polígrafo práticas de bioquímica - uergs

Universidade Estadual do Rio Grande do Sul – UERGS

Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE

BIOQUÍMICA I

Profa. Dra. Jane Marlei Boeira

NOME:_________________________________________________________

Unidade de Porto Alegre

2015/2

Práticas de Bioquímica Profa Jane Marlei Boeira

Normas para o trabalho no laboratório

A palavra LABORATÓRIO provém da união de duas palavras latinas: labor = trabalho + oratorium = lugar de reflexão. Assim, o laboratório é um local de muito trabalho e muita concentração. Este ambiente é um recinto construído especialmente para a execução de experiências e a maior parte das atividades no dia-a-dia de um bioquímico se desenvolve no laboratório, local adequado para o trabalho de identificação, separação e determinação da quantidade de substâncias bem como, da preparação e obtenção de novos produtos. Resultados tais que podem ser utilizados para uma série de estudos, entre estes, para a pesquisa do funcionamento de organismos, de doenças e de novos medicamentos, entre outros.

Ao chegar ao laboratório lembre-se que este é um local de trabalho onde o cuidado e atenção são requisitos fundamentais para evitar acidentes.

Utilize sempre um guarda-pó, de preferência de algodão (os tecidos sintéticos podem grudar na pele, quando inflamados) e de manga comprida (para uma maior proteção).

O uso de shorts, bermudas, saias, sandálias ou chinelos não são permitidos durante as aulas práticas; a pele fica melhor protegida com calças compridas e sapato ou tênis fechado.

Cabelos compridos deverão ser presos, para evitar o risco de se incendiarem quando próximos de um bico de gás.

Faça apenas as experiências indicadas. Caso tenha interesse em outras experiências, consulte o seu professor. EXPERIÊNCIAS NÃO AUTORIZADAS SÃO PROIBIDAS.

Use capelas sempre que indicado. Comunique seu professor sobre qualquer acidente, por menor que seja.

Não use a boca para pipetar qualquer solvente ou solução.

Tenha cuidado com os materiais inflamáveis. Qualquer incêndio deve ser abafado imediatamente com uma toalha ou cobertor. Na primeira vez que entrar no laboratório procure se familiarizar com a localização dos extintores de incêndio, toalhas ou cobertores, chuveiros, etc.

Nunca jogue produtos ou soluções na pia ou no lixo. Descarte os resíduos conforme os procedimentos indicados pelo professor.

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Leia com atenção o rótulo de qualquer frasco antes de usá-lo. Leia duas vezes para ter certeza de que pegou o frasco certo. Anote no Caderno de Laboratório os dados constantes nos rótulos dos reagentes.

Nunca use espátulas ou pipetas de um frasco em outro para evitar contaminações.

Se um ácido ou outra solução em uso for derramado chame imediatamente o professor.

Não toque com os dedos os produtos químicos nem prove qualquer droga ou solução.

Não é recomendável tentar sentir o odor de uma substância.

Deixe qualquer objeto quente esfriar por bastante tempo. Lembre-se que a aparência do objeto quente ou frio é a mesma.

OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: AO TÉRMINO DE SUAS ATIVIDADES LAVE TODO MATERIAL UTILIZADO COM DETERGENTE E OS ENXÁGÜE COM ÁGUA E, EM SEGUIDA, COM ÁGUA DESTILADA. LIMPE AS BANCADAS ANTES DE DEIXAR O LABORATÓRIO.

O LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA deve possuir como suporte equipamentos como espectrofotômetro, banhos-maria, estufa, geladeiras para os kits bioquímicos, centrífugas, um aparelho medidor de pH (phmetro) e microcentrífuga, bem como materiais como os kits de reagentes, vidrarias, micropipetas, ponteiras, tubos de ensaio etc.

As aulas são programadas previamente pelo professor e posteriormente executadas em grupos pequenos de alunos proporcionando um aprendizado efetivo.

Este polígrafo foi preparado pela profa Dra Jane Marlei Boeira, após pesquisas em várias referências. No entanto, estas aulas poderão sofrer alterações, complementações ou podem ser substituídas, dependendo da disponibilidade de reagentes e equipamentos no Laboratório de Biotecnologia da Uergs, na Unidade de Novo Hamburgo.

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PRÁTICA 1

REAÇÃO DE AMINOÁCIDOS SULFURADOS

1. OBJETIVOS:

Identificar aminoácidos sulfurados, presentes na albumina do ovo, através de reação de precipitação com chumbo.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA:

Os α-aminoácidos fundamentais utilizados pelas células para a biosíntese das proteínas apresentam características estruturais diferentes. Em parte são essas diferenças que permitem que as proteínas desempenhem papéis muito variados nos seres vivos. Todos os α-aminoácidos fundamentais contêm na sua estrutura um grupo funcional amino e um grupo funcional ácido carboxílico ligados a um mesmo átomo de carbono, conhecido por carbono α. Esses grupos funcionais deixam de existir nesta forma quando os aminoácidos são ligados uns aos outros para originarem a molécula de uma proteína (ficando apenas um grupo amino na extremidade “inicial” da cadeia polipeptídica e um grupo ácido carboxílico na extremidade “final”). De fato são substituídos pelos grupos peptídicos, que resultam do estabelecimento das ligações entre os resíduos dos aminoácidos, ou seja, entre o que resta dos aminoácidos na estrutura da proteína.

AMINOÁCIDOS SULFURADOS: METIONINA e CISTEÍNA

Você já usou alguma fórmula para queda ou fortalecimento dos cabelos? Geralmente elas contêm os aminoácidos metionina e cisteína - aminoácidos sulfurados, ou seja, que contêm enxofre na cadeia lateral.

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Os aminoácidos são precursores das proteínas. No caso dos cabelos (assim como da pele e unhas), eles constituem a QUERATINA, uma proteína fibrosa que tem a CISTEÍNA como seu principal aminoácido. A queratina representa 90% da constituição dos fios e é responsável pela sua integridade.

Agressões, como poluição, secador, excesso de química, sol e chapinha podem danificar a queratina do cabelo, fazendo com que o fio perca a sua integridade.

Fica fácil entender também por que uma pessoa com dieta muito restritiva começa logo a ter queda de cabelos, não é mesmo? Assim como aquelas que não mantêm boa ingestão de proteínas! Uma curiosidade: as pontes dissulfeto (entre moléculas de enxofre) dos aminoácidos sulfurados é que fazem com que o cabelo seja mais ou menos ondulado. Rompendo estas pontes, através de diferentes processos, faz-se o alisamento dos fios!

3. MATERIAIS: Solução de albumina 10%: preparar uma solução de clara de ovo a 10% v/v em

solução salina (NaCl 0,9g/100mL) ou tampão fosfato 10 mmol/L, pH 7,0 (ovo disponibilizado pelos alunos)

NaOH 2,5 M Acetato de chumbo II 10% 5 tubos de ensaio Pipetas graduadas de 1 e 5 mL

4. PROCEDIMENTOS:a) Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de solução de albumina de ovo, 1 mL de

solução de hidróxido de sódio 2,5 M e 1 mL de acetato de chumbo II a 10%.

b) Aquecer e observar.Obs.:esta reação caracteriza-se pela liberação de H2S de aminoácidos e proteínas que contenham enxofre na sua molécula. O precipitado de cor________________________ forma-se através da seguinte reação:

Pb+2 + S-2 PbS

5. REFERÊNCIAS:

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.

BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Bioquímica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.

Bioquímica: aulas práticas / Departamento de Bioquímica, 6a ed., Curitiba: Ed. da UFPR, 1999.

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RELATÓRIO No 1

PRÁTICA 1: REAÇÃO DE AMINOÁCIDOS SULFURADOS

NOME:_________________________________________ DATA:_________________

RESPONDA:

1. Qual a cor observada na reação com o acetato de chumbo II em presença da proteína albumina, presente na clara do ovo?

2. Procurar a fórmula estrutural dos aminoácidos que poderão dar os resultados obtidos na atividade acima.

3. Com base na cadeia lateral destes aminoácidos, você acha que eles são solúveis ou insolúveis em água? Justifique.

4. Analisar a polaridade de outros aminoácidos.

5. Como os aminoácidos devem unir-se para formar uma proteína?

6. Construir modelos de peptídeos contendo aminoácidos polares e apolares, indicando suas possíveis interações.

7. As proteínas globulares normalmente são solúveis em água. Você observou que a albumina, uma das proteínas existentes na clara do ovo, é solúvel em água. Que tipo de aminoácidos você espera que esteja em maior quantidade nesta proteína?

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PRÁTICA 2

DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA

1. OBJETIVOS

Reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas; Analisar a influência do pH sobre a distribuição dessas cargas.


Os aminoácidos apresentam dois rupos que são passíveis de sofrer protonação (adição de H) e desprotonação (retirada de H). Observe:

A figura demonstra as etapas de ionização em que podem ser encontrados os aminoácidos: 1. Forma positivamente carregada. 2. Forma eletricamente neutra. Note que existe uma densidade de carga negativa e uma densidade de carga positiva sobre a molécula, conferindo carga total nula. Essa forma também é denominada isoelétrica ou zwitteriônica. 3. Forma negativamente carregada.

Essas formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do pH em que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor de pH, maior a concentração de íons H+ em solução e, conseqüentemente, maior a prevalência da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o valor de pH, menor a quantidade de íons H+ em solução, havendo prevalência da forma negativamente carregada(3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá existir, então, numa condição de pH intermediária à existência predominante da forma positiva e negativa do aminoácido. Esses valores de pH podem ser facilmente determinados experimentalmente e também podem ser estendidos às proteínas, ou seja: as proteínas também apresentam uma distribuição de cargas, que pode ser alterada em função do pH.O ponto onde a carga líquida total da molécula de aminoácido ou proteína é nula é tão importante, que recebeu uma denominação especial. Assim, o valor de pH onde existe equivalência entre as cargas positivas e negativas da molécula é denominado PONTO ISOELÉTRICO.

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Mas por que o ponto isoelétrico é tão importante??

A solubilidade das proteínas, como veremos mais adiante, depende de vários fatores. Dentre eles, destaca-se a presença das cargas elétricas ao longo da molécula. A existência de uma carga positiva ou negativa determina a interação com o meio aquoso, além de estabelecer um estado de repulsão entre as próprias moléculas de proteína, aumentando a interação com o solvente e, conseqüentemente, favorecendo a solubilidade. Com vimos, no ponto isoelétrico existe um equilíbrio entre o número de cargas positivas e negativas, o que gera uma situação em que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína e as forças de interação com o solvente são mínimas. Assim, as proteínas vão formando aglomerados que, cada vez maiores, tendem a precipitar. É importante destacar que essa diminuição de solubilidade varia de proteína para proteína.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A parte experimental está dividida em três momentos, a saber:

3.1. Extração da caseína do leite 3.2. Preparo de uma solução de caseína 3.3. Determinação do ponto isoelétrico da caseína

3.1. EXTRAÇÃO DA CASEÍNA DO LEITE

3.1.1. Material

a) Reagentes e soluções

- Leite (disponibilizado pelos alunos) - Solução de ácido acético (CH3COOH) 2M - Etanol (CH3CH2OH) 95% (v/v) - Éter etílico (CH3CH2OCH3CH2)

b) Vidraria e instrumental - Béquer de 250 mL- Proveta de 100 mL- Conta-gotas- Funil e papel de filtro

3.1.2. Procedimento

1. Aquecer 150 mL de água destilada a 38oC; 2. Adicionar 50 mL de leite e misturar bem; 3. À solução acima, gotejar a solução de ácido acético, até o aparecimento de um precipitado abundante (aproximadamente 0,7 mL do ácido); 4. Deixar descansando durante, aproximadamente, 20 minutos para sedimentação da proteína; 5. Separar o sobrenadante por decantação; 6. Ao precipitado, adicionar 20 mL de etanol e misturar bem; 7. Filtrar (ou, se possível, centrifugar) e desprezar o filtrado (só interessa o

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precipitado); 8. Adicionar, ao precipitado, 5 mL de éter etílico e misturar; 9. Decantar o sobrenadante e secar o precipitado (caseína) em papel de filtro (em estufa).

3.2. PREPARO DA SOLUÇÃO DE CASEÍNA

3.2.1. Material


- Caseína obtida na etapa anterior - Hidróxido de sódio (NaOH) 1M - Ácido acético (CH3COOH) 1M

b) Vidraria e instrumental - Proveta de 50 mL- Béquer de 200 mL- Béquer de 100 mL- Papel indicador universal

3.2.2. Procedimento

1. Pesar, aproximadamente, 1g da caseína obtida na etapa anterior; 2. Adicionar 50 mL de água destilada para ressuspender a caseína; 3. Adicionar 25 mL da solução de NaOH e agitar lentamente, para evitar a formação de espuma, até completa dissolução da caseína; 4. Adicionar 25 mL de ácido acético 1M e agitar cuidadosamente; 5. Ajustar o pH para um valor próximo da neutralidade utilizando, para isso, ácido ou base (a solução terá volume final de 100 mL, preparada por um grupo somente).

3.3. DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA

3.3.1. Material


- Solução de caseína preparada acima - Ácido acético 2M - Ácido acético 1M - Ácido acético 0,1M - Ácido acético 0,01M

b) Vidraria e instrumental - Nove tubos de ensaio- Papel indicador universal- Pipetas ou conta-gotas

3.3.2. Procedimento

1. Numere nove tubos de ensaio e distribua os reagentes (quantidades em mL) seguindo as indicações da tabela abaixo:

SUBSTÂNCIA 1 2 3 4 5 6 7 8 9

9


Água destilada 4,0 4,4 4,3 3,7 3,5 2,5 0,5 3,9 3,7Ácido acético 0,01M 0,5 - - - - - - - -Ácido acético 0,1M - 0,1 0,2 0,8 - - - - -Ácido acético 1M - - - - 1,0 2,0 3,0 - -Ácido acético 2M - - - - - - - 0,8 1,0

2. A cada tubo, adicionar 0,5mL da solução de caseína preparada na etapa anterior.

3. Agitar lentamente, sem fazer espuma;

4. Medir o pH em todos os tubos (papel indicador universal ou phmetro)

5. Preencha a tabela abaixo e discuta os resultados.

RESULTADOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9pH

turbidez

* Sugestão: você pode adotar a seguinte escala para quanto à turbidez:

4. REFERÊNCIAS:

REMIÃO, J.O.R.; SIQUEIRA, A.J.S.; AZEVEDO, A.M.P. BIOQUÍMICA: Guia de Aulas Práticas. Porto Alegre: EdiPUCRS, 2003.



