA et al.,
2015).
Um estudo realizado através de necrópsias em gatos no sudoeste do
Texas, nos Estados Unidos, mostrou que 10% dos gatos analisados albergavam
parasitos adultos de D. immitis no coração. Tal resultado evidenciou uma taxa de
infecção por dirofilariose, superior à infecção pelo vírus da imunodeficiência e
leucemia felinas (NELSON, 2008a).
No primeiro estudo epidemiológico da infecção por D.immitis em gatos
realizado em Barcelona, Alonso e colaboradores (2014) encontraram uma
prevalência de 11,47% (87/758), utilizando técnica sorológica descrita por Morchón e
colaboradores (2004). Os alvos foram as pesquisas de anticorpo anti-D.immitis e
Anti-Wolbachia. Nesta mesma população, encontraram 0,26% (2/758) gatos
positivos para pesquisa de antígeno para D. immitis.
Os gatos não podem ser considerados reservatórios de microfilárias, visto que,
a microfilaremia é transitória ou inexistente (NELSON, 2008a). No entanto, Mak e
colaboradores (1980) encontraram uma amostra sanguínea de gato com
microfilárias, após análise de 477 amostras provenientes de gatos da Tailândia, que
foram submetidas à técnica de Knott modificado. Nuchprayoon e colaboradores
(2006) também encontraram microfilárias em uma amostra sanguínea de um gato.
Em seu estudo, que contou com a análise de 52 amostras analisadas, eles
observaram que os níveis de microfilaremia foram de 47microfilárias/20µl.
No continente asiático, Sukhumavasi e colaboradores estudaram que a
prevalência da infecção em gatos na Tailândia foi de 4,6% (34/746), onde o
diagnóstico foi realizado através de técnica sorológica para pesquisa de antígeno
(SUKHUMAVASI et al., 2012).
Liu e colaboradores (2005), não encontraram microfilárias nas 155 amostras
felinas analisadas em Gyiunggi, na Koreia em seus estudos. No entanto, 2,6%
(4/155) deram positivas no teste de pesquisa de antígeno. Estas quatro amostras
foram submetidas ao diagnóstico molecular, utilizando os primers para amplificação
do segmento do rRNA 16S, de 440 pares de bases. Tais amostras foram positivas
37
na PCR. Contudo, os autores não mencionaram se a sequência nucleotídica
apresentava similaridade com sequências de Dirofilaria spp. depositadas no
GenBank.
Hyunk e colaboradores (2013) fizeram um estudo de prevalência usando
235 amostras sanguíneas de gatos errantes por biologia molecular, também na
Koreia, no qual utilizaram como gene barcoding para D. immitis, fragmentos do
gene cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1). Os pesquisadores obtiveram uma
prevalência de 6% (14/235). Apesar de não haver diferença estatística relevante
entre os sexos, foi observado maior incidência em machos do que em fêmeas
(8/114, 7,0% e 6/121, 5,0% respectivamente).
Além dos gatos, a dirofilariose pode ocorrer em outros felídeos, como
relataram Mazzariol e colaboradores (2010), ao descreverem o caso de um
leopardo africano (Panthera pardus pardus), residente no zoológico da Região de
Veneto, província da Itália, que veio a óbito natural em março de 2009. Durante sua
necrópsia, foi constatado que a possível causa da morte tenha sido a oclusão da
região pilórica total e duodeno. Foram encontrados quatro helmintos em ventrículo
direito e dois em artéria pulmonar. Após análises morfométricas e confirmação por
PCR, tais helmintos eram D. immitis. Destes seis helmintos, haviam quatro machos
e duas fêmeas. O animal também apresentava grandes quantidades de microfilárias
em sangue periférico.
Apesar de diversos estudos demonstrarem a infecção por D. immitis em
felinos em vários países do mundo, há poucos relatos desta infecção em gatos no
Brasil.
O primeiro caso da infecção em gatos relatado em gatos no Brasil foi
realizado por Travassos em 1921. Todavia, de lá para cá, apenas outros dois
relatos da infecção em gatos e um relato em gato do mato pequeno foram descritos,
onde os diagnósticos foram mediante necrópsia (LABARTHE, 1997; FILONI, 2009;
BRANCO, 2009).
Em um estudo, 125 gatos da região metropolitana do estado do Rio de
Janeiro foram eutanasiados. Suas amostras foram submetidas à pesquisa de
microfilárias e os animais foram necropsiados. Todos os felinos foram
38
amicrofilarêmicos pela pesquisa de Knott modificado. Um gato apresentava um
parasito macho de 14,5 cm de comprimento, na região apical da porção cranial do
lobo pulmonar esquerdo (LABARTHE et al., 1997).
