Diagnóstico laboratorial Brucelose - wp.ufpel.edu.brwp.ufpel.edu.br/ccz/files/2016/03/Diagnóstico-laboratorial... ·…

Download Diagnóstico laboratorial Brucelose - wp.ufpel.edu.brwp.ufpel.edu.br/ccz/files/2016/03/Diagnóstico-laboratorial... ·…

Post on 04-Sep-2018

212 views

Category:

Documents

0 download

TRANSCRIPT

  • Diagnstico laboratorial Brucelose

    TESTE DO ANEL DO LEITE (TAL)

    Universidade Federal de Pelotas

    Medicina Veterinria

    Zoonoses

    http://www.ufpel.edu.br/

  • Diagnstico a campo de Brucelose

    Med. Veterinrio (privado) HABILITADO

    Curso de treinamento reconhecido pelo MAPA

    Padronizar diagnstico aes sanitrias eficcia de um programa sanitrio

  • Testes oficiais (PNCEBT) - Brucelose

    Triagem (MV habilitado, laboratrio credenciado, laboratrio oficial credenciado)

    Teste do anel do leite

    Teste do antgeno acidificado tamponado

    Confirmatrios: (reagentes aos de triagem)

    Teste do 2-mercaptoetanol (laboratrio credenciado, laboratrio oficial credenciado)

    Teste de fixao do complemento (laboratrio oficial credenciado)

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Monitorar condio sanitria de propriedades livres (rebanhos livres)

    Identifica rebanho leiteiro (vacas em lactao) com o problema outro diagnstico para comprovar quais vacas em lactao so infectadas

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Leite: anticorpos contra Brucella abortus

    Teste sorolgicos - Diagnstico INDIRETO (pesquisa de anticorpos)

    Teste de aglutinao

    Antgeno usado no teste: clulas inteiras de B. abortus

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Triagem: alta sensibilidade

    Capacidade do teste em fornecer resultado positivo quando a animal infectado

    Sensvel: detectar 1 animal positivo entre 150 animais testados (leite)

  • Teste do Anel do Leite

    Leite de mistura rebanho em lactao

    Amostra de leite: representativa - todas vacas lactao

    Tarro

    Tanque de refrigerao

    Caminho tanque / isotrmico

    Detecta rebanho infectado

    No individualmente o animal infectado

    Evita manejo direto com animal

    Prejudica a ordenha / estresse = queda produo

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Antgeno corado com hematoxilina

    Cor azul caracterstica reao positiva

    positivo

    Anel de creme

    Coluna de leite

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Anticorpos Anti B. abortus

    Antgeno clulas de B. abortus

    + corante hamatoxilina

    Aglutinao

    Malha de complexo Ag - Ac

    Arrastada para superfcie

    pelos glbulos de gordura

    (menos denso)

    Anel azulado no creme

    Reao positiva

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Ausncia de anticorpos anti-B. abortus

    Antgeno clulas de B. abortus

    + corante hamatoxilina

    Ausncia de aglutinao

    Gordura do creme: anel

    de creme: branca

    Corante na coluna de

    leite- azulada

    Reao negativa

  • Teste do Anel do Leite (TAL)

    Limitaes: resultados FALSO-POSITIVOS

    Leite cido

    Animais com mastite

    Incio de lactao colostro

    Secagem

    INSTABILIDADE interferir no resultado

  • Colheita de amostra de leite CRU

    Correta resultados confiveis

    Mistura de leite representar o leite ordenhado de todas as vacas em lactao

    Misturar o leite suavemente: homogneo / creme no estar separado

    Usar uma colher tarro

    Ligar o misturador do tanque

  • Colheita de amostra de leite CRU

    Tamanho do rebanho x quantidade de leite usada na hora do exame (no tubo de vidro)

    At 150 vacas lactao: 1 mL leite

    151 at 450 : 2 mL

    451 at 700 : 3 mL

    acima de 700 : dividir em lotes menores

    Quantidade antgeno sempre a mesma (30 L = 0,03 mL)