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RELATÓRIO No 2

PRÁTICA 2: DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA

NOME:_________________________________________ DATA:_________________

I. Resultados:

RESULTADOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9pH

turbidez

II. Responda:

1. Qual a propriedade da proteína que permite identificar seu ponto isoelétrico? Justifique sua resposta.

2. Explique a turbidez apresentada no tubo identificado como o do ponto isoelétrico?

3. A caseína é a principal proteína do leite, constituído aproximadamente por 1/3 da proteína total no leite humano. Considerando que o pH deste leite é de aproximadamente 6,6 e com base no experimento, responda:

a. A caseína é solúvel ou está precipitada no leite humano?

b. O que aconteceria se acidificássemos o leite até um valor de pH que coincida com o PI da caseína?

4. Embora fosse proibido e tornasse o leite impróprio para o consumo humano, alguns produtores inescrupulosos adicionavam soda cáustica ao leite de vaca para evitar que ele “coalhasse”. Esta adição era feita empiricamente, mas você tem condições de explicar o fenômeno. Descreva-o.

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AULA PRÁTICA 3

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS (REAÇÃO DO BIURETO)

1. OBJETIVO:

Caracterizar a presença de proteínas em material biológico através da reação do biureto.


Biureto é o nome dado à estrutura originada a partir da decomposição da uréia, quando essa é submetida a uma temperatura de, aproximadamente, 180oC:

Soluções alcalinas que contenham biureto desenvolvem uma coloração violeta, quando em presença de sulfato de cobre (CuSO4). Esse fenômeno deve-se à formação de um complexo entre o íon Cu2+ e os átomos de Nitrogênio presentes na molécula do biureto. O esquema abaixo representa um modelo da formação desse complexo:

Interação biureto / Cu2+

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Se fizermos uma boa observação, veremos que as ligações existentes na molécula de biureto são muito parecidas com as ligações peptídicas estabelecidas entre os aminoácidos durante a formação de peptídeos e das proteínas.

Observe o esquema abaixo, que representa a interação entre as ligações peptídicas de uma proteína ou peptídeo com íons Cu2+:

Interação ligação peptídica / Cu2+

Assim, a reação de peptídeos e proteínas com o sulfato de cobre recebeu o nome de Teste do Biureto, e é utilizada para pesquisa de ligações peptídicas.

OBS.: quando soluções de proteínas em meio fortemente alcalino são tratadas com soluções diluídas de íon cúprico há o aparecimento da cor característica (violácea). O aparecimento da coloração deve-se a formação de um complexo de coordenação íon Cu+2

com átomos de nitrogênio presentes nos grupos peptídicos.

3. MATERIAL

1. Caseína (Sol 10%) (1) 2. batata (trazer) 3. glicose (sol 10%)4. frutose ((Sol 10%) 5. farinha (trazer) 6. fígado (trazer: fígado de frango)7. clara de ovo (trazer) 8. mamão (trazer) 9. açúcar (trazer)10. leite de soja (trazer) 11. leite integral (trazer) 12. maisena (trazer)13. NaOH 2,5 M 14. Solução de CuSO4 1% 60 Tubos de ensaio

15 Pipetas graduadas p/ 1mLObs.: (1) caseína preparada na aula prática anterior.

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4. PROCEDIMENTO

1) Identificar os tubos de ensaio com o nome ou número da respectiva amostra a ser testada.

2) Pipetar 1,0 mL de solução de caseína e colocar num tubo de ensaio.

3) Adicionar 1,0 mL de solução da NaOH 2,5 M e 1,0 mL de solução de CuSO4 1%. Agitar bem, observar e anotar o resultado na tabela.

4) Utilizando o resultado obtido no item anterior como padrão, testar a presença de proteínas nas demais amostras mencionadas na tabela. Observar e anotar os resultados.

Observação: Para a realização desta atividade as amostras sólidas devem ser dissolvidas em água destilada: conforme indicação:

Farinha, maizena e açúcar: dissolver aproximadamente 1g da amostra em 5 mL de água destilada;

As amostras mamão, fígado, batata devem ser maceradas e misturadas a aproximadamente a 5 mL de água destilada. Filtrar a mistura com auxílio de um pedaço de gaze.

5. REFERÊNCIAS:



Bioquímica: aulas práticas / Departamento de Bioquímica, 6a ed., Curitiba: Ed. da UFPR, 1999.

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RELATÓRIO No 3

AULA PRÁTICA 3: IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS (REAÇÃO DO BIURETO)

NOME:______________________________________DATA:___________________

I. Resultados

MATERIAL BIOLÓGICO COR APRESENTADA1. CASEÍNA

2. BATATA

3. GLICOSE

4. FRUTOSE

5. FARINHA

6. FÍGADO

7. CLARA DE OVO

8. MAMÃO

9. AÇÚCAR

10. LEITE DE SOJA

11. LEITE INTEGRAL

12. MAIZENA

II. Responda:

a) Em quais alimentos/tecidos você comprovou a existência de proteínas? Justifique.

b) Pesquisar o tipo de proteína mais abundante em cada amostra testada.

c) Quais os grupos presentes nas proteínas (se houver) que são responsáveis pela mudança de cor oservada?

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PRÁTICA 4

CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS POR MEIO DE REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO

1. OBJETIVOS:

Caracterizar a presença de proteínas em material biológico; Demonstrar as reações de coloração para proteínas; Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação; Relacionar as observações práticas com a teoria de proteínas gerais, estrutura e

isolamento de proteínas.


Caracterização de proteínas A caracterização de proteínas pode ser feita utilizando reações de coloração ou precipitação.

Devido à presença de diferentes aminoácidos e às ligações peptídicas as proteínas reagem com uma variedade de compostos formando produtos coloridos. Existem reações de coloração que são específicas para aminoácidos encontrados nas proteínas e essas reações são importantes tanto na detecção como na dosagem de aminoácidos e proteínas. Existem também reações chamadas de gerais, porque irão caracterizar grupamentos comuns a todas as proteínas, como grupos aminos e ligações peptídicas (reação da ninhidrina e do biureto, respectivamente).

Os grupos -amino de aminoácidos, peptídeos e proteínas reagem com a ninhidrina formando um complexo de cor púrpura, quando a solução é aquecida. A intensidade da cor é proporcional à concentração de aminoácidos sendo a técnica utilizada para a determinação quantitativa dos mesmos. Os iminoácidos (prolina e hidroxiprolina) formam um complexo amarelo.

A reação do biureto é devida às ligações peptídicas dando positiva para peptídeos com mais de 2 aminoácidos e proteínas, sendo também positiva para substâncias que contêm mais de dois grupos amida. Ocorre a formação de um complexo de coordenação com o cobre de cor púrpura.