Labathe e colaboradores (2001) coletaram amostras sanguíneas e as
submeteram à pesquisa de anticorpos em 55 gatos do bairro do Engenho do Mato-
Niterói, onde a população canina apresentava 26% de animais microfilarêmicos.
Nenhum gato foi positivo na pesquisa sorológica. Até o momento, este é o único
estudo sobre frequência de infecção por D. immitis em população de gatos no Brasil.
Branco e colaboradores (2009) realizaram a necrópsia de uma gata sem raça
definida com 11 anos de idade, residente do bairro do Engenho Novo do município
do Rio de Janeiro e encontraram um parasito em ventrículo direito que foi
identificado como D. immitis. O felino, que residia em área não endêmica para esta
infecção, apresentou quadros de tosse, dispneia, e efusão pleural cerca de dois
meses antes da morte. Na noite anterior ao óbito súbito, a tutora relata que o animal
apresentava comportamento normal.
O terceiro relato da infecção de D. immitis em felino no Brasil foi descrito por
Filoni e colaboradores (2009), através do encontro de três parasitos adultos de D.
immitis (dois machos e uma fêmea) em ventrículo direito e uma fêmea, em
ventrículo esquerdo em um gato-do-mato pequeno fêmea (Leopardus tigrinus) de
vida livre da região de Ubatuba-SP, que veio a óbito com os sinais clínicos
compatíveis com a doença. Esse é o primeiro caso de infecção e doença
associados à D. immitis em L. tigrinus. Os autores sugeriram que o gato-do-mato
pequeno agiu como hospedeiro definitivo para este parasito, e confirmando que D.
immitis é um agente patogênico também para esta espécie, e não apenas para os
felinos domésticos.
Os estudos referenciados apresentam-se listados no Quadro 1.
39
QUADRO 1: Porcentagem de felinos positivos em diferentes estudos sobre a
infecção por D. immitis, o número de amostras (N), diagnóstico utilizado em cada
estudo e referências.
Região Geográfica N (%) Diagnóstico Referência
Tailândia 477 0,2 Microfilárias Mak et al., (1980)
Niterói – Brasil 55 0 Anticorpo Labathe et al. (2001)
Toscana – Italia 349 24,9 Anticorpo Magi et al. (2002)
Flórida – EUA 553 1,3 Antígeno Luria et al. (2004)
Flórida – EUA 380 7,6 Necrópsia Berdoulay et al.,
(2004)
Gyunngi – Koreia 155 2,6 Antígeno Liu et al., (2005)
Tailândia 52 1,9 Biologia Molecular Nuchprayoon et al.,
(2006)
São Paulo – Brasil 1 - Necrópsia Filoni et al., (2009)
Padova – Itália 1 - Necrópsia Mazzariol et al.,
(2010)
Tailândia 746 4,6 Antígeno Sukhumavasi et al.,
(2012)
Koreia 235 6,0 Biologia molecular Hyung et al., (2013).
Norte de Portugal 434 15 Anticorpo Anti-D.immitis
e Anti-Wolbachia
Veira et al., (2014)
Barcelona –
Espanha
758
11,47
0,26
Anticorpo Anti-D.immitis
e Anti-Wolbachia
Antígeno para D. immitis
Alonso et al., (2014)
Sul de Portugal 271 4,8 Antígeno Maia et al., (2015)
40
Devido a existência de estudos mostrando a alta prevalência da infecção
por D.immitis na região oceânica de Niterói, Rio de janeiro/ Brasil, a proposta do
presente estudo é investigar a ocorrência desta infecção na população de gatos
residentes nesta região.
41
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVOS GERAIS
Pesquisar a ocorrência de D. immitis na população de gatos residentes da região
oceânica do município de Niterói.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.2.1 Pesquisar a ocorrência de microfilárias mediante exames parasitológicos
através da técnica de Knott modificado, e pesquisa em esfregaço sanguíneo
de gatos da região oceânica de Niterói/RJ;
3.2.2. Pesquisar a ocorrência da infecção através da realização de teste
imunológico para pesquisa de antígeno de D. immitis em gatos da região
oceânica de Niterói/RJ e comparar os resultados com as pesquisas
parasitológicas;
3.2.3. Confirmação diagnóstica de D. immitis por meio da PCR, e sequenciamento
nucleotídico em amostras positivas nos exames imunológicos e microscopia.
