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Diagnóstico laboratorial – Brucelose
TESTE DO ANEL DO LEITE (TAL)
Universidade Federal de Pelotas
Medicina Veterinária
Zoonoses
Diagnóstico a campo de Brucelose
• Med. Veterinário (privado) HABILITADO
• Curso de treinamento – reconhecido pelo MAPA
• Padronizar diagnóstico – ações sanitárias eficácia de um programa sanitário
Testes oficiais (PNCEBT) - Brucelose
• Triagem (MV habilitado, laboratório credenciado, laboratório oficial credenciado)
▫ Teste do anel do leite
▫ Teste do antígeno acidificado tamponado
• Confirmatórios: (reagentes aos de triagem)
▫ Teste do 2-mercaptoetanol (laboratório credenciado, laboratório oficial credenciado)
▫ Teste de fixação do complemento (laboratório oficial credenciado)
Teste do Anel do Leite (TAL)
• Monitorar condição sanitária de propriedades livres (rebanhos livres)
• Identifica rebanho leiteiro (vacas em lactação) com o problema outro diagnóstico para comprovar quais vacas em lactação são infectadas
Teste do Anel do Leite (TAL)
• Leite: anticorpos contra Brucella abortus
• Teste sorológicos - Diagnóstico INDIRETO (pesquisa de anticorpos)
• Teste de aglutinação
• Antígeno usado no teste: células inteiras de B. abortus
Teste do Anel do Leite (TAL)
• Triagem: alta sensibilidade
• Capacidade do teste em fornecer resultado positivo quando a animal é infectado
• Sensível: detectar 1 animal positivo entre 150 animais testados (leite)
Teste do Anel do Leite
• Leite de mistura – rebanho em lactação
• Amostra de leite: representativa - todas vacas lactação
▫ Tarro
▫ Tanque de refrigeração
▫ Caminhão tanque / isotérmico
• Detecta rebanho infectado
• Não individualmente o animal infectado
• Evita manejo direto com animal
• Prejudica a ordenha / estresse = queda produção
Teste do Anel do Leite (TAL)
• Antígeno corado com hematoxilina
• Cor azul característica reação positiva
positivo
Anel de creme
Coluna de leite
Teste do Anel do Leite (TAL)
Anticorpos Anti B. abortus
Antígeno células de B. abortus
+ corante hamatoxilina
Aglutinação
Malha de complexo Ag - Ac
Arrastada para superfície
pelos glóbulos de gordura
(menos denso)
Anel azulado no creme
Reação positiva
Teste do Anel do Leite (TAL)
Ausência de anticorpos anti-B. abortus
Antígeno células de B. abortus
+ corante hamatoxilina
Ausência de aglutinação
Gordura do creme: anel
de creme: branca
Corante na coluna de
leite- azulada
Reação negativa
Teste do Anel do Leite (TAL)
• Limitações: resultados FALSO-POSITIVOS
• Leite ácido
• Animais com mastite
• Início de lactação – colostro
• Secagem
INSTABILIDADE interferir no resultado
Colheita de amostra de leite CRU
• Correta – resultados confiáveis
• Mistura de leite – representar o leite ordenhado de todas as vacas em lactação
• Misturar o leite suavemente: homogêneo / creme não estar separado
• Usar uma colher – tarro
• Ligar o misturador do tanque
Colheita de amostra de leite CRU
• Tamanho do rebanho x quantidade de leite usada na hora do exame (no tubo de vidro)
• Até 150 vacas lactação: 1 mL leite
• 151 até 450 : 2 mL
• 451 até 700 : 3 mL
• acima de 700 : dividir em lotes menores
• Quantidade antígeno sempre a mesma (30 µL = 0,03 mL)
Colheita de amostra de leite
• Frasco: limpo, esterilizado, tampa (100 mL / tarro, tanque)
• Conservante: evitar proliferação de microrganismos (cru): proteólise = interferir na reação Ag-Ac
• Formol 1% ou Cloreto de mercúrio 2%
• 1 mL de conservante 10 mL leite
Colheita de amostra de leite
• Refrigerar o frasco com a amostra
▫ Armazenar a 2ºC a 8ºC por até 2 semanas
• Enviar para o laboratório
• Sala no laboratório:
• T.A. controlada 22ºC ± 4ºC (ar condicionado)
• Evitar luz solar
Interferências
• Amostra mal homogeneizada – excesso ou falta de gordura (formação do anel de creme)
• Agitação excessiva (quebrar a gordura)
• Aquecimento excessivo (> 45ºC / 5 min - destruição dos anticorpos)
• Excessivo tempo e temp. de armazenamento (4ºC até 2 semanas pode usar)
Interferências
• FALSO-POSITIVO
• Leite fresco – teste realizado no mesmo dia da colheita (instável)
• Refrigeração por 24 hs – resolve esse problema (tempo para estabilizar o leite)
• Mastite: proteínas, células e bactérias
Interferências
• FALSO-NEGATIVOS
• Congelamento (quebra dos glóbulos gordura)
• Pasteurização (queda no título de anticorpos)
• Não utilizar leite pasteurizado ou congelado para o teste!
