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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular da Faculdade
de Medicina da Universidade do Porto
MODULAÇÃO DO SISTEMA DOS
PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS EM MODELOS
EXPERIMENTAIS DE UNINEFRECTOMIA E
INSUFICIÊNCIA RENAL
Carla Alexandra Ribeiro dos Santos Araújo
Porto 2007
DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU
DE MESTRE APRESENTADA À FACULDADE DE
MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
INDICE
RESUMO 1
INTRODUÇÃO 2
SISTEMA DOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS 4 RECEPTORES DOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS E SEUS LIGANDOS 5 ACÇÕES DOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS 6 REGULAÇÃO DO SISTEMA DOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS 8 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE BNP 9 PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS E REDUÇÃO DA MASSA RENAL 10
OBJECTIVOS 13
MATERIAL E MÉTODOS 14
ABLAÇÃO DA MASSA RENAL 14 ESTUDOS METABÓLICOS 15 AVALIAÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL 15 AVALIAÇÃO HEMODINÂMICA DO VENTRÍCULO ESQUERDO 16 EXPANSÃO DE VOLUME 17 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE BNP 18 HISTOLOGIA E IMUNO-HISTOQUÍMICA RENAIS 19 QUANTIFICAÇÃO DE ARNM ESPECÍFICO POR RT E REAL-TIME PCR 21 ANÁLISE ESTATÍSTICA 23
RESULTADOS 24
UNINEFRECTOMIA 24 NEFRECTOMIA DE ¾ 33
DISCUSSÃO 44
CONCLUSÕES 55
REFERÊNCIAS 56
1
RESUMO
Introdução: A activação do sistema dos peptídeos natriuréticos (PN’s)
desempenha um papel importante nos mecanismos de adaptação renal à
expansão de volume. Apesar de estar descrito um aumento da actividade
do sistema dos PN’s nas situações de redução da massa renal como a
uninefrectomia e a insuficiência renal crónica, o papel deste sistema na
progressão da doença renal e no aumento da pressão arterial permanece
ainda por esclarecer. O objectivo do presente trabalho foi o de avaliar a
modulação renal do sistema dos PN’s em modelos experimentais de
uninefrectomia e de insuficiência renal crónica. Material e Métodos: Ratos
wistar machos (n=83) foram submetidos a uninefrectomia (Unx) ou
nefrectomia de ¾ (¾nx). Duas, 10 e 26 semanas após a cirurgia procedeu-
se à avaliação da hemodinâmica cardíaca, dos níveis plasmáticos de BNP,
da resposta natriurética à expansão de volume e da expressão renal do
receptor efector (RPN-A) e do receptor de clearance (RPN-C) dos PN’s.
Resultados: Os animais Unx e ¾nx apresentaram ao longo do estudo um
aumento progressivo da pressão arterial sistólica e diastólica e um aumento
sustentado dos níveis plasmáticos de BNP. Verificou-se uma diminuição
precoce e sustentada da expressão do RPN-A na medula renal dos animais
¾nx enquanto que os níveis de ARNm do RPN-C aumentaram no córtex
renal às 10 e 26 semanas após a cirurgia. Nos animais Unx os níveis de
ARNm do RPN-A na medula renal apresentaram-se diminuídos às 10
semanas, mas aumentaram de forma marcada às 26 semanas após a
cirurgia. No córtex renal dos animais Unx observou-se também um aumento
da expressão do RPN-A às 26 semanas. Conclusões: No rim remanescente
dos animais Unx e ¾nx verifica-se uma modulação dependente do tempo
do RPN-A e do RPN-C, que é distinta no córtex e na medula renal. A
alteração da expressão renal dos receptores dos PN’s depende do grau de
ablação da massa renal e ocorre independentemente da activação sistémica
do sistema dos PN’s. Estes resultados poderão contribuir para o
esclarecimento do papel desempenhado pelo sistema dos PN´s nos
mecanismos de adaptação à perda de massa renal.
2
INTRODUÇÃO
Os modelos animais de perda de massa renal desenvolvem uma série
de mecanismos adaptativos para manter a homeostasia do sódio, que se
traduzem pelo aumento da excreção de sódio por nefrónio residual1 e pela
manutenção do balanço de sódio mesmo na presença de diminuição da taxa
de filtração glomerular. Apesar da activação de mecanismos natriuréticos,
nos modelos de ablação de massa renal verifica-se uma diminuição da
resposta natriurética à expansão de volume, que se acompanha de
hipertensão arterial sensível ao sal que é mais pronunciada nos animais
com menor grau de massa renal remanescente2,3.
Os primeiros estudos animais experimentais de uninefrectomia
demonstraram que a remoção da massa renal se pode associar a um
aumento da pressão arterial, ao aparecimento de proteinúria e à
deterioração da função renal4. No entanto, estes resultados não foram
confirmados em experiências conduzidas posteriormente por outros autores,
que atribuiram a variabilidade de resultados após uninefrectomia à presença
de patologia intrínseca do rim remanescente nos estudos originais5,6. Para
além deste factor, a idade no momento da uninefrectomia, e
consequentemente o número de nefrónios no rim remanescente, parece ser
igualmente determinante para o risco de desenvolvimento de doença renal7.
Em humanos, não foi possível fundamentar até ao momento um aumento
do risco de desenvolvimento de doença renal progressiva após
uninefrectomia em indivíduos previamente com dois rins normalmente
funcionantes. De facto, a uninefrectomia no contexto do transplante renal
de dador vivo é considerada um procedimento seguro e com baixo risco de
3
complicações8,9,10,11, apesar de se verificar num pequeno número de
indivíduos o desenvolvimento de hipertensão arterial e de proteinúria
ligeira, cujo impacto a longo prazo está ainda por definir12,13. Foi já bem
documentado que nos dias imediatamente após a uninefrectomia se
desencadeiam uma série de mecanismos de adaptação rápidos que se
caracterizam pelo aumento da excreção de sódio e da taxa de filtração
glomerular no rim remanescente, permitindo atingir em algumas semanas
valores de depuração de creatinina que correspondem a 75-80% do valor
prévio à uninefrectomia e que estabilizam posteriormente por períodos de
15 a 20 anos14. Um aumento precoce da excreção fraccional de sódio é
também evidente nas situações de insuficiência renal crónica, seja por
remoção cirúrgica de tecido renal seja pela presença de doença renal
intrínseca15. Vários trabalhos experimentais demonstraram que o aumento
da resposta natriurética no contexto de diminuição da taxa de filtração
glomerular é determinado pela necessidade de manter o balanço de sódio
na presença de uma dieta sem restrição salina, o que é confirmado pelo
facto de a excreção fraccional de sódio diminuir significativamente quando é
imposta uma restrição de sódio proporcional à diminuição da função
renal16,17. Em contraste com esta resposta aguda, os modelos animais de
nefrectomia evidenciam um aumento da pressão arterial sistólica e
diastólica dependente do tempo e uma diminuição da resposta natriurética à
expansão de volume, que podem ser explicados pela acção de múltiplos
mecanismos independentes que interactuam para modificar quer a
hemodinâmica cardíaca quer a excreção renal de sódio3. O aparecimento
precoce de hipertensão arterial caracteristicamente dependente da
expansão de volume na insuficiência renal crónica reveste-se da maior
4
importância clínica, uma vez que determina de forma fundamental o risco
cardiovascular destes doentes e a própria progressão da doença renal.
Apesar disto, os factores que contribuem para o aumento da pressão
arterial e para a sua progressiva sensibilidade ao sódio ainda não foram
sistematicamente avaliados, reforçando a pertinência da avaliação da
modulação a longo termo de sistemas natriuréticos no contexto de perda de
massa renal funcionante.
Os peptídeos natriuréticos (PN’s) pertencem a uma família de
moléculas peptídicas libertadas a nível cardiaco em situações
fisiopatológicas que se caracterizam por sobrecarga de volume18. As suas
acções fisiológicas reflectem-se essencialmente a nível vascular e renal e
caracterizam-se por efeitos natriuréticos, diuréticos, vasorelaxantes e
antifibróticos, que no seu conjunto contribuem para a manutenção do
volume do fluído extracelular e para a redução da pressão arterial19. Por
esse motivo, o sistema dos peptídeos natriuréticos constitui um potencial
mediador da resposta adaptativa à perda de massa renal.
Sistema dos peptídeos natriuréticos
A descoberta por deBold em 197920 de que os extractos de tecido
auricular, quando injectados em animais, possuíam propriedades
natriuréticas e diuréticas potentes esteve na base da identificação do
primeiro membro da família dos PN’s, o peptídeo natriurético auricular
(ANP)21. Desde então vários outros membros foram adicionados à família:
o peptídeo natriurético auricular tipo B (BNP), identificado pela primeira vez
no tecido cerebral de porco22; o peptídeo natriurético auricular tipo C
(CNP), de produção essencialmente endotelial23; a urodilatina, a
5
adrenomodulina e o peptídeo natriurético dendroaspis, um grupo de
peptídeos que partilha uma grande semelhança estrutural24,25.
Todos os membros da família dos PN’s são sintetizados como
precursores de alto peso molecular e libertados da porção C-terminal após
processamento da molécula original. Embora, quer o ANP quer o BNP sejam
secretados pelos cardiomiócitos auriculares e ventriculares, a elevação dos
níveis plasmáticos de BNP que se observa nas situações de hipertrofia ou de
disfunção cardíaca deve-se essencialmente ao aumento da produção deste
peptídeo a nível ventricular26,27. Ao contrário do ANP, que é secretado a
partir de grânulos de armazenamento localizados no tecido auricular, a
secreção de BNP é regulada essencialmente ao nível transcripcional e
requer a presença de um estímulo prolongado. Embora já tenham sido
descritos vários estímulos não-hemodinâmicos para a produção de BNP28, os
principais factores envolvidos na libertação aguda de BNP são o estiramento
e o desenvolvimento de tensão na parede ventricular em resposta à
sobrecarga crónica de volume ou de pressão29.