A solubilidade das proteínas é muito variável e depende da distribuição e da proporção dos grupos polares e apolares na molécula. A proteína é solúvel quando ocorre interação proteína-água e tende a ser insolúvel quando ocorre interação proteína-proteína. Qualquer condição que altere essas interações alterará a solubilidade.

Desnaturação é por definição a modificação que ocorre na estrutura nativa de uma proteína, alterando assim sua propriedade. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária das proteínas. A estrutura primária é mantida.

Existem vários agentes desnaturantes: calor, ácidos, solventes orgânicos, sais de metais pesados etc.

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As alterações que se observam em decorrência da desnaturação podem ser, entre outras, a diminuição da solubilidade e/ou a perda da atividade biológica.

A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favorecem a interação proteína-proteína. A floculação e a coagulação são manifestações visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.

Agentes desnaturantes

Calor: agitação térmica afeta as interações que estabilizam a estrutura tridimensional das proteínas (pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas).

Reagentes para alcalóides (ácidos): combinam com proteínas com carga positiva formando complexos insolúveis. Por exemplo: tricloroacetato de proteína.

Sais de metais pesados: combinam-se com proteínas com carga negativa, formando proteinatos insolúveis, por exemplo: proteinato de chumbo.

Solventes orgânicos: estes solventes apresentam constante dielétrica inferior à água, então a atração entre cargas opostas é alta (precipitação).

As proteínas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por variação do pH e por alterações da força iônica do meio e por ação de solventes orgânicos à baixa temperatura.

Ao variar o pH da solução de proteína, os radicais dos aminoácidos sofrem dissociação e no ponto isoelétrico, quando a molécula está totalmente dissociada, a força de atração eletrostática é máxima e a solubilidade decresce.

A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade de muitas proteínas é uma função da força iônica. A concentração reduzida de sal aumenta a solubilidade das proteínas porque diminui a interação proteína-proteína, fenômeno denominado "salting-in". Em altas concentrações de sal ocorre a remoção da água de hidratação, o que leva a predominância da interação protéina-proteína, resultando em precipitação, ou "salting-out". O "salting-out" é um processo muito importante porque diferentes concentrações de sal podem ser empregadas para separar diferentes proteínas.

3. REATIVOS: Solução de proteínas a 10% (trazer um ovo para preparar a solução) Solução de ninhidrina 0,1% Hidróxido de sódio 2,5 mol/L Solução de sulfato de cobre 1% Ácido tricloroacético (TCA) a 10% v/v Acetato de chumbo 5% p/v Álcool etílico absoluto Clara de ovo "in natura" (trazer um ovo) Cloreto de sódio 1 mol/L Solução saturada de sulfato de amônio 76,6g% p/v

4. MATERIAIS:

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45 tubos de ensaio 5 bastões de vidro Banho-Maria

5. PREPARO DOS REATIVOS Solução de proteínas : preparar uma solução de clara de ovo a 10% v/v em solução

salina (NaCl 0,9g/100mL) ou tampão fosfato 10 mmol/L, pH 7,0

Solução de ninhidrina : pesar 100 mg de ninhidrina e dissolver em 100 mL de tampão fosfato 0,01 mol/L, pH 7,0. Conservar em frasco escuro e em geladeira.

6. PROCEDIMENTOS

I. Reações de coloração

a) Reação da Ninhidrina (não temos) Tubo 1: 2 mL de ninhidrina + 5 gotas de proteínas 10%, banho-maria por 5 min, a

100oC. Anotar o resultado.b) Reação do BiuretoTubo 2: 1 mL de proteína 10% + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de

cobre 1%Tubo 3: 1 mL de água destilada + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato

de cobre 1%Anotar o resultado.

II. Reações de precipitação

a) Ação do calor Tubo 4: 2 mL de proteína 10%, aquecer em banho-maria a 100oC por 3 min. Anotar o resultado.

b) Reação com reagentes para alcalóides Tubo 5: 1 mL de proteína 10% + 1 mL de TCA 10%. Anotar o resultado.

c) Reação com sais de metais pesadosTubo 6: 1 mL de proteína 10% + 1 mL de acetato de chumbo 5%. Anotar o resultado

d) Reação com solventes orgânicosTubo 7: 1 mL de proteína 10% + 3 mL de álcool etílico. Anotar o resultado.

e) Efeito da adição de sais

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Tubo 8: 3 mL de clara pura + água destilada até a formação de precipitado esbranquiçado. Dissolver com auxílio de um bastão, adicionar NaCl 1mol/L gota a gota até o precipitado redissolver.

Tubo 9: 2 mL da solução anterior + 4 mL de solução saturada de sulfato de amônio. Observar. Adicionar 4 a 6 mL de água destilada e observar o efeito.

7. Referências:



Bioquímica: aulas práticas / Departamento de Bioquímica, 6a ed., Curitiba: Ed da UFPR, 1999.

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RELATÓRIO No 4

AULA-PRÁTICA 4: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS POR MEIO DE REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO

NOME:____________________________________________DATA:_______________

I. OBJETIVOS:____________________________________________________

________________________________________________________________

___

II. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

REAÇÕES TUBO RESULTADO INTERPRETAÇÃO

1. Reações de coloração

Ninhidrina 1

Biureto2

3

2. Reações de precipitação

4

5

6

7

8

9

III. Responder:1. Em que se fundamenta a reação da ninhidrina e que classes de substâncias reagem

positivamente?

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2. Em que se fundamenta a reação do Biureto e que grupos nas proteínas são responsáveis por esta reação?

3. Qual a importância da reação do Biureto?

4. Qual é a importância das reações de precipitação de proteínas por reagentes dos alcalóides e por sais de metais pesados?

5. Explique os mecanismos que levam uma proteína a se dissolver quando há um pequeno aumento na força iônica da solução e os mecanismos que levam uma proteína a precipitar quando há um grande aumento na força iônica da solução.

6. Que mudanças ocorrem com uma proteína quando em contato com etanol?

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AULA PRÁTICA 5

CARACTERIZAÇÃO DOS TRIACILGLICERÓIS DE ÓLEO VEGETAL

1. OBJETIVOS: Caracterizar triacilgliceróis através de hidrólise alcalina (reação de saponificação); Evidenciar a formação dos produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades.


Os lipídios se caracterizam por sua insolublidade em água e solubilidade em solventes orgânicos como clorofórmio, éter, benzeno, mistura de Folch (clorofórmio:metanol). A grande maioria dos lipídios apresenta ácidos graxos esterificados em sua estrutura, abrangendo os acilgliceróis ou os glicerídeos, os cerídeos, os fosfolipídeos e os glicolipídeos. Estes compostos, mediante aquecimento em presença de bases fortes como NaOH e KOH, produzem sais de sódio ou potássio de ácidos graxos ou sabões alcalinos. Devido a esta propriedade, estes lipídeos são denominados de lipídeos saponificáveis já que podem ser caracterizados pela saponificação.

