Estudo da interação e estrutura secundária de proteínas e peptídeos com técnicas experimentais em biofísica molecular

Jéssica Aparecida Pedro & Victor Klein de Sousa

Sumário da apresentação

1. Área de pesquisa: O que é Biofísica? 2. Objeto de pesquisa: O que são Proteínas e Peptídeos?

a. Aminoácidos;b. Ligação Peptídica; c. Estruturas: Primária, Secundária, Terciária e Quaternária; d. Tipos de Estrutura Secundária;

3. Técnicas experimentais: Estrutura x Interaçãoa. Dicroísmo Circular - Teoria, aplicações, resultados e exemplos;b. Espectroscopia de Infravermelhoc. SAXS d. Monocamadas de Langmuir;

4. Comentários finais 5. Referências

O que é biofísica?É o campo científico interdisciplinar que aplica teorias e métodos das física para entender como os sistemas biológicos funcionam.

Os biofísicos utilizam:

● Análise de dados e estrutura (ex. para estudar dinâmica e estrutura de proteínas, vírus, DNA etc)● Modelagem computacional (ex. para ver as formas e estruturas de vírus e macromoléculas para

estudar, por exemplo, os mecanismos de ação viral, interação de biomoléculas com fármacos e mecanismos de doenças )

● Movimento de moléculas (ex. investigar como moléculas se movimentam nos tecidos)● Neurociência (ex. comunicação celular, modelos de redes neurais para modelar cérebro e sistema

nervoso)● Bioengenharia, Nanotecnologias, Biomateriais (ex. desenvolvimento de materiais bioprotéticos,

nanomateriais para transporte de medicamento e vacinas

● Imagem e aplicações médicas (ex. desenvolvimento de técnicas de diagnóstico por imagem e também podem atuar no desenvolvimento de tratamentos e dispositivos que podem salvar vidas)

Nossas pesquisas…

Peptídeos antimicrobianos (AMP)

O objetivo é estudar a estrutura secundária destes peptídeos em diferentes meios. Uma vez que essa estrutura é totalmente correlacionada com o mecanismo de ação do AMP. Estes peptídeos podem interagir e destruir bactérias, fungos e até mesmo células cancerígenas, sendo assim promissores fármacos.

Proteínas incorporadas em materiais mesoporosos ordenado

O objetivo é estudar modificações nas estruturas secundárias de algumas proteínas modelo devido a sua incorporação ‘dentro’ dos poros de um material mesoporoso ordenado feito de sílica (SBA-15). Esse material pode ser utilizado como adjuvante em vacinas e o projeto está inserido nesse contexto.

O nosso grupo atua na área de análise de dados e estrutura de peptídeos e proteínas com foco em suas interações com membranas e materiais mesoporos de sílica, respectivamente.

O que são Proteínas e Peptídeos?

Aminoácidos(AA) são as 20 moléculas essenciais à vida, possuem diferentes características físico-químicas dadas pelas suas cadeias laterais;

Peptídeos e Proteínas são polímeros de aminoácidos formados através das ligações peptídicas. A diferença básica entre ambos é a quantidade de AA, peptídeos possuem menos de 100 resíduos de AA, enquanto proteínas são geralmente muito maiores.

FIG. 1 (Peptide Sciences)

O que são Proteínas e Peptídeos?Aminoácidos

Aminoácidos(AA) são moléculas orgânicas que apresentam o grupo funcional amino (-NH2) e o grupo ácido carboxílico(-COOH) atados a um carbono alpha (Cα-central). Como as duas pontas possuem diferentes cargas parciais, há a formação de um dipolo

A característica físico-química vem da cadeira lateral (R) que poderá ser apolar, polar, ácida ou básica. Os AA (com exceção da glicina) são moléculas quirais e este fator é importante para as técnicas experimentais.

FIG. 2 - Os 20 principais AA. (Lehninger. 6º ed. )

Ligação Peptídica

Através das ligações peptídicas que unem os aminoácidos de cadeia laterais diferentes, uma proteína ‘cresce’ formando uma sequência de resíduos de AA chamada de estrutura primária.

Essas ligações peptídicas são fortes do tipo covalente e ocorrem sempre entre o carbono do grupo carboxílico de um AA com o nitrogênio do grupo amino de outro AA, liberando uma molécula de água . Além disso, a ligação peptídica, é menor do que uma ligação covalente N-C comum, indicando que há um compartilhamento parcial de dois elétrons na ligação peptídica.

ligações peptídicas

FIG.3 - Cadeia de resíduos de AA. (Lehninger. 6º ed. )

Estrutura Proteica

Estrutura primária: formada por ligações fortes covalentes, dada pelo sequenciamento de AA (‘esqueleto’ polipeptídico)Estrutura secundária: As proteínas formam alguns tipos de interações intramolecular através de ligações não-covalentes como as pontes de hidrogênio levando a formação das estruturas secundárias, as mais conhecidas são as hélices-α e as folhas-β. Esse tipo de estrutura é o enfoque do nosso grupo. Estrutura terciárias: A combinação de estruturas secundárias começam a formar dobras complexas que levam a forma tridimensional da proteína Estrutura quaternárias: em algumas proteínas, a partir da junção de estruturas terciárias são formada estruturas multiméricas.

