UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

Propriedades Imunomodulatórias de Peptídeos Miméticos da LDL

Eletronegativa

Felipe Wakasuqui

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador(a):

Prof.(a). Dr(a) Dulcineia Saes Parra

Abdalla

São Paulo

2017

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Abreviaturas .......................................................................... 1

RESUMO .......................................................................................... 3

1. INTRODUÇÃO................................................................................. 4

2. OBJETIVOS.................................................................................... 14

3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................... 14

4. RESULTADOS.................................................................................. 23

5. DISCUSSÃO.................................................................................... 31

6. CONCLUSÃO................................................................................... 34

7. BIBLIOGRAFIA................................................................................. 36

8. ANEXOS........................................................................................ 44

1

LISTA DE ABREVIATURAS

ApoB, Apolipoproteína - B 100

CCR2–CCL2 C-C chemokine receptor-like 2- chemokine (C-C motif) ligand 2

CCR5–CCL5 C-C chemokine receptor-like 5- chemokine (C-C motif) ligand 5

CD Cluster of differentiation

CSFE Éster de succinimidil carboxifluoresceína

CX3CR1-

CX3CL1

CX3C chemokine receptor 1 - chemokine (C-X3-C motif) ligand 1

CXCL1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 1

DAMP Danger associated molecular patterns

FBS Fetal Bovine Serum/ Soro Fetal Bovino

Fc γ Receptor Fc para gama globulina

FSC-A Forward-scattered light - Area

FSC-H Forward-scattered light - Height

GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

HSP Heat Shock Protein

IgG e IGM Imunoglobulina G e Imunoglobulina M

IL Interleucina

IFN-γ Interferon gama

LDL Low Density Lipoprotein/ Lipoproteína de Baixa Densidade

LFA1 Lymphocyte function-associated antigen 1

2

LPS Lipopolysaccharide/ Endotoxina

LY6Chi Lymphocyte antigen 6 complex high

LY6Clow Lymphocyte antigen 6 complex low

MCP-1 Monocyte chemoattractant protein 1 (CCL2)

MHC II Major histocompatibility complex II

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NALP3 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3

NF-κB Nucear Factor – kappa B

PBS Phosphate buffered saline

PDGF Platelet Derivated Growth Factor

PPR Pattern Recognition Receptor

rM-CSF Recombinant macrophage colony-stimulating factor

RMPI Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute 1640

SSC-A Side scatter

TGF- β Transforming Growth Factor - β

TLR Toll-like receptor

TNF Tumour necrosis factor

VLA4 Very Late Antigen-4/ Integrin α4β1

3

RESUMO

Wakasuqui, F. Propriedades Imunomodulatórias de Peptídeos Miméticos da LDL Eletronegativa. 2017. no. 499. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Palavras-chave: Peptídeos miméticos, Aterosclerose, Linfócitos, Macrófagos. INTRODUÇÃO: As doenças cardiovasculares, cuja base fisiopatológica é a aterosclerose, são a principal causa de mortalidade no mundo. Na aterosclerose, o endotélio ativado permite a entrada e o acúmulo de lipoproteínas modificados na matriz subendotelial, assim como das células do sistema imune. Os macrófagos reconhecem as partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) modificada acumulada na íntima dos vasos e a internalizam. O acúmulo de ésteres de colesterol nos macrófagos resulta na formação das células espumosas, que posteriormente sofrem apoptose, contribuindo para o acúmulo de lipídios na lesão aterosclerótica. A resposta imune nessa lesão é modulada principalmente pelos macrófagos e linfócitos T, cujas subpopulações desencadearão um efeito protetor ou pró-aterogênico, através da produção de citocinas. Estudos anteriores selecionaram peptídeos miméticos que são reconhecidos pelas porções variáveis de anticorpos monoclonais anti-LDL humana modificada in vivo, denominada LDL eletronegativa. Esses peptídeos têm potenciais aplicações diagnósticas, como antígenos sintéticos e terapêuticas, modulando a resposta imune na aterosclerose. OBJETIVO: Avaliar o efeito dos peptídeos miméticos da LDL eletronegativa sobre a expressão de citocinas em macrófagos e a proliferação de linfócitos. MATERIAIS E MÉTODOS: Avaliou-se por qRT-PCR o efeito de dois peptídeos miméticos (P1 e P2) sobre a expressão gênica de Cd40, Ccl2, Cox2, Il1a, Il1b, Il6, Il10 e Tnfa em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57BL/6 e sobre a expressão de CCL2, IL-6, IL-8 e IL-10 em macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico de indivíduos saudáveis. O efeito dos peptídeos sobre a proliferação de linfócitos isolados do baço de camundongos C57BL/6 e do sangue humano foi avaliado por meio de citometria de fluxo, utilizando o marcador éster de succinimidil carboxifluoresceína (CSFE) RESULTADOS: Os peptídeos induziram a expressão de citocinas pró-inflamatórias em macrófagos murinos, porém em menor intensidade quando comparados à LDL(-). Os resultados em macrófagos humanos não foram conclusivos. O efeito dos peptídeos sobre a proliferação total de linfócitos não foi significativo. CONCLUSÃO: Os peptídeos miméticos estudados não tem o mesmo potencial pro-inflamatório da LDL(-).

4

1. INTRODUÇÃO

1.1 Aterosclerose

Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela

formação de ateromas nas artérias de médio e largo calibre, especialmente em

áreas de bifurcação do fluxo sanguíneo, onde o sangue assume um fluxo

turbulento. Nestes locais o endotélio está exposto à tensão de cisalhamento e

responde a essa tensão alterando sua transcrição gênica pela ligação de

elementos responsivos ao stress a fatores de transcrição como o NF-κB

(Gimbrone et al., 2000). As células endoteliais ativadas pelos estímulos lesivos

expressam moléculas de adesão para leucócitos em sua superfície. Outros

estímulos lesivos incluem dislipidemias, hipertensão, hiper-homocisteinemia,

diabetes, obesidade, inflamação sistêmica, tabagismo, entre outros (Lusis, 2000).

Ao mesmo tempo ocorrem mudanças na permeabilidade do endotélio, o que

permite a entrada e retenção de partículas de lipoproteína de baixa densidade

(LDL) na matriz celular abaixo da túnica íntima (Tabas et al., 2007) devido a

interações da proteína ApoB100 com os proteoglicanos da matriz (Borén et al.,

1998).

As partículas de LDL modificadas ativam o endotélio e induzem a

expressão de moléculas de adesão para leucócitos, permitindo a entrada de

monócitos circulantes e a posterior diferenciação desses em macrófagos, que

expressam receptores scavenger os quais reconhecem e internalizam a LDL

modificada. Os macrófagos acumulam de forma massiva as partículas de LDL

modificada em seu interior, transformando-se em células espumosas, que morrem

por apoptose e contribuem para o aumento do conteúdo lipídico da lesão. A LDL

em sua forma nativa não gera células espumosas porque é endocitada via

receptor B/E, que é controlado por um feedback negativo que diminui a expressão

do mesmo e impede o acúmulo intracelular de ésteres de colesterol (Kruth et al.,

2002). O aumento das células espumosas no espaço subendotelial forma as

estrias gordurosas, que são as lesões iniciais da aterosclerose. As células

5

espumosas também liberam citocinas e fatores de crescimento, como o PDGF,

que estimulam a migração e proliferação das musculares lisas da túnica média da

artéria para a camada íntima. As células musculares lisas também secretam

elementos da matriz extracelular como colágeno e elastina e formam a cápsula

fibrosa que circunda o núcleo necrótico rico em lipídios das lesões ateroscleróticas

(Libby et al., 2011). A lesão continua a se expandir devido à migração contínua de

células mononucleares da circulação, assim como a entrada de lipoproteínas e a

formação de células espumosas, o que é acompanhado pela proliferação das

células musculares lisas, produção da matriz extracelular e pelo acúmulo de

lipídios. Inicialmente, as lesões crescem para a adventícia até um ponto crítico ser

atingido e após isso, começam a expandir-se e invadir o lúmen. (Lusis, 2000).

A cápsula fibrosa sofre contínua remodelação que pode tornar a placa

susceptível a alterações agudas. O colágeno secretado pelas células musculares

lisas representa o principal componente estrutural da cápsula fibrosa e é

responsável por sua força e estabilidade mecânicas. O colágeno é degradado

principalmente por metaloproteinases secretadas por macrófagos no interior da

placa ateromatosa; enquanto os inibidores teciduais de metaloproteinases,

produzidos por células endoteliais, células musculares lisas e macrófagos,

modulam a atividade das metaloproteinases. (Finn et al., 2010). A inflamação da

placa resulta em um aumento da degradação do colágeno e redução da síntese

de colágeno, assim desestabilizando a integridade da cápsula fibrosa. (Halvorsen

et al., 2008). Diversas outras modificações estruturais podem ocorrer na placa

aterosclerótica como calcificação, ulceração na superfície luminal e hemorragia a

partir de pequenos vasos que se formam na lesão por neoangiogênese e que se

originam da parede de vasos sanguíneos da vasa vasorum da camada adventícia

das artérias (Lusis, 2000).

As principais complicações clínicas da aterosclerose dependerão do

tamanho dos vasos, da estabilidade da própria placa e do grau de degeneração da

parede arterial subjacente. Nos pequenos vasos a estenose aterosclerótica

obstruirá gradualmente a luz dos vasos e causará diminuição crônica da perfusão

6

arterial. Entre as consequências da estenose estão a oclusão mesentérica e

isquêmica do intestino, encefalopatia isquêmica e claudicação intermitente. A

ruptura da placa é o evento clínico mais preocupante, pois a placa que se rompeu

pode levar à trombose vascular aguda e/ou embolia com obstrução distal do vaso,

causando por exemplo um infarto agudo do miocárdio ou um acidente vascular

cerebral. Por fim, a aterosclerose pode levar à destruição da parede vascular

subjacente à placa com formação de aneurisma, ruptura e/ou trombose

secundária (Stary et al., 1995) .

Vale ressaltar a importância do estudo da aterosclerose pois dois de seus

desfechos clínicos, a doença cardíaca isquêmica e o acidente vascular cerebral,

são as principais causas de morte na atualidade, como tem sido indicado pela

Organização Mundial da Saúde nos últimos 15 anos (WHO, 2017).