42
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. LOCAL DE ESTUDO
O estudo foi realizado na região oceânica do município de Niterói, Rio de
Janeiro, Brasil, local este que compreende os bairros de Piratininga, Jacaré, Cafubá,
Camboinhas, Itaipu, Engenho do Mato e Itacoatiara, conforme ilustram as figuras 04,
05 e 06.
FIGURA 04: Mapa do Estado do Rio de Janeiro, com evidência (seta) para a cidade de Niterói. Fonte: http://spe-gge-rj.blogspot.com.br/2010/11/divisao-regional-gge-rjspe.html
43
FIGURA 05: Mapa cidade de Niterói com evidência
(círculo) para a Região Oceânica.
Fonte:http://www.agenciario.com/municipios/estrutura-prefeitura.asp?codMunic=47
FIGURA 06: Mapa da Região Oceânica de Niterói e seus principais bairros. Fonte: http://www.nitvista.com/index_frame.php?url=%2Fbrobm.php
44
4.2. AMOSTRAGEM
Por não ser conhecido o número real da população de gatos na região do
estudo, a estimativa de 385 gatos é necessária para fornecer um intervalo de
confiança de 95%, com erro de 5%, numa população de prevalência estimada em
30% (segundo fontes secundárias) de acordo com o teste de estimação de
parâmetros de inferência estatística para determinar a frequência da infecção em
gatos da região oceânica de Niterói/RJ.
4.3. MATERIAL BIOLÓGICO
As 387 amostras foram obtidas através de coletas em clínicas veterinárias
colaboradoras, gatis, abrigos de gatos, além de animais residentes da região,
durante o período de setembro de 2014 a agosto de 2015.
Os gatos foram escolhidos aleatoriamente, obedecendo apenas os requisitos
de, residir nos bairros da região estudada, não utilizar qualquer tipo de produto
profilático contra a infecção, e possuir mais de um ano de idade (tempo mínimo para
o período pré-patente). Não houve seleção por tipo de residência nem classe social
dos proprietários, tampouco o fato de serem ou não levados ao médico veterinário. É
uma região predominantemente composta por casas, e com isso, os gatos tinham
livre acesso às ruas, além de geralmente conviverem com outros animais, em sua
maioria cães.
Foi coletado um volume de amostra de no mínimo, 700 µl de sangue por
animal. Em seguida, o material foi transferido para um tubo contendo
etilenodiaminotetracético (EDTA), sendo posteriormente confeccionado esfregaço
sanguíneo.
Cinco necropsias foram realizadas durante o período do estudo. Um parasito
foi retirado da artéria pulmonar, submetido a análises morfométricas e moleculares.
45
4.4. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
4.4.1 Parasitológico
4.4.1.1 Esfregaço sanguíneo
Para esta técnica diagnóstica, foram analisadas 387 amostras. Após a
coleta de sangue, o esfregaço sanguíneo de cada animal foi confeccionado e fixado
em metanol, sendo então corado pelo método Panótico Rápido®. Os esfregaços
foram analisados no aumento de 100 x no microscópio Primo Star Zeiss, no
Laboratório de Parasitologia do Instituto Biomédico da Universidade Federal
Fluminense.
4.4.1.2 Knott modificado
Foram utilizados os princípios da técnica de Knott modificado, pois a
proporção de uma parte de amostra para nove de solução foi mantida. No entanto,
para a hemólise, ao invés da formalina a 2%, utilizou-se água destilada. Tal
mudança se deve ao fato de, caso uma larva fosse encontrada, haveria a opção de
se aproveitar o material para a análise molecular, uma vez que o uso do formol
poderia interferir negativamente no diagnóstico molecular. Por este mesmo motivo,
azul de metileno a 0,1% não foi utilizado. Devido às dificuldades encontradas
durante durante a coleta de alguns gatos, para padronizar, em todos foram usados
0,5ml de sangue total para 4,5ml de água destilada, mantendo-se, desta forma, a
proporção de uma parte da amostra para nove partes do diluente, conforme consta
indica-se na Técnica de knott modificado. Todas as 387 amostras foram submetidas
à esta técnica.
46
4.4.2. Imunológico
Foi utilizado o teste imunocromatográfico dirofilariose Ag, produzido pela
Alere®, de acordo com as especificações do fabricante. Das 387 amostras
coletadas, 205 amostras foram submetidas à técnica imunológica para pesquisa de
antígeno do parasito.