Exemplo:

Os sabões são moléculas anfipáticas, apresentando em sua estrutura uma longa cadeia hidrocarbonada (cauda apolar) e um grupo carboxilato (cabeça polar). Formam soluções coloidais estáveis em água, já que as moléculas se associam por interações hidrofóbicas entre as caudas apolares formando micelas, apresentando grupos carboxilatos carregados negativamente na superfície das mesmas. Na superfície da água, as moléculas de sabão se orientam em uma camada onde as cabeças polares interagem com a água e as caudas apolares permanecem fora do líquido. Esta disposição provoca o abaixamento da tensão

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H2-C-O-CO(CH2)7-CH=CH(CH2)7-CH3

H-C-O-C0(CH2)7-CH=CH(CH2)7-CH3 + 3KOH100oC, 30 min

H2-C-O-CO(CH2)7-CH=CH(CH2)7-CH3 Trioleil-glicerol (ou trioleína)

CH2OH O

3CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-C + CH2OH OK

CH2OHOleato de potássio (sabão) glicerol


superficial da água. Os ácidos graxos dos sabões podem ser precipitados pela adição de ácidos fracos (ácido acético).

Os sabões de metais alcalinos terrosos (Ca++) são insolúveis porque se encontram praticamente não dissociados.

Os sabões também possuem poder emulsificante visto que quando agitados com óleo ou gordura, em meio aquoso, interagem com os mesmos através das caudas apolares produzindo gotículas carregadas que se mantêm em emulsão.

3. REATIVOS: Solução de potassa alcoólica : 1 volume de hidróxido de potássio a 40% e 1 volume

de etanol a 95% Óleo vegetal (preparar partir de semente de soja, ver item 5) Ácido acético concentrado Solução de cloreto de cálcio a 10% Solução saturada de cloreto de sódio Acetona

4. MATERIAIS 25 tubos de ensaio 2 Copos de béquer 100mL Papel filtro Banho-maria Pérolas de porcela ou vidro para ebulição

5. PREPARO DOS REATIVOS

1. Obtenção de óleo vegetal a partir da extração de lipídios de semente de soja: em um copo de Becker de 100 mL pesar 10 g de soja moída e seca. Adicionar 25 mL de acetona e agitar por 5 min. Filtrar através de papel filtro para um outro copo de Becker de peso conhecido e lavar o resíduo com 10 mL de acetona por duas vezes. Evaporar o filtrado em banho-maria à temperatura de 50oC, com agitação constante até eliminação total da acetona.

23

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7COO-K+ + CH3COOH Oleato de potássio + ácido acético

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7COOH + CH3COOKÁcido oléico + acetato de potássioCH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7COO-K+ + CaCl3

Oleato de potássio + cloreto de cálcio

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7COO Ca + 2 KCl

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7COOOleato de cálcio (insolúvel)


Observar o resíduo amarelo e oleoso, pesar o copo de Becker e por diferença de peso calcular o rendimento da extração.

6. PROCEDIMENTOS:

I. Em um tubo de ensaio grande colocar 15 gts de óleo vegetal e 5 mL de solução de potassa alcoólica. Adicionar pérolas de porcelana para evitar ebulição tumultuosa. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 min. Nestas condições, o óleo é saponificado obtendo-se uma solução opalescente de sais de potássio de ácidos graxos (sabões) e glicerol.

II. Repartir a solução de sabões em quatro tubos de ensaio e realizar os seguintes testes:a) Tubo 1 : Abaixamento da tensão superficial: agitar a solução de sabões e verificar a

formação de espumab) Tubo 2 : Precipitação de ácidos graxos: ao segundo tubo adicionar gota a gota ácido

acético concentrado até notar o aparecimento de um precipitado branco de ácidos graxos, que são insolúveis devido ao seu baixo grau de dissociação

c) Tubo 3 : Precipitação de sabões de cálcio: ao terceiro tubo adicionar cloreto de cálcio a 10% gota a gota até notar o aparecimento de um precipitado de sabões de cálcio

d) Tubo 4 : Precipitação por excesso de eletrólitos: ao quarto tubo adicionar igual volume de solução saturada de cloreto de sódio. Observar a formação de um precipitado de sabão por excesso de sais neutros, sendo explicada pelo efeito do íon comum, que reprime a dissociação dos sabões fazendo que as micelas percam a carga e precipitem.

7. REFERÊNCIAS:




24


RELATÓRIO No 5PRÁTICA 5: CARACTERIZAÇÃO DOS TRIACILGLICERÓIS DE ÓLEO

VEGETAL

NOME:____________________________________DATA:___________________

I. OBJETIVOS:_______________________________________________________

_________________________________________________________________________

II. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

TUBO REAÇÃO RESULTADO OBSERVAÇÕES

1 Abaixamento da tensão superficial

2 Precipitação de ácidos graxos

3 Precipitação de sabões de cálcio

4 Precipitação por excesso de eletrólitos

III. RESPONDA:

1. Escrever a reação de hidrólise alcalina de um triglicerídeo.

2. Por que se utiliza etanol na reação de saponificação?

3. Explicar a ação detergente dos sabões.

4. Explicar a precipitação de sabões por excesso de eletrólitos.

25


AULA PRÁTICA 6

VERIFICAÇÃO DA SOLUBILIDADE DO ÓLEO DE SOJA E DO ÁCIDO ESTEÁRICO EM SOLVENTES ORGÂNICOS

1. OBJETIVOS: Verificar a solubilidade dos óleos de soja e esteárico em solventes orgânicos e

inorgânicos.


Os lipídios (do grego: lipos, gordura) são substâncias de origem biológica, solúveis em solventes orgânicos (éter, clorofórmio, benzeno) e insolúveis ou pouco solúveis em água.

Os testes de solubilidade são feitos utilizando-se solventes como a água destilada, éter etílico, solução de hidróxido de sódio, de bicarbonato de sódio, de ácido clorídrico e ácido sulfúrico concentrado, entre outros.

3. MATERIAIS: Ácido esteárico (procurar na Delaware (fone: 3341-0812), ver também no

mercado público - ou substituir por óleo de coco) Óleo de soja (trazer) HCl 0,1M NaOH 0,1 M Etanol 70% Éter etílico 25 tubos de ensaio Pipetas graduadas de 5 mL Espátula

4. PROCEDIMENTOS:a) Numerar cinco tubos de ensaio e adicionar em cada um deles uma ponta de espátula

rasa de ácido esteárico (estearina). b) Após, adicionar em cada tubo 5,0 mL de cada uma das seguintes substâncias,

conforme a tabela:

TUBO 5,0 mL SOLVENTE1 Água2 Sol de ácido clorídrico 0,1M3 Sol de hidróxido de sódio 0,1 M4 Sol de etanol 70%5 Éter etílico

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c) Agitar bem cada um dos seguintes solventes e verificar se o ácido esteárico solubiliza ou não em cada um dos solventes. Anotar os resultados na tabela de resultados.

d) Repetir o experimento anterior, utilizando no lugar do ácido esteárico 3 gotas de óleo de soja. Anotar os resultados na tabela de resultados.