1.2 LDL eletronegativa

A LDL é uma partícula esférica, com aproximadamente 22nm de diâmetro,

que contém um núcleo apolar de ésteres de colesterol e triglicérides, cercados por

uma monocamada anfipática de fosfolípides e colesterol não esterificado e uma

molécula de apolipoproteína B-100 (Prassl e Laggner, 2009). É a responsável pelo

transporte sérico do colesterol, sendo internalizada por sua ligação aos receptores

de LDL (B/E) presentes na membrana plasmática dos hepatócitos e dos tecidos

periféricos (Braunwald, 1999). As partículas de LDL na circulação não são

homogêneas, e podem formar diversas subclasses baseadas em diferenças de

densidade, tamanho e carga elétrica (Berneis, 2002). As partículas de LDL

também podem sofrer diversas modificações químicas como carbamilação (Shah

et al., 2008), enriquecimento com ácidos graxos não-esterificados (BenıTez et al.,

2002), glicação (Brown et al., 2007), nitração (Peluffo e Radi, 2007), oxidação

(Jun-Jun et al., 2000) e modificações provocadas pela ação enzimática de

lipoxigenases e mieloperoxidases (Hevonoja et al., 2000), gerando diversas

subpopulações de LDL desde a minimamente modificada até a extensivamente

oxidada.

7

Dentre as subfrações de LDL modificada, a LDL eletronegativa (LDL(-)) se

diferencia da forma nativa por ter sua carga superficial negativa aumentada. A

população de LDL(-) também é heterogênea, podendo apresentar variações em

densidade e tamanho, e diferentes graus de eletronegatividade, que pode estar

associada ao seu conteúdo aumentado de ácidos graxos não esterificados

(Sánchez-Quesada et al., 2003), elevado conteúdo de hidroperóxidos (Sevanian et

al., 1997), dienos conjugados e óxidos de colesterol (Chang et al., 1997), e menor

conteúdo de α-tocoferol (Cazzolato et al., 1991). Sua origem não está bem

estabelecida, mas inibição da fosfolipase A2 parece inibir sua formação (Greco et

al., 2009). O mais provável é que não apenas um processo esteja envolvido em

sua formação, mas sim o resultado de sucessivas e diferentes modificações, como

glicação não-enzimática e enriquecimento de ácidos graxos não-esterificados,

além de modificações relacionadas à ação das enzimas fosfolipase A2 e

esfingomielinase (Kovanen e Pentikäinen, 2003).

A LDL(-) diferencia-se das formas mais oxidadas de LDL(-) por ainda ser

reconhecida pelos receptores de LDL (Benítez et al., 2004), apesar da afinidade

diminuída, devido a modificação na apoB-100 (Parasassi et al., 2001) o que

aumenta a meia vida da lipoproteína na circulação e promove um aumento de sua

afinidade por proteoglicanos da matriz extracelular (Estruch et al., 2013). A LDL(-)

apresenta tendência a agregação. A agregação de partículas de LDL(-) aumenta

sua ligação aos proteoglicanos da matriz subendotelial das artérias, sendo

portanto pró-aterogênica (Ivanova et al., 2015).

A LDL(-) é citotóxica para o endotélio, diminuindo a transcrição de FGF-2, o

que pode contribuir para aumento da apoptose (Chen et al., 2003), além de induzir

a inflamação por liberação de IL-6, IL-8, MCP-1, GM-CSF, PDGF-B por

macrófagos (Benítez et al., 2006; De Castellarnau et al., 2007) e aumentar a

expressão de moléculas de adesão de células vasculares induzidas por TNF-α

(Ziouzenkova et al., 2003). A LDL(-) induz ainda a liberação do fator estimulador

de colônias de macrófagos e PDGF-B (De Castellarnau et al., 2007), além de inibir

a síntese de óxido nítrico pela óxido nítrico sintase endotelial (Berliner et al.,

8

1995). Todas essas citocinas pró-inflamatórias contribuem para o processo

aterogênico pelo recrutamento de leucócitos, sua proliferação e a manutenção do

estado pró-inflamatório.

O nível de LDL(-) representa de 1 a 10% da concentração plasmática de

LDL de uma pessoa normal (Benítez et al., 2004), mas encontra-se aumentado em

indivíduos com doenças como diabetes tipos 1 e 2 (SaNchez-Quesada et al.,

2001), hipercolesterolemia familiar (Sánchez-Quesada et al., 1999), síndromes

coronarianas (Oliveira et al., 2006) e em pacientes renais crônicos sob tratamento

de hemodiálise (Lobo et al., 2008). Por estar aumentada nestas situações de

elevado risco cardiovascular, a LDL(-) pode ser considerada um importante

biomarcador e fator de risco para doenças cardiovasculares, assim como um

possível alvo terapêutico (Ivanova et al., 2015). Nosso grupo desenvolveu

anticorpos monoclonais que distinguem a LDL(-) da fração nativa, bem como

imunoensaios validados para sua detecção de forma rápida e direta que poderiam

ser usados na prática clínica (Damasceno et al., 2006; Faulin et al., 2012).

1.3 Macrófagos na aterosclerose

Nas primeiras etapas da aterogênese, o endotélio promove a captura e o

rolamento dos monócitos circulantes através das quimiocinas CCL5 e CXCL1

(Soehnlein et al., 2013) e a adesão através da P-selectina, VCAM1, ICAM1, que

se ligam às integrinas VLA4 e à LFA1 e são importantes para a firme adesão dos

monócitos na superfície luminal do endotélio. A transmigração dos monócitos em

direção à placa é mediada por quimiocinas liberadas pelo endotélio, células

musculares lisas e macrófagos residentes, sendo CCR2–CCL2, CX3CR1-CX3CL1

e CCR5–CCL5, os principais pares quimiocina-receptor responsáveis pela

transmigração (Tacke et al., 2007).

A intensa captura das lipoproteínas pelos macrófagos derivados de monócitos,

tornando-os células espumosas, é um dos primeiros eventos patogênicos na

aterosclerose. Embora os macrófagos possam endocitar as lipoproteínas que

contêm a ApoB100 pelo receptor de LDL, a expressão desse receptor é regulada

9

negativamente pelo excesso de colesterol. O acúmulo de colesterol forma cristais

presentes na placa aterosclerótica, tanto no espaço extracelular quanto no interior

dos macrófagos, os quais podem induzir a ativação do inflamossoma NLRP3, que

resulta no processamento e secreção da IL-1β, que é pró-inflamatória (Duewell et

al., 2010). As diversas formas modificadas da LDL contêm domínios que são

reconhecidos como sinais associados ao perigo (DAMPs) por diferentes

receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRR) das células do

sistema imune. Os macrófagos reconhecem as diversas classes de LDL

modificada através dos receptores scavenger e também pelos receptores Toll-like

(Moore e Tabas, 2011). A LDL(-) é reconhecida principalmente pelo CD14

(Estruch et al., 2013), LOX-1 (Lu et al., 2009), TLR2 e TLR4 (Chávez-Sánchez et

al., 2010). A ativação de CD14, TLR2 e TLR4 induz a produção das citocinas

TNF, IL-1β, IL-6, e IL-10 (Chávez-Sánchez et al., 2010); e a produção de

espécies reativas de oxigênio pela NADPH oxidase 2, através da sinalização via

TLR4 (Bae et al., 2009).

No interior da placa, os macrófagos encontram sinais distintos, que os levarão

a diversas polarizações, formando uma população heterogênea. A sinalização por

TLR pode induzir a polarização para macrófagos M1, que são pró-inflamatórios e

produzem diversas citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e IL-12 e espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio (Adamson e Leitinger, 2011), enquanto a LDL

oxidada pode levar a polarização M2, que é ateroprotetora, através da ativação de

PPARγ (Gallardo-Soler et al., 2008). Macrófagos M2 têm propriedades anti-

inflamatórias e secretam as citocinas IL-10 e o agonista do receptor de IL-1 em

resposta às citocinas IL-4 e IL-13 de linfócitos Th2 (Bobryshev et al., 2016). No

entanto, essa visão de duas polarizações distintas com propriedades antagônicas

é simplificada pois outras polarizações de macrófagos estão presentes na placa,

como o Mox caracterizado pela expressão aumentada de NRF2 (Kadl et al., 2010).

A origem da polarização dos macrófagos ainda não está completamente

elucidada. Sugere-se que em camundongos os macrófagos M1 possam vir

preferencialmente de monócitos LY6Chi, que são mais pró- inflamatórios, e que

10

macrófagos M2 venham de monócitos LY6Clow, ou derivados de macrófagos M2

residentes no tecido. É provável que os linfócitos TH1 e TH2 secretem fatores

polarizantes. Sabe-se que a população de macrófagos M1 aumenta conforme a

lesão aterosclerótica progride (Khallou-Laschet et al., 2010), enquanto macrófagos

M2 estão envolvidos com a regressão da placa e o reparo tecidual (Bobryshev et

al., 2016). A maior compreensão do fenômeno da polarização de macrófagos pode

levar a terapias que estimulem a polarização M2 e seu efeito ateroprotetor.

Conforme a placa avança, os macrófagos continuam sendo um dos maiores

moduladores do processo aterosclerótico, seja através das secreção de citocinas,

metaloproteinases, espécies reativas de oxigênio, ou mesmo através da sua

eventual morte por apoptose ou necrose, liberando conteúdo lipídico e fator

tecidual, que irá formar o material pró-trombótico no interior da placa (Moore et al.,

2013), além de apresentarem antígenos para os linfócitos T através do complexo

MHC II.

1.4 Linfócitos na aterosclerose

Aproximadamente 10% dos linfócitos T em placas ateroscleróticas humanas

podem reconhecer LDL oxidada através da apresentação de antígenos via MHC

classe II (Andersson et al., 2010). A apresentação de antígenos ocorre

principalmente através de células dendríticas imaturas que internalizam antígenos

relacionados ao processo aterosclerótico e os levam aos linfonodos e baço onde

induzem o priming nos linfócitos T naive. Após a ativação desses linfócitos,

poucos clones se expandem dentro da lesão, o que é compatível com a baixa

expansão que ocorre no sangue periférico (Andersson et al., 2010). Diversos

antígenos próprios ou microbianos estão relacionados com a ativação dos

linfócitos T no processo aterosclerótico, entre os mais importantes auto antígenos

estão a LDL modificada (Stemme et al., 1995), as proteínas de choque térmico

(HSPs) e a glicoproteína β2 (George et al., 1999).