  • Colheita de amostra de leite

    Frasco: limpo, esterilizado, tampa (100 mL / tarro, tanque)

    Conservante: evitar proliferao de microrganismos (cru): protelise = interferir na reao Ag-Ac

    Formol 1% ou Cloreto de mercrio 2%

    1 mL de conservante 10 mL leite

  • Colheita de amostra de leite

    Refrigerar o frasco com a amostra

    Armazenar a 2C a 8C por at 2 semanas

    Enviar para o laboratrio

    Sala no laboratrio:

    T.A. controlada 22C 4C (ar condicionado)

    Evitar luz solar

  • Interferncias

    Amostra mal homogeneizada excesso ou falta de gordura (formao do anel de creme)

    Agitao excessiva (quebrar a gordura)

    Aquecimento excessivo (> 45C / 5 min - destruio dos anticorpos)

    Excessivo tempo e temp. de armazenamento (4C at 2 semanas pode usar)

  • Interferncias

    FALSO-POSITIVO

    Leite fresco teste realizado no mesmo dia da colheita (instvel)

    Refrigerao por 24 hs resolve esse problema (tempo para estabilizar o leite)

    Mastite: protenas, clulas e bactrias

  • Interferncias

    FALSO-NEGATIVOS

    Congelamento (quebra dos glbulos gordura)

    Pasteurizao (queda no ttulo de anticorpos)

    No utilizar leite pasteurizado ou congelado para o teste!

  • Material para o teste

    Amostra de leite

    Homogeneizao correta do leite de mistura

    Conservante 1 mL para 10 mL leite

    2C a 8C por mn. 24 hs sob refrigerao antes do teste

  • Material para o teste

    Antgeno para TAL

    Clulas B. abortus + hematoxilina (corante azul)

    Compra: habilitado / controlado pela MAPA /

    adquirido no servio de DSA Estadual

    Conservados sob refrigerao (2C a 8C)

    Usados sempre dentro do prazo de validade

    No podem ser congelados

  • Material para o teste

    Luvas ltex

    Tubos de vidro: 1 cm x 7,5 cm ou 1 cm x 10 cm

    Grade para tubos

    Pipetas de 1 mL

    Micropipetador calibrado 30 L

    Estufa ou banho-maria a 37C

  • Material para o teste

    Testar simultaneamente

    Amostras de leite controle positivo e negativo

  • Tcnica do teste

    Equilibrar a temperatura do leite e do antgeno a temperatura ambiente mnimo 60 min

    Misturar bem a amostra de leite (inverter)

    1 mL leite no tubo vidro (2 cm de coluna)

    Quantidade de leite nmero vacas lactao

    30 L do antgeno

    Tampar e homogeneizar (inverter vrias vezes)

  • Tcnica do teste

    Manter em repouso por 1 min

    Observar se est bem homogneo no pode sobrar antgeno na parede do tubo

    Incubar a 37C / 1 hora

    Retirar grade com delicadeza

    Leitura dos resultados

  • Tcnica do teste

    RESULTADOS

    Anel de creme Coluna de leite Resultado do

    rebanho

    AZUL BRANCA / AZULADA REAGENTE (+)

    BRANCO AZUL NO

    REAGENTE (-)

    Leite = rebanho reagente: testes sorolgicos individuais em todos animais do rebanho em lactao (AAT)

  • positivo negativo

    Anel de creme

    Coluna de leite

  • Diagnstico laboratorial Brucelose

    TESTE DO ANTGENO ACIDIFICADO

    TAMPONADO (AAT)

    Prof Dr Fernanda de Rezende Pinto

    DVP FV UFPel

    Universidade Federal de Pelotas

    Medicina Veterinria

    Zoonoses

    http://www.ufpel.edu.br/

  • Teste do AAT

    Triagem

    Muito sensvel

    Fcil execuo

    MV habilitado / laboratrio credenciado / oficial credenciado

    Soro do animal

  • Falso-positivo: 2 fatores

    Anticorpos no especficos:

    Infeces por bactrias: Yersinia enterocolitica 0:9, Salmonella sp, Escherichia coli 0:157,

    Pseudomonas sp.

    Resultado da vacinao com B19 aps a idade recomendada (acima 8 meses)

    Conhecimento da dinmica das imunoglobulinas nos diferentes estgios da resposta imune

  • Resposta imune infeco e vacinao

    Bactria intracelular macrfagos

    Resposta imune celular: fagocitrias

    Resposta imune humoral

    Acs especficos cadeia O LPS da B. abortus

    Imunoglobulinas em soro bovdeo:

    Classe G (IgG 1 e IgG 2) seguidas de:

    Classe M (IgM)

    Classe A (IgA)

    Infeco B. abortus ou

    vacinao com B 19

  • Resposta dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados

    com amostra patognica de Brucella abortus ou vacinados com B19.

    1 = IgM

    2 = IgG 1

    IgG 2 e IgA = mais tarde, aumentam gradativamente, mas

    permanecem nveis baixos

    Ps-infeco ou ps-vacinao (a

    partir da 1 semana) (IgM)

  • Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em

    bovinos infectados com amostra patognica de Brucella abortus.

    Leve decrscimo IgM

    IgG 1 permanece alto, inalterado

    IgG 2 e IgA permanecem nveis baixos e estveis

    Infeco crnica B. abortus

    IgG

  • 0

    50

    100

    150

    200

    250

    0 5 12Tempo em meses

    Tt

    ulo

    de

    An

    tic

    orp

    os

    em

    UI

    IgG1

    IgM

    IgA

    IgG2

    Ttulo de anticorpos em bovinos infectados com

    Brucella abortus ao longo do tempo.

  • Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em

    bovinos vacinados com a amostra B19 de Brucella abortus.

    Vacinados at 8 meses (3 8 meses)

    Ttulos Acs decrescem rapidamente depois 12 meses

    Vacinao acima 8 meses

    Ttulos vacinais elevados por mais tempo (Falso + )

    Vacinao

    com B 19

  • Ttulo de anticorpos em bezerras vacinadas entre 3 e 8 meses de idade com Brucella abortus amostra B-19.

    0

    50

    100

    150

    200

    250

    0 2 4 5 8 10 12

    Tempo em meses

    Tt

    ulo

    de

    An

    tic

    orp

    os

    em

    UI

    IgG1

    IgM

    IgA

    IgG2

  • TAAT

    Teste de aglutinao: soroaglutinao (Ag + Acs = grumos)

    Antgeno:

    Clulas inteiras da amostra de B. abortus 1119-3 a

    concentrao de 8%

    Tamponado em pH cido (3,65) (inibe IgG)

    Corado com o Rosa de Bengala

    A maioria dos soros de animais bacteriologicamente positivos apresenta reao a essa prova

  • TAAT

    Pode ocorrer alguns poucos casos de reaes falso + em decorrncia da utilizao da vacina B19

    Toda reao positiva nesse teste confirmada por testes de maior especificidade para se evitar o sacrifcio de

    animais no infectados

    Prova qualitativa: no indica o ttulo de anticorpos do soro testado.

  • Vacina B19

    Amostra B. abortus lisa

    Brasil: obrigatria bezerras 3 8 meses

    Atenuada para fmeas jovens

    Machos: orquite

    Fmeas gestantes: aborto

    Lisa anticorpos especficos contra LPS liso interferncia diagnstico sorolgico

    Persistncia dos Acs relacionado idade de vacinao

  • Vacina B19

    Fmea vacinada > 8 meses: Acs permanecem e interferem por mais de 24 meses

    Vacina at 8 meses: Acs desaparecem rapidamente: animais > 24 meses so negativos ao teste

  • Vacina RB 51

    Amostra de B. abortus rugosa atenuada

    Proteo semelhante B 19

    Rugosa: no induz formao Acs anti-LPS liso

    No interfere na sorologia

    No indutora de Acs aglutinantes

    Brasil: vacinao estratgica fmeas adultas

    Viva: mesmos cuidados que B 19

  • Animais que devem ser testados

    Fmeas igual ou > 24 meses (vacinadas 3 8 m)

    Machos e fmeas no vacinadas igual ou > 8 m (exclui castrado)

    Fmeas vacinadas (B 19) podem ser testadas?