5. REFERÊNCIAS




27


RELATÓRIO No 6

AULA PRÁTICA 6: VERIFICAÇÃO DA SOLUBILIDADE DO ÓLEO DE SOJA E

DO ÁCIDO ESTEÁRICO EM SOLVENTES ORGÂNICOS

NOME:____________________________________DATA:______________________

I. OBJETIVOS:____________________________________________________

________________________________________________________________

___

II. RESULTADOS:

Solvente Ácido esteárico Óleo de soja

Água

Ácido clorídrico 0,1M

Hidróxido de sódio 0,1M

Etanol 70%

Éter etílico

III. INTERPRETAÇÃO:

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

28


---------------------------------------------------------------------------------------------------------

---

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AULA PRÁTICA 7

EXTRAÇÃO DE DNA DE Allium cepa PELA PRECIPITAÇÃO EM ETANOL

(Extração de DNA: método de extração com detergente e precipitação em etanol)

1. OBJETIVOS:

Extrair DNA pelo método de precipitação em etanol

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas: a) Ruptura das células para liberação dos núcleos; b) Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos, DNA e proteínas; c) Separação do DNA dos demais componentes celulares.

O bulbo da cebola será usado por apresentar células grandes, que se rompem quando a célula é picada. O detergente desintegra os núcleos e os cromossomos das células da cebola, liberando DNA. Um dos componentes do detergente, o dodecil (ou lauril) sulfato de sódio, em concentração salina adequada, desnatura as proteínas, separando-as do DNA cromossômico. O álcool gelado, em ambiente salino faz com que as moléculas de DNA se aglutinem, formando uma massa filamentosa e esbranquiçada.

3. MATERIAL

uma cebola grande (+- 200g) (disponibilizado pelos alunos) faca de cozinha (disponibilizado pelos alunos) dois copos de Becker banho-maria (+- 60º C) água filtrada sal de cozinha detergente (SDS – dodocil sulfato de sódio ou SLS – lauril sulfato de sódio) (pode

ser detergente comum de lavar a louça) álcool etílico 95 % gelado a cerca de -10º C bastão fino de vidro papel filtro gelo moído solução salina-citrato pH5,6

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4. PROCEDIMENTOS

1. Descascar uma cebola de tamanho médio e picá-la em pedaços pequenos de aproximadamente 0,5 cm.2. Pesar cerca de 50g de cebola picada e adicionar, em um bequer , a mistura de 60 mL de detergente (SDS ou SLS a 25%) e uma colher de 5 mL de NaCl. Mexer bem até a dissolução.3. Misturar a cebola e a solução de detergente salino e deixar 15 minutos em banho – maria a 60 º C.4. Retirar e esfriar rapidamente em banho de gelo picado, por 5 minutos.5. Filtrar em papel filtro e recolher o filtrado em um bequer limpo.6. Ao filtrado, adicionar deixando escorrer vagarosamente pela borda, 75 mL a 100 mL de álcool 95 % gelado a -10 º C. Formar-se-ão 2 fases: a superior , alcóolica e a inferior, aquosa.7. Introduzir um bastão de vidro atravessando a interfase e, em seguida, imprimir-lhe um movimento circular. Verifica-se que o material filamentoso (filamentos de DNA) vai aderindo ao mesmo.8. Retirar o bastão e dissolver o filamento a ele aderido em 5 mL da solução salina-citrato, previamente pipetados num tubo de ensaio. Guardar a 4oC, caso queiram guardar o material para posterior análise.

Reagentes e suas funções:- Solução de Dodecil Sulfato de Sódio a 25% - o detergente lisa os núcleos pela ação sob os lipídios da membrana nuclear, inibe a ação enzimática (DNAse) e desnatura proteínas- Álcool Etílico 95% - para precipitar o DNA- Solução Salina-Citrato – Cloreto de sódio 0,025 M e Citrato trissódico a 0,0015 M pH7,0. Esta solução contém força iônica adequada para dissolver o DNA.

5. REFERÊNCIAS




31


RELATÓRIO No 7

Prática 7: EXTRAÇÃO DE DNA DE Allium cepa

NOME:_______________________________________________DATA:__________

1. OBJETIVO:___________________________________________________________

_____________________________________________________________________

2. RESULTADO:

2.1 Descrever o que foi observado ao isolar o DNA da cebola:

_____________________________________________________________________

______________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

3. RESPONDA:

3.1. Qual a função do SDS sobre as células?________________________________

_________________________________________________________________________

___________________________________________________________________

3.2 Qual a função do álcool etílico sobre o DNA?____________________________

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

4. CONCLUSÕES:______________________________________________________

______________________________________________________________________

5. COMENTÁRIOS:_____________________________________________________

________________________________________________________________________

32


PRÁTICA 8

EXTRAÇÃO DE AMIDO E CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS

Esta prática será dividida em duas etapas:

I) Extração de amido;

II) Caracterização de carboidratos.

I. EXPERIMENTO 1: EXTRAÇÃO DE AMIDO

1. OBJETIVO:

Extrair o amido de batata inglesa.


Polissacarídeos são moléculas de elevado peso molecular, cuja unidade fundamental são os monossacarídeos, principalmente a glicose. Exemplos de polissacarídeos importantes na natureza, podemos destacar o glicogênio, a celulose e o amido.

O amido, polissacarídeo de extrema importância em alimentos, é produzido em grande quantidade nas folhas dos vegetais como forma de armazenamento dos produtos da fotossíntese, e é constituído por dois outros polissacarídeos estruturalmente diferentes: amilose e amilopectina (ver figuras abaixo).

33


3. MATERIAIS:

Providenciados pelos alunos

1 batata média e uma faca sem ponta (ou uma batata já descascada e cortada em cubos) (trazer)

Do laboratório Liquidificador papel de filtro ou gaze 2 béqueres ( 1 e 2 ) de 200 mL 1 bastão de vidro água fervente e água fria pipeta

4. PROCEDIMENTO:

Liquidificar a batata sem casca com 100 mL de água destilada (temperatura ambiente) e transferi-la para o béquer 1, sem desprezar o líquido formado;

Filtrar o material do béquer 1 e transferir o filtrado para o béquer 2; Deixar o béquer 2 em repouso por 10 minutos e verificar o surgimento de um

precipitado branco no fundo do béquer; Limpar o béquer 1; Ferver 150 mL de água destilada no béquer 1; Separar cuidadosamente o sobrenadante do precipitado do béquer 2; Ao precipitado adicionar 50 mL da água fria, agitar e misturar à água do béquer 1

até a formação de uma solução opalescente. Esta solução (de amido) será usada no experimento seguinte.

II. EXPERIMENTO 2 - CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS

1. OBJETIVOS: Entender o mecanismo de solubilização do amido; Caracterizar o amido como um polissacarídio; Caracterizar os monômeros do amido; Entender a interação do amido com o iodo.


34


Por serem moléculas muito ricas em grupamentos hidroxila (-OH), os monossacarídeos podem ser facilmente desidratados por ação de ácidos fortes concentrados, como o ácido sulfúrico (H2SO4). O ácido rompe facilmente as ligações glicosídicas presentes em moléculas de polissacarídeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacarídeos. Esses, por sua vez, são desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o monossacarídeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Tanto o furfural quanto o HMF são substâncias incolores, impedindo que a reação seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenólico ao meio (alfa-naftol, conhecido como reativo de Molisch). O fenol reage como os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de coloração lilás.