Receptores dos peptídeos natriuréticos e seus ligandos
Foram descritos até ao momento três tipos de receptores com
afinidades distintas para os diferentes tipos de PN’s30. O receptor dos
peptídeos natriuréticos tipo A (RPN-A) e o receptor dos peptídeos
natriuréticos tipo B (RPN-B) são receptores transmembranares que
possuem um domínio intracelular com actividade de guanilil-cíclase e que
medeiam a maioria dos efeitos biológicos dos PN’s através da alteração da
produção de GMPc31,32. O ANP e o BNP ligam-se com elevada afinidade ao
RPN-A, enquanto que o CNP parece ser o ligando natural para o RPN-B33. O
6
terceiro receptor descrito, o receptor dos peptídeos natriuréticos tipo C
(RPN-C), tem uma importante homologia com os outros dois receptores
mas ao contrário destes não possui o domínio guanilil-cíclase intracelular34.
O RPN-C é expresso numa variedade de tecidos mas apresenta um padrão
de expressão distinto do RPN-A e a colocalização destes dois receptores é
apenas proeminente a nível renal35.
O RPN-A é a forma dominante de expressão dos receptores dos PN’s
nos tecidos periféricos e é responsável pela mediação da maioria as acções
do ANP e BNP36. Apesar de ter sido sugerido previamente que o RPN-C
poderia participar na mediação de alguns dos efeitos celulares dos PN’s,
este receptor parece estar envolvido fundamentalmente na remoção dos
PN’s do plasma através da sua internalização e degradação intracelular e,
assim, na modulação das concentrações sistémicas e locais de PN’s que se
encontram disponíveis para ligação ao RPN-A37,38. Por esse motivo, é
também designado por receptor de clearance. O RPN-B é activado
essencialmente pelo CNP que, como referido anteriormente, é produzido a
nível endotelial e actua localmente de forma autócrina/parácrina como
regulador do tónus vascular e do crescimento celular39.
Acções dos peptídeos natriuréticos
Efeitos hemodinâmicos centrais
A administração de doses farmacológicas de BNP a indivíduos normais
origina uma diminuição rápida e sustentada da pressão arterial média40.
Este efeito do BNP resulta da acção conjugada da diminuição do volume de
ejecção, da redução da resistência vascular sistémica e do aumento da
excreção renal de sódio com diminuição do volume intravascular. Por outro
7
lado, a administração de doses baixas de BNP a indivíduos normais ou
hipertensos não altera de forma significativa o perfil hemodinâmico
central41.
Efeitos vasculares
Estudos realizados in vivo e in vitro demostraram que os PN’s têm um
efeito vasorrelaxante dependente da dose a nível arterial, resultando num
aumento regional do fluxo plasmático42. O efeito dos PN’s na
microcirculação está menos bem esclarecido. A infusão de doses baixas de
BNP a indivíduos saudáveis está associada a vasoconstrição da
microcirculação, essencialmente a nível venular43. O aumento da pressão
hidraúlica capilar que resulta deste efeito poderá contribuir de forma
significativa para a transudação de fluído do compartimento vascular para o
extravascular e, desta forma, promover a redução da pré-carga cardíaca44.
Efeitos renais
As acções diuréticas e natriuréticas dos PN’s resultam
simultaneamente de efeitos hemodinâmicos e tubulares directos45,46. Estas
acções incluem: 1) a dilatação das arteríolas aferentes e constrição das
arteríolas eferentes renais, originando um aumento da pressão capilar
glomerular e da taxa de filtração glomerular; 2) a modulação do fluxo
plasmático medular interno e 3) a inibição do transporte de sódio nos
segmentos tubulares proximais e distais do nefrónio47,48. Os PN’s interferem
com a reabsorção de sódio a nível da porção interna do ducto colector, uma
porção do nefrónio responsável pela reabsorção de menos de 5% do sódio
8
filtrado mas que desempenha um papel fundamental na excreção final de
sódio na urina49.
Efeitos anti-fibróticos e anti-proliferativos
Para além do efeito no balanço de sódio e na regulação da pressão
arterial, o sistema dos PN’s foi também implicado na limitação de resposta
proliferativa e fibrótica, quer a nível cardíaco quer a nível renal. De facto, foi
já demonstrado previamente que os PN’s inibem o crescimento e a
proliferação de cardiomiócitos e fibroblastos em cultura e que este efeito é
mediado pelo RPN-A50,51,52. Em concordância com estes dados existe
evidência de que modelos animais sem expressão de RPN-A desenvolvem
hipertrofia cardíaca e eventos vasculares fatais53,54. A nível renal, a
hiperexpressão de BNP associou-se a uma diminuição da resposta
proliferativa e fibrótica em animais transgénicos com doença glomerular de
natureza imune ou submetidos a ablação da massa renal55,56.
Regulação do sistema dos peptídeos natriuréticos
Embora a activação do sistema dos PN’s tenha sido avaliada no
passado essencialmente através dos níveis circulantes dos PN’s, evidências
recentes sugerem que a expressão de receptores dos PN’s nos orgãos alvo
desempenha um papel fundamental na regulação da actividade do
sistema57. De facto, os modelos animais que não expressam RPN-A
desenvolvem precocemente hipertensão arterial enquanto que os animais
com duplicação génica do RPN-A apresentam amplificação das acções dos
PN’s, sugerindo que o nível de expressão do RPN-A é determinante para a
extensão dos efeitos biológicos do ANP e BNP58. Se considerarmos que o
9
RPN-A é o principal mediador das acções do ANP e do BNP59 e que, por
outro lado, o RPN-C parece estar envolvido fundamentalmente na remoção
dos PN’s do plasma60,61, é legítimo supôr que as acções renais dos PN’s
podem ser reguladas negativamente pelo aumento da expressão renal de
RPN-C e/ou pela diminuição da expressão do RPN-A. De facto, vários
investigadores sugerem que a resistência aos PN’s relacionada com
alterações na expressão renal dos PN’s podem explicar em parte a
manutenção da expansão de volume nas situações associadas à formação
de edema62,63. Na insuficiência cardíaca, por exemplo, os níveis circulantes
de BNP estão elevados e correlacionam-se positivamente com a expansão
de volume e com um mau prognóstico da doença64.
Níveis plasmáticos de BNP
O aumento do aporte de sódio e as modificações no volume de sangue
central induzidas por alterações posturais ou as condições patológicas
associadas a sobrecarga de volume como a insuficiência cardíaca associam-
se a um aumento da produção cardíaca de PN’s e, consequentemente, a um
aumento dos níveis plasmáticos de BNP65,66. Por esse motivo, os níveis
plasmáticos de BNP têm sido utilizados clinicamente como marcadores de
disfunção ou de hipertrofia ventricular esquerda67,68,69,70. No entanto, os
níveis plasmáticos de BNP são regulados também por factores associados à
sua depuração, nomeadamente através da internalização pelo RPN-C,
através da excreção renal por filtração glomerular e em resultado da
degradação pelas endopeptídases neutras localizadas essencialmente a nível
renal71,72. Embora alguns trabalhos tenham conseguido identificar uma
correlação positiva entre a presença de cardiopatia estrutural ou funcional e
10
os níveis plasmáticos de BNP em doentes com insuficiência renal
crónica73,74,75, estudos recentes confirmam que a elevação dos níveis
plasmáticos de BNP observada nos doentes com alteração da função renal
se relaciona inversamente com a taxa de filtração glomerular76,77,78 e pode
ocorrer na ausência de doença cardíaca. Verifica-se, adicionalmente, uma
elevação dos níveis plasmáticos de BNP com a idade independentemente da
presença de disfunção cardíaca, tendo este efeito sido atribuído à presença
de disfunção renal latente79,80.
Peptídeos natriuréticos e redução da massa renal
Apesar dos factores subjacentes aos mecanismos de adaptação à
perda de massa renal não estarem ainda definidos, vários trabalhos
experimentais descrevem um aumento dos níveis plasmáticos dos PN’s no
período imediato após a uninefrectomia e sugerem que os PN’s podem ser
determinantes para a resposta funcional aguda da massa renal
remanescente após a remoção do rim contralateral81,82,83. Estudos animais
de uninefrectomia mais recentes revelam, no entanto, uma diminuição
tardia na resposta natriurética à sobrecarga de volume e confirmam o risco
de desenvolvimento de hipertensão arterial, relacionando-o com uma
diminuição dependente do tempo de alguns mecanismos envolvidos na
homeostasia do sódio, como o sistema dopaminérgico3. O papel da
modulação do sistema dos PN’s na resposta adaptativa crónica à
uninefrectomia encontra-se, contudo, ainda por definir.
Na insuficiência renal crónica (IRC) observa-se igualmente um
aumento dos níveis plasmáticos de PN’s84 e esta alteração foi implicada na
resposta compensatória de aumento da taxa de filtração glomerular e de
11
aumento da rebsorção de sódio, tanto em condições basais como nas
situações de sobrecarga de volume78,85. Embora a IRC esteja
frequentemente associada a alterações da hemodinâmica cardíaca, os
mecanismos responsáveis pelo aumento dos níveis plasmáticos dos PN’s nos
doentes com alteração da função renal permanecem ainda por esclarecer.
Concretamente, o verdadeiro impacto da diminuição da função depuradora
renal na diminuição da excreção e metabolização destes peptídeos e,
consequentemente, no aumento dos seus níveis plasmáticos, apesar de
abordado em diversos trabalhos76,77,84 ainda não está bem estabelecido.
Adicionalmente, não é ainda conhecido se a elevação dos níveis plasmáticos
dos PN’s neste contexto se acompanha de alterações na expressão dos
receptores dos PN’s no córtex e na medula renal do rim remanescente
durante a progressão da doença. Este aspecto reveste-se da maior
importância, uma vez que se verifica que o aumento substancial dos níveis
plasmáticos de ANP em doentes com IRC induz apenas um aumento
modesto na resposta natriurética quando comparada com a observada em
controlos normais ou em doentes com glomerulonefrite e função renal
normal86 sugerindo nesta situação um estado de resistência às acções
renais do sistema dos PN’s, à semelhança do que se verifica noutras
condições associadas a alterações da homeostasia do sódio como a
insuficiência cardíaca ou o síndrome nefrótico63,87,88. A verificar-se, este
estado de resistência à acção dos PN’s poderia ter implicações quer a nível
do balanço de sódio com repercussões para o agravamento da hipertensão
arterial quer ao nível da regulação da resposta fibrótica e proliferativa renal,
contribuindo desta forma para o aparecimento de alterações estruturais do
12
parênquima renal que se sabem ser determinantes para a progressão da
IRC nas situações de perda de massa renal14,89.