4.4.3. Molecular
Foram selecionadas 30 amostras sanguíneas e submetidas à técnica da
PCR. A extração de DNA foi feita utilizando o Kit Pure Link (Invitrogen®) adotando o
protocolo para amostras sanguíneas seguindo as instruções do fabricante, havendo
apenas a alteração do tempo de incubação com proteinase K para 30 minutos e a
eluição final em 50µL.
Na PCR, foram utilizados genes que são considerados barconding para D.
immitis. Foram usados fragmentos dos genes cytochrome c oxidase subunit 1
(cox1) e 12S rDNA (FERRI et al., 2009.
Na PCR, as reações foram acompanhadas de controle negativo (H2O) e
controle positivo (DNA do parasito adulto). Cada reação foi preparada no volume
final de 50µl (tampão [1X]; Mg [2,5 mM]; dNTP [0,2mM]; [100ng] de cada primer; 2.5
U taq Platinum – Invitrogen, 5µl DNA). Foram utilizados os primers forward COIfilF:
5’-TDTCTWTRDTDATTCGTT-3’ e reverse: D.imm-coxI R 5’-
GCACTGACAATACCAAT-3’, e forward D.imm-12S F 5’-
ATTTGTTGTAATATTACGA-3’ e reverse 12SR: 5’-ATT GAC GGA TGR TTT GTA
CC-3’, que amplificam um fragmento de aproximadamente 500pb e 470pb para o
gene cox1 e 12S rDNA, respectivamente (CASIRAGHI et al., 2001, 2004, 2006).
47
As reações foram submetidas em um termociclador programável a um ciclo
inicial de 5 minutos a 94ºC, seguido de 45 ciclos de 94ºC por 45 segundos, 50ºC por
45 segundos e 72ºC por 90 segundos, e extensão por 7 minutos.
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
2%, corado com brometo de etídio e visualizados em transluminador com luz ultra-
violeta (UV) e fotodocumentados.
Os produtos amplificados foram purificados ou quando na presença de
amplificações inespecíficas, foi necessário recortar do gel a amplificação na altura
correta, os produtos amplificados foram purificados com o kit IlustraTM GFXTM
PCR DNA and GEL Band (GE Healthcare).
Após a purificação, os produtos foram sequenciados em ambas as fitas em
sequenciador automático 3100 Applied Biosystems, pela plataforma
PDTIS/FIOCRUZ ou MIP/UFF. Os programas Chromas, BioEdit, Gendoc e DAMBE
foram usados na edição e análise das sequências nucleotídicas, as quais foram
comparadas às depositadas no GenBank.
Foi realizado o diagnóstico molecular de um parasito adulto, com o mesmo
Kit comercial, porém usando-se o protocolo para tecidos. Antes do processamento
da amostra, foi feita a maceração do parasito utilizando nitrogênio líquido.
Prosseguiu-se como os mesmos procedimentos supracitados para as amostras
sanquíneas.
5. ASPECTOS ÉTICOS
O presente projeto foi aprovado pelo comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA)/ UFF, sob o 357.
48
6. RESULTADOS
6.1. Parasitológico
Uma larva foi encontrada na técnica de Knott modificada (FIGURA 7).
Durante a análise morfométrica, a larva apresentava 300µm de tamanho e 8µm de
largura. Tais medidas não se relacionam com o intervalo morfomético de
microfilárias. A amostra sanguínea do animal foi submetida ao diagnóstico
imunológico onde apresentou resultado negativo.
Das 387 amostras analisadas pelas técnicas parasitológicas, em nenhuma
delas foram encontradas microfilárias.
FIGURA 07: Larva encontrada pela técnica de
Knott modificada em uma amostra sanguínea
de gata.
49
6.2. Imunodiagnóstico
O presente estudo verificou uma ocorrência de 0,2% (1/205) de gatos
infectados e diagnosticados por técnica de imunodiagnóstico.
No total, 205 amostras foram analisadas por todas as técnicas diagnósticas,
nenhuma amostra foi positiva nas técnicas de diagnóstico parasitológicas. Uma
amostra foi positiva para a infecção por D. immits na técnica imunológica utilizando o
kit imunocromatográfico.
Uma amostra foi positiva no diagnóstico imunológico (FIGURA 8). O animal
veio a óbito natural aproximadamente dois meses após a confirmação positiva para
o teste imunocromatográfico. Durante a necrópsia, foi encontrado um parasito
adulto fêmea dobrado em artéria pulmonar (Figura 9 e 10).