Material para o teste
• Amostra de leite
• Homogeneização correta do leite de mistura
• Conservante – 1 mL para 10 mL leite
• 2ºC a 8ºC por mín. 24 hs sob refrigeração antes do teste
Material para o teste
• Antígeno para TAL
▫ Células B. abortus + hematoxilina (corante azul)
▫ Compra: habilitado / controlado pela MAPA /
adquirido no serviço de DSA Estadual
▫ Conservados sob refrigeração (2°C a 8°C)
▫ Usados sempre dentro do prazo de validade
▫ Não podem ser congelados
Material para o teste
• Luvas látex
• Tubos de vidro: 1 cm x 7,5 cm ou 1 cm x 10 cm
• Grade para tubos
• Pipetas de 1 mL
• Micropipetador calibrado 30 µL
• Estufa ou banho-maria a 37ºC
Técnica do teste
• Equilibrar a temperatura do leite e do antígeno a temperatura ambiente – mínimo 60 min
• Misturar bem a amostra de leite (inverter)
• 1 mL leite no tubo vidro (2 cm de coluna)
• Quantidade de leite – número vacas lactação
• 30 µL do antígeno
• Tampar e homogeneizar (inverter várias vezes)
Técnica do teste
• Manter em repouso por 1 min
• Observar se está bem homogêneo – não pode sobrar antígeno na parede do tubo
• Incubar a 37ºC / 1 hora
• Retirar grade com delicadeza
• Leitura dos resultados
Técnica do teste
• RESULTADOS
Anel de creme Coluna de leite Resultado do
rebanho
AZUL BRANCA / AZULADA REAGENTE (+)
BRANCO AZUL NÃO
REAGENTE (-)
Leite = rebanho reagente: testes sorológicos individuais em todos animais do rebanho em lactação (AAT)
Diagnóstico laboratorial – Brucelose
TESTE DO ANTÍGENO ACIDIFICADO
TAMPONADO (AAT)
Profª Drª Fernanda de Rezende Pinto
DVP – FV – UFPel
Universidade Federal de Pelotas
Medicina Veterinária
Zoonoses
Teste do AAT
• Triagem
• Muito sensível
• Fácil execução
• MV habilitado / laboratório credenciado / oficial
credenciado
• Soro do animal
Falso-positivo: 2 fatores
• Anticorpos não específicos:
• Infecções por bactérias: Yersinia enterocolitica 0:9,
Salmonella sp, Escherichia coli 0:157,
Pseudomonas sp.
• Resultado da vacinação com B19 após a idade
recomendada (acima 8 meses)
• Conhecimento da dinâmica das imunoglobulinas
nos diferentes estágios da resposta imune
Resposta imune – infecção e vacinação
• Bactéria intracelular – macrófagos
• Resposta imune celular: fagocitárias
• Resposta imune humoral
• Acs específicos – cadeia O – LPS da B. abortus
• Imunoglobulinas em soro bovídeo:
• Classe G (IgG 1 e IgG 2) – seguidas de:
• Classe M (IgM)
• Classe A (IgA)
Infecção B. abortus ou
vacinação com B 19
Resposta dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados
com amostra patogênica de Brucella abortus ou vacinados com B19.
1º = IgM
2º = IgG 1
IgG 2 e IgA = mais tarde, aumentam gradativamente, mas
permanecem níveis baixos
Pós-infecção ou pós-vacinação (a
partir da 1ª semana) (IgM)
Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em
bovinos infectados com amostra patogênica de Brucella abortus.
Leve decréscimo IgM
IgG 1 permanece alto, inalterado
IgG 2 e IgA permanecem níveis baixos e estáveis
Infecção crônica B. abortus
IgG
0
50
100
150
200
250
0 5 12Tempo em meses
Tít
ulo
de
An
tic
orp
os
em
UI
IgG1
IgM
IgA
IgG2
• Título de anticorpos em bovinos infectados com
Brucella abortus ao longo do tempo.
Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em
bovinos vacinados com a amostra B19 de Brucella abortus.
Vacinados até 8 meses (3 – 8 meses)
Títulos Acs decrescem rapidamente – depois 12 meses
Vacinação acima 8 meses
Títulos vacinais elevados por mais tempo (Falso + )
Vacinação
com B 19
• Título de anticorpos em bezerras vacinadas entre
3 e 8 meses de idade com Brucella abortus amostra B-19.
