proteínas plasmáticas

Dosagem de proteínas plasmáticas através de ensaios de Imunodiagnóstico

Prof. Ricardo PortelaSalvador – Fevereiro 2013

Proteínas plasmáticas

• Resumidamente, todo e qualquer tipo de molécula complexa que pode ser encontrada no soro

• Sua identificação e dosagem têm como objetivo avaliar o estado clínico de algum paciente perante algum tipo possível de patologia e/ou tratamento.

Proteínas plasmáticas

• Intervalos de referência ou valores de referência: – Intervalo de valores no qual 95 a 99% da

população da espécie estudada apresenta os níveis de proteínas plasmáticas sem apresentar nenhum tipo de alteração patológica – pacientes hígidos!

– É calculado levando em consideração os valores obtidos em uma população clinicamente hígida!

Intervalos de Referência

• Cálculos de Intervalo de Referências:

– TEMA DE AULA PRÁTICA!

Proteínas Constituintes

• Tipos de proteínas a serem analisadas:

– Proteínas constituintes básicas: albumina

– “Colesterol”

– “Triglicerídeos”

Enzimas

• São proteínas altamente especializadas com atividade catalítica; praticamente todas as reações químicas celulares onde participam biomoléculas orgânicas são catalisadas por enzimas.

• Existem milhares de enzimas, cada uma capaz de catalisar um tipo de reação química diferente.

• Exemplos: fosfatase ácida, fosfatase básica, transaminases

• Podem não ser típicas do soro, mas sua presença neste serve de marcador de injúria tecidual

Proteínas Transportadoras

• São proteínas que se ligam a íons ou a moléculas específicas, as quais são transportadas de um órgão para outro.

Transportam hormônios, vitaminas, metais, drogas e oxigênio (hemoglobina); solubilizam os lipídios (apoproteínas). Transportam, por exemplo, a glicose, aminoácidos e outras substâncias.

Proteínas de Armazenamento

• Atuam no armazenamento de certas substâncias, ex.: ferritina, que armazena átomos de ferro.

Proteínas com função imunológica

• Imunoglobulinas

• Proteínas da cascata da coagulação

• Proteínas do Sistema do Complemento

• Proteínas de Fase Aguda

Proteínas Reguladoras - Hormônios

• Muitas vezes presentes na circulação sanguínea, pois é a via de transporte desde o órgão produtor ao órgão alvo

• Prolactina, FSH, LH, TSH, eritropoietina, hormônio do crescimento

• Não proteínas: testosterona, progesterona, estrógeno

Escolha do método a ser empregado

• Natureza da molécula: proteína, açúcar, lipídeo

• Tamanho da molécula e complexidade

• Peso molecular

• Possibilidade ou não de formação de complexos com outras moléculas

• Função da molécula: hormônio, enzima...

• Concentração da molécula no soro

ENZIMAS - MÉTODOS

• Grande parte das enzimas plasmáticas NÃO são quantificadas por métodos imunológicos

• Levando-se em consideração a sua ação enzimática específica, utilizam-se métodos nos quais se adiciona o substrato da enzima, e um marcador para a transformação enzimática

• Resultados lidos por espectrofotometria

ENZIMAS

• Exemplos– Amilase: adição de amido e iodo, e a diminuição da cor

azul é correspondente a quantidade de amilase na amostra;

– GamaGT: catalisa a transferência de glutamil para glicilglicina, formando p-nitroanilina, que absorve a 405nm

– Lipase: clivagem de triglicéride de cadeia longa, com formação de composto de coloração vermelha

ENZIMAS

• Exemplos– Fosfatase ácida: atuando sobre timolftaleína, e um

álcali converte o resultado da reação em substância de cor azul

– Transaminase pirúvica: formação de piruvato e hidrazona, formando cor em meio alcalino

– CK-MB: formação de tiocolina, e redução de ferricianeto.

ENZIMAS

• Mas...– Algumas enzimas são presentes em baixas

concentrações no soro, e não se pode dosá-las por métodos bioquímicos de pouca sensibilidade;

– A ação enzimática de algumas é difícil de reproduzir in vitro, com alto custo de substrato e co-enzimas;

– Algumas tem ação enzimática muito específica, e ainda não foi desenvolvida técnica para tornar essa ação detectável...

