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Profª Eleonora – Slide de aula

ProteProteíínasnas


Estruturas conformacionais São resultantes das forças de ligação entre os diferentes segmentos da cadeia polipeptídica e freqüentemente envolvem grupamentos funcionais das cadeias laterais.

� Estrutura secundária

As rotações em torno das ligações adjacentes à ligação peptídica originam essencialmente dois tipos de estrutura: as hélices e as folhas pregueadas.

� Estabilização das conformações

Tanto as hélices como as folhas pregueadas são estabilizadas por pontes de hidrogênio que se estabelecem entre o oxigênio do grupo carbonila (＞C=O) de determinados aminoácidos e o hidrogênio do grupo amina (＞N-H) de outros aminoácidos.

Nas hélices, estes grupos pertencem à mesma cadeia polipeptídica (segmentos peptídicos adjacentes); nas folhas pregueadas estes grupos pertencem a cadeias diferentes (ou àmesma cadeia depois da cadeia ter se dobrado).

As estruturas dos diferentes aminoácidos influenciam a adoção, pela cadeia, de um determinado tipo de estrutura secundária, isto é, existe uma correlação entre seqüência e conformação.

Proteínas


Para a formação de α hélices (a mais freqüente, com 3,6 resíduos de aminoácidos) a rotação ocorre no mesmo sentido; para a formação de folhas β pregueadas, os ângulos de torção têm sinal contrário.

Ligações por pontes de hidrogênio entre resíduos da mesma cadeia

Ligações por pontes de hidrogênio entre cadeias ou segmentos polipeptídicos diferentes

α hélice Folha β pregueada

As folhas β pregueadas são:

� paralelas quando as cadeias polipeptídicas estão dispostas paralelamente no mesmosentido;

� antiparalelas quando estão em sentidos opostos.

O ácido glutâmico, a alanina e a leucina dão principalmente origem à α hélices, enquanto a valina e a isoleucina originam folhas β pregueadas.

Prolina, glicina e asparagina causam reversões na cadeia, através das qual a cadeia polipeptídica dobra 180º.


Este nível de estrutura corresponde à conformação tridimensional das cadeias polipeptídicas e é fundamental para a atividade biológica.

� Estrutura terciária

Enquanto a estrutura secundária é determinada por interações de grupos R próximos entre si, a estrutura terciária é conferida pela interação a longa distância na seqüência de aminoácidos da cadeia.

Resíduos de aminoácidos muito distanciados uns dos outros, na seqüência, podem se encontrar próximos devido aos enrolamentos e formar, desse modo, regiões indispensáveis ao funcionamento da proteína - por exemplo, o centro ativo das enzimas.

Forças que estabilizam a estrutura terciária

� Pontes de hidrogênio entre grupos Rde resíduos pertencentes a alças adjacentes

� Atração iônica entre grupos R com cargas elétricas opostas

� Interações hidrofóbicas� Ligações dissulfeto


�� Estrutura quaternária

Corresponde a associações, quase sempre reversíveis, mantidas por ligações fracas (não covalente) entre várias cadeias polipeptídicas idênticas ou diferentes.

A estrutura quaternária designa o arranjo de subunidades polipeptídicas (monômeros). A proteína é, portanto oligomérica sendo, por exemplo, um dímero se for constituída por duas subunidades ou um tetrâmero se for constituída por quatro subunidades.

Observação: O número de cadeias polipeptídicas de uma proteína oligomérica pode ser avaliado pela determinação do número de resíduos N-terminal existente na molécula de proteína.


Desnaturação

As proteínas sofrem desnaturação em decorrência de alterações na sua estrutura conformacional.

Na desnaturação não ocorre o rompimento das ligações covalentes do esqueleto da cadeia polipeptídica, ou seja, a estrutura primária da proteína é mantida. Entretanto, as alterações no seu arranjo espacial resultam na perda da atividade biológica.

A desnaturação pode ser provocada por:

� Calor� Solutos (ex: uréia, etc.)� Valores extremos de pH� Detergentes� Solventes orgânicos

(ex: etanol, acetona, etc.)� Agitação vigorosa

Estrutura da toxina diftérica

Apresenta segmentos em α-hélice, em folha β pregueada e sem estrutura regular.