    Sim. Idade igual ou > 24 meses

  • Colheita de sangue

    Sangue soro

    Tubos com vcuo (sem anticoagulante)

    Siliconados: facilita a retrao do cogulo

    Agulhas individuais e descartveis

    Sangue: 50% tubo 10 mL

    Tubos a T.A. (2 a 3 horas), abrigo da luz boa coagulao

    Soro: frasco limpo e seco

    Enviar para laboratrio rapidamente (resfriado ou congelados)

    Identificao correta frascos

  • Protocolo

    Antgeno para AAT

    Soros a testar

    Soros controles positivo e negativo

    Pipetas de Bang

    Micropipetador de 30 L (0,03 mL)

    Ponteiras

    Placa de vidro quadrados delimitados 4 cm x 4 cm

    Misturador de plstico ou metal

    Caixa de luz indireta para leitura

    Agitador de placa (opcional)

  • Protocolo

    Antgeno para AAT

    Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido no servio de DSA Estadual

    Conservados sob refrigerao (2C a 8C)

    Usados sempre dentro do prazo de validade

    No podem ser congelados

  • Cuidados na execuo

    Antgeno no em uso: manter 2 a 8 C (perda da sensibilidade por resfriar/aquecer

    Temperatura de execuo: 22C 4C

    Limpar material aps uso (placas, pipetas, misturadores)

    Soros muito hemolisados = desprezados Falso +

    Controle positivo e negativo da reao

  • Tcnica

    Equilibrar soro e antgeno T.A. (30 min)

    Soro congelado: tempo maior

    Homogeneizar soros (cuidado!)

    Identificar rea da placa

    30 L de soro por rea da placa encostar pipeta num ngulo 45

    Agitar suavemente antgeno 30 L ao lado do soro (sem misturar)

  • Tcnica

    Misturar soro e Ag com misturador (crculo 2 cm dimetro)

    Agitar a placa movimentos oscilatrios (30 movimentos / minuto) por 4 minutos

    Colocar placa na caixa de leitura

    Anotar resultados

    Desconsideram reaes de aglutinao que ocorrem aps os 4 minutos

  • Tcnica

    Resultado

    Presena de grumos Reagente

    Ausncia de grumos No reagente

    Negativa Positiva

    Reao

    positiva

  • DIAGNSTICO de BRUCELOSE

    2-ME

    2-ME (RETESTE)

    Fonte: Comit Cientfico Consultivo do PNCEBT

  • Lgica de testes em propriedades livres

    Propriedade

    infectada

    Propriedade

    no infectada

    teste 1 teste 2 teste 3 teste 4 teste 5

    Propriedade

    livre

    teste 1 teste 2 teste 3

    saneamento

    (+) (+) (-) (-) (-)

    (-) (-) (-) Propriedade

    livre

    saneamento

    Propriedade

    livre com

    reinfeco teste 1 teste 2 teste 3 teste 4

    Propriedade

    livre

    (+) (+) (-) (-)

    saneamento Fonte: Comit Cientfico Consultivo do PNCEBT

  • ETAPAS DE SANEAMENTO - BRUCELOSE

    Enquanto houver animais reagentes positivos, deve-se continuar

    realizando testes e sacrifcio desses animais. O intervalo entre esses testes

    deve ser de 30 a 90 dias, at que se obtenha resultado negativo de

    TODOS os animais examinados. O procedimento at obteno do

    certificado pode ser visto no esquema seguinte:

    AAT teste do antgeno acidificado tamponado

    2-ME teste do 2-mercaptoetanol

    FC teste de fixao do complemento

    Fonte: Comit Cientfico Consultivo do PNCEBT

Recommended

View more >