Profa. Dra. Fernanda de Rezende Pinto

Urina / Soro / LCR

Visualização de espiroquetas – lâmina – microscópio de campo

escuro (objetivas: 10x e 20x)

Espiroqueta x leptospira

Resultado:

Soro: encontrar uma ou mais espiroquetas características por

morfologia e movimentos: ESPIROQUETEMIA

Não encontrar espiroquetas: AUSÊNCIA DE ESPIROQUETEMIA NA

AMOSTRA ANALISADA

Urina: ESPIROQUETÚRIA / AUSÊNCIA DE ESPIROQUETÚRIA

Leptospiras (antígeno) sofrem aglutinação na presença dos

anticorpos no soro

Negativo Positivo

• Microplaca = 96 poços

• Luvas / jaleco

• Lâmina de vidro

• Micropipetas (mono e multicanal)

• Ponteiras

• Tubos de vidro (tampa) – diluição soro e cultura

• Descarte: hipoclorito sódio 5% ou pinho-sol 1:256

Cultura de leptospiras (sorovares)

Bateria de culturas da OMS + isolados locais (antígenos)

Meio de cultura líquido: EMJH

Solução salina fisiológica (0,85%)

Soros a testar

Ex: bateria de cultura

Sorogrupo: Grippotyphosa / Sorovares: grippotyphosa (8)

Sorogrupo: Icterohaemorragie / Sorovares: copenhagi(10A); lai (10G)

Controles Positivos e negativos

Controle positivo: soro positivo (Acs contra leptospira) mais

de um sorovar

Controle negativo interno (sem soro) – 20µL Ag + 20µL sol.

salina

Microscópio de campo escuro (objetivas 10x, 20x e 40x)

Estufa 30ºC

• Considerar reação positiva na sorologia de triagem (título)

• Humano e caninos domiciliados: 1/25

• Sinais: 2 a 3 dpi médico

• Dono do cão – visualiza início dos sinais clínicos

• Bovinos: 1/100

• Aborto – ajuda veterinário (tempo maior – produção maior de Acs)

• Janela imunológica – tempo que o sistema imune necessita para produzir Acs em nível suficiente para ser detectado

Usar um sorovar de cada sorogrupo (no mínimo)

Sorovares locais

Sorovares de mesmo sorogrupo: determinantes

antigênicos comuns reação cruzada entre sorovares

Também pode ocorrer reação cruzada entre sorogrupos

diferentes

Tubo com cultura de leptospiras (meio líquido EMJH)

Olhar contra a luz – contaminação

Densidade (quantidade de leptospiras – densidade)

1 gota lâmina: MCE – contagem (verificar o nº lept. por campo,

se há auto-aglutinação)

Repique semanal: 10% volume para outro tubo

2 a 3 dias (30°C)

Usar como antígeno no teste: 7 a 14 dias no meio

Poços da primeira linha (A) – colocar o controle negativo

interno do teste (antígeno = cultura de leptospira e

solução salina)

20 µL Ag + 20 µL sol.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4

B

C

D

E

F

G

H

Linha A: colocar o Ag diluído em salina (diferentes sorovares em cada poço)

20 µL sol. salina + 20 µL do AgCONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Diluição do soro – sempre a metade do ponto de corte da

leitura do resultado

Humano ou cão domiciliado: diluição do soro adicionado à

microplaca: 1: 12,5

Bovino: 1: 50

Quando se adiciona o Ag o volume final no poço da

microplaca dobra, e assim, a diluição também dobra (1:25

e 1:100)

Primeiro faz a diluição inicial 1:5

100 µL do soro em 400 µL de solução salina

100 µL do soro teste 400 µL salina

Soro diluído 1:5

Em seguida, faz a segunda diluição: a partir da diluição 1:5.

A segunda diluição é metade do valor da diluição de leitura no teste

Ex: Leitura 1:25 Diluição do soro: 1:12,5 (Humano, cão)

Diluição 1:12,5400 µL do soro diluído 1:5 +

600µL salinaSoro diluído 1:5

Segunda diluição: a partir da diluição 1:5

Leitura 1:100 Diluição do soro: 1:50 (bovino)

Diluição 1:50200 µL do soro diluído 1:5 +

1800 µL salinaSoro diluído 1:5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4

B

C

D

E

F

G

H

CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Cada linha B até H: Soro a testarB = soro do bovino 1C = soro do bovino 2

1º: 20µL do soro (diluído 1 / 50 ) do bovino 1

2º: 20µL do Ag (em cada soro a ser testado) 1 / 100 (dobro volume e dilui para 1:100) – O Ag é a cultura de leptospira mantida em tubo de vidro no meio de cultura líquido EMJH.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4