Os diferentes tipos de linfócitos têm papeis muito diferentes no processo

aterosclerótico, que será descrito adiante. Os linfócitos T CD4+ são tão

11

importantes para a lesão, que sua inativação por anticorpos monoclonais anti-

CD4+ reduzem a lesão em até 70% em modelos murinos (Lichtman, 2013). Há

diversos padrões de resposta das células T CD4, cada um tendo um efeito

diferente no processo aterogênico. As células Th1 produzem principalmente INF-γ,

um potente ativador de macrófagos que contribui para o aumento da lesão, pois

recrutam outros macrófagos para a placa, aumentando a expressão do complexo

MHC classe II e a captura de lipídios das lipoproteínas pelos macrófagos (Leon e

Zuckerman, 2005). O IFN-γ pode desestabilizar a placa através da diminuição da

infiltração e proliferação de células musculares lisas, reduzindo a síntese de

colágeno, além do aumento da produção de enzimas que degradam a matriz

extracelular, potencializando a ruptura da placa (Mclaren e Ramji, 2009).

A resposta por linfócitos Th2 conduz a vias pró e antiaterogênicas. Seu efeito

pró-inflamatório deve-se à expressão da citocina IL-4, que tem efeitos como

ativação de mastócitos, redução da produção de colágeno e aumento das

proteases elastase e metaloproteinase-12, que degradam a matriz extracelular, o

que desestabiliza a placa, além de digerir elementos estruturais da parede da

artéria o que pode provocar um aneurisma (Andersson, 2010). Em contraste, a

síntese da IL-5 pelos linfócitos Th2 tem um efeito protetor, pois ela estimula

linfócitos B1a que expressam mais IgM, conhecida como anticorpo natural, pois

reconhece epítopos resultantes da oxidação da LDL e favorece o clearence

desses autoantígenos sem promover inflamação (Binder, 2010). A classe das

imunoglobulinas IgG, secretadas por linfócitos B2, está comumente associado a

processos pró-aterogênicos, por mediarem a captura de imunocomplexos através

do receptor Fcγ dos macrófagos. Essa captura mediada por Fcγ resulta em

ativação celular, liberação de citocinas pró-inflamatórias, metaloproteinases,

espécies reativas de oxigênio e na regulação positiva dos receptores de LDL

(Wang et al., 2012). Entretanto, diversos candidatos à vacina para aterosclerose

aumentam o nível de IgG (Tse et al., 2013; Gisterå et al., 2017), portanto seus

efeitos podem depender de sua especificidade, subclasse e capacidade de formar

imunocomplexos (Le Borgne et al., 2015).

12

Todos os tipos de linfócitos Treg têm um efeito ateroprotetor, exercendo

atividade imunoregulatória e supressiva através de vários mecanismos, entre os

quais a secreção de IL-10, TGF- β e inibição mediada por contato (Ketelhuth e

Hansson, 2016).

Os linfócitos T CD8+ tem um papel na vulnerabilidade da placa, pois levam à

apoptose de macrófagos, células de músculo liso, células endoteliais o que, por

sua vez, aumenta a formação de núcleo necrótico e aumenta ainda mais a

inflamação via TNF-α (Kyaw T et al, 2013). No entanto, o papel dos linfócitos T

CD8+ como ateroprotetor ou pró aterogênico ainda não é claro, assim como dos

linfócitos Th17 e dos linfócitos da imunidade inata γδ, NK e NKT (Hedrick, 2015;

Ketelhuth e Hansson, 2016).

1.5 Peptideos mimotopos e suas aplicações

Peptídeos mimotopos são sequências de aminoácidos que mimetizam um

epítopo de um antígeno. Como esses peptídeos são reconhecidos por receptores

de células B, eles tem semelhança com a estrutura 3D do epítopo, mas não

necessariamente homologia, podendo mimetizar não só antígenos protéicos, mas

também lipídeos e carboidratos (Kimura et al., 2015).

O método utilizado para seleção dos peptídeos mimotopos é o chamado

‘’phage display’’, no qual sequências aleatórias de DNA são inseridas no gene do

capsídeo proteíco de um vírus filamentoso como o M13. Quando a capsula viral é

expressa, os aminoácidos do gene ficam fundidos aos aminoácidos do capsídeo e

o fago pode então apresentar os aminoácidos da sequência de interesse na

superfície. Devido à acessibilidade, a sequência de aminoácidos incorporados aos

fagos comporta-se como se estivessem livres, permitindo seu reconhecimento por

estruturas biológicas. São montados então diversos tipos de fagos apresentando

diversas sequências diferentes, normalmente com 5 a 20 aminoácidos para formar

uma biblioteca. Há dois tipos de bibliotecas de fagos: as de sequências lineares e

as cíclicas, nas cíclicas a sequência da região randomizada é flanqueada por duas

cisteínas para manter a conformação do peptídeo por meio das pontes dissulfeto.

13

Os fagos com alta afinidade pelo anticorpo são isolados do restante da biblitoeca

por meio da seleção por afinidade, em que o anticorpo é incubado com a

biblioteca de fagos, realizando-se uma lavagem para remover os fagos não

ligados. Os fagos ligados ao anticorpo são eluídos posteriorente utilizando-se um

tampão ácido. Estes fagos que se ligaram ao anticorpo são amplificados em E. coli

e são submetidos a outro processo de seleção por afinidade. Ao final de várias

etapas, os clones de fagos que se ligam fortemente ao anticorpo são obtidos, e

tem sua sequência de DNA sequenciada para determinar os peptídeos com alta

afinidade pelo anticorpo (Smith & Petrenko, 1997); (Matsubara, 2012).

Os peptídeos utilizados neste trabalho são epítopos da porção da

apolipoproteína B-100 modificada reconhecida pela porção variável de dois

anticorpos monoclonais anti-LDL(-) humana desenvolvidos no laboratório da Profa

Dra Dulcineia SP Abdalla. Para o mapeamento dos epítopos utilizou-se bibliotecas

de peptídeos apresentadas por fagos construídas pelo Prof. Dr. Ricardo José

Giordano do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP. Os

peptídeos selecionados possuem a sequência CX8C, ou seja, são oito

aminoácidos com cisteínas nas extremidades. Depositou-se o pedido de patente

desses peptídeos sob o número de registro BR 1020131063, em 30 de abril de

2013 com o título “Peptídeos Sintéticos Miméticos a LDL, seu Processo de

Produção e seus Usos”, depositado no Instituto Nacional da Propriedade Industrial

(INPI).

Peptídeos mimotopos possuem muitas aplicações. Na área da pesquisa

esses peptídeos são úteis para identificação dos domínios de uma proteína

importantes para o reconhecimento pelo anticorpo, o que proporciona informações

adicionais sobre a estrutura e atividade do antígeno. Peptídeos mimotopos

também tem aplicações diagnósticas, substituindo o antígeno natural em ensaios

clínicos (Deroo e Muller, 2001). Isso é particularmente útil para montagem de

curvas de calibração e controles positivos em kits diagnósticos para detecção de

LDL(-) em doenças como a aterosclerose, em que o antígeno necessita ser

purificado do sangue humano. Outra importante aplicação dos peptídeos

14

mimotopos é como antígeno em vacinas. Por substituírem uma proteína complexa

por um pequeno peptídeo que mantêm uma atividade biológica, mimotopos têm o

potencial de substituir a proteína original na formulação de vacinas, mas para isso

sua imunogenicidade precisa ser confirmada (Deroo e Muller, 2001). Peptídeos

miméticos da ApoB 100 já estão sendo estudados como vacinas, e têm se

mostrado efetivos em reduzir a aterosclerose em camundongos, reduzindo a placa

aterosclerótica, gerando resposta imune Th2 e aumentando a população de

linfócitos Treg (Pierides et al., 2013; Kimura et al., 2015).

2. OBJETIVO(S)

O objetivo geral deste trabalho foi investigar as ações de peptídeos miméticos da

LDL eletronegativa sobre macrófagos e linfócitos. Para tanto foram analisados os

efeitos dos peptídeos P1 e P2 miméticos da LDL eletronegativa sobre:

• Expressão de Cd40, Ccl2, Cox2, Il1a, Il1b, Il6, Il10 e Tnfa em macrófagos

murinos derivados da medula óssea, por meio de qRT-PCR

• Proliferação de linfócitos murinos obtidos do baço, por citometria de fluxo

utilizando CSFE.

• Expressão das citocinas IL-6, CCL2 e IL-10 em macrófagos humanos

derivados de monócitos do sangue periférico de voluntários, por meio de qRT-

PCR.

• Proliferação de linfócitos humanos obtidos de sangue periférico, por

citometria de fluxo utilizando CSFE.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1-Obtenção e Diferenciação de Macrófagos Medulares Murinos

Protocolo baseado em ‘’Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and

Applications’’. (Weischenfeldt e Porse, 2008). Utilizaram-se camundongos machos

C57BL/6, saudáveis, com idade aproximada de 60 dias e peso aproximado de 20

g. Para eutanásia foram anestesiados com uma dose de 50 µL de cloridrato de

15

xilazina (2,0 g/100 mL na dose de 5 mg/Kg) mais 50 µL de cloridrato de cetamina

(1,0 g/10 mL na dose de 10 mg/Kg). Após a perda da consciência, os animais

foram eutanasiados por deslocamento cervical. Este protocolo foi aprovado pela

Comissão de Ética no Uso Animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas,

Protocolo CEUA/FCF/438.

Após a eutanásia, o fêmur e a tíbia foram higienicamente removidos,

lavados com álcool 70ºGL, e transportados para um fluxo laminar. O fêmur e a

tíbia tiveram suas epífises clivadas para exposição da medula óssea. Uma seringa

de 5mL com agulha de seringa de 1mL (com calibre de 13 mm x 0,38 mm) cheia

de meio de cultura RMPI 10% FBS foi utilizada para extração da medula,

utilizando 2,5mL de meio por osso. O material celular obtido foi colocado em tubos

cônicos de 50mL e homogeneizado com pipeta Pasteur. Após isso, as amostras

foram transferidas para tubos cônicos de 15mL e centrifugadas a 1200 rpm por 8

minutos a 4ºC. Então, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi

ressuspendido em 1mL de tampão de lise de eritrócitos (155 mM NH4Cl; 10 mM

KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,4). Após a ressuspenção, 4 mL de solução de

lise foram acrescidos e as células foram centrifugadas novamente por 8 minutos a

1200 rpm. O sobrenadante foi mais uma vez desprezado e 10mL de meio de

cultura RPMI foram adicionados ao precipitado que foi ressupendido.

Realizou-se a contagem celular em câmara de Neubauer utilizando 10 µL

da amostra diluídos em 90µL de 0,1% de azul de Tripan. Feita a contagem, as

células foram novamente centrifugadas por 8 minutos a 1200 rpm, ressuspendidas

em meio RPMI e plaqueadas em placas de seis poços, colocando 8x105 células

por poço, além de pequenas alíquotas da suspensão celular com

aproximadamente 2x105 células, terem sido colocadas em uma placa de cultura

pequena para posteriormente servir para confirmação por citometria.

Essas placas foram incubadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 7 dias. O

meio foi trocado a cada 2-3 dias. Houve dois meios de diferenciação distintos: o

meio condicionado de fibroblastos L929 (WEISCHENFELDT et al, 2008), e RPMI

com 10% de soro fetal bovino contendo rM-CSF murino (Preprotech Catalog

16

Number: 300-25) na concentração de 20ng/mL. Em cada poço foram colocados

2mL de um desses meios. As placas foram cuidadosamente separadas e

identificadas. A mudança de fenótipo foi acompanhada através de microscopia e

as células foram utilizadas a partir do sétimo dia, após confirmação de sua

diferenciação por citometria de fluxo utilizando o anticorpo F4/80-PE-Cy5

(Ebioscience, #15-4801-82) titulado a 1:1000.

3.2-Tratamento com Peptídeos Miméticos P1 e P2

Depois de confirmada a diferenciação, os macrófagos que estavam nas

placas de 6 poços passaram por sincronização do ciclo celular através do

carenciamento com RPMI com 1% FBS durante 24 horas.

Após o carenciamento iniciou-se o tratamento com 500 μL de RPMI com

10% FBS com peptídeos P1 ou P2, ou LDL(-) nas concentrações de 100, 50, 25

ou 12,5 µg/mL, ou LPS na concentração de 10μg/mL ou PBS.

Estes tratamentos foram utilizados tanto para as células diferenciadas com

meio condicionado de L929 quanto para as células diferenciadas com o rM-CSF.

Após as 3 horas de tratamento, procedeu-se a extração de RNA.

3.3-Extração de RNA

RNA total foi extraído utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) segundo

especificações do fabricante. A quantificação do RNA extraído foi em

espectrofotômetro BioTeck e considerados de boa qualidade os RNAs que

apresentaram uma razão da absorbância em 260/280nm com valores próximos de

2

3.4-Construção dos cDNAs

Para a síntese de cDNA seguiu-se o protocolo do produto SuperScript®

VILO Master Mix. Foram utilizados 2 μg de RNA total de cada amostra. Os tubos

foram incubados por 5 min a 65°C, 120 min a 50º C e 5 min a 95ºC em um

17

termociclador. Após a reação, os tubos foram colocados imediatamente em gelo e

armazenados a -20ºC.

3.5-Reação de PCR Real Time

Para as reações de real time PCR (qRT-PCR) foram utilizados 1,0 μL de

cDNA, 0,4 μL da mistura de um dos pares de primers forward e reverse de cada

gene da tabela abaixo, 3,6 μL de água miliQ estéril e 5,0 μL de SYBR Green

Master Mix (Applied Biosystems®), por poço.

O ensaio qRT-PCR foi realizado no aparelho 7500 FAST (Applied

Biosystems®) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 15 min,

seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento dos

primers e extensão a 60°C por 60 segundos. Cada amostra foi feita em duplicata.

A análise dos dados resultantes das reações de real-time PCR foi feita pelo

método Delta-Delta Ct (ΔΔCt) (Livak e Schmittgen, 2001) .

Genes Primer Forward Primer Reverse

Cd40 CTGGACAAGCTGTGAGGATAAG TAGAGAAACACCCCGAAAATG

Ccl2 TGAGTAGGCTGGAGAGCTACAA ATGTCTGGACCCATTCCTTC

Cox2 TGGTGCCTGGTCTGATGATG GTGGTAACCGCTCAGGTGTTG

Il1a CTGCAGTCCATAACCCATGAT TGACAAACTTCTGCCTGACG

Il1b TTCCCATTAGACAACTGCACTAC GTCGTTGCTTGGTTCTCCTT

Il6 TGTGCAATGGCAATTCTGAT ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC

Il10 GTACAGCCGGGAAGACAATAA GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA

Tnfa GGTGCCTATGTCTCAGCCTC CACTTGGTGGTTTGCTACGA

Gapdh TCCACTCACGGCAAATTCAACG TAGACTCCACGACATACTCAGC

Tabela 1. Genes murinos avaliados por PCR-Real Time e as sequências de nucleotídeos dos primers utilizados para

detecção da expressão gênica.

18

3.6-Obtenção de Linfócitos Murinos

Os camundongos machos C57BL/6, saudáveis, com idade aproximada de

60 dias e peso aproximado de 20 g foram anestesiados com uma dose de 50 µL

de cloridrato de xilasina (2,0 g/100 mL na dose de 5 mg/Kg) mais 50 µL de

cloridrato de cetamina (1,0 g/10 mL na dose de 10 mg/Kg). Após a perda da

consciência, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. O baço foi

removido em condições higiênicas e transportado para um fluxo laminar. O baço

foi macerado, e seus pedaços foram tamisados contra um cell strain, um filtro de

nylon de 70 μm. Foram adicionados 10 mL de RPMI livre de soro e as células

foram centrifugadas a 300g durante 7 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi

descartado e as células ressuspendidas em 5 mL de tampão de lise de eritrócitos

(155 mM NH4Cl; 10 mM KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,4).

Após 5 minutos de incubação, foram adicionados 25 mL de RPMI e as

células foram centrifugadas a 300g durante 7 minutos a 4ºC. O sedimento foi

ressuspendido em 5 mL de RPMI e as células foram contadas em câmara de

Neubauer.

3.7- Ensaio de Proliferação de Linfócitos Totais

Ao volume de células ressuspendido em RPMI com 10% FBS aquecido a

37°C, foi adicionado volume suficiente do mesmo meio para deixar 2x105 células a

cada 100μL. Após isso foi adicionado CFSE suficiente para a concentração final

de 2,5μM. As células foram homogeneizadas vigorosamente e incubadas à

temperatura ambiente por 10 minutos, protegidas da luz, com homogeneizações

subsequentes a cada 2 minutos. As células foram centrifugadas e lavadas com

RPMI. A eficiência da marcação foi confirmada no dia por citometria de fluxo em

um citômetro BD FACS Canto (Lyons et al., 2001; Quah e Parish, 2010)

Foram incubadas 100 μL (2 x 105 células marcadas com CFSE) por poço

em placas de 96 poços. A essas adicionou-se 100 μL de soluções RPMI com 10%

FBS com diferentes estímulos: Concanavalina A (controle positivo de proliferação

de linfócito T) nas concentrações de 2,5; 5,0 e 10 μg/mL, LPS (controle positivo

19

para proliferação de linfócito B) nas concentrações de 1,0; 10 e 100 μg/mL, LDL

eletronegativa, peptídeo 1 e 2 nas concentrações de 10,0; 20,0 e 60,0 μg/mL

As placas foram incubadas por 5 dias em estufa à 37ºC com 5% CO2. Após

isso as células foram centrifugadas 300g durante 7 minutos a 4ºC e

ressuspendidas em 100 μL de PBS para análise por citometria de fluxo.

3.8 – Análise da Proliferação Celular Utilizando Software FlowJo

Para a análise da proliferação dos linfócitos utilizou-se o software de

citometria FlowJo para tratamentos dos dados adquiridos pelo equipamento de

citometria BD FACS Canto. Em cada amostra utilizou-se inicialmente os canais

FSC-H e FSC-A. Esses dois parâmetros tem uma relação diretamente

proporcional e unitária para as células que passam sozinhas pelo detector. Então

criou-se um gate para selecionar as células cuja relação FSC-H/FSC-A fosse

aproximadamente unitária, e estas foram consideradas como singlets.

Após isso, utilizando o gate dos singlets, mudaram-se os canais para SSC-

A relacionado à granulosidade das células, e FSC-A se relaciona ao tamanho.

Como os linfócitos são agranulares e tem um tamanho relativamente grande entre

as células não aderentes, eles formam uma banda que se destaca da população

total. Então foi criado um gate para selecionar apenas as células consideradas

linfócitos.

Por fim a população de linfócitos tem a sua proliferação calculada através

do decaimento da mediana da fluorescência, baseada na fluorescência das

células marcadas com CSFE sem estímulo. As células que não se proliferam têm

a mesma intensidade de fluorescência que o controle marcado, e são a geração

zero. As outras gerações são formadas em razão de meio da mediana da

fluorescência inicial, e a porcentagem de linfócitos em cada geração é calculada

pelo programa (Roederer, 2011).

20

3.9– Obtenção de Sangue Periférico Humano.

Indivíduos voluntários adultos recrutados na Universidade de São Paulo foram

convidados para participar do estudo através da coleta de sangue. Foram

considerados saudáveis após a análise da sua resposta a um questionário escrito

sobre seu estado geral de saúde. Por meio da coleta de sangue a vácuo,

utilizando escalpes para coleta múltipla, coletou-se até 50 mL de sangue, através

de uma veia cubital, seguindo as recomendações da Sociedade Brasileira de

Patologia Clínica /Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso (2010).

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas, Número CAAE 23181114.3.0000.0067.

3.10- Obtenção e Diferenciação de Monócitos a partir do Sangue Periférico

Humano

Em fluxo laminar adicionou-se 15 mL do meio Lymphocyte Separate

Medium a dois tubos Leucosep vazios por voluntário, os quais foram centrifugados

à 100 rpm por 20 segundos. O sangue foi dispensado igualmente entre os dois

tubos Leucosep e o volume foi completado para 50 mL com PBS- EDTA 0,5M. O

material foi centrifugado a 800g, por 15 minutos, à temperatura ambiente e em

desaceleração lenta. Após isso o plasma foi descartado e retirou-se a camada de

leucócitos, ao qual foi adicionada a um tubo cônico de 50 mL. O volume foi

preenchido para 50 mL com PBS-EDTA 0,5M e o tubo foi centrífugado a 500g por

5min a temperatura ambiente. O sobrenadante foi aspirado cuidadosamente e o

precipitado foi ressuspendido em PBS-EDTA 0,5M. Foi realizado por mais duas

vezes a etapa de lavagem com PBS- EDTA e a centrifugação.