FIGURA 08: Teste imunológico positivo obtido de uma amostra
sanguínea de gato residente do bairro de Piratininga, Niterói/ Rio de
Janeiro.
50
FIGURA 09: Parasito fêmea (seta), após a abertura do ventrículo direito de
felino.
FIGURA 10: Parasito Fêmea após remoção da artéria
pulmonar. Seta verde aponta a porção anterior do
parasito enquanto a seta branca indica a porção
posterior.
51
6.3. Diagnóstico Molecular
A amostra sanguínea onde encontrou-se uma larva em técnica de Knott
modificado foi submetida à análise molecular. No entanto, não houve amplificação
para os alvos utilizados no estudo, COX 1 e 12S, específicos para D. immitis. A
mesma amostra foi analisada para o alvo ITS (internal transcribed spacer) que
amplifica nematelmintos, porém, o sequenciamento do produto amplificado não
apresentou similaridade com sequências de helminto, mas sim aplificações
inespecíficas que apresentava alguma similaridade com DNA humano.
A amostra sanguínea da gata com teste imunocromatográfico positivo para D.
immitis foi submetida ao diagnóstico molecular, no entanto, e a análise do produto
amplificado apresentou ligeira similaridade com DNA suíno e ovino.
O parasito adulto recuperado da artéria pulmonar do animal positivo em teste
de antígeno apresentou sequências idênticas a D. immitis já previamente
caracterizados em cães na região (Selene, 2015).
Das 30 amostras sanguíneas analisadas pela técnica da PCR, todas
amplificaram o alvo para o hospedeiro, mostrando não existir inibidores da reação
de PCR. Todas as amostras também apresentaram amplificações na altura do alvo
cox1 (FIGURA 11).
52
As amplificações na altura esperada que continham bandas inespecíficas
foram recortadas do gel e então purificadas para o sequenciamento. Porém, o
sequenciamento mostrou não ser a espécie D. immitis.
53
7. DISCUSSÃO
Segundo Nelson e colaboradores (2008b), onde houver diagnóstico da
parasitose em cães, haverá casos desta infecção em gatos. No entanto, Magi e
colaboradores (2002), acreditam que a infecção por D. immitis em gatos, não está
diretamente relacionada à alta prevalência da infecção em cães, mas sim à
abundância de vetores. Independente de qual seja o fator determinante para haver
a infecção em gatos, Labarte e colaboradores (1998) afirmaram que existem
potenciais vetores para a infecção de D.immitis na região oceânica de Niterói/RJ,
Brasil. E Selene e colaboradores (2015) relataram que a prevalência desta
parasitose é de 24,9% em cães residentes desta região. Portanto, tal localidade
apresenta tanto o fator citado por Nelson e colaboradores (2008b) como a ideia
sugerida por Magi e colaboradores (2002).
De acordo com Ryan & Newcomb em 1995, AHS em 2014; Levy em 2003 e
Venco em 2011, a população felina infectada por D.immitis corresponde de 5 a 20%
da população canina infectada da mesma área. Desta forma, segundo os autores, a
ocorrência no presente estudo deveria ser em torno de 1,25% a 5%, uma vez que, a
prevalência de cães infectados na região em 2015, é de cerca de 25%, segundo
Selene e colaboradores (2015).
O presente estudo encontrou uma ocorrência de 0,2% (1/205) das amostras
submetidas às técnicas imunológica e parasitológicas. Tal achado corresponde a
0,8% da população canina infectada da mesma área, portanto, encontra-se fora dos
5 a 20% dos cães parasitados da mesma região. Percentual este que vai de acordo
com os achados de Alonso e colaboradores (2014), onde os autores também
apontam uma prevalência de 0,2% (2/758) na pesquisa de antígeno para D. immitis.
No entanto, em suas pesquisas cujo diagnóstico foi feito por anticorpo, a prevalência
foi maior, com um percentual de 11,47% (87/758). A prevalência de 5 a 20% de
gatos em relação aos cães infectados deve-se colocar em consideração a técnica
diagnóstica empregada para detectar a D. immitis em felinos.
Em dezembro de 2008, o teste imunológico para pesquisa de antígeno de D.
immitis, foi incorporado ao kit sorológico para pesquisa de antígeno de FIV e FeLV,
54
da IDEXX Laboratories. Este teste, comumente utilizado na rotina clínica de gatos,
evidencia a necessidade do diagnóstico desta parasitose, tal sua importância na
população felina. O kit está disponível nos Estados Unidos da América, alguns
países da Europa e Austrália.