Classificação das proteínas de acordo com a função biológica

Classe Exemplo

Enzimas RibonucleasesTripsina

Proteínas transportadoras HemoglobinaLipoproteínas

Proteínas nutritivas e de reserva Ovoalbumina (ovo)Caseína (leite)

Proteínas contráteis ou de movimento ActinaMiosinaTubulina

Proteínas estruturais ColágenoElastinaQueratinaFibroína

Proteínas de defesa FibrinogênioTrombinaVeneno de serpenteToxinas bacterianas

Proteínas reguladoras InsulinaHormônio de crescimentoRepressores

Classe Exemplo

Enzimas RibonucleasesTripsina

Proteínas transportadoras HemoglobinaLipoproteínas

Proteínas nutritivas e de reserva Ovoalbumina (ovo)Caseína (leite)

Proteínas contráteis ou de movimento ActinaMiosinaTubulina

Proteínas estruturais ColágenoElastinaQueratinaFibroína

Proteínas de defesa FibrinogênioTrombinaVeneno de serpenteToxinas bacterianas

Proteínas reguladoras InsulinaHormônio de crescimentoRepressores


Classificação das proteínas de acordo com a forma

Proteínas globulares

Com cadeia(s) polipeptídica(s) fortemente enrolada em forma globular ou esférica. Usualmente solúvel em sistemas aquosos e se difundem facilmente.Proteínas globulares são quase todas as enzimas, as proteínas de transporte, os anticorpos e as proteínas de reserva nutritiva.

Proteínas fibrosas

Com cadeia(s) polipeptídica(s) estendida ao longo de um eixo. São insolúveis em água, compridas e filamentosas. A maioria tem função estrutural. Proteínas fibrosas típicas são: a queratina, o colágeno e a fibroína. Incluem, também, as proteínas que participam de processos contráteis como a actina e miosina.


Composição em aminoácidos de duas proteínas

Os números representam resíduos de cada aminoácido, por molécula de proteína

* proteína mitocondrial transportadora de elétrons.

** precursor inativo da enzima digestiva quimotripsina. 245104Total

45Tyr81Trp

237Thr282Ser94Pro63Phe23Met1418Lys196Leu108Ile23His

2313Gly58Glu102Gln102Cys83Asp155Asn42Arg

Quimotripsinogênio bovino**

Citocromo humano*

Aminoácido

226Ala

233Val


Proteínas Conjugadas

Desidrogenase alcoólicaZincoFerritinaFerroMetaloproteínas

Desidrogenase succínicaNucleotídeos de flavinaFlavoproteínas

HemoglobinaHeme (ferroporfirina)Hemoproteínas

Caseína do leiteGrupos fosfatoFosfoproteínas

γ-globulina do sangueCarboidratosGlicoproteínas

Lipoproteína do sangueLipídeosLipoproteínas

ExemploGrupo prostético*Classe

* porção de uma proteína conjugada não constituída por aminoácidos.


Características moleculares de algumas proteínas

≈ 40*≈ 8.3001.000.000Desidrogenase glutâmica (fígado bovino)

4*≈ 1.250149.900γ - globulina (cavalo)

4*≈ 80096.000Hexoquinase (levedura)

1≈ 55068.500Albumina do soro (humana)

4*57464.500Hemoglobina (humana)

3*24122.600Quimotripsina (pâncreas bovino)

115316.890Mioglobina (coração eqüino)

112913.930Lisozima (clara de ovo)

112412.640Ribonuclease (pâncreas bovino)

2*515.733Insulina (bovina)

Nº. de Cadeias

Nº. de Resíduos

PesoMolecular

* proteínas oligoméricas (duas ou mais cadeias polipeptídicas).

Peso molecular (proteínas simples) ÷ 110 = ≈ Número de resíduos de aminoácidos

Observação:


Separação e purificação de proteínas

� Diálise� Filtração em gel� Eletroforese� Cromatografia de troca iônica

� Diálise

Uma membrana (ex: papel celofane) contendo a solução de proteína e outros solutos permite que a água e solutos pequenos, como o NaCl e a glicose, passem livremente através dela. Não permite, porém, a passagem de solutos grandes como as proteínas

O tubo de diálise contendo a mistura de moléculas de proteína (azul) e de moléculas pequenas (vermelhas) éimerso em um volume grande de solução tampão (a).

Como a membrana semipermeável permite a passagem apenas das moléculas pequenas, sua concentração dentro e fora do saco tende a se igualar (b).