FIG.4 - Níveis de estrutura proteica (Lehninger. 4º ed. )

Estrutura Secundária

Devido ao compartilhamento parcial extra de um elétron, a ligação peptídica é muito mais rígida do que uma ligação covalente comum. Ela então define um plano, no qual se dispõe seis moléculas. Essa rigidez limita as possíveis conformações do peptídeo, uma vez que apenas as ligações N-Cα e C-Cα podem apresentar torções, definidas como os ângulos ϕ e ψ, respectivamente. O gráfico de Ramachandran representa um cálculo teórico dos possíveis ângulos ϕ e ψ, e as possíveis estruturas que podem ser formada a partir da combinação deles.

FIG.5 - Gráfico de Ramachandran (Lehninger. 4º ed. )

Alfa hélices

As hélices-α são formadas por ligações de hidrogênio entre o oxigênio do grupo ácido carboxílico(Cα-O

δ- ) e o hidrogênio do grupo amino(Cα-N-H

δ+), ambos ligados aos seus respectivos carbonos-α.

Essas ligações de hidrogênio dobram a cadeia polipeptídica formando uma hélice. Cada ligação peptídica possui um dipolo elétrico que ao formar a hélice terá um dipolo resultante.

Os resíduos de AA que formam uma hélice-α possuem seu ângulo ψ entre 45º a 50º e ϕ = 60º. Cada volta da hélice possui em média 3,6 AA. Esse tipo de estrutura foi descoberta por Linus Pauling et al(1950s)

FIG.6 - Representação gráfica de uma alfa hélice (Lehninger. 4º ed. )

Fitas Beta

Fitas ou folhas-β são um outro tipo de estrutura secundária e, portanto, também são dobras no esqueleto polipeptídico devido a ligações de

hidrogênio. Esse tipo de estrutura é mais

diversificado do que as hélices-α, podendo formar folhas de orientação paralela ou antiparalela dependendo do ângulo de formação da ponte de

hidrogênio.

FIG.7 - Representação gráfica de fitas beta (Lehninger. 4º ed. )

Técnicas Experimentais: Dicroísmo Circular

O dicroísmo circular (CD) é uma técnica espectroscópica baseada na diferença de absorção de ondas eletromagnéticas circularmente polarizadas à direita (LCD) e à esquerda (LCE). Essa diferença surge apenas para moléculas quirais.

Em suma, objetos quirais não podem ser sobrepostos pela sua “imagem especular”.

FIG.8 - Conchas quirais (Wallace BA & Janes R W)

FIG.9 - Representação da absorção da luz circularmente polarizada (Wallace BA & Janes R W)

Dicroísmo Circular

A figura 10 demonstra duas situações diferentes para duas ondas eletromagnéticas de mesma intensidade, comprimento de onda, mas circularmente polarizadas em sentidos diferentes (LCD e LCE). Em a) temos o efeito das duas ondas passando por um meio sem quiralidade. As duas são igualmente absorvidas e a superposição delas gera uma onda plano polarizada.

Em b) e c) temos as mesmas ondas passando por um meio quiral, cada uma delas será absorvida de forma diferente (representado pelos vetores de diferentes tamanhos). A sobreposição destas duas ondas será agora uma onda elipticamente polarizada. O ângulo θ (chamado de elipsidade) é o resultado obtido durante as medições de cd em um aparelho convencional. FIG.10 - Representação da absorção da luz circularmente polarizada ao interagir com diferentes meios. (Wallace BA & Janes R W )

Entretanto, quando estamos trabalhando com efeitos de absorção da luz, devemos lembrar da lei de Lambert-Beer (Eq. 1), que diz que a absorbância (A) de uma substância é proporcional ao caminho ótico da luz (l) e a concentração do meio (c). Assim, dependendo da concentração, o ângulo θ obtido num gráfico de CD pode ser maior ou menor (FIG. 11)

Por isso precisamos normalizar os dados para delta epsilon, que possui dimensão de 1/(M cm). Ele é definido como a diferença entre o coeficiente de extinção da partícula para a LCD e LCE (Eq. 2) e pode ser calculado a partir da Elipsidade Molar ([θ]), como mostrado nas equações 3 e 4.

Dicroísmo Circular

(Eq. 1), em que:

/ (cl) (Eq. 2)

(Eq. 3), em que: MRW é a massa molecular média por resíduo.