13
OBJECTIVOS
Com base nas considerações tecidas previamente, o objectivo deste
trabalho foi avaliar a actividade do sistema dos peptídeos natriuréticos em
modelos experimentais de ablação da massa renal (uninefrectomia e
nefrectomia de ¾) através dos níveis séricos e da expressão renal dos
receptores dos peptídeos natriuréticos. Para isso procedeu-se à avaliação da
hemodinâmica cardíaca, da pressão arterial, da função renal, da resposta à
expansão de volume, dos níveis circulantes de BNP assim como da
expressão do RPN-A e RPN-C no córtex e na medula renal de animais
submetidos a uninefrectomia e a nefrectomia de ¾ até às 26 semanas após
a cirurgia.
14
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho respeitou a Directiva Europeia 86/609/CEE, de 24 de
Novembro de 1986, que estabelece as normas mínimas relativas à
protecção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins
científicos, transposta para a ordem jurídica interna pelo DL 129/92 de 6 de
Junho, regulamentado pela Portaria 1005/92 de 23 de Outubro. Está
também de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals
publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH Publication No.
85-23, revisto em 1996).
Ablação da Massa Renal
Ratos Wistar-Han machos (Harlan, Barcelona, Espanha; 190-220 g)
foram mantidos em condições ambientais controladas (ciclos de 12:12
horas luminusidade/obscuridade e temperatura ambiente de 22±2 ºC) e
alimentados ad libitum (com ração regular contendo 1,9 g.Kg-1 de cloreto de
sódio – Panlab, Barcelona, Espanha), durante o período em que decorreu o
estudo.
Após um período de adaptação e estabilização de 7 dias os animais
foram anestesiados com pentobarbital de sódio (60 mg.Kg-1 intraperitoneal)
e aleatoriamente divididos em dois protocolos experimentais: (i)
laparotomia sem manipulação das áreas renais – grupo controlo (Sham,
n=20); (ii) remoção cirúrgica do rim direito – uninefrectomizados (Unx,
n=22) e (i) laparotomia sem manipulação das áreas renais – grupo controlo
(Sham, n=17); (ii) remoção cirúrgica do rim direito e de ambos os pólos do
15
rim esquerdo – nefrectomia de ¾ (¾nx, n=24). O procedimento cirúrgico
foi efectuado conforme descrito previamente2.
Às 2 (n=12; Sham n=6, Unx n=6 e n=12; Sham n=5, ¾nx n=7), 10
(n=13; Sham n=6, Unx n=7 e n=13; Sham n=5, ¾nx n=8) e 26 semanas
(n=17; Sham n=8, Unx n=9 e n=16; Sham n=7, ¾nx n=9) após a cirurgia
foram efectuados estudos hemodinâmicos, morfométricos, histológicos,
moleculares e de resposta à expansão de volume.
A taxa de sobrevivência durante o estudo foi de: 2 semanas – 100%
nos 3 grupos; 10 semanas – 100% nos 3 grupos; 26 semanas – 100% nos
grupos Sham e Unx e 93% no grupo ¾nx.
Estudos Metabólicos
Duas, 10 e 26 semanas após a cirurgia os animais foram colocados
em gaiolas metabólicas (Tecniplast, Buguggiate-VA, Itália). Durante esse
período procedeu-se à colheita de plasma e de urina de 24 horas para a
determinação da depuração de creatinina (Ccreat, ml.min-1.Kg-1) e da
excreção fraccional de sódio (EFNa+, %).
Avaliação da Pressão Arterial
Às 2, 10 e 26 semanas procedeu-se à avaliação da pressão arterial
sistólica e diastólica e da frequência cardíaca. As medições foram feitas em
animais conscientes no período entre as 7 e as 10 da manhã, tendo sido
utilizado para o efeito um detector de pulso de cauda fotoelectrico (LE5000
Letica, Barcelona, Espanha). Para análise posterior foi utilizado o valor
médio de 4 determinações consecutivas.
16
Avaliação Hemodinâmica do Ventrículo Esquerdo
Preparação Experimental
A anestesia foi induzida e mantida com pentobarbital de sódio (50
mg.kg-1, i.p. - dose de indução e bólus de 20mg.Kg-1 conforme necessário -
dose de manutenção). Os animais foram colocados sobre uma placa
aquecida para manter a temperatura corporal entre 36-38 ºC, após o que
foram monitorizados com ECG contínuo (DII) para controlo da frequência
cardíaca (Datascope 2000A). Os animais foram depois traqueostomizados e
ventilados mecanicamente (Harvard Small Animal Ventilator, Modelo 683)
com ar enriquecido em oxigénio. A frequência ventilatória e o volume
corrente foram ajustados para o peso corporal. De seguida, efectuou-se
uma esternotomia mediana e abriu-se completamente o pericárdio. Para
compensar as perdas de líquidos peri-operatórias, procedeu-se à
cateterização de uma veia jugular e iniciou-se uma perfusão contínua de
soro fisiológico (0,9% de NaCl), com 40 mEq/L de KCl e 80 mEq/L de
NaHCO3. Finalmente, procedeu-se à instrumentação cardíaca para o registo
das pressões do ventrículo esquerdo (VE). O registo das pressões foi
efectuado com um transdutor de alta-fidelidade (SPR-407, Millar
Instruments, Houston, Texas), montado na extremidade de cateteres 3F e
posicionado, através do ápice, no centro da câmara ventricular esquerda.
Após o posicionamento, o cateter foi conectado a um amplificador de
pressões.
17
Aquisição e Análise dos Dados Hemodinâmicos
Após a instrumentação, a preparação experimental estabilizou
durante 30 minutos. Os sinais correspondentes ao electrocardiograma
(derivação DII), pressão do VE e sua primeira derivada (dP/dt), foram
digitalizados automaticamente a uma frequência de 1000 Hz. Todos os
registos foram efectuados com a respiração suspensa no final da expiração.
A partir dos sinais registados em computador, foram calculados os
seguintes parâmetros hemodinâmicos: (i) pressão sistólica máxima (PS);
(ii) velocidades máximas de elevação (dP/dtmax) e de queda (dP/dtmin) da
pressão; (iii) pressão telediastólica (PTD); (iv) constante de tempo de
relaxamento isovolumétrico τ (tau).
No final do protocolo experimental procedeu-se à colheita de sangue
para tubos contendo heparina/lítio para posterior determinação da
concentração sérica de sódio e de creatinina e para a quantificação do BNP
plasmático. Adicionalmente foram colhidas amostras do VE, córtex renal
(CR) e medula renal (MR) para posterior quantificação de ARNm. Estas
amostras foram criopreservadas a -70 ºC. De forma a minimizar a
degradação do ARNm, procedeu-se à submersão das amostras em RNAlater
(Qiagen 74124), antes da congelação. Foram também colhidas amostras de
tecido renal, que foram embebidas em parafina e fixadas em formalina para
posterior estudo histológico e imunohistoquímico.
Expansão de Volume
Num grupo de experiências, 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia, os
animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio (indução com 60
mg.Kg-1 i.p.; manutenção com 20 mg.Kg-1,h-1 i.p.) e colocados em placas
18
aquecidas, com temperatura regulada por termostato para manter uma
temperatura rectal de 37 ºC. Após a traqueostomia, procedeu-se à
cateterização da veia jugular interna esquerda com um catéter PE50
(Becton Dickson, Lisboa, Portugal) para a expansão de volume e à
cateterização da bexiga através de uma incisão suprapúbica para a colheita
de urina. No fim dos procedimentos cirúrgicos foi iniciada a perfusão de
cloreto de sódio isotónico (0,9%) a uma velocidade de 5ml.Kg-1.h-1 durante
120 minutos; durante este período procedeu-se à colheita de uma amostra
de urina (t=120 min, Basal). Depois do período de estabilização, a
velocidade de administração de cloreto de sódio isotónico foi aumentada
para 100ml.Kg-1.h-1 durante 30 minutos (5% do peso corporal); durante
esta fase procedeu-se à colheita de uma amostra de urina (t=150 min, EV).
Posteriormente a velocidade de administração de cloreto de sódio foi
novamente reduzida para 5ml.Kg-1.h-1 durante 90 minutos; durante este
período de recuperação foram colhidas 3 amostras de urina (t=160 min, R-
EV1; t=170 min, R-EV2 e t=240 min, R-EV3).
Quantificação dos Níveis Plasmáticos de BNP
Às 2, 10 e 26 semanas, os níveis plasmáticos de BNP foram
quantificados por radioimunoensaio competitivo após extracção do peptídeo
do plasma de acordo com indicação do fabricante (RK-011-14; Phoenix
Pharmaceuticals; Belmont, California). Em cada reacção procedeu-se à
incubação do anticorpo anti-peptídeo de coelho com a amostra ou o padrão
(16-24h a 4 ºC) e à adição de uma quantidade fixa de peptídeo
radiomarcado (125I-peptídeo). Após um segundo período de incubação (16-
24h a 4 ºC) foram adicionados ao preparado anterior soro de cabra anti-
19
coelho e soro normal de coelho e incubados durante 90 minutos. Os tubos
de reacção foram subsequentemente centrifugados e o sedimento utilizado
para contagem numa câmara Gamma. Posteriormente foi construída uma
curva padrão utilizando a quantidade de 125I-peptídeo ligado em função da
concentração de peptídeo nas amostras padrão para determinação da
concentração de BNP de cada amostra. Os resultados são expressos em
pg/tubo.
Histologia e Imuno-Histoquímica Renais
Os cortes histológicos de tecido renal com 4 µm de espessura,
embebidos em parafina e fixados em formalina, foram desparafinizados em
xileno e re-hidratados em soluções de etanol com gradação crescente.
Fibrose Renal
A quantificação da fibrose renal intersticial foi obtida através da
detecção do colagénio pela coloração de tricrómio de Masson (Goldner with
light green; Bio-Optica, 011802). As secções de tecido renal foram coradas
sequencialmente com hematoxilina férrica de Weigert (10 min), solução
alcoólica estabilizada de ácido pícrico (4 min), fucsina ácida de Ponceau (4
min), ácido fosfomolíbdico (10 min) e light green (5 min). Para a
quantificação da fibrose intersticial foi utilizado o número de pontos de
colagénio corados de verde interseptando uma grelha específica, em 12
campos (ampliação x200) seleccionados aleatoriamente. Cada amostra foi
avaliada por dois observadores. Os resultados são expressos em número
médio de pontos de intersepção identificados na grelha.