B

C

D

E

F

G

H

CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Cada linha B até H: Soro a testarB = soro do bovino 1C = soro do bovino 2

• Agitar a placa agitador de placa para homogeneizar

• Incubar em estufa a 30ºC por 1 a 3 horas

Agitar a placa agitador de placas

Estufa 30°C por 1 a duas horas

Diluição do soro, reação (manhã)

Leitura: logo após almoço

Leitura dos resultados: microscópio de campo escuro –

visualizar se há aglutinação (Ag + Acs – soro)

1ª gota – controle negativo interno (sem soro) = Ag com leptospiras livres

Verificar se não há aglutinação nas leptospiras do antígeno (auto-aglutinação)Comparar o controle negativo interno com os soros a testar

1 gota (3 a 5 µL) – placaObjetiva de 10 xTempo de leitura não > 1,5 hora

Soros a testar

• Reação positiva para aglutinação: redução maior que 50% das leptospiras vivas (livres)

• Aglutinação em mais de 50% • Redução da densidade do Ag = aglutinação

Negativo Positivo

Soro (anticorpos) + antígeno (leptospiras)

Resultado: não é o título final do soro do bovino!

Informa apenas: reação positiva ou negativa (título é fixo no teste) para um sorovar

Teste de triagem: indica a presença de Acs no soro, mas não necessariamente a presença da doença

Soros reagentes na triagem sorologia / titulação

Testar o soro com sorovares que apresentaram reação positiva (aglutinação) no teste de triagem

Usar apenas os sorovares que reagiram com o soro teste na sorologia de triagem

Diluição seriada nos soros a testar (diluições dobradas)

Indica a titulação real do animal/pessoa

Soro humano (diluições possíveis em uma microplaca)

1:25

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

Soro bovino

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1.600

1:3.200

1:6.400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4

B 1:25

C 1:50

D 1:100

E 1:200

F 1:400

G 1:800

H 1:1600

CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) = controle negativo interno

Cada coluna (B até H): um soro a testar para cada sorovar (Ag)Cada linha é uma diluição do soro teste (diluições seriadas)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4

B 1:25

C 1:50

D 1:100

E 1:200

F 1:400

G 1:800

H 1:1600

CONTROLE NEGATIVO (sem soro)

Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag)

1º: Cada coluna (C até H): 20µL de sol. Salina2º: Poço B: 40 µL do soro diluído 1:12,5 (sem salina)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4

B 1:25

C 1:50

D 1:100

E 1:200

F 1:400

G 1:800

H 1:1600

Diluição seriada do soro teste:20 µL soro 1:12,5 (B) Poço C (1:25) Poço D (1:50) Poço E (1:100) Poço F (1:200) Poço G (1:400) Poço H (1:800) desprezar 20 µL finais

Adicionar 20 µL do Ag (cultura de sorovar de leptospira mantido em tubo de vidro com meio de cultura EMJH) em cada poço com soro dobro o volume contido no poço dobro a diluição alcança o título de leitura do soro

Agitar a placa agitador de placas

Estufa 30°C por 1 a duas horas

Leitura

Microscópio de campo escuro – visualizar se há

aglutinação (Ag + Acs – soro)

1ª gota – controle negativo (sem soro)

Cultura de leptospiras

Se não há aglutinaçãoComparar com os soros a testar

1 gota (3 a 5 µL) – placaObjetiva de 10 x ou 20XTempo de leitura não > 1,5 hora

Soros a testar

1:25

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

Fechar diagnóstico: Clínica + Epidemiológico + Título

Bovino: Aborto + Roedores/Aguada + título > 1:400

Sorovar infectante: título mais alto

2 sorovares com mesmo título: resultado positivo para os

dois títulos (reação cruzada ou infecção pelo 2)

Diluir mais o soro descobrir qual desses 2 sorovares é

infectante (título mais alto)

Ou infecção por um sorovar não existente na bateria

Diferenciar sorovar: estudos epidemiológicos ou

vacinação

Para clínica não interessa: tratamento é o mesmo

Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação

Título 1:400

Perguntar: quando foi a vacinação, para quais sorovares

Sem clínica nem evidência epidemiológica = vacinal

Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação

Título 1:400

Tem clínica + epidemiológico

Título alto de sorovar diferente do encontrado na vacina

doença

Ideal é fazer diagnóstico sorológico populacional

Amostra representativa:

Animais que abortaram (3-4 dias após aborto – queda

imunidade – sem Acs) + outras categorias

Títulos altos e baixos

Vaca aborto + > 1:400 infectado (não precisa novo teste)

1:100 (início ou fim infecção0 7-10 dias (PI: 2-14 dias,

média 7 d) nova coleta soroconversão