Após essa etapa, o precipitado foi ressuspendido em 2 mL de PBS e

adicionou-se 25μL de CD14 Dynabeads®, previamente lavadas em PBS conforme

o manual. Foram adicionados 8 mL de PBS ao tubo e centrifugou-se a 300g, 8

minutos, 4°C. O sobrenadante foi descartado para retirar as beads que não se

Iigaram. O precipitado foi ressuspendido novamente em 8mL e repetiu-se a

centrifugação. O pellet foi ressuspendido em 2ml de PBS e a partir desse ponto

21

seguiu-se integralmente o protocolo das Dynabeads® CD14 (Life Technologies

Catalog number: 11149D) para seleção positiva das células CD14+ (monócitos).

Após a obtenção das células CD14+, 10 µL da amostra foram diluídos em

90µL em azul de Tripan a 0,1% para prosseguir a contagem de células em câmara

de Neubauer. Feita a contagem, foram ressuspendidas em meio Macrophage-

SFM (Life Technologies Catalog number: 12065-074) contendo 50ng/mL de M-

CSF humano recombinante (Preprotech Catalog Number: 300-25) em analogia ao

tratamento dos macrófagos murinos e foram plaqueadas diretamente em placas

de seis poços, colocando 8x105 células por poço. Estas placas foram incubadas

em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 4 dias. Após o 4º dia as células diferenciaram-

se em macrófagos maduros, o que foi confirmado pela mudança morfológica. As

células foram posteriormente cultivadas em meio RPMI com 10% FBS até o

momento do seu tratamento.

3.11- Tratamentos com Peptídeos Miméticos e Análise da Expressão Gênica.

O meio foi trocado após o 4º dia, e as células foram então cultivadas em RPMI

com 10% FBS. Após isso seguiu-se o passo 3.2, mudando apenas os estímulos,

que agora são peptídeos P1 ou P2, nas concentrações de 100 e 50µg/mL, LDL(-)

na concentração de 50µg/mL para controle positivo, e PBS. Posteriormente, as

etapas 3.3, 3.4 e 3.5 foram seguidas integralmente.

3.12- Obtenção de Linfócitos a partir do Sangue Periférico Humano

Após a obtenção do sangue periférico humano, como descrito em 3.10,

seguiu-se o protocolo da solução Histopaque®-1077 (Sigma Aldrich) que é uma

solução com densidade ajustada para 1.077 g/mL, que facilita a separação das

células mononucleadas do sangue total.

22

Genes Primer Forward Primer Reverse

CICLOFILINA ATGGTCAACCCCACCGTGT TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC

CCL2 CCCCAGTCACCTGCTGTTAT CCCCAGTCACCTGCTGTTAT

GAPDH GAGTCAACGGATTTGGTCGT GAGTCAACGGATTTGGTCGT

IL10 TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA

IL6 TGTTGCCTGCTGCCTTCCCT TGTTGCCTGCTGCCTTCCCT

IL8 TGTGTGAAGGTGCAGTTTTG ATTTCTGTGTTGGCGCAGT

S18 GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG

Tabela 2. Genes humanos avaliados por PCR-Real Time e as sequências de nucleotídeos dos primers utilizados para

detecção da expressão gênica.

3.13- Ensaio de Proliferação de Linfócitos

Após a obtenção das células mononucleadas do sangue periférico, estas

seguiram as etapas descritas em 3.8. A única alteração foi que no lugar da

concanavalina A para controle positivo de proliferação de linfócito T utilizou-se o

anticorpo anti CD3 humano nas concentrações de 5,0; 7,5 e 10 μg/mL. Por fim, a

proliferação foi analisada como descrito em 3.8.

3.14- Análise Estatística

Os dados foram analisados utilizando-se GraphPad InStat software. Foi

utilizado o teste estatístico One-way Anova para observar a variação entre grupos

de tratamento, seguido do pós-teste de Tukey, um teste multivariado que mostra

se há ou não diferença entre as médias dos grupos de tratamento, dentro de um

intervalo de confiança, utilizando um nível de significância de 0.05.

23

4. RESULTADOS

4.1 – Efeito dos peptídeos miméticos da apo B100 da LDL(-) sobre a

expressão gênica de marcadores inflamatórios em macrófagos murinos

Primeiramente foi feita a comparação da expressão dos genes avaliados

nos macrófagos murinos diferenciados com o meio condicionado de células L929

e com o meio contendo o M-CSF recombinante após 3h de tratamento. A

utilização de M-CSF recombinante mostrou um padrão de expressão gênica mais

responsivo e dose resposta-dependente, conforme pode ser visto nos resultados a

seguir.

A)

Cd40 (L929)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Cd40 (rM-CSF)

LPS 10

LDL(-) 1

2

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

3050

100

150

200

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 1: Expressão gênica relativa do Cd40 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de L929, em

B o meio com M-CSF recombinante.

A)

Ccl2 (L929)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

10

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Ccl2 (rM-CSF)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

30

100

200

300

400

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 2: Expressão gênica relativa do Ccl2 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células

L929, em B o meio com M-CSF recombinante.

24

A)

Cox2 (L929)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

50

100

150

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Cox2 (rM-CSF)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

1

2

3

4

20

40

60

80

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 3: Expressão gênica relativa do Cox2 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células

L929, em B o meio com M-CSF recombinante.

A)

Il1b (L929)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

30

40

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Il1b (rM-CSF)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

20

40

60

100

200

300

400

500

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 4: Expressão gênica relativa do Il1b em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células

L929, em B o meio com M-CSF recombinante. Em A não houve replicata do experimento, por isso as barras não

apresentam o desvio padrão.

A)

Il6 (L929)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

100

200

300

400

500

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Il6 (rMCSF)

LPS 10

LDL 12

LDL 25

LDL 50

LDL 100

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

10

500

1000

1500

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 5: Expressão gênica relativa do Il6 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células

L929, em B o meio com M-CSF recombinante.

25

A)

Il10 (L929)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

1

2

3

4

5

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Il10 (rM-CSF)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

5

10

15

20

25

50

100

150

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 6: Expressão gênica relativa de Il10 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células

L929, em B o meio com M-CSF recombinante.

A)

Tnfa (L929)

LPS 10

LDL(-) 12,5

LDL(-) 25

LDL(-) 50

LDL(-) 100

P1 12,5P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5P2 25

P2 50

P2 1000

2

4

6

8

Tratamento ug/mL

Expr

essã

o G

ênic

a R

elat

iva

B)

Tnfa (rMCSF)

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

10

50

100

150

Tratamento ug/mL

Expr

essã

o G

ênic

a R

elat

iva

Figura 7: Expressão gênica relativa de Tnfa em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células

L929, em B o meio com M-CSF recombinante.

Com os dados obtidos percebe-se claramente que o meio contendo M-CSF

recombinante é mais adequando ao estudo da expressão gênica, pois como dito

anteriormente, apresenta uma resposta linear às diferentes concentrações

testadas, além de o controle positivo LPS ter a maior resposta, como esperado. O

meio com M-CSF também mostrou uma diferença da transcrição gênica relativa

entre os estímulos no curto período de tratamento. Os resultados obtidos em 3 e

14 hs estão exibidos a seguir, em gráficos com mesma escala para facilitar a

comparação.

26

A)

Cd40 (rM-CSF) 3h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

5

10

15

20

25

100

200

300

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Cd40 (rM-CSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

3050

100

150

200

250

300

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 8: Expressão gênica relativa de Cd40 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h(B).

A)

Ccl2 (rM-CSF) 3h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

30

100

200

300

400

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Ccl2 (rM-CSF) 14h

LPS 10

LDL 12

LDL 25

LDL 50

LDL 100

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

30

100

200

300

400

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 9: Expressão gênica relativa de Ccl2 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h (B).

A)

Cox2 (r-MCSF) 3h

LPS 10

LDL 12,5

LDL 25

LDL 50

LDL 100

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

10

50

100

150

200

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Cox2 (r-MCSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 25

LDL(-) 50

LDL(-) 100

P1 12P1 25

P1 50

P1 100P2 12

P2 25P2 50

P2 1000

5

10

15

50

100

150

200

Tratamento ug/mL

Expr

essã

o R

elat

iva

Figura 10: Expressão gênica relativa de Cox2 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h (B).

27

A)

Il1a (r-MCSF) 3h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

30

40

50

200

400

600

800

1000

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Il1a (r-MCSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

20

40

60

200

400

600

800

1000

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 11: Expressão gênica relativa de Il1a em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h (B).

A)

Il1b (r-MCSF) 3h

LPS 10

LDL 12,5

LDL 25

LDL 50

LDL 100

P1 12,5

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12,5

P2 25

P2 50

P2 100

0

50

100

150

200200

400

600

800

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Il1b (r-MCSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

50

100

150

200

400

600

800

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 12: Expressão gênica relativa de Il1b em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h (B).

A)

Il6 (r-MCSF) 3h

LPS

LDL(-)

12

LDL(-)

25

LDL(-)

50

LDL(-)

100

P1 12

P1 25

P1 50

P1 10

0

P2 12

P2 25

P2 50

P2 10

0

0

100

200

300

400

2000

4000

6000

Tratamento ug/mL

Exp

ressão

Gên

ica R

ela

tiva

B)

Il6 (r-MCSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

100

200

300

400

2000

4000

6000

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 13: Expressão gênica relativa de Il6 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h (B).

28

A)

Il10 (rM-CSF) 3h

LPS 10

LDL(-) 1

2,5

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

5

10

15

20

25

50

100

150

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Il10 (rM-CSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

10

20

30

40

50

100

150

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 14: Expressão gênica relativa de Il10 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h (B).

A)

Tnfa (rMCSF) 3h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

10

50

100

150

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

B)

Tnfa (rMCSF) 14h

LPS

LDL(-)12

LDL(-) 2

5

LDL(-) 5

0

LDL(-) 1

00

P1 12

P1 25

P1 50

P1 100

P2 12

P2 25

P2 50

P2 100

0

2

4

6

8

10

50

100

150

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 15: Expressão gênica relativa de Tnfa em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h

(A) ou 14 h(B).

Observa-se que a expressão gênica relativa decai com o tempo para a

maioria dos estímulos, especialmente para a LDL eletronegativa. Baseado nestes

dados se escolheu o tempo de 3h para o tratamento dos macrófagos humanos.