0
50
100
150
200
250
0 2 4 5 8 10 12
Tempo em meses
Tít
ulo
de
An
tic
orp
os
em
UI
IgG1
IgM
IgA
IgG2
TAAT
• Teste de aglutinação: soroaglutinação (Ag + Acs = grumos)
• Antígeno:
• Células inteiras da amostra de B. abortus 1119-3 a
concentração de 8%
• Tamponado em pH ácido (3,65) (inibe IgG)
• Corado com o Rosa de Bengala
• A maioria dos soros de animais bacteriologicamente positivos
apresenta reação a essa prova
TAAT
• Pode ocorrer alguns poucos casos de reações falso + em
decorrência da utilização da vacina B19
• Toda reação positiva nesse teste confirmada por testes
de maior especificidade para se evitar o sacrifício de
animais não infectados
• Prova qualitativa: não indica o título de anticorpos do soro
testado.
Vacina B19
• Amostra B. abortus lisa
• Brasil: obrigatória bezerras 3 – 8 meses
• Atenuada para fêmeas jovens
• Machos: orquite
• Fêmeas gestantes: aborto
• Lisa anticorpos específicos contra LPS liso
interferência diagnóstico sorológico
• Persistência dos Acs – relacionado à idade de vacinação
Vacina B19
• Fêmea vacinada > 8 meses: Acs permanecem e
interferem por mais de 24 meses
• Vacina até 8 meses: Acs desaparecem rapidamente:
animais > 24 meses são negativos ao teste
Vacina RB 51
• Amostra de B. abortus rugosa atenuada
• Proteção semelhante à B 19
• Rugosa: não induz formação Acs anti-LPS liso
• Não interfere na sorologia
• Não indutora de Acs aglutinantes
• Brasil: vacinação estratégica fêmeas adultas
• Viva: mesmos cuidados que B 19
Animais que devem ser testados
• Fêmeas igual ou > 24 meses (vacinadas 3 – 8 m)
• Machos e fêmeas não vacinadas igual ou > 8 m (exclui
castrado)
• Fêmeas vacinadas (B 19) podem ser testadas?
• Sim. Idade igual ou > 24 meses
Colheita de sangue
• Sangue soro
• Tubos com vácuo (sem anticoagulante)
• Siliconados: facilita a retração do coágulo
• Agulhas individuais e descartáveis
• Sangue: 50% tubo 10 mL
• Tubos a T.A. (2 a 3 horas), abrigo da luz – boa
coagulação
• Soro: frasco limpo e seco
• Enviar para laboratório rapidamente (resfriado ou
congelados)
• Identificação correta frascos
Protocolo
• Antígeno para AAT
• Soros a testar
• Soros controles positivo e negativo
• Pipetas de Bang
• Micropipetador de 30 µL (0,03 mL)
• Ponteiras
• Placa de vidro – quadrados delimitados 4 cm x 4 cm
• Misturador de plástico ou metal
• Caixa de luz indireta para leitura
• Agitador de placa (opcional)
Protocolo
• Antígeno para AAT
• Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido
no serviço de DSA Estadual
• Conservados sob refrigeração (2°C a 8°C)
• Usados sempre dentro do prazo de validade
• Não podem ser congelados
Cuidados na execução
• Antígeno não em uso: manter 2 a 8 ºC (perda da
sensibilidade por resfriar/aquecer
• Temperatura de execução: 22ºC ± 4ºC
• Limpar material após uso (placas, pipetas, misturadores)
• Soros muito hemolisados = desprezados Falso +
• Controle positivo e negativo da reação
Técnica
• Equilibrar soro e antígeno – T.A. (30 min)
• Soro congelado: tempo maior
• Homogeneizar soros (cuidado!)
• Identificar área da placa
• 30 µL de soro por área da placa – encostar pipeta num
ângulo 45º
• Agitar suavemente antígeno – 30 µL ao lado do soro
(sem misturar)
Técnica
• Misturar soro e Ag com misturador (círculo 2 cm
diâmetro)
• Agitar a placa – movimentos oscilatórios (30
movimentos / minuto) por 4 minutos
• Colocar placa na caixa de leitura
• Anotar resultados
• Desconsideram reações de aglutinação que ocorrem
após os 4 minutos
Técnica
• Resultado
• Presença de grumos – Reagente
• Ausência de grumos – Não reagente
Negativa Positiva
Reação
positiva
Lógica de testes em propriedades livres
Propriedade
infectada
Propriedade
não infectada
teste 1 teste 2 teste 3 teste 4 teste 5
Propriedade
livre
teste 1 teste 2 teste 3
saneamento
(+) (+) (-) (-) (-)
(-) (-) (-) Propriedade
livre
saneamento
Propriedade
livre com
reinfecção teste 1 teste 2 teste 3 teste 4
Propriedade
livre
(+) (+) (-) (-)
saneamento Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT
ETAPAS DE SANEAMENTO - BRUCELOSE
Enquanto houver animais reagentes positivos, deve-se continuar
realizando testes e sacrifício desses animais. O intervalo entre esses testes
deve ser de 30 a 90 dias, até que se obtenha resultado negativo de
TODOS os animais examinados. O procedimento até obtenção do
certificado pode ser visto no esquema seguinte:
AAT – teste do antígeno acidificado tamponado
2-ME – teste do 2-mercaptoetanol
FC – teste de fixação do complemento
Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT