2 aula bioquímica clínica - instrumentação em bioquímica clínica

Instrumentação emBioquímica Clínica

I – Histórico

- Anos 30: medidor de pH (Beckman), colorímetro de filtro e fotômetro de chama;

- Início das determinações em laboratórios: Costa Leste dos EUA no final do séc. XIX;

- Primeiros analitos: Gases sangüíneos, substâncias redutoras (açúcares) e compostosnitrogenados;


I – Histórico

- Anos 60: analisadores acoplados a computadores que controlavam, processavame calculavam.

- Anos 40: espectrofotômetro de luz ultravioleta(Beckman);

- Anos 50: balanças automáticas, potenciômetros, amperômetros, tituladoresautomáticos, contador hematológico (Coulter);

Figura 1: Espectrofotômetro de absorção, marca Beckman (1940).


I – Histórico

- Anos 80: robotização de processos, químicado ácido nucléico (sondas de DNA);

- Anos 70: eletroforese em gel de poliacrilamida, cromatografia líquida de altaperformance (HPLC), uso do laser nosaparelhos contadores de células;- Ainda nos 70: uso de anticorpos marcadoscom agentes fluorescentes, citometria de fluxo.;


I – Histórico

- Anos 80 e 90: descentralização (exames emshoppings, eventos, testes de farmácia, glicosímetros portáteis)

- Testes baseados em análise do DNA: paternidade, propensão à doenças, diagnósticode causas de doenças, etc…


II – Análises baseadas em propriedades da luz2.1 – Radiações eletromagnéticas- Luz: é uma radiação eletromagnética que se propaga na forma de pulsos;

- A luz é uma energia que se propaga em pulsos;- Cada cor de luz se propaga em ondas com comprimento variável, dependendo da cor.

Figura 2: Espectro de absorção da radiação eletromagnética. Note a faixa do vísível, ou seja, que pode ser percebida pelo olho humano.

Comprimento de onda (em nm)

... Lembrando que 1nm = 10-9m

Figura 3: Espectro de absorção da radiação eletromagnética da faixa do visível. Quanto mais vermelha a luz, maior o seu comprimento de onda.

Comprimento de onda (em nm) ou λ

Figura 3: Escala do espectro de absorção das radiações eletromagnéticas (REM). Note que o comprimento de onda das ondas de rádio é grande, por isso elas alcançam grandes distâncias, enquanto que dos raios X tem comprimento de onda menor e, por isso, ficam circunscritas a uma pequena distância.

Apenas para comparar...


II – Análises baseadas em propriedades da luz2.1 – Radiações eletromagnéticas- Uso das propriedades da luz: fotometria e espectrofotometria.

- Ambos os métodos buscam isolar partes do espectro de luz;- Tornam possíveis as dosagens


II – Análises baseadas em propriedades da luz2.2 – Fotometria

- Fotometria: É um método para determinação da quantidade de um analito por meio intensidade da luz;- O aparelho: fotocolorímetro;- Para se isolar a luz usam-se filtros;

- Baseia-se na equação Lei de Lambert-Beer


II – Análises baseadas em propriedades da luz2.3 – Espectrofotometria

- Fotometria: É um método para determinação da quantidade de um analito por meio da intensidade da luz;- O aparelho: espectrofotômetro;- Para se isolar a luz usa-se o prisma;

- Também baseia-se na equação Lei de Lambert-Beer


2.3 – Espectrofotometria/colorimetria2.3.1 – Fundamento

- Lei de Lambert-Beer:

Po = Luz incidente (proveniente da lâmpada)

P = Luz transmitida (que passou pelo objeto)

Po/P = Transmitância (T)

- Transmitância: refere-se à luz que conseguiu passar pelo objeto.




- Absorção: a luz que não é transmitida, éabsorvida pela solução (Absorbância)

A = a.b.cOnde,

a = absorção; b = percurso da luz no objeto; c = concentração da substância de interesse




- “A concentração de uma substância édiretamente proporcional à quantidade de luz absorvida”.

- “A concentração de uma substância éexponencialmente proporcional à quantidadede luz transmitida”.

Figura 5: Gráfico da transmitância versus concentração de uma substância numa amostra. Quanto maior a concentração, menor a transmitância, mas de maneira exponencial.

A relação entre a concentração de umasubstância numa amostra com a quantidade de luz que passa atravésdessa amostra é conseguida pelafórmula T = 2 – Log%T.

Porém, não é uma relação direta! Elatem de ser convertida (por uma tabela) em absorbância!

Figura 6: Gráfico da absorbância versus concentração de uma substância numa amostra. Quanto maior a concentração, mais luz é absorvida, ou seja, maior a absorbância.

A relação entre a concentração de umasubstância numa amostracom a quantidade de luz queé absorvida é conseguidapela fórmula A = a.b.c

Com isso, temos uma relaçãolinear, direta entre a absorbância e a concentração de determinada substâncianuma amostra.

POR ISSO QUE NA FOTOMETRIA/ESPECTROFOTOMETRIA TRABALHA-SE COM ABSORBÂNCIA


2.3.2 – Componentes de um fotômetro- No entanto, cada substância absorve luz em determinado comprimento de onda;- Como aproveitar a melhor absorção da luz naespectrofotometria?- Como garantir que a máxima quantidade de luz emitida por uma lâmpada não se perderá?

PARTES DO ESPECTROFOTÔMETRO/FOTOCOLORÍMETRO


2.3.2 – Componentes de um fotômetro

a) MONOCROMADORES: FILTROS (colorímetros) OU PRISMAS/GRADES DE DIFRAÇÃO (espectrofotômetros)

- São componentes que têm a função de regular a transmissão da luz, isolando um determinado comprimento de onda.

Figura 7: Prisma de vidro. Note a decomposição da luz branca (à esquerda) em diversas luzes, de comprimento de onda diferente.

O prisma, feito de vidro com quartzo, tem a capacidade de isolar osdiversos componentes da luz. É a luz com o comprimento de ondaisolado que irá incidir sobre a amostra (dentro de um tubo de vidro) para que seja feita a leitura a fim de mensurar a quantidade daquelasubstância na amostra.

Porém, para cada substância, é requerido um comprimento de ondadiferente para melhor leitura. Assim, basta regular (ou mexer) o prisma.


2.3.2 – Componentes de um fotômetrob) FONTE DE LUZ:

- É uma lâmpada que tem como funçãofornecer uma luz (visível e invisível) quepassará através do monocromador e tambémda amostra;

- Geralmente: lâmpada de tungstênio e de iodeto. - Duração: 2.000 – 3.000 horas.


2.3.2 – Componentes de um fotômetroc) FENDA DE ENTRADA:

- Tem a função de limitar a entrada da luzemitida pela fonte, evitando que ela se disperse. - Assim, o máximo de luz emitida passa pelomonocromador e também da amostra;- Luz desviada = erros na Lei de Beer. Portanto, indica erro na leitura!


2.3.2 – Componentes de um fotômetrod) CÉLULA ANALÍTICA OU CUBETA:

- É o pequeno recipiente que acomodará a amostra no ato da passagem da luz. - Deve ser o mais translúcido possível, evitando interferências na passagem da luz.- Cubetas sujas, arranhadas, manchadas = Luz desviada = erros na Lei de Beer. Portanto, indica erro na leitura!

Figura 8: Cubeta para análise em espectrofotometria. Pode ser feita em vidro, borossilicato, quartzo ou plástico.


2.3.2 – Componentes de um fotômetroe) GALVANÔMETRO:

- É um medidor da intensidade de luz quechega até a célula fotoelétrica. - Quanto menos luz chega à célula fotoelétrica, indica maior absorbância da substância, o queindica maior concentração dessa substância nasolução.

Figura 9: Esquema de um aparelho de fotocolorimetria.

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