Após várias trocas de tampão (c), restam apenas as moléculas de proteína dentro do saco de diálise (d).


� Filtração em gel

Separação de proteínas com base no tamanho por filtração em gel. A mistura de proteínas em solução é passada pela coluna de esferas muito pequenas e porosas de um polímero hidrofílico. Derivados de dextrana são amplamente empregados.

As proteínas com molécula pequena podem penetrar no interior das esferas, porém as proteínas maiores não o fazem.

O peso molecular de uma proteína pode ser determinado por comparação da velocidade com que atravessa a coluna com a velocidade de outras proteínas de peso molecular conhecido.

Uma mistura de proteínas grandes e pequenas é aplicada em uma coluna de esferas de dextrana.

À medida que o solvente flui pela coluna as moléculas pequenas de proteína penetram nas esferas e são retardadas.

As moléculas grandes de proteína emergem primeiro da coluna.


� Eletroforese

As várias formas de eletroforese são muito eficiente para separar moléculas carregadas.

1) Eletroforese em tira de acetato de celulose (umedecida com um tampão de pH conhecido)

Uma mistura de três proteínas (A, B e C) éaplicada sobre uma tira de papel ou acetato de celulose, umedecida com tampão.

A tira é colocada em um equipamento apropriado e um campo elétrico é aplicado ao sistema (a).

As proteínas migram de sua posição inicial (b) para os pólos, de acordo com a carga que apresentam no pH do tampão utilizado.

Depois de algum tempo, a eletroforese éinterrompida e a posição das proteínas érevelada (c).


� Pontos isoelétricos de algumas proteínas

Proteínas pI Proteínas pI

Pepsina < 1,0 Hemoglobina 6,8

Ovoalbumina 4,6 Mioglobina 7,0

Soroalbumina 4,9 Quimotripsinogênio 9,5

Urease 5,0 Citocromo C 10,7

β-lactoglobulina 5,2 Lisozima 11,0

γ-globulina 6,6

Proteínas pI Proteínas pI

Pepsina < 1,0 Hemoglobina 6,8

Ovoalbumina 4,6 Mioglobina 7,0

Soroalbumina 4,9 Quimotripsinogênio 9,5

Urease 5,0 Citocromo C 10,7

β-lactoglobulina 5,2 Lisozima 11,0

γ-globulina 6,6


2) Eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida

Uma molécula desloca-se em uma velocidade proporcional à sua densidade de carga total, tamanho e forma.

As amostras são aplicadas em poços na parte superior do gel. Moléculas carregadas negativamente migram através da matriz do gel em direção ao ânodo, em resposta ao campo elétrico aplicado. A mobilidade das moléculas pequenas é maior do que a das grandes com a mesma densidade de carga.

Após a eletroforese, as moléculas separadas são visualizadas por meio de técnicas de coloração, de fluorescência ou por técnicas radiográficas.

O pH no gel deve ser alto o suficiente de forma que praticamente todas as proteínas possuam carga líquida negativa e se movam em direção ao ânodo quando a voltagem é aplicada.


� Cromatografia de troca iônica

Explora as diferenças no comportamento ácido-base dos aminoácidos e das proteínas.

Resinas: Com grupos aniônicos (-) ⇒ trocadoras de cátionsCom grupos catiônicos (+) ⇒ trocadoras de ânions

+ NH3-CHR2-COOH

+ NH3-CHR1-COOH

+

2 Na+

SO3

SO3+ NH3-CHR2-COOH

+ NH3-CHR1-COOH

+

SO3

SO3 Na+

Na+

partícula de resina

sítios aniônicos

troca de cátions

Aminoácidos com carga positiva (lisina, arginina e histidina) deslocam, com mais facilidade, o Na+ da resina e são ligados mais fortemente

Aminoácidos com menor quantidade de carga positiva (ácidos glutâmico e aspártico) se ligam com a menor intensidade

Todos os demais aminoácidos têm quantidade intermediária de carga positiva

A mistura de proteínas (ou de aminoácidos) deve estar em solução ácida. Portanto, são cátions com carga líquida positiva, porém, com diferentes graus de ionização.

� Exemplo: Resina de troca catiônica (grupos sulfônicos)


� A eluição é feita com diferentes tampões com valores de pH sucessivamente mais elevados

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