Na ausência de testes diagnósticos específicos para D.immitis em gatos no
Brasil, foi utilizado no presente estudo, o teste imunocromatográfico para pesquisa
de antígeno, confeccionado para o hospedeiro canino, da marca Alere®. De acordo
com o fabricante, o teste foi capaz de detectar o antígeno, mesmo que o hospedeiro
albergue apenas um parasito adulto fêmea em habitat.
Neste estudo, uma amostra foi positiva no teste imunológico. Apesar do kit
imunocromatográfico ser indicado para cão, o teste foi capaz de detectar a infecção
no hospedeiro felino, confirmando a sensibilidade descrita pelo fabricante. Tanto que
o gato referente a amostra positiva, albergava apenas um parasito fêmea
comprovado através de necrópsia.
O kit é sensível e específico para detecção do antígeno sexual do parasito
adulto fêmea de D. immitis. Este achado reitera as informações passadas pelo
fabricante. Tal eficiência, portanto, torna irrelevante a espécie do hospedeiro, visto
que, a presença de um único parasito adulto fêmea, é suficiente para o teste apontar
um resultado positivo.
O diagnóstico de D.immitis foi confirmado através da caracterização molecular
dos genes específicos para a espécie, mostrando se tratar do mesmo genótipo do
parasito que circula na região, como relatado por Selene (2015). Ou seja, apesar de
apenas um felino tenha sido diagnosticado, esta infecção tem relação direta à
endemia nos cães, o que torna a profilaxia nos cães ainda mais importante, pois
pode ocorrer uma relação na infecção em gatos.
Partindo desta premissa, Berdoulay e colaboradores (2004), compararam os
resultados dos testes diagnósticos, disponíveis nos Estados Unidos e de diferentes
fabricantes, que detectam a infecção por D. immitis. Em tais resultados, gatos que
foram positivos nos kits confeccionados para a espécie felina, também obtiveram um
resultado positivo nos testes direcionados ao hospedeiro canino. Seus achados
positivos foram confirmados mediante necrópsia dos gatos submetidos às análises
55
imunológicas. Comparando o resultado da pesquisa realizada por estes autores e o
encontrando no presente estudo, aparentemente o fato do hospedeiro ser canino ou
felino seja indiferente em relação a sensibilidade do teste para pesquisa de
antígeno.
Nenhuma amostra, das 387 analisadas, apresentou microfilárias. O encontro
de microfilárias é considerado um achado, devido a patência ser rara, transitória
e/ou inexistente. Tal informação vai de encontro com os resultados de outros
estudos cujo objetivo era a pesquisa de microfilárias em gatos. Labathe e
colaboradores (1997) também não encontraram microfilárias nas 125 amostras
sanguíneas felinas analisadas pela técnica de Knott modificado.
Em outro estudo, Labarthe e colaboradores (2001) também não encontraram
microfilárias nas 55 amostras sanguíneas de gatos residentes do bairro do Engenho-
do-mato, em Niterói/RJ, no ano de 2001.
Corroborando com o estudo realizado no Brasil, Liu e colaboradores (2005)
também não encontraram microfilárias após a análise das 155 amostras sanguíneas
de gatos na Koreia, apesar de, 2,6% (4/155) estarem infectados e terem sido
diagnosticados por técnica de pesquisa de antígeno. Os achados do estudo de 2005
assemelham-se ao presente estudo, pois ambos não encontraram microfilárias, no
entanto, a presença da infecção foi confirmada por técnica de pesquisa de antígeno
em ambos os estudos.
Todavia, Mak e colaboradores (1980) encontraram uma amostra felina com
microfilária, das 477 analisadas, ressaltando que, por mais que seja raro, não é
impossível encontrar microfilárias em gato. Para tal, basta que este apresente um
casal de parasitos fertéis em habitat.
Nuchprayoon e colaboradores (2006) também encontraram microfilárias em
um gato, de 52 amostras analisadas. Em seu estudo, eles comentam que os níveis
de microfilaremia foram de 47 microfilárias/20µl.
Em cães infectados por D.immitis, a carga parasitária é maior quando
comparados com gatos infectados. Apresentam parasitos machos e fêmeas em
56
habitat, fator fundamental para microfilaremia. Por isso os cães são considerados
reservatórios da infecção, tornando-se mais sensíveis à técnica de knott modificado.