Os dados obtidos também mostram que os peptídeos tem um efeito pouco

pronunciado sobre a expressão gênica quando comparados com a LDL(-). Os

peptídeos induziram aumento da expressão em no máximo 10x o basal para a

grande maioria dos genes, enquanto a LDL(-) chega a patamares muito maiores.

Isto demonstra que apesar dos peptídeos, em especial o P2, mimetizarem a ação

29

pró-inflamatória da LDL (-), outros componentes da partícula dessa lipoproteína

atuam sinergicamente para ampliar o efeito.

Infelizmente não foi realizada uma amostragem suficiente para permitir a

análise através do teste estatístico ANOVA, então os dados mostram a tendência,

mas não conseguem demonstrar a diferença estatística.

4.2 – Efeito dos peptídeos mimotopos sobre a proliferação de linfócitos

murinos.

A avaliação da proliferação foi feita conforme descrita anteriormente

(Roederer, 2011). Dentre os vários índices para calcular a proliferação descritos,

escolheu-se o ‘’fraction diluted’’, que se relaciona com a fração de células que se

dividem na cultura pelo menos uma vez sobre as células totais, e fornece uma

ideia geral sobre a proliferação da população celular.

Proliferação de Linfócitos

Basal

ConA 2,5 ug

ConA 5 ug

ConA 10 ugLPS 1

LPS 10

LPS 100

LDL(-) 10

LDL(-) 20

LDL(-) 60P1 10

P1 20P1 60

P2 10P2 20

P2 600

20

40

60

80

100

*** ***

***

***

Tratamento ug/mL

% d

e cé

lula

s qu

e pr

olife

rara

m

Figura 16: Ensaio de proliferação de linfócitos murinos totais: porcentagem de células que proliferaram com os diferentes

tratamentos. *** p <0,0001 comparado ao basal. Teste ANOVA, pós teste Tuckey.

Os dados mostram que tanto os peptídeos miméticos como a LDL(-) não

induzem a proliferação de linfócitos murinos. Nem mesmo LPS em concentrações

mais baixas funciona como um controle positivo adequado nesse ensaio.

30

4.3 – Efeito dos peptídeos miméticos da LDL(-) sobre a expressão gênica de

citocinas em macrófagos humanos

Avaliou-se o efeito dos peptídeos P1 e P2 e da LDL(-) sobre os macrófagos

obtidos a partir das células mononucleares isoladas do sangue periférico de

doadores saudáveis.

Considerando-se os resultados obtidos com os macrófagos murinos,

escolheu-se o tempo de 3h para o tratamento dos macrófagos humanos porque foi

o que apresentou maior variação da transcrição gênica induzida pelos peptídeos

em relação à LDL(-). Devido à menor quantidade de células obtidas dessa matriz

foram avaliadas apenas as concentrações de peptídeos mais relevantes e a

concentração de 50 μg/mL de LDL(-), substituindo o controle positivo de LPS.

Ccl2 (rM-CSF) 3h

LDL(-) 5

0

P1 100

P1 50

P2 100

P2 50

0

1

2

3

4

Tratamento ug/mL

Exp

ressão

Gên

ica R

ela

tiva

Il8 (rM-CSF) 3h

LDL(-) 5

0

P1 100

P1 50

P2 100

P2 50

0

1

2

3

4

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Il6 (rM-CSF) 3h

LDL(-) 5

0

P1 100

P1 50

P2 100

P2 50

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Il10 (rM-CSF) 3h

LDL(-) 5

0

P1 100

P1 50

P2 100

P2 50

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tratamento ug/mL

Exp

ress

ão G

ênic

a R

elat

iva

Figura 17: Expressão gênica relativa de CCL2 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.

Figura 20: Expressão gênica relativa de IL10 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.

Figura 19: Expressão gênica relativa de IL6 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.

Figura 18: Expressão gênica relativa de IL8 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.

31

Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre os

grupos para nenhum dos genes avaliados, indicando um fraco efeito pró-

inflamatório nos macrófagos humanos, tanto da lipoproteína como dos peptídeos.

4.4 – Efeito dos peptídeos mimotopos sobre a proliferação de linfócitos

humanos.

O ensaio de proliferação de linfócitos humanos mostrou-se bastante

parecido com o ensaio de proliferação murino, exceto que novamente o LPS não

se mostrou um bom controle positivo, mesmo em uma concentração mais alta.

Assim como ocorreu nos linfócitos murinos, não se observou efeito dos

peptídeos ou da LDL(-) sobre a proliferação de linfócitos humanos nas

concentrações utilizadas.

Proliferação de Linfócitos

Basal

AntiCD3 5ug

AntiCD3 7,5ug

AntiCD3 10ug

LPS 1

LPS 10

LPS 100

LDL(-) 10

LDL(-) 20

LDL(-) 60P1 10

P1 20P1 60

P2 10P2 20

P2 600.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 *** ***

***

***

Tratamento ug/mL

% d

e cé

lulas

que

pro

lifera

ram

Figura 21: Ensaio de proliferação de linfócitos humanos totais: porcentagem de células que proliferaram com os diferentes

tratamentos. *** p <0,0001. Teste ANOVA, pós teste Tuckey.

5. DISCUSSÃO

Os peptídeos miméticosotopos da LDL(-) são uma promissora ferramenta

pois são epítopos peptídicos que representam uma região antigênica da apo B100

da LDL(-) . Os microdominíos que os peptídeos mimetizam pode ser formados

pelas modificações sofridas por esta partícula, tais como, glicosilação, proteólise,

oxidação, dentre outras, ou seja, sítios já existentes na apo B100 que assumam

uma conformação diferente após a partícula de LDL sofrer estas modificações,

não sendo expostos na LDL nativa. Esses microdomínios (determinantes

32

antigênicos) podem permitir a orientação precisa da resposta imune, o que

poderia ter aplicações terapêutica ou preventiva na aterosclerose.

Os dados da literatura são claros quanto ao poder inflamatório da LDL(-),

mas o foco deste trabalho foi descobrir o potencial dos peptídeos mimotopos

como miméticos da ação da LDL(-) em macrófagos e em linfócitos. Conforme foi

observado nos ensaios de expressâo gênica em macrófagos murinos, o melhor

meio de diferenciação foi o meio contendo apenas o fator estimulador de colônias

de macrófagos recombinante no lugar do meio condicionado das células L929. Os

fibroblastos da linhagem L929 além do M-CSF também secretam outros fatores,

como o GM-CSF (Englen et al., 1995). As linhagens de macrófagos obtidas com

GM-CSF e o M-CSF diferem no seu perfil de produção de citocinas e atividades de

fatores de transcrição (Fleetwood et al., 2007; Lacey et al., 2012; Jaguin et al.,

2013), polarizando os macrófagos preferencialmente para M1 e M2,

respecitvamente. Com isso percebe-se que o meio condicionado de células L929

gera uma população heterogênea, cuja resposta a estímulos é difícil de se

interpretar. Além disso, o meio condicionado de células L929, por ser obtido do

sobrenadante de uma cultura celular apresenta maior variabilidade quanto à

concentração destes fatores de crescimento, além de outras possíveis moléculas

que possam interferir na diferenciação. Devido a isso escolheu-se o M-CSFr como

fator de diferenciação, além do fato do M-CSF polarizar os macrófagos

principalmente para M0 e M2a (Gleissner, 2012). A população M0 é menos

especializada, o que é muito interessante para mostrar o efeito dos peptídeos

sobre macrófagos que já não estão predispostos a um padrão de resposta.

Os resultados obtidos com os macrófagos murinos indicam que os

peptídeos são muito menos pró-inflamatórios que a LDL(-), baseado nos genes

escolhidos Cd40, Ccl2, Cox2, Il1a, Il1b, Il6, Il10 e Tnfa. O gene Cd40 codifica uma

molécula co-estimulatória importante para a imunidade inata e adaptativa (Tedgui

e Mallat, 2006; Andersson et al., 2010). A baixa expressão desse gene mostra que

o P1 não estimularia os macrófagos para a apresentação de antígenos aos

linfócitos T, mas que o P2 em concentrações mais elevadas (100 ug/mL) tem este

33

potencial embora seja sendo menos imunogênico que a partícula de LDL(-) A

mesma tendência se observa para o gene Ccl2, que é de uma proteína

quimiotática para monócitos, mostrando-se que o P1 não tem efeito indutor mas

que o P2 tem menor potencial de recrutamento de células imunes comparado à

partícula de LDL(-). Os genes Il1a, Il1b, Il6 e Tnfa codificam potentes citocinas

promotoras da inflamação (Tedgui e Mallat, 2006; Andersson et al., 2010). Embora

haja uma discrepância entre a intensidade de indução da expressão destes genes

pela LDL(-) e os peptídeos, o P2 em concentração mais elevada mostra potencial

indutor para IL1a e Il1b. Por fim, nem os peptídeos nem a LDL(-) mostraram

grande potencial na expressão da citocina anti-inflamatória IL-10.

Posteriormente para o grupo será importante analisar também a expressão

gênica de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-13 e analisar a expressão proteica

induzida pelos peptídeos. A expressão proteica tem maior relevância biológica,

pois diversos mecanismos podem atenuar a quantidade de RNA mensageiros

produzidos durante a expressão gênica.

Os dados relativos à expressão gênica em macrófagos humanos mostram

claramente que o tempo de tratamento foi muito curto para se observar o efeito

dos peptídeos, uma vez que nem o controle positivo de LDL(-) mostrou

significativa alteração em relação à condição basal. Para se investigar o efeito

desses peptídeos em células humanas deverá ser utilizado um tempo de

tratamento mais longo.

O ensaio de proliferação de linfócitos murinos mostrou que a LDL(-) não

induz proliferação nos linfócitos totais, não tendo havido diferença estatística em

relação ao controle. Apesar de ter domínios que poderiam atuar como padrões

moleculares associados ao perigo, a LDL(-) não induziu a proliferação de linfócitos

in vitro, o que não exclui outros efeitos imunogênicos in vivo. Os resultados da

expressão gênica mostraram que a LDL(-) induziu a expressão de CD40, embora

mas não tenha ocorrido proliferação no ensaio. A literatura confirma que peptídeos

da ApoB100 não induzem a proliferação in vivo de linfócitos esplênicos em

34

camundongos não imunizados, possivelmente devido ao baixo número de

linfócitos auto reativos (Hermansson et al., 2010).