MÉTODOS E SUAS UTILIZAÇÕES

IMUNODIFUSÃO(IMUNODIFUSÃO SIMPLES)

• Método antigo, de boa especificidade, mas de baixa sensibilidade

• Medição dos halos de precipitação, e comparação com os halos de calibradores

• Praticidade, baixo custo, não há necessidade de aparato sofisticado, confecção rápida

IMUNODIFUSÃO(IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES)

• Limitação: utilizado para proteínas séricas que tenham alta concentração em fluidos corporais (nível de mg/mL)

• Utilizado para proteínas séricas que tenham um intervalo de referência largo (pequenas variações não influenciariam no resultado)

• Em desuso atualmente, principalmente devido a problemas de reprodutibilidade, de manutenção do gel (comercialmente)

IMUNODIFUSÃO

• O caso das Imunoglobulinas:– Por terem uma concentração sérica considerada

alta (com exceção de IgE), e por terem largas faixas de referências, podem ser dosadas por Imunodifusão simples.

– Praticidade, custo baixo

– Exceção: quando se necessita do resultado com urgência (incubações podem durar até 3 dias)

ELISA SANDUÍCHE

• Utilizado atualmente como método de referência para diversas proteínas plasmáticas

• Consegue realizar detecção e quantificação de proteínas plasmáticas com sensibilidade de até nanogramas (dependendo do tipo de sistema utilizado)

• Relação custo/benefício boa

Outros componentes do soro

ELISA “SANDWICH”

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Anticorpo conjugado

TMB

Enzima Peroxidase

ELISA SANDUÍCHE

• Para o desenvolvimento do método:– Necessário a proteína ser de um peso molecular e

complexidade razoáveis – necessidade de haver mais de um epitopo

– Necessário o emprego de anticorpos para dois epitopos diferentes, e espacialmente afastados um do outro

– Necessário o analito purificado e quantificado de forma confiável

ELISA SANDUÍCHE

• Para o desenvolvimento do método:– Necessário quantidade razoável de soros para serem

empregados como referências – previamente quantificados para o analito em questão

– Decidir quanto ao método enzimático a ser empregado

– Verificar questões de sensibilidade analítica, linearidade, range de detecção, reprodutibilidade, repetitividade...

QUESTÃO DO MEIO PONTO

• O caso do PSA e do PSA Livre:– PSA utilizado como um marcador para alterações e

patologias prostáticas– Dosado rotineiramente por Elisa Sanduíche– Encontrado normalmente complexado com anti-

proteases– PSA Livre e relação PSA Livre/PSA Total normalmente é

mais informativo do que somente PSA Livre– Pergunta-se: como desenvolver uma dosagem em ELISA

sanduíche de PSA Livre, sem ser influenciado pelo PSA Total?

ELISA COMPETIÇÃO

• Moléculas monovalentes – possuem somente um epitopo (as vezes a molécula inteira é um anticorpo) – incapacidade de realizar um ELISA Sanduíche

• Alternativa para dosar esse tipo de molécula: ELISA de competição

ELISA DE COMPETIÇÃO

Outros componentes do soro

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Antígeno biotinilado

TMB

ST-AV- Peroxidase

ELISA COMPETIÇÃO

• Exemplos de moléculas séricas com essas características: T3, T4, estrógeno, progesterona, testosterona

• Diferença importante: Na competição a correlação entre reação desenvolvida e quantidade de analito é inversamente proporcional!

• Importante frisar: a curva desenvolvida é, além de inversa, também logarítmica, para a grande maioria dos analitos em ELISA Competição!

ELISA COMPETIÇÃO

• Pontos necessários para desenvolvimento de um ELISA competição:– Necessário: ter um anticorpo específico para o epitopo único

de seu analito!

– Necessário: ter o seu analito marcado/conjugado com substância enzimática, purificado e quantificado corretamente

– Necessário: Saber previamente o intervalo de referência do analito para poder fazer calibrações na concentração de analito conjugado a ser utilizado no ensaio

QUESTÃO DO MEIO PONTO• O caso de T3/T4:

– T3 e T4 são moléculas bem pequenas, que devem ser dosadas em sistema de competição.

– Enzimas como a peroxidase e a fosfatase alcalina são grandes, complexas

– A diferença de tamanho entre a enzima e o analito pode influenciar em seu reconhecimento pelo anticorpo de captura

– PERGUNTA: como proceder?