Mazzoriol e colaboradores (2010) realizaram contagens de microfilárias em
um leopardo africano, e encontraram uma concentração média de 2400
microfilária/ml. De acordo com Atkins e colaboradores (1998) felinos possuem menor
capacidade de biomassa, quando comparados com cães, e que tal fato ajuda a
justificar uma menor carga parasitária de vermes adultos em habitat. No entanto, um
leopardo, tal como cão, possuem maior capacidade de biomassa que gatos.
Portanto, pode-se concluir que a relação de parasitos adultos em habitat pode estar
mais relacionada à capacidade física do hospedeiro em comportar parasitos adultos,
do que o fato de ser um felídeo ou um canídeo. Com isso, segundo Nelson (2008a)
a microfilaremia é rara, transitória ou inexistente nos felinos, em se tratando de
pequenos felinos. Os autores constataram que o leopardo, com maior volume
hemodinâmico, é capaz de comportar mais exemplares de parasitos adultos, e
consequentemente, microfilaremia.
Uma amostra apresentou um nematoide na técnica de Knott modificado. De
acordo com a análise morfométrica, tal larva apresentava largura superior à das
microfilárias. A amostra foi negativa para o teste imunológico, bem como na
pesquisa de microfilárias em lâmina.
A colônia na qual o felino da amostra com o nematoide residia, apresentava
alta taxa de infecção por Toxocara sp. Desta forma, pode haver a chance de ser
uma larva desde ascarídeo em fase migratória do seu ciclo evolutivo.
Para sanar a dúvida, a amostra foi submetida ao diagnóstico molecular para
amplificação de genes específicos do Filo Nemathelmintes. Contudo, houve
amplificação com pouca similaridade com DNA humano. Provavelmente, havia
pouco material genético reverente ao helminto no restante da alíquota. Apesar de
ser um alvo específico, ele foi capaz de amplificar este DNA, o que pode sigerir uma
contaminação da amostra. Não foram encontrados trabalhos relatando o encontro de
larvas de helmintos intestinais, caracterizando um resultado falso-positivo para
diagnóstico de D. immitis.
57
O fato de encontrar um nematoide em técnica de concentração de larvas no
hospedeiro felino, não necessariamente indica que seja uma microfilária de
D.immitis. Portanto, a análise morfométrica é peça fundamental para casos de
ocorrência de microfilárias. Em virtude da microfilaremia variar de acordo com o
hospedeiro, tal técnica diagnóstica se mostra tão eficiente, que é capaz de revelar a
presença mesmo que de apenas uma larva. De tal forma, por contribuir para um
correto diagnóstico, fica notória a importância do profissional que analisa as
amostras.
Apesar de Atkins e colaboradores (1998) e Dillon e colaboradores (1996)
demonstrarem que gatos machos apresentam uma frequência maior do que fêmeas
à infecção, característica associada ao hábito out door motivado pelo
comportamento sexual, o presente estudo diagnosticou um felino do sexo feminino.
Com isso, pode-se levantar o questionamento de que, a frequência da infecção não
está ligada ao sexo do hospedeiro definitivo, mas sim ao tempo de exposição do
mesmo ao hospedeiro intermediário, em uma região endêmica para a infecção.
Como o estudo em questão encontrou um único caso de felino infectado por
D.immitis, não é possível afirmar que a taxa de infecção de gatos na área estudada
seja equivalente para ambos os sexos.
Hyung e colaboradores (2013) encontraram uma prevalência maior em gatos
machos do que em fêmeas, no entanto, este resultado não foi estatisticamente
significativo em seu estudo.
Todas as 30 amostras que foram submetidas à técnica de biologia molecular
apresentaram amplificação na altura correspondente ao primer do gene cox-1, e
sem amplificações na altura correspondente ao alvo 12S. Após a purificação e
sequenciamento, tais fragmentos não eram compatíveis com D. immitis. O resultado
final da análise molecular pode esclarecer o resultado da análise parasitológica,
pois, se não foram encontradas microfilárias em nenhuma amostra, logo, não havia
DNA do parasito circulante, e portanto, as PCR foram negativas.
Caso o sequenciamento não tivesse sido realizado e a PCR para diagnóstico
para D.immitis tivesse sido confeccionado apenas para o primer cox-1, poderia-se
58
concluir, erroneamente, que a banda amplificada na altura correspondente ao alvo
cox-1, eram amostras positivas para D. immitis.