20
Atrofia Tubular
A quantificação da atrofia tubular foi obtida através da detecção do
espessamento da membrana basal tubular, conforme descrito
previamente90. A membrana basal tubular foi identificada pela coloração do
ácido periódico de Schiff (PAS - Hotchkiss-MC Manus; Bio-Optica, 04-
130802). As secções de tecido renal foram coradas sequencialmente com
ácido periódico (10 min), reagente de Schiff (20 min), metabissulfito de
potássio (2 min), solução fixadora (2 min) e Hemalum de Mayer (3 min).
Em cada grupo experimental a espessura da membrana basal tubular foi
medida em 100 secções transversas tubulares (50 túbulos no córtex, 50
túbulos na medula). Cada amostra foi avaliada por dois observadores. Os
resultados são expressos em percentagem de secções tubulares transversas
espessadas.
Imunolocalização do RPN-A
A coloração imuno-histoquímica do RPN-A foi obtida pela incubação
sequencial de amostras de tecido renal dos animais às 26 semanas após a
cirurgia, à temperatura ambiente em: solução de H2O2 a 0,3% solution (10
min; Labvision Corp., TR-004-HD), solução bloqueadora (15 min; Labvision
Corp., TR-004-HD), soro anti-RPN-A de rato (30 min; diluição 1/4000;
Biodesign International, K24031R), soro biotinilado de cabra anti-coelho (15
min; Labvision Corp., TR-004-HD), peroxidase de estreptavidina (15 min;
Labvision Corp., TR-004-HD) e 3,3-diaminobenzidina a 4% (10 min;
Labvision Corp., TR-004-HD). A contracoloração foi feita com hematoxilina.
21
Quantificação de ARNm Específico por RT e Real-Time PCR
Extracção do ARNm Total
A extracção do ARNm total foi efectuada a partir de amostras de CR
e MR submersas em RNAlater (Qiagen 74124) e criopreservadas a -70ºC.
Após pulverização e homogeneização da amostra com rotor metálico (~800
rpm), procedeu-se à extracção do ARNm total pelo método de guanídio-
tiocianato e membrana de sílica-gel, de acordo com as instruções do
fabricante (Qiagen 74124). A concentração de ARNm foi calculada por
espectrofotometria (1 A260 = 40,0 µg/ml; Eppendorf 6131 000.012) e a
pureza das amostras foi avaliada pelo quociente da absorvância da amostra
final a 260 nm pela absorvância a 280 nm (A260/A280).
Transcrição Reversa
Sintetizou-se o ADNc total por transcrição reversa (RT; Whatmann
Biometra 050-901) a partir de 50 ng do ARNm total das amostras, num
volume de 20 µl: 30 U/reacção de transcriptase reversa (Invitrogen 18064-
014); 20 U/reacção de inibidor de ARNases (Promega N2515); 0,6 µg de
random primers (Invitrogen 48190-011); 0,5 mM nucleótidos (MBI
Fermentas R0192); 1,9 mM MgCl2 (Promega A3513); 10 mM DTT
(Invitrogen 18064-014).
PCR em Tempo Real
Dez por cento do ADNc resultante da RT foi amplificado por PCR
(volume total 20 µl), sendo o produto da reacção detectado por tecnologia
de avaliação em tempo real (LightCycler®, Roche), utilizando o fluorocromo
22
SYBR Green (Qiagen 204143), de acordo com as instruções do fabricante.
Para cada gene de interesse, utilizou-se um par de primers:
RPN-A - fw 5’-ACA CAT GCC CAG TCC CAC CCT TAC-3’ e rev 5’-AAC
CGG CAG CTT CTC TTC TCC TCA-3’; RPN-C - fw 5’-GGA CCG CGA AGC CTG
AGT TTG AGA-3’ e rev 5’-ATG GAC ACC TGC CCG GCG ATA CCT-3’; BNP -
fw 5’-CAG AGC TGG GGA AAG AAG AG-3’ e rev 5’-GGA CCA AGG CCC TAC
AAA AGA-3’; e GAPDH - fw 5’-CCG CCT GCT TCA CCA CCT TCT-3’ e rev 5’-
TGG CCT TCC GTG TTC CTA CCC-3’.
No final de cada experiência foi efectuada a avaliação da
especificidade da PCR, excluindo a formação de dímeros de primers e a
contaminação por ADN, através da análise do ponto de fusão (melting curve
analysis). Adicionalmente procedeu-se, para cada gene, à electroforese
(agarose 2%; brometo de etídio 0,5 µg/ml) de pelo menos uma reacção de
amplificação, tendo-se obtido bandas únicas com o número esperado de
pares de bases.
Para cada gene assegurou-se a linearidade da reacção de RT-PCR
através da criação de curvas-padrão, obtidas a partir de diluições seriadas
de um padrão de ARNm total. A linearidade (r>0,97) da relação entre o
log10 da quantidade inicial de ARNm total do padrão e o ciclo limiar da
amplificação na PCR (obtido pelo método do máximo da segunda derivada
da fluorescência), permitiu a quantificação relativa de ARNm do gene em
estudo de cada amostra através da regressão do ciclo limiar. O gene da
GAPDH (Desidrogenase do Gliceraldeído 3-Fosfato) foi usado como controlo
interno, conforme descrito previamente91. As experiências foram efectuadas
em duplicado. O nível de expressão de um determinado gene, para cada
amostra, foi calculado através da razão entre a quantidade de ARNm desse
23
gene e a de GAPDH, após comparação com o valor médio do grupo controlo
(Sham). Os resultados são assim expressos em unidades arbitrárias (UA) da
razão gene/GAPDH, em que 1 UA corresponde à média do grupo controlo
(Sham).
Análise Estatística
Os resultados são apresentados como média±erro padrão. A análise
inter-grupos foi efectuada pelo teste two-way ANOVA. Quando se
registaram diferenças estatisticamente significativas empregou-se o teste
Student-Newman-Keuls para efectuar comparações múltiplas entre os
grupos. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas
quando P<0,05.
24
RESULTADOS
Uninefrectomia
Dados Morfométricos
A ablação da massa renal não teve efeito significativo no
crescimento corporal, uma vez que os animais do grupo Unx atingiram o
mesmo peso corporal que os animais do grupo Sham (Tabela 1). Dez
semanas após a uninefrectomia verificou-se um aumento de cerca de 85%
da massa do rim remanescente, que se manteve até às 26 semanas após a
cirurgia. A ablação da massa renal nos animais Unx não teve efeito no peso
do coração ao longo das 26 semanas do estudo. De facto, nos animais do
grupo Sham e nos animais do grupo Unx o peso cardíaco aumentou de
forma semelhante das 2 para as 10 semanas, não se tendo verificado em
nenhum dos grupos experimentais um aumento adicional do peso cardíaco
das 10 para as 26 semanas após a cirurgia (Tabela 1).
Dados Metabólicos
Os animais do grupo Unx apresentaram um aumento significativo
dos valores de creatinina plasmática às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia
e uma redução concomitante de 40% a 50% nos valores da depuração da
creatinina às 2, 10 e 26 semanas (Tabela 1). Nos animais do grupo Sham
verificou-se uma elevação dos valores de creatinina plasmática e uma
diminuição concomitante dos valores da depuração da creatinina plasmática
às 26 semanas após a cirurgia. Como resultado, o valor de depuração da
creatinina plasmática apresentado pelos dois grupos 26 semanas após a
cirurgia foi semelhante.
25
Tabela 1. Morfometria, função renal, pressão arterial e frequência cardíaca nos animais controlo (Sham) e
submetidos a uninefrectomia (Unx) 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
Resultados expressos em médias ± DP; Peso corp., peso corporal; PCreat, concentração plasmática de creatinina; CCreat, depuração de creatinina; EFNa+, excreção fraccional de sódio; PA sistólica, pressão arterial sistólica; PA diastólica, pressão arterial diastólica. *P<0,05 vs. Sham; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; δP<0,05 vs. 10 semanas.
2 semanas 10 semanas 26 semanas
Sham Unx Sham Unx Sham Unx
Peso corporal, g 2555 2604 4176‡ 4219‡ 48014‡δ 47410‡δ
Peso do coração, g 0,740,02 0,750,02 1,050,03‡ 1,030,04‡ 1,080,06‡ 1,100,03‡
Aumento da massa renal, % 516 8411‡ 865‡
PCreat , mg.dl-1 0,340,02 0,470,02* 0,310,03 0,420,04* 0,550,02‡δ 0,630,02*‡δ
CCreat, ml.min-1.kg-1 8,81,0 6,00,4* 10,81,0 7,70,9* 4,70,4‡δ 3,70,2*‡δ
EFNa+, % 0,360,04 0,500,09* 0,230,05 0,310,03* 0,330,04 0,460,04*
PA sistólica, mmHg 123 3 122 2 128 3 150 3*‡ 136 2‡δ 160 5*‡
PA diastólica, mmHg 80 3 81 3 92 2‡ 108 4*‡ 101 3‡δ 111 4‡
26
Não se observaram diferenças significativas na excreção urinária
diária de sódio entre o grupo Sham e o grupo Unx às 2 e às 10 semanas do
estudo. Às 2 e 10 semanas após a cirurgia, a excreção fracccional de sódio
nos animais do grupo Unx foi superior à excreção fracional de sódio do
grupo Sham (Tabela 1). Pelo contrário, 26 semanas após a cirurgia a
excreção diária de sódio no grupo Unx foi inferior à observada no grupo
Sham e a excreção fraccional de sódio foi semelhante entre os dois grupos
(Tabela 1).
Pressão Arterial
A ablação da massa renal nos animais Unx acompanhou-se de um
aumento da pressão arterial sistólica e diastólica às 10 e às 26 semanas
após a cirurgia ao passo que nos animais Sham a pressão arterial sistólica e
diastólica subiu apenas às 26 semanas. Os valores de pressão arterial
sistólica e diastólica foram significativamente superiores nos animais Unx
em relação aos animais do grupo Sham às 10 e 26 semanas após a cirurgia
(Tabela 1).