Deverá ser melhor investigado se alguma subpopulação específica de

linfócitos seria responsiva aos peptídeos uma vez que não foi utilizado um

marcador específico para os diferentes tipos de linfócitos. Algumas das

populações específicas de linfócitos T CD4+ ou CD8+, assim como as de linfócitos

B (CD19+), podem ter tido uma proliferação que não foi percebida por estar

mascarada pela população total o que seria relevante considerando-se que cada

população tem um papel importante na aterosclerose. Portanto, será importante

para o grupo mapear posteriormente as subpopulações de linfócitos e ver como os

peptídeos interagem com essas subpopulações, e qual o perfil de resposta que os

peptídeos induzem para uma melhor compreensão da ação desses mimotopos.

Outros estudos já mostraram a importância do baço como órgão ateroprotetor. As

subpopulações de linfócitos B esplênicas contendo os receptores de células B

com região variável de cadeia pesada Vh5 e Vh7, reativos à fostatidilcolina,

proliferam quando estimulados com lipídeos oxidados, contidos em células

apoptóticas ou LDL oxidada. Estes lipídeos oxidados induzem a ativação do

inflamassoma NALP3, e ativação da caspase-1, e a produção de anticorpos

ateroprotetores.(Grasset et al., 2015)

Os resultados da proliferação de linfócitos humanos foram semelhantes ao

que ocorreu com os linfócitos murinos, não se observando efeitos da LDL(-) e dos

peptídeos miméticos. As mesmas considerações podem ser feitas sobre o que foi

comentado para os linfócitos murinos, mas se deve levar em conta as diferenças

da matriz, já que enquanto o baço contém uma grande quantidade de linfócitos B

maduros, chegando a 55% da população de células do baço murino, sem contar

as hemáceas (Pellegrini et al., 2007), enquanto a porcentagem de linfócitos B no

sangue periférico humano é baixa, sendo até 7% dos leucócitos, enquanto os

linfócitos T representam de 7% a 24% (StemCellTechnologie, 2014). Isso explica

porque o LPS que era o controle positivo dos linfócitos B não se mostrou efetivo

em um ensaio que não diferencia os subtipos de linfócitos.

35

Referente ao possível uso dos peptídeos como antígenos em vacinas para

aterosclerose muito ainda precisa ser estudado. Os peptídeos precisam

demonstrar capacidade de estimular mecanismos ateroprotetores como estimular

resposta imune Th2, linfócitos Treg, secreção de IgM e polarização para

macrófagos M2, além de diminuir a progressão da placa aterosclerótica em

modelos murinos e em outras espécies. Trabalhos recentes mostraram que

imunização com peptídeos da ApoB100 restritos ao complexo MHC II têm efeito

ateroprotetor pois aumenta o nível de mRNA codificante para IL-10 (Tse et al.,

2013), induz aumentos significantes de IL-10 nos leucócitos peritoneais, e

expande a população peritoneal de linfócitos regulatórios FoxP3+ e mais que

triplica os linfócitos regulatórios CCR5+FoxP3+ (Kimura et al., 2017), e aumenta

os níveis de IgG (Tse et al., 2013; Gisterå et al., 2017), além de diminuírem o

tamanho da lesão aterosclerótica.

Por fim, além de possíveis antígenos, os peptídeos miméticos continuam

ferramentas promissoras para o estudo da aterosclerose. Outros estudos do grupo

estão investigando o potencial desses peptídeos como radiofármacos para

diagnóstico por imagem, e como antígenos sintéticos nos imunoensaios para

detecção de LDL modificada, eliminando a necessidade do isolamento contínuo

dessa lipoproteína a partir da plasmo humano.

6. CONCLUSÃO

Conclui-se que os peptídeos apresentam diferentes perfis de indução de

citocinas pró-inflamatórias, sendo que o P2 tem maior potencial como um peptídeo

mimético da LDL(-) em macrófagos, enquanto o P1 não apresenta atividade pró-

inflamatória. Diversas aplicações podem ser propostas para esses peptídeos, mas

seus efeitos sobre as células do sistema imune precisam ser melhor elucidados.

Espera-se que no futuro eles possam ajudar a combater essa grande causa de

mortalidade e morbidade que é a aterosclerose, mas até lá há um longo caminho a

ser trilhado.

36

7. BIBLIOGRAFIA

ADAMSON, S.; LEITINGER, N. Phenotypic modulation of macrophages in response to plaque lipids. Current opinion in lipidology, v. 22, n. 5, p. 335-342, 2011. ANDERSSON, J.; LIBBY, P.; HANSSON, G. K. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clinical Immunology, v. 134, n. 1, p. 33-46, 2010. BAE, Y. S. et al. Macrophages generate reactive oxygen species in response to minimally oxidized LDL: TLR4- and Syk-dependent activation of Nox2. Circulation research, v. 104, n. 2, p. 210-218, 2009. BENÍTEZ, S. et al. Wide proinflammatory effect of electronegative low-density lipoprotein on human endothelial cells assayed by a protein array. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, v. 1761, n. 9, p. 1014-1021, 2006. BENÍTEZ, S. et al. Effect of simvastatin in familial hypercholesterolemia on the affinity of electronegative low-density lipoprotein subfractions to the low-density lipoprotein receptor. The American Journal of Cardiology, v. 93, n. 4, p. 414-420, 2004. BENıTEZ, S. et al. Changes in low-density lipoprotein electronegativity and oxidizability after aerobic exercise are related to the increase in associated non-esterified fatty acids. Atherosclerosis, v. 160, n. 1, p. 223-232, 2002. BERLINER, J. A. et al. Atherosclerosis: Basic Mechanisms. Oxidation, Inflammation, and Genetics, v. 91, n. 9, p. 2488-2496, 1995. BERNEIS, K. K. Metabolic origins and clinical significance of LDL heterogeneity. The Journal of Lipid Research, v. 43, n. 9, p. 1363-1379, 2002. BINDER, C. J. Natural IgM Antibodies Against Oxidation-Specific Epitopes. Journal of Clinical Immunology, v. 30, n. 1, p. 56-60, 2010. BOBRYSHEV, Y. V. et al. Macrophages and Their Role in Atherosclerosis: Pathophysiology and Transcriptome Analysis. BioMed Research International, v. 2016, p. 9582430, 2016. BORÉN, J. et al. Identification of the principal proteoglycan-binding site in LDL. A single-point mutation in apo-B100 severely affects proteoglycan interaction without affecting LDL receptor binding. J Clin Invest, v. 101, n. 12, p. 2658-64, 1998.

37

BRAUNWALD, E. Myocardial oxygen consumption: the quest for its determinants and some clinical fallout. Journal of the American College of Cardiology, v. 34, n. 5, p. 1365-1368, 1999. BROWN, B. E. et al. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal, v. 274, n. 6, p. 1530-1541, 2007. CAZZOLATO, G.; AVOGARO, P.; BITTOLO-BON, G. Characterization of a more electronegatively charged LDL subfraction by ion exchange HPLC. Free Radical Biology and Medicine, v. 11, n. 3, p. 247-253, 1991. CHANG, Y. H.; ABDALLA, D. S. P.; SEVANIAN, A. Characterization of Cholesterol Oxidation Products Formed by Oxidative Modification of Low Density Lipoprotein. Free Radical Biology and Medicine, v. 23, n. 2, p. 202-214, 1997. CHÁVEZ-SÁNCHEZ, L. et al. The activation of CD14, TLR4, and TLR2 by mmLDL induces IL-1β, IL-6, and IL-10 secretion in human monocytes and macrophages. Lipids in Health and Disease, v. 9, p. 117-117, 2010. CHEN, C.-H. et al. Low-Density Lipoprotein in Hypercholesterolemic Human Plasma Induces Vascular Endothelial Cell Apoptosis by Inhibiting Fibroblast Growth Factor 2 Transcription. Circulation, v. 107, n. 16, p. 2102-2108, 2003. DAMASCENO, N. R. T. et al. Detection of electronegative low density lipoprotein (LDL−) in plasma and atherosclerotic lesions by monoclonal antibody-based immunoassays. Clinical Biochemistry, v. 39, n. 1, p. 28-38, 2006. DE CASTELLARNAU, C. et al. Atherogenic and inflammatory profile of human arterial endothelial cells (HUAEC) in response to LDL subfractions. Clinica Chimica Acta, v. 376, n. 1–2, p. 233-236, 2007. DEROO, S.; MULLER, C. P. Antigenic and Immunogenic Phage Displayed Mimotopes as Substitute Antigens Applications and Limitations. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, v. 4, n. 1, p. 75-110, 2001. DUEWELL, P. et al. NLRP3 inflamasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals that form early in disease. Nature, v. 464, n. 7293, p. 1357-1361, 2010. ENGLEN, M. D. et al. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods, v. 184, n. 2, p. 281-283, 1995.

38

ESTRUCH, M. et al. CD14 and TLR4 mediate cytokine release promoted by electronegative LDL in monocytes. Atherosclerosis, v. 229, n. 2, p. 356-362, 2013. FAULIN, T. D. E. S. et al. Development of immunoassays for anti-electronegative LDL autoantibodies and immune complexes. Clinica Chimica Acta, v. 413, n. 1–2, p. 291-297, 2012. FINN, A. V. et al. Concept of Vulnerable/Unstable Plaque. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, v. 30, n. 7, p. 1282-1292, 2010. FLEETWOOD, A. J. et al. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (CSF) and Macrophage CSF-Dependent Macrophage Phenotypes Display Differences in Cytokine Profiles and Transcription Factor Activities: Implications for CSF Blockade in Inflammation. The Journal of Immunology, v. 178, n. 8, p. 5245-5252, 2007. GALLARDO-SOLER, A. et al. Arginase I Induction by Modified Lipoproteins in Macrophages: A Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ/δ-Mediated Effect that Links Lipid Metabolism and Immunity. Molecular Endocrinology, v. 22, n. 6, p. 1394-1402, 2008. GEORGE, J. et al. Immunolocalization of β2-Glycoprotein I (Apolipoprotein H) to Human Atherosclerotic Plaques. Potential Implications for Lesion Progression, v. 99, n. 17, p. 2227-2230, 1999. GIMBRONE, M. A. et al. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesisa. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 902, n. 1, p. 230-240, 2000. GISTERÅ, A. et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine, 2017. GLEISSNER, C. A. Macrophage Phenotype Modulation by CXCL4 in Atherosclerosis. Frontiers in Physiology, v. 3, p. 1, 2012. GRASSET, E. K. et al. Sterile inflammation in the spleen during atherosclerosis provides oxidation-specific epitopes that induce a protective B-cell response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 112, n. 16, p. E2030-E2038, 2015. GRECO, G. et al. Generation in Human Plasma of Misfolded, Aggregation-Prone Electronegative Low Density Lipoprotein. Biophysical Journal, v. 97, n. 2, p. 628-635, 2009.