Em virtude da ausência de amostras positivas na pesquisa por biologia
molecular, aliado à questão dos gatos apresentarem microfilaremia rara, inexistente
ou transitória, conclui-se que este não seja o melhor método diagnóstico para
pesquisa de D. immitis em gatos. No entanto, Hyung e colaboradores (2013),
encontraram quatro amostras positivas das 235 submetidas à PCR. Os dados
sugerem que os gatos da região por eles estudados sejam oriundos de áreas, cuja
prevalência da infecção em cães seja maior do que a do presente estudo. Ou até
mesmo, contar com uma maior população de hospedeiros intermediários,
contribuindo para o aumento da taxa de infecção.
Não houve amplificação através da PCR na amostra positiva em kit
imunocromatógráfico, apesar do felino apresentar um parasito adulto fêmea em
habitat. Tal achado pode ser explicado em virtude da ausência do DNA do parasito
circulante, pois o hospedeiro não apresentava microfilaremia. Este resultado é
conflitante aos achados de Liu e colaboradores (2005) realizaram a PCR das
amostras positivas em seus estudos, tendo em todas elas a formação de banda na
altura específica do gene escolhido (16S). No entanto, o estudo de 2005 também
não pode afirmar infecção nas amostras cujas amplificações estavam na altura do
gene escolhido, uma vez que o autor não realizou o sequenciamento. Ainda que
menor que o esperado, o presente estudo comprovou a importância do
sequenciamento dos produtos purificados mesmo na presença de amplificações na
altura para o fragmento do gene alvo escolhido, pois tais amplificações podem ser
inespecíficas.
Devido a prevalência de cerca de 25% da infecção em cães na região
oceânica de Niteroi, que é considerada endêmica para D. immitis, acreditava-se que
a infecção em gatos seria entre 1,25% a 5% de acordo com informações presentes
em literatura. Este estudo comprova a infecção por D. immitis em gatos na região
estudada, e, portanto, a quimioprofilaxia indicada pelo AHS se faz necessária nos
felinos residentes nesta localidade.
59
A presença da baixa ocorrência da infecção por D.immitis em gatos
encontrada no presente estudo, pode estar relacionada à escassez de métodos
diagnósticos mais sensíveis para esta espécie, como o teste de pesquisa de
anticorpo que não se encontra disponível para comercialização em território nacional
e necessidade de testes capazes de diagnosticar não apenas fêmeas, mas ambos
os sexos, uma vez basta um exemplar do parasito para levar o hospedeiro felino a
óbito.
60
8. CONCLUSÃO
O presente estudo mostrou a ocorrência de 0,2% da infecção por D. immitis
em gatos na região oceânica de Niterói.
É o primeiro estudo com diagnóstico laboratorial para infecção por D. immitis
em gatos no Brasil.
Conforme descrito pelo fabricante, o kit imunocromatográfico para pesquisa
de antígeno de D. immitis da Marca Alere® possui alta sensibilidade, pois apenas
uma fêmea foi capaz de positivar o teste.
A técnica de concentração de larvas, diferente dos cães, não foi uma técnica
sensível para gatos.
As sequências nucleotídicas do parasito que infectou o felino deste estudo
foram idênticas às de parasitos de D.immitis que infectam cães na mesma região.
A infecção por D. immitis em gatos deve ser colocada como diagnóstico
diferencial em gatos de regiões endêmicas que apresentem dispneia, efusão pleural
e morte súbita.
61
9. PRODUÇÕES
Prêmio Professor Adauto José Gonçalves de Araújo, pelo melhor trabalho
apresentado na forma oral durante a I Semana Científica do Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da Universidade Federal
Fluminense.
Diagnóstico Imunocromatográfico de Dirofilaria immitis em gato através de kit
diagnóstico para cães. Autores: Bárbara Bianca do Nascimento Pereira, Lucas
Keidel de Oliveira, Beatriz Brener. XXIV CONGRESSO DA SOCIEDADE
BRASILEIRA DE PARASITOLOGIA, SBP. 27 a 31 de outubro de 2015, Salvador,
Brasil.
Podemos confiar nos achados de microfilárias pela técnica de Knott em
felinos? Autores: Bárbara Bianca do Nascimento Pereira, Lucas Keidel Oliveira,
Daniela Leles e Beatriz Brener. XXIV CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA
DE PARASITOLOGIA, SBP. 27 a 31 de outubro de 2015, Salvador, Brasil.
Estudo da ocorrência de Dirofilariose em gatos da região oceânica de Niterói-
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