Hemodinâmica do Ventrículo Esquerdo
Os parâmetros hemodinâmicos do ventrículo esquerdo (VE) dos dois
grupos experimentais estão sumariados na Tabela 2. Em relação aos
parâmetros hemodinâmicos sistólicos, não foram detectadas diferenças
estatisticamente significativas entre os dois grupos às 2, 10 e 26 semanas
após a cirurgia, quer na pressão ventricular esquerda máxima (PVEmax)
quer no índice de contractilidade (dP/dtmax). Adicionalmente, a pressão de
27
enchimento do VE estimada pela pressão telediastólica do VE e pela
constante de tempo de relaxamento isovolumétrico τ foram semelhantes
nos dois grupos às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
Tabela 2. Parâmetros hemodinâmicos do ventrículo esquerdo (VE) nos animais
controlo (Sham) e submetidos a uninefrectomia (Unx) às 2, 10 e 26 semanas após a
cirurgia.
Resultados expressos em médias ± DP. VE, ventrículo esquerdo; PVEmax, pressão sistólica máxima do VE; dP/dtmax e dP/dtmin, velocidades máximas de aumento e queda da pressão ventricular, respectivamente; PTDVE, pressão telediastólica do VE; τ, constante de tempo de relaxamento isovolumétrico. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros hemodinâmicos estudados entre os dois grupos às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
2 semanas 10 semanas 26 semanas
Sham Unx
Sham Unx
Sham Unx
PVEmax, mmHg 77,4±8,0 80,6±11,1 85,2±15,6 96,3±11,1 87,8±6,8 96,7±9,8
dP/dtmax, mmHg/s 4212±642 4478±561 4716±1062 5738±823 4608±458 4894±629
dP/dtmin, mmHg/s -2259±309 -2432±268 -2669±673 -3251±562 -2582±297 -3343±435
PTDVE, mmHg 2,9±0,9 3,0±1,2 2,3±0,5 3,4±0,7 3,7±0,7 3,9±1,0
τ, ms 20±2 18±1 21±2 19±2 21±1 18±1
Resposta à Expansão de Volume
A excreção urinária de sódio antes (t=0-120 min, Basal), durante
(t=120-150 min, EV) e após (t=150-210 min, R-EV1 e t=210-240 min, R-
EV2) a expansão de volume nos animais controlo (Sham) e nos submetidos
a uninefrectomia (Unx) está representada na Figura 1. Duas semanas após
a cirurgia a resposta natriurética à expansão de volume foi semelhante
entre os dois grupos de animais. No entanto, às 10 e 26 semanas após a
cirurgia verificou-se uma diminuição da resposta natriurética dos animais
Unx à expansão de volume em relação à observada no grupo Sham.
28
Sódi
o U
rinár
io (m
ol/g
cre
atin
ina)
0
1
2
3
4
5
6
Basal EV
- Unx- Ctrl
REV1 REV2 REV3
26 Semanas
Sódi
o U
rinár
io (m
ol/g
cre
atin
ina)
0
1
2
3
4
5
6
Basal EV
- Unx- Ctrl
REV1 REV2 REV3
10 Semanas
Sódi
o U
rinár
io (m
ol/g
cre
atin
ina)
0
1
2
3
4
5
6
Basal EV
- Unx- Ctrl
REV1 REV2 REV3
2 Semanas
*
* **
Figura 1. Excreção urinária de sódio nos animais submetidos a uninefrectomia (mol.g creatinina-1) antes
(t=120 min, Basal), durante (t=150 min, EV) e após (t=160 min, R-EV1 e t=170 min, R-EV2, t=240 min, R-EV3) uma
expansão de volume com cloreto de sódio isotónico às 2, 10 e 26 semanas após a cirugia. Resultados expressos em
médias ± DP. *P<0,05 vs. Sham; †P<0,05 vs. 2 semanas; ‡P<0,05 vs. 10 semanas.
29
Níveis Plasmáticos de BNP
Apesar da ausência de disfunção cardíaca nos animais Unx,
verificou-se uma elevação significativa e progressiva dos níveis plasmáticos
de BNP neste grupo experimental ao longo do estudo. No grupo Sham, pelo
contrário, obervou-se uma elevação dos níveis plasmáticos de BNP apenas
às 26 semanas após a cirurgia. Como resultado, os níveis plasmáticos de
BNP às 26 semanas foram semelhantes entre os dois grupos (Tabela 3).
Tabela 3. Níveis plasmáticos de BNP nos animais controlo (Sham) e
submetidos a uninefrectomia (Unx) às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
2 semanas
10 semanas
26 semanas
Sham 1,35±0,39 2,85±0,67 4,43±0,32*‡
Unx 2,51±0,20*
3,44±0,79* 4,30±0,20*‡
Resultados expressos em médias ± DP em pg/tubo. *P<0,05 vs Sham 2 semanas; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; P<0,05 vs. 10 semanas.
Fibrose Intersticial e Atrofia Tubular Renal
Nos animais Unx, a ablação da massa renal acompanhou-se de um
aumento progressivo quer da fibrose intersticial quer da atrofia tubular a
partir das 10 semanas após a cirurgia (Figura 2) enquanto que no grupo
Sham se observou apenas um aumento ligeiro da atrofia tubular às 26
semanas após a cirurgia.
30
Figura 2. Fibrose intersticial e atrofia tubular nos animais controlo (Sham)
e submetidos a uninefrectomia (Unx) às 2, 10 e 26 semanas após a
cirurgia. *P<0,05 vs. Sham; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; δP<0,05 vs. 10
semanas.
Scor
e de
Fib
rose
0
50
100
150
200
250
300
Fibrose Inters tic ial Sh am U nx
Espe
ssam
ento
da
MB
T (%
)
0
10
20
30
40
A tro fia Tubu lar Sh am U nx
*
* ‡
‡*
*
2 sem an as 10 sem an as 26 sem anas
2 sem an as 10 sem anas 26 sem anas
31
Perfil de Expressão Génica dos Receptores dos PN’s
Nos animais controlo (Sham), a expressão basal do RPN-A e do
RPN-C diferiu entre o córtex e a medula renal: os níveis de ARNm do RPN-A
foram superiores na medula renal (Córtex: 1,0±0,40 AU; Medula:
14,0±3,10 AU) enquanto que os níveis de ARNm do RPN-C foram superiores
no córtex renal (Córtex: 1,0±0,17 AU; Medula: 0,37±0,02 AU) (Figura 3).
Durante o estudo, observou-se um aumento significativo e
progressivo dos níveis de ARNm do RPN-A na medula renal dos animais do
grupo Sham ao passo que a expressão do RPN-A na medula renal dos
animais Unx baixou às 10 semanas e aumentou às 26 semanas após a
cirurgia. Estes resultados condicionaram que a expressão do RPN-A na
medula renal dos animais Unx às 10 semanas fosse menor do que no grupo
Sham (Figura 3). No córtex renal, os níveis de ARNm do RPN-A foram
semelhantes entre os dois grupos de animais ao longo do estudo, tendo-se
verificado um aumento significativo dos níveis de ARNm do RPN-A nos
animais dos dois grupos apenas às 26 semanas após a cirurgia (Figura 3).
A expressão do ARNm do RPN-C no córtex renal não variou ao longo
do tempo e não foi diferente entre os dois grupos. Adicionalmente, na
medula renal dos animais do grupo Sham os níveis de ARNm do RPN-C não
variaram ao longo do estudo. No entanto, na medula renal dos animais Unx
os níveis de ARNm do RPN-C diminuiram significativamente a partir das 10
semanas após a nefrectomia (Figura 3). Estes resultados condicionaram que
a expressão do RPN-C na medula renal dos animais Unx fosse menor do que
no grupo Sham às 10 e às 26 semanas após a cirurgia.
32
Figura 3. Quantificação do ARNm por RT-PCR do RPN-A e do RPN-C
no cortex e medula renal nos animais do grupo controlo (Sham) e animais
submetidos a uninefrectomia (Unx) às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
*P<0,05 vs. Sham; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; δP<0,05 vs. 10 semanas.
RP
N-A
/GAP
DH A
RN
m (U
A)
0
10
20
40
60
80
100
Córtex
RP
N-A
/GAP
DH A
RN
m (U
A)
0
10
20
40
60
80
100
Medula
RP
N-C
/GAP
DH A
RN
m (U
A)
0
1
2
3
4
5
6
*‡
‡
- Sham- Unx
*‡
*‡ ‡
RP
N-C
/GAP
DH A
RN
m (U
A)
0
1
2
3
4
5
6
‡
‡ ‡
‡
2 semanas 10 semanas 26 semanas 2 semanas 10 semanas 26 semanas
2 semanas 10 semanas 26 semanas2 semanas 10 semanas 26 semanas
33
Nefrectomia de ¾
Dados Morfométricos
A ablação da massa renal não teve efeito significativo no
crescimento corporal, uma vez que os animais do grupo ¾nx atingiram o
mesmo peso corporal ao longo do estudo que os animais do grupo Sham
(Tabela 4). No grupo ¾nx verificou-se um aumento progressivo da massa
renal remanescente durante o estudo: às 26 semanas após a cirurgia a
massa renal remanescente dos animais ¾nx pesava mais 257±15% do que
no dia da nefrectomia (Tabela 4). A ablação da massa renal nos animais
¾nx acompanhou-se também de um aumento progressivo no peso do
coração ao longo das 26 semanas do estudo. Estes dados contrastam com
as características de crescimento do coração nos animais do grupo Sham,
nos quais o peso cardíaco aumentou das 2 para as 10 semanas, mas não
das 10 para as 26 semanas após a cirurgia. Às 26 semanas após a cirurgia
o peso do coração dos animais ¾nx era significativamente superior ao peso
do coração dos animais do grupo Sham (Tabela 4).
Dados Metabólicos
Às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia, os animais do grupo ¾nx
apresentaram aumentos significativos dos valores de creatinina plasmática
e reduções concomitantes de 50 a 60% dos valores da depuração da
creatinina quando comparados com os animais do grupo Sham (Tabela 4).