Reação do carboidrato com o Reativo de Molisch

Reação do amido com o iodo:

O amido é uma mistura de 10% a 20% de amilose e 80% a 90% de amilopectina. Como mostrado na figura do experimento 1, a amilose é um polímero de cadeia não ramificada e a amilopectina contém ramificações.

Como podemos observar, a molécula da amilose não apresenta ramificações e, no espaço, assume conformação helicoidal (forma de hélice). A ligação entre os átomos de carbono das unidades de glicose são do tipo alfa 1-4.

35

http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/oligossacarideos.htm

http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/oligossacarideos.htm


A amilopectina apresenta estrutura ramificada, sendo que os "ramos" aparecem a cada 24-30 moléculas de glicose. A ligação entre as unidades de glicose também é do tipo alfa 1-4 na mesma cadeia. Porém, unindo duas cadeias aparecem ligações do tipo alfa 1-6. Observe a figura abaixo:

Moléculas de alto peso molecular (como a amilose e a amilopectina) podem sofrer reações de complexação, com formação de compostos coloridos. Um exemplo importante é a complexação da amilose e da amilopectina com o iodo, resultando em complexo azul e vermelho-violáceo, respectivamente. A figura abaixo esquematiza a interação do iodo com a estrutura do amido:

36


O amido está presente nas farinhas de trigo, de milho, na batata, no arroz, e nos grãos em geral. As moléculas de amido ficam organizadas em grânulos. A presença dessa substância constitui uma reserva de glicose, portanto, energia dos vegetais e pode ser reconhecida quando o alimento entra em contato com a solução de tintura de iodo (Lugol).

O amido pode precipitar após a adição de solução saturada de Sulfato de Amônio ou de solução de álcool etílico (etanol). O sulfato de amônio aumenta a força iônica desidratando o amido, que precipita. O etanol é um solvente orgânico, possui grande solubilidade na água, assim, quando adicionado à solução de amido, ele se solubiliza rompendo as interações amido-água, formada por pontes de H, fazendo com que o amido precipite.

3. MATERIAIS:

Filtros de papel Solução de amido preparada no experimento 1 4 tubos de ensaio 3 pipetas graduadas Ácido sulfúrico concentrado (cuidado corrosivo) Béquer pequeno Bastão de vidro Álcool etílico absoluto

Reativo de Molisch : 5,0g de alfa-naftol em 100 mL de ácido acético (CH3COOH) concentrado (95%); (temos beta-naftol, ok, testar com este)

Solução de Lugol : 5 g de iodo (I2) + 10 g de iodeto de potássio (KI). Completar o volume para 100 mL com água destilada. Diluir 1:10 no momento da utilização;

Solução saturada de Sulfato de Amônio: dissolva 7,7 g de sulfato de amônia em 10 mL de água destilada;

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O complexo esquematizado ao lado apresenta coloração azul intensa, desenvolvida pela oclusão (aprisionamento) do iodo nas cadeias lineares da amilose.

Como a amilopectina não apresenta estrutura helicoidal, devido à presença das ramificações, a interação com o iodo será menor, e a coloração menos intensa.


3. PROCEDIMENTOS:

3.1. Reação de Molisch (reação geral para carboidratos):

Transferir 2 mL de solução de amido para o tubo 1 (sem agitar; evitar transferir o precipitado);

Adicionar 3 gotas do reativo de Molisch e misturar bem; Adicionar ao tubo 1, 2mL de ácido sulfúrico concentrado (cuidado

ao adicionar), fazendo-o escorrer pela parede do tubo; Registrar o ocorrido.

3.2. Reação com o Iodo ( reação para identificação de amido) Transferir 2 mL da solução de amido para o tubo 2; Adicionar 5mL de água destilada; Adicionar uma gota de lugol; Aquecer o tubo 2 a 90oc por 5min e observar alterações; Deixar o tubo esfriar e observar alterações; Registrar o ocorrido.

3.3. Reação de Precipitação (I): precipitação do amido por solução saturada de sulfato de amônio

Transferir para o béquer pequeno 5 mL da solução de amido (sem agitar);

Adicionar 3 mL de solução de Sulfato de Amônio ao béquer, agitando;

Deixar o material em repouso por 10 minutos; Filtrar a solução deixando o precipitado no béquer; Adicionar 1 gota de lugol ao filtrado e ao precipitado; Registrar o ocorrido.

3.4. Reação de precipitação (II): precipitação do amido por álcool etílico Transferir 1 mL da solução de amido para o tubo de ensaio 3; Acrescentar 5 mL de Álcool Etílico, agitando; Deixar o material em repouso por 10 minutos; Filtrar a solução deixando o precipitado no béquer; Adicionar 1 gota de lugol ao filtrado e ao precipitado; Registrar o ocorrido.

4. REFERÊNCIAS NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto Alegre:

Artmed, 2011. BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Bioquímica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2008. Bioquímica: aulas práticas / Departamento de Bioquímica, 6a ed., Curitiba: Ed da UFPR, 1999.

38


RELATÓRIO No 8

PRÁTICA 8 – EXTRAÇÃO DE AMIDO E CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS

NOME:____________________________________________DATA:______________

1. OBJETIVOS:_______________________________________________________

___________________________________________________________________

2. RESULTADOS:

2.1. Reação de Molisch:

2.2. Reação com o Iodo:

2.3. Reação de Precipitação (I)

2.4. Reação de precipitação (II)

3. RESPONDA

a. Explicar os motivos para a precipitação e solubilização do amido em água com a variação da temperatura.

b. Correlacionar tal propriedade com a estrutura da molécula de amido.c. Explicar por que o amido, apesar de sua polaridade, pode ser de difícil solubilização

em algumas condições.d. Explicar a reação de Molisch.e. Explicar como o amido interage com o iodo (a nível molecular) e como ocorreram

as mudanças de cor observadas.f. Por que ocorre a precipitação do amido em presença de solução saturada de sulfato

de amônio e de etanol?

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PRÁTICA 9

TESTE DA ATIVIDADE DE FERMENTAÇÃO DO LEVEDO

1. OBJETIVOS:

Comprovar a ocorrência da fermentação; Identificar os produtos obtidos após este processo.


A fermentação alcoólica é um processo biológico no qual açúcares como a glicose, frutose e sacarose são convertidos em energia celular com produção de etanol e dióxido de carbono como resíduos metabólicos. Como este processo pode ser realizado sem a presença de oxigênio é considerado um processo anaeróbico.

Praticamente todos os organismos vivos podem utilizar a glicose para produção da energia necessária para seus processos metabólicos. Neste processo, chamado glicólise, a glicose e alguns outros açúcares são transformados em outras substâncias, com liberação de energia.

O que determina quais substâncias serão produzidas depende do tipo de micro-organismos e o meio onde vivem. As leveduras de cervejaria e padaria e em todos os outros organismos que promovem a fermentação alcoólica, fermentam a glicose em etanol e CO2, de forma que, neste processo, toda massa de glicose está contida nos produtos e não é utilizada outra substância como "matéria prima" (como oxigênio, nitrato, íons férricos, etc).