(Eq. 4)

FIG.11 - Espectros de CD para mioglobina em diferentes concentrações, não normalizados.

CD de ProteínasO dicroísmo circular pode ser utilizado para estudar as mais diversas moléculas quirais. Em especial para se investigar proteínas e peptídeos, devido a natureza quiral dos aminoácidos.

Como há uma a diferença de momento de dipolo, ligações intramoleculares, conformação espacial, e outros fatores, intrínsecos de cada tipo de estrutura secundária das proteínas, as transições eletrônicas que acontecem devido a interação da LCD e LCE com essas moléculas geram espectros específicos para cada estrutura secundária. (FIG 12).

Assim, o CD pode ser implementado não só para verificar qual é a estrutura de uma proteína ou peptídeo em estado nativo, mas também para monitorar se há mudança nessa estrutura devido à alterações no meio. Nesse sentido, é especialmente interessante para verificar se houve interações entre proteína e substrato, ou acompanhar o processo de desnaturação.

FIG. 12 Representação dos espectros de CD e SRCD (Dicroísmo circular com

luz síncrotron). A curva em vermelho representa a estrutura em hélice alfa, a

azul em fitas beta, e em amarelo a estrutura intrinsecamente desordenada. A

região verde representa os comprimentos de onda que só podem ser

acessados através da luz síncrotron. (Wallace BA. 2009. QRB 42: 317-70).

CD Deconvolução

Diferentemente de outras técnicas de caracterização de estrutura secundária, como cristalografia de raios X, o CD é uma técnica que pode ser aplicada para proteínas nas mais diversas condições e é extremamente prática e rápida de ser implementada.

Entretanto, a maioria das proteínas possuem uma grande cadeia de AA, que formam diversas estruturas secundárias. Assim, na realidade, o espectro de CD obtido é uma combinação linear dos espectros individuais de cada estrutura secundária da proteína estudada (FIG. 13 e Eq. 5).

Então para obter uma estimativa da porcentagem de cada estrutura secundária presente na proteína, é necessário realizar um processo de deconvolução. Atualmente há diversos algoritmos capazes de produzir essa estimativa a partir de diferentes métodos, os mais utilizados pelo nosso grupo estão disponíveis no portal Dichroweb (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

Todos esses métodos utilizam de um grande conjunto de ferramentas estatísticas de análise. Acreditamos que neste ponto, essa disciplina nos será muito importante, e nos ajudará, não só na compreensão destes resultados, mas também em futuros avanços que possamos fazer na análise de espectros de CD.

(Eq. 5) - Cλ é o resultado observado para o comprimento de onda λ, fi é a fração de estrutura secundária i, e Biλ é o CD da estrutura secundária i em λ. No geral, as deconvoluções são baseadas em base de dados de proteínas com estrutura cristalográfica resolvida.

FIG.13 - Espectros de CD para ribonuclease ( 21% α, 33% β) , subtilisina (30% α e 18% β) e elastase (11% α, 34% β, e 34% desordenada) (Woody R W, in Berova et al.)

http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk

Outras técnicas utilizadas em nosso grupo

Espectroscopia de Infravermelho (FTIR)

O infravermelho é uma técnica utilizada para identificar a presença de grupos atômicos. A incidência de radiação na faixa do infravermelho na amostra provocará vibração específicas nas ligações entre os átomos presentes gerando uma região de assinatura espectral da molécula. No caso das proteínas, ela pode ser utilizadas para identificar vibrações características das ligações peptídicas como as bandas amida I e amida II. Essas bandas podem ser relacionadas as estruturas secundárias das proteínas, ou seja, posições levemente deslocadas de cada uma dessas bandas podem indicar a presença da estrutura hélices-α ou as folhas-β, por exemplo. A dificuldade está em justamente quantificar essa informação. Como os valores definidos para as bandas de cada estrutura estão numa região muito próxima, se torna um desafio defini-las e diferenciá-las. Para esse propósito, esta disciplina ajudará a verificar a melhor abordagem para quantificar e validar os dados obtidos por essa técnica.

FIG.14 ( Lisa M. Miller et al (2013))

SAXS

Espalhamento de raio-X a baixos ângulos (SAXS) é uma técnica de caracterização de partículas em geral. No caso das nossas pesquisas o SAXS será usado para análise de forma, peso molecular, dinâmica de dobra e desnaturação de proteínas/peptídeos e identificação da estrutura e geometria dos materiais mesoporosos ordenados.

O SAXS também será utilizado para investigar a interação dos peptídeos e membranas e das proteínas com partículas de sílicas mesoporosa ordenada.

Nesse caso, esta disciplina irá nos auxiliar com relação a definição de estatísticas apropriadas aos dados de maneira geral, que não é algo fácil de fazer.