Não se observaram diferenças significativas na excreção diária de sódio
entre o grupo Sham e o grupo ¾nx durante o período do estudo. A
34
excreção fracccional de sódio foi consistentemente cerca de 2,5 vezes mais
elevada nos animais do grupo ¾nx ao longo do estudo (Tabela 4).
35
Tabela 4. Morfometria, função renal, pressão arterial e frequência cardíaca nos animais controlo (Sham) e
submetidos a nefrectomia de ¾ (¾nx) 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
Resultados expressos em médias ± DP; Peso corp., peso corporal; PCreat, concentração plasmática de creatinina; CCreat, depuração de creatinina; EFNa+, excreção fraccional de sódio; PA sistólica, pressão arterial sistólica; PA diastólica, pressão arterial diastólica. *P<0,05 vs. Sham; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; δP<0,05 vs. 10 semanas.
2 semanas 10 semanas 26 semanas
Sham ¾nx Sham ¾nx Sham ¾nx
Peso corporal, g 2566 2475 4218‡ 40915‡ 47222‡δ 4627‡δ
Peso do coração, g 0,740,02 0,770,02 1,050,03‡ 1,110,04‡ 1,080,06‡ 1,320,04*‡δ
Aumento da massa renal, % 9910 19117‡ 25715‡δ
PCreat , mg.dl-1 0,350,03 0,760,04* 0,320,03 0,690,07* 0,560,03‡δ 1,270,17*‡δ
CCreat, ml.min-1.kg peso corp.-1 9,41,5 3,50,3* 8,00,4 4,60,7* 4,70,4‡δ 2,00,2*‡δ
EFNa+, % 0,360,04 0,890,06* 0,240,05 0,670,10* 0,290,02 0,80,10*
PA sistólica, mmHg 125 2 139 4* 130 2 187 6*‡ 137 2‡δ 209 4*‡δ
PA diastólica, mmHg 85 2 106 4* 93 2‡ 142 5*‡ 100 2‡δ 156 4*‡δ
36
Pressão Arterial
A ablação da massa renal nos animais ¾nx acompanhou-se de um
aumento significativo da pressão arterial sistólica e diastólica às 2 semanas
após a cirurgia com aumento progressivo subsequente às 10 e 26 semanas
após a cirurgia (Tabela 4).
Hemodinâmica do Ventrículo Esquerdo
Os parâmetros hemodinâmicos do ventrículo esquerdo (VE) dos dois
grupos experimentais estão sumariados na Tabela 5. Em relação aos
parâmetros hemodinâmicos sistólicos, não foram detectadas diferenças
estatisticamente significativas entre os dois grupos às 2, 10 e 26 semanas
após a cirurgia, quer na pressão ventricular esquerda máxima (PVEmax)
quer no índice de contractilidade (dP/dtmax). Adicionalmente, a pressão de
enchimento do VE estimada pela pressão telediastólica do VE e pela
constante de tempo de relaxamento isovolumétrico τ foram semelhantes
nos dois grupos às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
37
Tabela 5. Parâmetros hemodinâmicos do ventrículo esquerdo (VE) nos animais
controlo (Sham) e submetidos a nefrectomia de ¾ (¾nx) às 2, 10 e 26 semanas após
a cirurgia.
Resultados expressos em médias ± DP. VE, ventrículo esquerdo; PVEmax, pressão sistólica máxima do VE; dP/dtmax e dP/dtmin, velocidades máximas de aumento e queda da pressão ventricular, respectivamente; PTDVE, pressão telediastólica do VE; τ, constante de tempo de relaxamento isovolumétrico. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros hemodinâmicos estudados entre os dois grupos às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
2 semanas 10 semanas 26 semanas
Sham ¾nx
Sham ¾nx
Sham ¾nx
PVEmax, mmHg 77,6±9,8 71,5±6,4 83,4±16,8 102,3±7,4 81,1±6,4 76,3±9,2
dP/dtmax, mmHg/s 4258±785 4114±335 4697±1075 5823±405 4421±468 3635±568
dP/dtmin, mmHg/s -2262±379 -2205±172 -2632±695 -3282±391 -2526±622 -2117±340
PTDVE, mmHg 2,9±1,1 3,2±1,3 2,2±0,7 3,9±0,4 4,2±0.8 3,1±0,5
τ, ms 19±2 17±2 21±2 21±2 22±1 22±1
Resposta à Expansão de Volume
Duas semanas após a cirurgia a resposta natriurética à expansão de
volume foi semelhante entre os animais dod dois grupos. Pelo contrário, 10
semanas após a cirurgia os animais do grupo ¾nx apresentaram uma
diminuição significativa da resposta natriurética durante a fase REV-1
(t=150-210 min). Para além disso, 26 semanas após a cirurgia, verificou-se
uma diminuição da resposta natriurética à expansão de volume nos animais
do grupo ¾nx quer na fase REV-1 (t=150-210 min) quer na fase REV-2
(t=210-240 min) (Figura 5).
38
Sódi
o U
rinár
io (m
ol/g
cre
atin
ina)
0
1
2
3
4
5
6
Basal EV
- 3/4 nx- Ctrl
REV1 REV2 REV3
26 SemanasSó
dio
Urin
ário
(mol
/g c
reat
inin
a)
0
1
2
3
4
5
6
Basal EV
- 3/4 nx- Ctrl
REV1 REV2 REV3
10 Semanas
Sódi
o U
rinár
io (m
ol/g
cre
atin
ina)
0
1
2
3
4
5
6
Basal EV
- 3/4 nx- Ctrl
REV1 REV2 REV3
2 Semanas
* * **
Figura 5. Excreção urinária de sódio nos animais submetidos a nefrectomia de ¾ (mol.g creatinina-1) antes
(t=120 min, Basal), durante (t=150 min, EV) e após (t=160 min, R-EV1 e t=170 min, R-EV2, t=240 min, R-EV3)
expansão de volume com cloreto de sódio isotónico 2, 10 e 26 semanas após a cirugia. Resultados expressos em médias
± DP. *P<0,05 vs. Sham; †P<0,05 vs. 2 semanas; ‡P<0,05 vs. 10 semanas.
39
Níveis Plasmáticos de BNP
Apesar da ausência de disfunção cardíaca nos animais ¾nx,
verificou-se uma elevação significativa e progressiva dos níveis plasmáticos
de BNP neste grupo experimental, ao longo do estudo (Tabela 6). No grupo
Sham, pelo contrário, a elevação dos níveis plasmáticos de BNP foi
observada apenas às 26 semanas após a cirurgia. Como resultado, os níveis
plasmáticos de BNP às 26 semanas foram semelhantes entre os dois
grupos.
Tabela 6. Níveis plasmáticos de BNP nos animais controlo (Sham) e submetidos
a nefrectomia de ¾ (¾nx) às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia.
2 semanas
10 semanas
26 semanas
Sham 1,19±0.38 2,84±0,77 4,51±0,37*‡
3/4nx 2,95±0,81*
3,86±0,43* 4,58±0,20*‡
Resultados expressos em médias ± DP em pg/tubo. *P<,05 vs Sham 2 semanas; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; P<0,05 vs. 10 semanas.
Fibrose Intersticial e Atrofia Tubular Renal
Nos animais ¾nx, a ablação da massa renal resultou num aumento
progressivo da fibrose intersticial e da atrofia tubular desde a 10 semanas
após a cirurgia (Figura 6). Em contraste, no grupo Sham observou-se
apenas um aumento ligeiro da fibrose intersticial e da atrofia tubular às 26
semanas após a cirurgia. Como resultado, o grupo ¾nx apresentou um
maior grau de fibrose intersticial e de atrofia tubular que o grupo Sham
quer às 10 quer às 26 semanas após a cirurgia.
40
Figura 6. Fibrose intersticial e atrofia tubular nos animais do grupo
controlo (Sham) e animais submetidos a nefrectomia de ¾ (¾nx) às 2, 10 e
26 semanas após a cirurgia. *P<0,05 vs. Sham; ‡P<0,05 vs. 2 semanas;
δP<0,05 vs. 10 semanas.
Scor
e de
Fib
rose
0
50
100
150
200
250
300
F ibrose In te rstic ia l S ham
‡
*‡
Espe
ssam
ento
da
MB
T (%
)
0
10
20
30
40
A tro fia Tubu lar S ham 3/4 nx
3/4nx
*
*‡
*‡
‡*
*‡
*‡
*
2 s em a nas 1 0 sem ana s 2 6 sem anas
2 sem anas 1 0 sem ana s 26 s em a nas
41
Perfil de Expressão Génica dos Receptores dos PN’s
Nos animais controlo (Sham), a expressão basal do RPN-A e do
RPN-C diferiu entre o córtex e a medula renal: os níveis de ARNm do RPN-A
foram superiores na medula renal (Córtex: 1,0±0,40 AU; Medula:
14,0±3,10 AU) enquanto que os níveis de ARNm do RPN-C foram superiores
no córtex renal (Córtex: 1,0±0,17 AU; Medula: 0,37±0,02 AU) (Figura 7).
Observou-se um aumento significativo dependente do tempo nos
níveis de ARNm do RPN-A na medula renal de ambos os grupos
experimentais (Figura 7). Contudo, a expressão do RPN-A na medula renal
dos animais ¾nx foi consistentemente inferior ao apresentado pelos animais
Sham às 2, 10 e 26 semanas após a cirurgia. No córtex renal, os níveis de
ARNm do RPN-A dos animais ¾nx aumentaram significativa e
progressivamente durante o estudo enquanto que nos animais Sham a
expressão do RPN-A aumentou apenas discretamente às 26 semanas após a
cirurgia (Figura 7). Como resultado, os níveis de ARNm do RPN-A no córtex
renal dos animais ¾nx foram superiores aos observados nos animais Sham,
quer às 10 quer às 26 semanas após a cirurgia.
A expressão do ARNm do RPN-C na medula renal não variou ao
longo do tempo, quer no grupo Sham quer no grupo ¾nx. Os níveis de
ARNm do RPN-C no córtex renal dos animais Sham também não variaram
entre as 2 e as 26 semanas após a cirurgia. No entanto, os níveis de ARNm
do RPN-C no córtex renal dos animais ¾nx aumentaram significativamente
às 10 e 26 semanas após a ablação da massa renal (Figura 7).