O processo de glicólise, comum as fermentações, produz ácido pirúvico, que no meio celular encontra-se ionizado na forma de piruvato e um intermediário reduzido, o NADH. Como a quantidade de NADH é limitada e ele é necessário na sua forma oxidada (NAD+) na glicólise e, consequentemente, na continuação do processo de produção de energia, o NADH tem que ser oxidado. A forma como ele será oxidado caracteriza o tipo de fermentação, e quase sempre utiliza o outro subproduto da glicólise: o piruvato ou seus derivados.

Na fermentação alcoólica, o piruvato sofre descarboxilação (perda de um átomo de carbono, na forma de CO2), pela ação da uma enzima piruvato descarboxilase, enzima esta que necessita de Mg2+para catalisar, possuindo também uma coenzima, a tiamina pirofosfato (que auxilia na catálise), formando aldeído acético (acetaldeído). Este aldeído sofre redução, oxidando o NADH para NAD+ e formando o etanol, processo intermediado pela enzima álcool desidrogenase. Esta enzima está presente em muitos organismos que

40

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81lcool_desidrogenase

https://pt.wikipedia.org/wiki/Alde%C3%ADdo_ac%C3%A9tico

https://pt.wikipedia.org/wiki/Descarboxilase

https://pt.wikipedia.org/wiki/Carbono

https://pt.wikipedia.org/wiki/NADH

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvico

https://pt.wikipedia.org/wiki/Ferro

https://pt.wikipedia.org/wiki/Nitrato

https://pt.wikipedia.org/wiki/Oxig%C3%AAnio

https://pt.wikipedia.org/wiki/Massa

https://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A3o

https://pt.wikipedia.org/wiki/Cerveja

https://pt.wikipedia.org/wiki/Levedura

https://pt.wikipedia.org/wiki/Micro-organismo

https://pt.wikipedia.org/wiki/Micro-organismo

https://pt.wikipedia.org/wiki/A%C3%A7%C3%BAcar

https://pt.wikipedia.org/wiki/Glic%C3%B3lise

https://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

https://pt.wikipedia.org/wiki/Energia

https://pt.wikipedia.org/wiki/Glicose

https://pt.wikipedia.org/wiki/Oxig%C3%AAnio

https://pt.wikipedia.org/wiki/Di%C3%B3xido_de_carbono

https://pt.wikipedia.org/wiki/Etanol

https://pt.wikipedia.org/wiki/Celula

https://pt.wikipedia.org/wiki/Sacarose

https://pt.wikipedia.org/wiki/Frutose

https://pt.wikipedia.org/wiki/Glicose

https://pt.wikipedia.org/wiki/A%C3%A7%C3%BAcar


metabolizam o álcool, incluindo o homem. No fígado humano esta enzima catalisa a oxidação do etanol, quer ele seja ingerido quer ele seja produzido por micro-organismos intestinais, com a concomitante redução do NAD+ para NADH.

Durante a produção de etanol há liberação de CO2. Essa liberação é responsável pelo crescimento de massas de bolo e de pão que possuem fermento (organismos fermentadores). A fermentação também é responsável pela fabricação de bebidas alcoólicas.

3. MATERIAIS:

a) Providenciado pelos alunos :

Fermento biológico (cubos) Faca (sem ponta) Açúcar comum.

b) Do laboratório: Dois tubos de ensaio; Dois tubos de Durham; Solução de levedo vivo em meio

nutritivo (solução de açúcar);

Banho-Maria (aproximadamente 100oC )

Fitas de medição de pH Dois béqueres

4. PROCEDIMENTO:

1) Diferencie os dois tubos de ensaio escrevendo LV e LM em cada um deles, significando Levedo Vivo e Levedo Morto, respectivamente;

2) Faça o mesmo com os dois tubos de Durham;

3) Prepare a Solução 1 de levedo juntando 1 colher de café de açúcar a 75 mL de água destilada e 1/8 do cubo de levedo;

4) Prepare a solução 2 de levedo juntando 2 colheres de açúcar a 25mL de água destilada e 1\4 de cubo de levedo (fermento biológico);

5) Preencha os tubos grandes LM e LV com a solução 1 de levedo até 3 cm da borda;

6) Preencha os tubos de Durham com a solução 2 até a borda;

7) Coloque o tubo Durham LM e o tubo de ensaio LM no Banho-Maria por 20 minutos;

8) Findado este tempo pegue os tubos fervidos e, segurando um tubo em cada mão, jogue o tubo Durham LM, com a boca para baixo, dentro do tubo de ensaio LM;

9) Faça o mesmo com os tubos LV;

41

https://pt.wikipedia.org/wiki/Dinucle%C3%B3tido_de_nicotinamida_e_adenina

https://pt.wikipedia.org/wiki/Intestino

https://pt.wikipedia.org/wiki/Etanol

https://pt.wikipedia.org/wiki/F%C3%ADgado


10) Observe os tubos em intervalos de 10 minutos anotando os resultados em uma tabela. Deverão ser feitas 7 medições, iniciando-se do tempo 0. (caso não note grandes alterações, dê maiores intervalos, fazendo as 7 medições em cerca de meia-hora – enquanto realiza as demais atividades).

Obs: A altura do tubo deve ser medida da base do tubo de ensaio até a borda inferior do tubo de Durham.

11) Insira uma fita de medição de pH em cada tubo após 50 minutos;

12) Faça um gráfico com os resultados obtidos na tabela, indicando duas curvas que representarão as alturas em LM e LV.

5. Referências



HARVEY. R.A.; FERRIER, D.R. Bioquímica Ilustrada. 5ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.

42


RELATÓRIO No 9

PRÁTICA 9: TESTE DA ATIVIDADE DE FERMENTAÇÃO DO LEVEDO

NOME:__________________________________________DATA:________________

1. OBJETIVOS:_______________________________________________________

___________________________________________________________________

2. RESULTADOS:

MEDIÇÕESTempo LV LM

0 min

Medida de pH(após 50 min)

LV LM

43


3. Gráfico:

4. RESPONDER:

a) Por que a fermentação é um processo anaeróbico?

b) Qual a desvantagem da fermentação anaeróbica em comparação à fermentação aeróbica em termos energéticos?

c) Quais as aplicações da fermentação alcoólica para a indústria?

d) Bactérias acéticas são utilizadas para a produção de vinagre (ácido acético) a partir do etanol. Pesquise como ocorre este tipo de fermentação e qual a aplicação na indústria de alimentos.

e) A fermentação lática pode ocorrer nos músculos de animais superiores e em microrganismos.

i. Pesquise sobre a fermentação lática que ocorre pelos lactobacilos, bactérias presentes no leite e diga quais as suas aplicações.

ii. Pesquise a importância da fermentação lática nos músculos dos organismos superiores, incluindo o homem.

iii. Quais as conseqüências de uma intensa atividade física no homem? Que substâncias são produzidas em quantidade maior, neste caso?

44

polígrafo práticas de bioquímica - uergs

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