Monocamadas de Langmuir

Diferentemente das técnicas anteriores, que utilizam luz para obter informações sobre a estrutura secundária de proteínas e peptídeos. A técnica de tensiometria de Langmuir, não caracteriza a estrutura destas moléculas, mas sim a interação delas com modelos de membrana. Ela é particularmente interessante para verificar o mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos.

A ideia principal dela, é a medição da mudanças na tensão superficial (de água ou monocamadas lipídicas, vide FIG 15. c) a partir da inserção de um tensoativo na subcamada aquosa. Para AMP, normalmente, há uma diferença de adsorção dependendo da concentração de peptídeo, composição da monocamada (carga total do lipídio na superfície), e tensão superficial inicial (quanto lipídio foi disposto na superfície) (FIG. 15 a e b).

É uma técnica difícil de se obter vários dados. Uma vez que as medidas podem demorar até 4 horas para estabilizar, e o ajuste da tensão superficial inicial é feito manualmente. Então é muito difícil obter dois valores iguais para os parâmetros iniciais.

Dessa forma, estimar as incertezas destas medidas têm sido um desafio, que esperamos que possa ser superado com os auxílios das técnicas de análise abordadas neste curso.

FIG.15 - a) Variação da pressão superficial de um peptídeo antimicrobiano em água e três lipídios diferentes (azul é neutro, vermelho e verde negativamente carregados) em função do tempo. b) variação da pressão superficial em função da pressão superficial inicial. (Kumagai, P.S., Sousa, V.K., Donato, M. et al.). c) Esquema de adsorção de tensoativos em monocamadas de Langmuir. (DELTA PI - Kibron).A pressão superficial é definida como a diferença entre a tensão superficial da água e da monocamada.

Comentários Finais

A biofísica é uma área interdisciplinar muito rica que faz uso desde simulações computacionais à variadas técnicas experimentais que variam entre espectroscopia, imagem, espalhamento de radiação e caracterização química. As técnicas experimentais mais amplamente utilizadas para a análise de estrutura e dinâmica de peptídeos/proteínas são o dicroísmo circular, FTIR, espectroscopia de fluorescência, espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS).

No que tange a interação de peptídeos e proteínas com outros meios, podemos utilizar a tensiometria de Langmuir, microscopia óptica (com diversos modelos de membranas), FTIR, SAXS, tomografias entre outras.

Os dados gerados por cada técnica são tratados cada um de uma maneira específica relacionada a natureza do método utilizado. Para algumas delas (como o CD) há a disposição variados algoritmos computacionais de análise estatística prontos para uso.

De maneira geral, a disciplina irá ajudar a avaliar criticamente a forma que já utilizamos para analisar as nossas estimativas de grandezas e incerteza, além de fornecer novas ferramentas e ideias para serem implementadas a partir de nossos dados. Por fim, acreditamos que também teremos uma direção mais segura para análise de novos experimentos e técnicas que iremos realizar ao longo das nossas carreiras como experimentais.

Referências(1) Nelson, David L.; Cox, Michael M. Lehninger Principles of Biochemistry. 4. ed. New York: Freeman And Company, 2005

(2) Pauling, L., Corey, R. B., & Branson, H. R. (1951). The structure of proteins: Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide

chain. Proceedings of the National Academy of Sciences, 37(4), 205–211. doi:10.1073/pnas.37.4.205

(3) B.A. Wallace ; R.W. Janes. Modern Techniques for Circular Dichroism and Synchrotron Radiation Circular Dichroism Spectroscopy. 1. ed.

Amsterdam: IOS Press BV, 2009

(4) Berova N. ; Polavarapu P. L.; Nakanishi K. ; R. W. Woody. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy, V2. Applications in Stereochemical

Analysis of Synthetic Compounds, Natural Products, and Biomolecules. 1. ed. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc., 2012

(5) Wallace, B. A. (2009). Protein characterisation by synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics,

42(04), 317–370. doi:10.1017/s003358351000003x

(6) L.M. Miller, M. W. Bourassa ,R. J. Smith. FTIR spectroscopic imaging of protein aggregation in living cells.Biochimica et Biophysica Acta 1828

(2013) 2339–2346

(7) Kumagai, P.S., Sousa, V.K., Donato, M. et al. Unveiling the binding and orientation of the antimicrobial peptide Plantaricin 149 in zwitterionic

and negatively charged membranes. Eur Biophys J 48, 621–633 (2019). doi: 10.1007/s00249-019-01387-y

(8) What is BioLisa M. Miller a,b,⁎, Megan W. Bourassa b, Randy J. Smithphysics, BioPhysical Society. Disponível em: . Acesso em 13 de abril de 2020

(9) Peptide Information, Peptides vs Proteins, PeptideScience. Agosto de 2019. Disponível em :

. Acesso em 13 de abril de 2020

(10) DELTAPI. 2017. Disponível em: . Acesso em: 13 abril 2020.