42
Figura 7. Quantificação do ARNm por RT-PCR em tempo real do RPN-A e do
RPN-C no cortex e na medula renal nos animais controlo (Sham) e dos
animais submetidos a nefrectomia de ¾ (¾nx) às 2, 10 e 26 semanas após
a cirurgia. *P<0,05 vs. Sham; ‡P<0,05 vs. 2 semanas; δP<0,05 vs. 10
semanas.
RPN
-A/G
APD
H A
RN
m (U
A)
0
10
20
40
60
80
100
Córtex
RPN
-A/G
APD
H A
RN
m (U
A)
0
10
20
40
60
80
100
Medula
RPN
-C/G
AP
DH A
RN
m (U
A)
0
1
2
3
4
5
6
*‡
*‡
*‡
‡
*
- Sham
- 3/4nx
*‡
*‡
RPN
-C/G
APD
H A
RN
m (U
A)
0
1
2
3
4
5
6
*‡
‡
‡
‡
*‡
2 semanas 10 semanas 26 semanas 2 semanas 10 semanas 26 semanas
2 semanas 10 semanas 26 semanas 2 semanas 10 semanas 26 semanas
43
Imunolocalização do RPN-A
Na medula renal, o RPN-A foi detectado nas estruturas tubulares
dos animais do grupo Sham e do grupo ¾nx. No córtex renal dos animais
do grupo Sham, o RPN-A foi apenas identificado de forma ténue nas
estruturas corticais glomerulares e tubulares enquanto que nos animais do
grupo ¾nx a coloração do RPN-A foi claramente identificada nas estruturas
tubulares corticais 26 semanas após a cirurgia.
44
DISCUSSÃO
Neste modelo experimental, a ablação da massa renal acompanhou-se
de um esperado crescimento compensatório do rim remanescente, de um
aumento da pressão arterial e de um aumento da excreção fraccional de
sódio. Apesar do aumento da excreção fraccional de sódio observado, a
nefrectomia condicionou uma diminuição da resposta natriurética à
expansão de volume que se foi intensificando ao longo do tempo e se
manifestou de forma mais marcada nos animais submetidos a nefrectomia
de ¾. Em paralelo com estas alterações, observou-se uma modulação
dependente do tempo da expressão renal dos receptores dos peptídeos
natriuréticos que foi distinta no córtex e na medula renal e que ocorreu na
presença de uma elevação consistente dos níveis plasmáticos de BNP. Nos
animais ¾nx observou-se uma diminuição precoce e sustentada da
expressão do RPN-A na medula renal, que foi acompanhada por um
aumento dos níveis de ARNm do RPN-C no córtex renal. Por outro lado, nos
animais submetidos a uninefrectomia a diminuição da expressão do RPN-A
na medula renal foi apenas observada transitoriamente 10 semanas após a
cirurgia, tendo-se verificado um aumento marcado da expressão deste
receptor às 26 semanas quer no córtex quer na medula renal;
concomitantemente, não foram observadas alterações significativas na
expressão do RPN-C no córtex renal dos animais uninefrectomizados. A
modulação da expressão génica dos receptores dos peptídeos natriuréticos
observada a nível renal ocorreu independentemente da activação sistémica
dos PN’s e foi distinta nos animais Unx e ¾nx. Estes dados sugerem que o
45
tipo de modulação do sistema dos PN’s na resposta adaptativa à perda de
massa renal depende da quantidade de nefrónios funcionantes residuais e
que nas situações de uninefrectomia e de insuficiência renal podem
contribuir de forma distinta para a diminuição da resposta natriurética à
sobrecarga de volume e para o desenvolvimento de hipertensão arterial.
Neste trabalho, verificou-se uma expressão distinta do RPN-A e RPN-C
no córtex e medula renal dos animais Sham às 2 semanas. De facto, os
níveis basais de ARNm do RPN-A na medula renal foram cerca de 14 vezes
superiores aos do córtex renal, tendo-se observado o inverso em relação à
expressão do RPN-C, cuja expressão foi cerca de 3 vezes superior no córtex
em relação à medula renal. Estudos prévios efectuados em rins normais
descrevem de forma consistente diferenças na expressão do RPN-A e do
RPN-C no córtex e medula renal92,93. Nestes trabalhos, o RPN-A é expresso
essencialmente no ducto colector medular enquanto que o RPN-C
predomina nas estruturas corticais. Esta descrição está de acordo com
estudos funcionais de natriurese induzida pelos PN’s, que realçam os efeitos
dos PN’s no transporte tubular e atribuem menor importância fisiológica às
alterações que induzem na hemodinâmica glomerular94,95,96. Curiosamente,
também os animais do grupo controlo apresentaram às 26 semanas uma
elevação da pressão arterial sistólica e diastólica e uma diminuição da taxa
de filtração glomerular. Apesar da ausência de disfunção cardíaca nos
estudos hemodinâmicos do VE, estas alterações ocorreram em simultâneo
com uma elevação dos níveis plasmáticos de BNP. O efeito da idade na
elevação dos níveis plasmáticos de PN’s foi já descrito anteriormente,
mesmo na ausência de cardiopatia estrutural, e foi explicado pela presença
46
de disfunção renal latente79,97. Alguns autores chegam a sugerir, por esse
motivo, que no estabelecimento de intervalos de normalidade para os níveis
plasmáticos de BNP o efeito de covariáveis como a idade e a função renal
devam ser tidas em consideração98. Por outro lado, a elevação dos níveis
plasmáticos dos PN’s com o desenvolvimento, principalmente se
interpretada em conjunto com a diminuição do racio entre o GMPc e o BNP
observada nalguns trabalhos, pode sugerir uma diminuição da actividade
biológica compensatória do sistema dos PN’s com a idade97. A verificar-se,
este estado de diminuição da capacidade da resposta renal à acção dos PN’s
poderia contribuir para o aparecimento de hipertensão arterial sensível ao
sódio, já por diversas vezes documentada nos indivíduos das faixas etárias
mais avançadas99. No nosso trabalho observamos nos animais Sham ao
longo das 26 semanas um aumento consistente da expressão do RPN-A no
córtex (cerca de 2 vezes) e, de forma mais marcada, na medula renal
(cerca de 6 vezes), sem alterações na expressão do receptor de clearance
RPN-C, o que não sugere uma situação de resistência renal à acção dos PN’s
e orienta para uma interpretação diferente dos resultados. O rim é um
orgão alvo da hipertensão arterial de importância crescente. De facto,
vários ensaios clínicos demonstraram até ao momento uma relação
significativa entre a presença de hipertensão arterial e uma diminuição da
taxa de filtração glomerular100,101. Apesar dos benefícios que o tratamento
da hipertensão teve nos últimos anos no desenvolvimento de doença cardio
ou cerebrovascular, a insuficiência renal associada à hipertensão arterial
tem vindo a aumentar sem mostrar tendência para a estabilização. Nos
mecanismos subjacentes à lesão renal pela hipertensão arterial foram
47
implicados previamente a hiperfiltração glomerular e o aumento da
reabsorção proximal de sódio102, embora estes resultados não tenham sido
consensualmente confirmados noutros trabalhos. Um estudo realizado
posteriormente em doentes hipertensos confirma uma alteração da
reabsorção proximal de sódio e documenta adicionalmente uma elevação
sustentada dos níveis dos PN’s nestas situações, sugerindo um papel
contraregulador dos PN’s no desenvolvimento de glomerulosclerose
hipertensiva103. De acordo com estes dados estão os resultados de estudos
realizados em indivíduos normais que documentam um aumento da acção
tubular distal dos PN’s nas situações de aumento da pressão arterial e uma
atenuação desses efeitos quando se verifica uma diminuição da pressão
arterial na ausência de alteração dos níveis plasmáticos104. De facto, o
padrão de expressão dos receptores dos PN’s nos animais controlo do nosso
estudo está de acordo com uma diminuição da capacidade de reabsorção
tubular de sódio e pode servir de base para uma explicação molecular para
o aumento da resposta natriurética na hipertensão arterial. Até que ponto a
modulação da expressão dos receptores dos PN’s observada contribui para
um possível papel protector deste sistema no desenvolvimento de lesão
renal condicionado pelo aumento da pressão arterial permanece ainda por
esclarecer.
A ablação da massa renal teve um profundo impacto na expressão dos
receptores dos PN’s tanto a nível cortical como a nível medular renal, mas
de forma distinta nos animais submetidos a uninefrectomia e a nefrectomia
de ¾. No grupo Unx, a alteração da expressão do RPN-A no córtex e na
medula renal variou com o tempo decorrido após a cirurgia. Na medula
48
renal, observou-se uma diminuição transitória dos níveis de ARNm do RPN-
A às 10 semanas após a cirurgia, enquanto que às 26 semanas se observou
um aumento significativo da expressão deste receptor, quer na medula quer
no córtex renal. Simultaneamente, verificou-se nos animais Unx uma
diminuição da expressão do RPN-C na medula renal, sem alteração da
expressão deste receptor a nível cortical. Adicionalmente, os animais
submetidos a uninefrectomia apresentaram um aumento precoce e
sustentado dos níveis plasmáticos de BNP na ausência de disfunção
cardíaca,. Apesar de estar bem documentado o aumento da excreção
fraccional de sódio após a uninefrectomia, os mecanismos subjacentes à
adaptação aguda e, principalmente, à adaptação crónica do transporte de
sódio na sequência de perda de nefrónios funcionantes ainda não se
encontram bem esclarecidos. A excreção renal de sódio resulta da
interacção de um conjunto de factores que interferem por um lado com a
reabsorção tubular de sódio e, por outro, com a quantidade de sódio filtrada
a nível glomerular através da modulação da pressão de perfusão glomerular
e dos mecanismos que a controlam, tais como o débito cardíaco e as
resistências vasculares periféricas105. Várias linhas de investigação têm
implicado alguns destes factores na fisiopatologia da hipertensão arterial
parenquimatosa, mas poucos são os estudos que avaliaram o seu contributo
para a adaptação da massa renal remanescente à redução do número de
nefrónios funcionantes106. O sistema dopaminérgico foi um dos sistemas
natriuréticos já avaliado no contexto de uninefrectomia experimental3,
tendo a diminuição da natriurese mediada pela dopamina dependente do
tempo decorrido após a cirurgia sido implicada na diminuição da excreção
49
de sódio e no aparecimento de hipertensão arterial nos animais submetidos
a uninefrectomia. De acordo com estes dados estão outros trabalhos que
documentaram a ausência de um efeito antagonista da resposta natriurética
após uninefrectomia em animais submetidos a inibição selectiva dos
receptores da dopamina e da enzima conversora da angiotensina107. O
sistema dos peptídeos natriuréticos foi já avaliado previamente na fase
adaptativa à uninefrectomia. De facto, estudos efectuados em modelos
experimentais de uninefrectomia documentaram um aumento precoce dos
níveis plasmáticos dos PN’s após a cirurgia e uma diminuição da resposta
natriurética aquando do tratamento com anticorpo anti-ANP81,108. No
entanto, estes estudos não avaliaram a função cardíaca ou o padrão de
expressão renal dos receptores dos PN’s. No Homem, essencialmente após
uninefrectomia electiva para doação renal, foi também observado um
aumento precoce dos níveis plasmáticos dos PN´s, mas não existem
trabalhos que tenham avaliado o sistema dos PN’s alguns meses ou anos
após a uninefrectomia109. O aumento da expressão de RPN-A observado
tanto a nível da medula como do córtex renal às 26 semanas após a
cirurgia, principalmente se avaliado em conjunto com a diminuição da
expressão de RPN-C na medula renal sugere que os PN’s podem
desempenhar um papel importante na resposta adaptativa crónica à
ablação da massa renal, permitindo manter a excreção de sódio mesmo na
presença de uma diminuição da actividade de outros sistemas natriuréticos.