39

HALVORSEN, B. et al. Atherosclerotic plaque stability--what determines the fate of a plaque? Prog Cardiovasc Dis, v. 51, n. 3, p. 183-94, 2008. HEDRICK, C. C. Lymphocytes in Atherosclerosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, v. 35, n. 2, p. 253-257, 2015. HERMANSSON, A. et al. Inhibition of T cell response to native low-density lipoprotein reduces atherosclerosis. The Journal of Experimental Medicine, v. 207, n. 5, p. 1081-1093, 2010. HEVONOJA, T. et al. Structure of low density lipoprotein (LDL) particles: Basis for understanding molecular changes in modified LDL. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, v. 1488, n. 3, p. 189-210, 2000. IVANOVA, E. A.; BOBRYSHEV, Y. V.; OREKHOV, A. N. LDL electronegativity index: a potential novel index for predicting cardiovascular disease. Vascular Health and Risk Management, v. 11, p. 525-532, 2015. JAGUIN, M. et al. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology, v. 281, n. 1, p. 51-61, 2013. JUN-JUN, W. et al. Correlation between susceptibility of LDL subfractions to in vitro oxidation and in vivo oxidized LDL. Clinical Biochemistry, v. 33, n. 1, p. 71-73, 2000. KADL, A. et al. Identification of a novel macrophage phenotype that develops in response to atherogenic phospholipids via Nrf2. Circulation research, v. 107, n. 6, p. 737-746, 2010. KETELHUTH, D. F. J.; HANSSON, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circulation Research, v. 118, n. 4, p. 668-678, 2016. KHALLOU-LASCHET, J. et al. Macrophage Plasticity in Experimental Atherosclerosis. PLoS ONE, San Francisco, USA, v. 5, n. 1, p. e8852, 2010. KIMURA, T. et al. Atheroprotective vaccination with MHC-II-restricted ApoB peptides induces peritoneal IL-10-producing CD4 T cells. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology, 2017. KIMURA, T. et al. Vaccination to Modulate Atherosclerosis. Autoimmunity, v. 48, n. 3, p. 152-160, 2015.

40

KOVANEN, P. T.; PENTIKÄINEN, M. O. Circulating lipoproteins as proinflammatory and anti-inflammatory particles in atherogenesis. Current Opinion in Lipidology, v. 14, n. 5, p. 411-419, 2003. KRUTH, H. S. et al. Macrophage foam cell formation with native low density lipoprotein. J Biol Chem, v. 277, n. 37, p. 34573-80, 2002. LACEY, D. C. et al. Defining GM-CSF– and Macrophage-CSF–Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. The Journal of Immunology, v. 188, n. 11, p. 5752-5765, 2012. LE BORGNE, M.; CALIGIURI, G.; NICOLETTI, A. Once Upon a Time: The Adaptive Immune Response in Atherosclerosis—a Fairy Tale No More. Molecular Medicine, v. 21, n. Suppl 1, p. S13-S18, 2015. LEON, M. L. A.; ZUCKERMAN, S. H. Gamma interferon: a central mediator in atherosclerosis. Inflammation Research, v. 54, n. 10, p. 395-411, 2005. LIBBY, P.; RIDKER, P. M.; HANSSON, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature, v. 473, n. 7347, p. 317-25, 2011. LICHTMAN, A. H. Adaptive Immunity and Atherosclerosis: Mouse Tales in the AJP. The American Journal of Pathology, v. 182, n. 1, p. 5-9, 2013. LIVAK, K. J.; SCHMITTGEN, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods, v. 25, n. 4, p. 402-408, 2001. LOBO, J. et al. Electronegative LDL and Lipid Abnormalities in Patients Undergoing Hemodialysis and Peritoneal Dialysis. Nephron Clinical Practice, v. 108, n. 4, p. c298-c304, 2008. LU, J. et al. Mediation of Electronegative Low-Density Lipoprotein Signaling by LOX-1. A Possible Mechanism of Endothelial Apoptosis, v. 104, n. 5, p. 619-627, 2009. LUSIS, A. J. Atherosclerosis. Nature, v. 407, n. 6801, p. 233-241, 2000. LYONS, A. B.; BLAKE, S. J.; DOHERTY, K. V. Flow Cytometric Analysis of Cell Division by Dilution of CFSE and Related Dyes. In: (Ed.). Current Protocols in Cytometry: John Wiley & Sons, Inc., 2001. MATSUBARA, T. Potential of peptides as inhibitors and mimotopes: selection of carbohydrate-mimetic peptides from phage display libraries. J Nucleic Acids, v. 2012, p. 740982, 2012.

41

MCLAREN, J. E.; RAMJI, D. P. Interferon gamma: A master regulator of atherosclerosis. Cytokine & Growth Factor Reviews, v. 20, n. 2, p. 125-135, 2009. MOORE, K. J.; SHEEDY, F. J.; FISHER, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol, v. 13, n. 10, p. 709-721, 2013. MOORE, K. J.; TABAS, I. The Cellular Biology of Macrophages in Atherosclerosis. Cell, v. 145, n. 3, p. 341-355, 2011. OLIVEIRA, J. A. et al. Minimally modified electronegative LDL and its autoantibodies in acute and chronic coronary syndromes. Clinical Biochemistry, v. 39, n. 7, p. 708-714, 2006. PARASASSI, T. et al. Loss of apoB-100 secondary structure and conformation in hydroperoxide rich, electronegative LDL−. Free Radical Biology and Medicine, v. 31, n. 1, p. 82-89, 2001. PELLEGRINI, A. et al. Spleen B cells from BALB/c are more prone to activation than spleen B cells from C57BL/6 mice during a secondary immune response to cruzipain. International Immunology, v. 19, n. 12, p. 1395-1402, 2007. PELUFFO, G.; RADI, R. Biochemistry of protein tyrosine nitration in cardiovascular pathology. Cardiovascular Research, v. 75, n. 2, p. 291-302, 2007. PIERIDES, C. et al. Immune responses elicited by apoB-100-derived peptides in mice. Immunologic Research, v. 56, n. 1, p. 96-108, 2013. PRASSL, R.; LAGGNER, P. Molecular structure of low density lipoprotein: current status and future challenges. Eur Biophys J, v. 38, n. 2, p. 145-58, 2009. QUAH, B. J. C.; PARISH, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. n. 44, p. e2259, 2010. ROEDERER, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry Part A, v. 79A, n. 2, p. 95-101, 2011. SÁNCHEZ-QUESADA, J. L. et al. Electronegative LDL of FH subjects: chemical characterization and induction of chemokine release from human endothelial cells. Atherosclerosis, v. 166, n. 2, p. 261-270, 2003. SÁNCHEZ-QUESADA, J. L. et al. Effect of simvastatin treatment on the electronegative low-density lipoprotein present in patients with heterozygous

42

familial hypercholesterolemia. The American Journal of Cardiology, v. 84, n. 6, p. 655-659,1999. SANCHEZ-QUESADA, J. L. et al. Effect of Glycemic Optimization on Electronegative Low-Density Lipoprotein in Diabetes: Relation to Nonenzymatic Glycosylation and Oxidative Modification1. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 86, n. 7, p. 3243-3249, 2001. SEVANIAN, A. et al. LDL- is a lipid hydroperoxide-enriched circulating lipoprotein. Journal of Lipid Research, v. 38, n. 3, p. 419-28, 1997. SHAH, S. V. et al. Novel Mechanisms in Accelerated Atherosclerosis in Kidney Disease. Journal of Renal Nutrition, v. 18, n. 1, p. 65-69, 2008. SOEHNLEIN, O. et al. Distinct functions of chemokine receptor axes in the atherogenic mobilization and recruitment of classical monocytes. EMBO Molecular Medicine, Weinheim, v. 5, n. 3, p. 471-481, 2013. STARY, H. C. et al. A Definition of Advanced Types of Atherosclerotic Lesions and a Histological Classification of Atherosclerosis. A Report From the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association, v. 92, n. 5, p. 1355-1374, 1995. STEM CELL TECHNOLOGIES. Frequencies of Cell Types in Human Peripheral Blood Wallchart. Disponível em https://www.stemcell.com/forms/wallchart-cell-frequencies.html Acesso em fevereiro de 2017. STEMME, S. et al. T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 92, n. 9, p. 3893-3897, 1995. TABAS, I.; WILLIAMS, K. J.; BORÉN, J. Subendothelial Lipoprotein Retention as the Initiating Process in Atherosclerosis. Update and Therapeutic Implications, v. 116, n. 16, p. 1832-1844, 2007. TACKE, F. et al. Monocyte subsets differentially employ CCR2, CCR5, and CX3CR1 to accumulate within atherosclerotic plaques. Journal of Clinical Investigation, v. 117, n. 1, p. 185-194, 2007. TEDGUI, A.; MALLAT, Z. Cytokines in Atherosclerosis: Pathogenic and Regulatory Pathways. Physiological Reviews, v. 86, n. 2, p. 515-581, 2006. TSE, K. et al. Atheroprotective Vaccination with MHC-II Restricted Peptides from ApoB-100. Frontiers in Immunology, v. 4, p. 493, 2013.

43

WANG, X. et al. The role of Fcγ receptors in atherosclerosis. Experimental Biology and Medicine, v. 237, n. 6, p. 609-616, 2012. WEISCHENFELDT, J.; PORSE, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc, v. 2008, p. pdb prot5080, 2008. World Health Organization. The top 10 causes of death. Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/>. Acesso em: 3 mar. 2017. ZIOUZENKOVA, O. et al. Dual Roles for Lipolysis and Oxidation in Peroxisome Proliferation-Activator Receptor Responses to Electronegative Low Density Lipoprotein. Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 41, p. 39874-39881, 2003.

Aluno: Felipe Wakasuqui 29/03/2017 Orientadora: Dulcinéia Saes Parra Abdalla 29/03/2017

8. ANEXOS

Aprovação da Comissão de Ética no uso de Animais, Protocolo CEUA/FCF/438,

página 44

Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, Número CAAE 23181114.3.0000.0067, página 45 a 47.

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