• A questão da Biotina:– Biotina - vitamina H, B7 ou B8

– Streptoavidina: quelação de biotina em indivíduos infectados com Streptomyces

– Ligação de grande afinidade de Streptoavidina com biotina


• A questão da Biotina:– Biotina: pode ser usada em mecanismos de conjugação

com grande sucesso!

– Streptoavidina: pode ser conjugada com peroxidase!

– Uma streptoavidina pode carregar 4 peroxidases (3 para deixar um sítio para ligar a biotina)

– E daí???

IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIAIMUNOFLUORESCÊNCIA

• São aplicadas quando se necessita de maior sensibilidade analítica!

• Pode detectar analitos na ordem de pico a fentogramas!

• Muito utilizadas hoje em dia (Luminescência mais) em ensaios de dosagem de analitos séricos humanos (mesmo com concentrações usuais nem tão baixas assim!)

Adição de anticorpo monoclonal específico para o antígeno pesquisado conjugado a enzima.

Uma microesfera de poliestireno é revestida com anticorpo monoclonal contra antígeno analisado

Adição do soro do paciente, que é incubado com agitação intermitente.

Lavagem para retirada do antígeno não fixado

Incubação do conjugado e mais uma lavagem para tirar o anticorpo não fixado

PASSOS DA TÉCNICA

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Adição do substrato da enzima, em seguida, incubação.

A adição de substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que geram emissão de fótons (luz).

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Anticorpo monoclonal

Substrato

Conjugado

Antígeno do soro do paciente

Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por segundo (cps). Essa unidade é proporcional a quantidade de antígenos presentes na amostra.

Estes fótons são medidos través de um fotomultiplicador (PMT) que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos.

PASSOS DA TÉCNICA

http://www.solostocks.pt/img/detector-de-fluorescencia-rf-10-axl-371197n0.jpg


• Possuem as mesmas variações de um ELISA: Competição, Indireto, Sanduíche, Captura

• A escolha do tipo vai seguir os mesmos padrões para o ELISA!

• Grande vantagem: Sensibilidade analítica elevada!

• Consegue detectar pequenas variações nas concentrações dos analitos!


• Necessário: anticorpos diretamente conjugados com substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, ou com enzimas que tenham ação sobre um substrato que se torne luminescente ou fluorescente

• Necessário: substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, e outras que façam sua estabilização


• Necessário: leitores de quimioluminescência ou fluorescência

• Necessário: soros padrões dosados por técnicas igualmente sensíveis

• Necessário: PADRONIZAÇÃO CORRETA DE CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES, e determinação de sua repetitividade e reprodutibilidade

QUESTÃO DE MEIO PONTO

• A questão da alta sensibilidade:

– A alta sensibilidade dos ensaios acarreta um preço: Qualquer variação mínima em tempo de incubação, pipetagem, temperatura de incubação, lavagens pode acarretar um resultado distorcido

– Portanto, a reprodutibilidade pode ser problemática!

– Pergunta: como proceder?

AUTOMAÇÃO

Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas

• Questão SORO x Plasma!– Plasma: contém ainda proteínas da coagulação

– Soro: sem proteínas da coagulação – mais limpo!

– Tempo de coagulação: consumo de glicose e de outras enzimas

– Tamanho das proteínas a serem dosadas: podem estar aprisionadas no processo de coagulação!

– Interação Antígeno/Anticorpo e moléculas da coagulação!


• Hemólise!– Liberação de hemoglobina no soro/plasma

– Alteração da coloração da amostra: influência em ensaios espectrofotométricos com utilização de grande qtdade de amostra

– Contaminação com componentes internos das células: problema maior em eletrólitos, e em algumas enzimas

– Interferência na ação de algumas enzimas (inibição)

– Interferências nas reações antígeno/anticorpo quando em grande concentrações!


• Hemólise!

• Para evitá-la:– Retirada de sangue: cuidados com a pressão negativa

violenta, com a manipulação de seringas e agulhas, com a retirada correta

– Evitar altas temperaturas– Evitar exposição a luz– Tempo de conservação– Tempo de permanência do coágulo antes de sua retirada


• Cuidados pessoais do paciente pré-coleta:– Jejum – fundamental para algumas enzimas e

proteínas carreadoras

– Suspensão de medicação: corticóides principalmente

– Relato de qualquer tipo de alteração

– Intervenções e reações cruzadas!

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