O RPN-C é um subtipo de receptor dos PN’s independente da guanilil-
cíclase, que parece mediar a clearance dos PN’s, contrariando desta forma
os efeitos biológicos do RPN-A110. Os mecanismos moleculares/celulares
50
envolvidos na regulação do RPN-C ainda não se encontram, contudo, bem
esclarecidos. A diminuição da expressão do RPN-C foi atribuída em estudos
anteriores, quer a um aumento dos níveis circulantes dos PN’s, através do
aumento da produção do GMPc por activação da guanilil-cíclase associada
ao RPN-A, quer ao aumento da ingestão de sódio na dieta, visando nesta
situação aumentar a biodisponibilidade renal dos PN’s para os receptores
efectores medulares111,112. No entanto, vários trabalhos sugerem que a
modulação da expressão do RPN-C é complexa podendo inclusivamente ser
influenciada por uma variedade de factores de crescimento113.
Independentemente do mecanismo subjacente à diminuição da expressão
do RPN-C após a uninefrectomia, estudos realizados em animais com
delecção génica para o RPN-C indicam que este receptor desempenha um
papel importante na regulação, quer dos níveis circulantes quer dos níveis
locais dos PN’s, estando a diminuição da sua expressão associada a um
aumento da disponibilidade local de PN’s para ligação ao receptor efector
RPN-A e, assim, a um aumento da actividade global do sistema114. Apesar
disto, nos animais Unx verificou-se ao longo do estudo um aumento da
pressão arterial e uma diminuição da resposta natriurética à expansão de
volume. Embora as evidências apontem para um aumento compensatório
da actividade do sistema dos PN’s neste modelo experimental, tal não
impediu a redução da resposta natriurética à expansão de volume nas fases
mais avançadas após a uninefrectomia, o que poderá estar associado à
diminuição dependente do tempo da actividade de outros sistemas
natriuréticos, conforme descrito previamente3.
51
Nos animais submetidos a nefrectomia de ¾ verificou-se um padrão
de modulação dos receptores dos PN’s distinto do apresentado pelos
animais submetidos a uninefrectomia. Ao contrário do que se observou nos
animais Unx, a redução da massa renal induzida pela nefrectomia de ¾
associou-se a uma diminuição precoce e sustentada da expressão do RPN-A
na medula renal, que persistiu durante as 26 semanas do estudo e que se
acompanhou de um aumento selectivo dos níveis de ARNm do RPN-C no
córtex renal dos animais ¾nx. Estes dados, quando avaliados em conjunto
com o aumento progressivo da pressão arterial e com a diminuição precoce
da resposta natriurética à expansão de volume nos animais submetidos a
¾nx sugerem que as alterações renais da expressão do RPN-A e do RPN-C
poderão contribuir para o desenvolvimento de hipertensão arterial, apesar
do aumento precoce e sustentado dos níveis plasmáticos de BNP observado
no nosso trabalho. Cerca de 99% dos receptores dos PN’s expressos a nível
renal são NPR-C e estão essencialmente localizados nas estruturas
vasculares e glomerulares do córtex115. O aumento selectivo da expressão
do RPN-C observado no córtex renal dos animais ¾nx às 10 e 26 semanas
após a cirurgia sugere que este mecanismo de regulação local da
biodisponibilidade dos PN’s poderá diminuir a concentração de PN’s ao nível
dos receptores RPN-A na medula renal33, assim contribuíndo para o
compromisso da resposta natriurética ao longo do tempo. Esta limitação da
capacidade de excreção de sódio torna-se ainda mais importante na
presença da diminuição da expressão do RPN-A na medula renal, conforme
foi documentado consistentemente nos animais submetidos a nefrectomia
de ¾ desde as 2 semanas após a cirurgia, e pode ajudar a explicar a
52
diminuição da resposta natriurética à expansão de volume apresentada
pelos animais ¾nx. No seu conjunto, estes resultados sugerem uma
dissociação entre a activação sistémica e local do sistema dos PN’s neste
modelo de insuficiência renal crónica: enquanto que a elevação dos níveis
circulantes destes peptídeos acompanha a expansão de volume, a redução
da expressão local do RPN-A inclui apenas o órgão em sobrecarga funcional.
Este fenómeno poderá estar na base da resistência local à acção tubular
renal dos PN’s e assim contribuir para o aparecimento da hipertensão
arterial e para a progressão da doença cardíaca e renal. Curiosamente, uma
alteração na regulação da sinalização pelo RPN-A foi já previamente descrita
em situações de expansão do volume. De facto, em doentes com
insuficiência cardíaca e síndrome nefrótico foi documentada uma diminuição
dos efeitos dos PN’s a nível renal, assim como uma diminuição da expressão
renal do RPN-A, sendo sugerido que a diminuição da expressão renal dos
receptores efectores dos PN’s poderia desempenhar um papel importante na
retenção de sódio e na progressão destas doenças63,116.
Em oposição ao observado na medula renal, a expressão do RPN-A
aumentou no córtex renal após a nefrectomia de ¾, com correspondente
aumento da marcação imunohistoquímica nas estruturas tubulares. Embora
não seja possível determinar a relevância fisiológica deste achado, esta
modulação poderá indicar uma contribuição da activação do RPN-A cortical
para as alterações da hemodinâmica glomerular e para a hiperfiltração que
caracteriza a insuficiência renal crónica.
As alterações do balanço de sódio observadas nos animais ¾nx
acompanharam-se, adicionalmente, de um aumento da fibrose intersticial e
53
da atrofia tubular. O sistema dos PN’s desempenha, como é sabido, um
papel importante na regulação da resposta fibrótica e proliferativa. A
diminuição da expressão do BNP ou do RPN-A foi implicada no aumento da
hipertrofia cardíaca53,54 e, por outro, o aumento da expressão de PN’s foi
implicado na diminuição da resposta proliferativa e fibrótica em modelos de
lesão glomerular imune55. No nosso modelo experimental de insuficiência
renal crónica, a diminuição global da actividade do sistema dos PN’s
sugerida pelo padrão de expressão molecular dos receptores RPN-A
designadamente a nível medular, poderá contribuir para o desenvolvimento
da fibrose e da atrofia tubular e para a perda progressiva de parênquima
renal funcionante. No entanto, permanece ainda por esclarecer o verdadeiro
papel desempenhado pelo sistema dos PN’s na regulação da resposta
fibrótica que caracteriza a evolução da insuficiência renal crónica.
Conforme esperado, a ablação da massa renal acompanhou-se de um
aumento precoce e sustentado dos niveis plasmáticos de BNP. Este
aumento não se relacionou com um aumento da produção cardíaca de BNP,
uma vez que não foram observadas alterações nos níveis de ARNm do BNP
no miocárdio e não foi documentada disfunção da hemodinâmica ventricular
esquerda dos animais submetidos a nefrectomia de ¾. Por outro lado, a
elevação dos níveis plasmáticos de BNP nos 3 grupos experimentais evoluiu
em paralelo com a diminuição da depuração da creatinina. Estes dados
estão de acordo com observações recentes que sugerem que a diminuição
da excreção renal de BNP poderá ser um determinante importante da
elevação dos níveis plasmáticos de BNP nas situações de insuficiência renal
crónica moderada a grave77,117. Assim sendo, a utilização do BNP como
54
marcador diagnóstico e prognóstico da doença cardíaca nos doentes com
insuficiência renal crónica deverá ser analisada tendo em conta esta
limitação potencial. Este facto é particularmente relevante se considerarmos
a prevalência de alterações da função renal nos doentes com doença
cardíaca clinicamente significativa.
55
CONCLUSÕES
A alteração da função renal acompanha-se de uma modulação da
expressão dos receptores dos PN’s dependente do tempo, que não se limita
apenas aos animais submetidos a ablação da massa renal mas que também
se observa durante o processo de envelhecimento dos animais do grupo
controlo.
Quer a expressão do RPN-A quer a do RPN-C é distinta no córtex e na
medula renal e varia em resposta à redução da massa renal,
independentemente da activação sistémica do sistema dos PN’s.
Nos animais uninefrectomizados o padrão de expressão dos receptores
dos PN’s parece sugerir um papel importante deste sistema na resposta
adaptativa e compensatória necessária para a excreção de sódio pelo rim
remanescente.
Nos animais submetidos a nefrectomia de ¾, o padrão de expressão dos
receptores dos PN’s traduz um estado de resistência renal à acção dos PN’s,
a qual poderá contribuir para explicar o desenvolvimento precoce e
agravamento progressivo da hipertensão arterial sensível ao sal.
Nos 3 grupos experimentais verifica-se um aumento dos níveis
plasmáticos de BNP, que ocorre na ausência de disfunção cardíaca e poderá
resultar da diminuição da função renal dependente do tempo.
56
REFERÊNCIAS
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