paper científico-transformação genética em escherichia coli

Escola Secundária Dr. Manuel Gomes de Almeida Página 1 de 17

Resumo

Após concluída a Actividade Prática Laboratorial Bactérias Fluorescentes, no

laboratório aberto do IPATIMUP, elaborou-se o seguinte relatório, no qual se esclarecem os

conceitos de Técnica do DNA recombinante e de como esta permite induzir novas

características fenotípicas em bactérias Escherichia Coli, utilizando como vector,

geneticamente modificado através de enzimas de restrição, o plasmídeo pGLO; e o gene

responsável pela fluorescência GFP (Green Fluorescent Protein). Esclarece ainda o conceito de

Técnica de Gram, Gram negativo e Gram positivo e ainda as vantagens de ter conhecimento da

composição da membrana bacteriana.

Abstract

Once completed the Practical Activity Fluorescent Bacteria, in the open laboratory of

IPATIMUP, this report was written to clear concepts such as recombinant DNA technique and

how it may induce new phenotypic characteristics in Escherichia Coli bacteria, using pGLO

plasmid as a vector, genetically modified by restriction enzymes; and the gene which is

responsible for fluorescence GFP (Green Fluorescent Protein). It also clarifies Gram Technique

concept, positive and negative Gram and the advantages of knowing the composition of the

bacterial membrane.

Palavras Chave: Técnica do DNA Recombinante, Características Fenotípicas, Bactéria,

Escherichia Coli, Enzimas de Restrição, pGLO, Gene GFP, Técnica de Gram, Gram Negativo,

Gram Positivo, Membrana Bacteriana.

Relatório de Trabalho Prático – Laboratório Aberto do IPATIMUP, Porto

Transformação genética em Escherchia Coli Inserção e expressão do gene GFP através do vector pGLO

Cláudia Franco | Cláudia Lobo | Edgar Couto | Sofia Osório


Introdução

A cada dia que passa o mundo já não é o mesmo, a vida transforma-se, a Biologia

reinventa-se.

É o caso da engenharia genética, um exemplo perfeito de como a junção do passar do

tempo com as potencialidades da mente humana colaboram em perfeito uníssono.

Todos os dias novas descobertas são feitas, por experimentação, teoria e prática

obtêm-se novas potencialidades capazes de alterar ideias prévias e neste caso testar métodos

alternativos com o objectivo de quebrar barreiras.

Em especial, o IPATIMUP (Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da

Universidade do Porto) merece ser mencionado pois serve de referência no campo da

engenharia genética por descobertas significativas e pioneiras, e também por teses e artigos

publicados nesta área.

Um dos parâmetros estudados e relevantes dentro da engenharia genética e posto em

prática na ida dos autores deste paper ao Laboratório Aberto deste instituto, são as

actividades com bactérias fluorescentes e a respectiva manipulação do seu DNA tendo em

vista responder às seguintes perguntas: Como introduzir um plasmídeo numa bactéria? Será

possível manipular o seu DNA de modo a torná-la mais resistente a um antibiótico específico?

O objectivo da actividade realizada no IPATIMUP é igualmente partilhado pelo

objectivo deste documento científico, alargar conhecimentos relativos a DNA recombinante,

bactérias, antibióticos e indução de novas características fenotípicas.

Esta actividade realizada devido à oportunidade proporcionada pelo Laboratório

Aberto, permite uma relação directa com a disciplina de Biologia por abranger conceitos tais

como: processos de manipulação de genes num dado organismo (geralmente fora do processo

reprodutivo normal deste), isolamento, manipulação e introdução de DNA num chamado

corpo de prova (ou hospedeiro), tendo como objectivo a expressão de um gene específico

previamente identificado e categorizado.

A importância teórica e prática da experiência realizada, residiu na oportunidade dada

aos participantes de explorar e pôr em prática conteúdos abordados na disciplina assim como

assistir ao resultado dessa mesma experimentação.

O presente paper está dividido em duas partes principais: Parte I. Bactérias

Fluorescentes e Parte II. Técnica de Gram.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Organismo


I. Bactérias Fluorescentes

Fundamentos Teóricos

Bactéria

As bactérias são procariontes unicelulares tendo, por isso, uma constituição muito

simples. São seres que não apresentam organelos membranares, nem núcleo individualizado,

tendo o DNA disperso no citoplasma e não associado a histonas. Para além da molécula de

DNA principal, as bactérias possuem ainda porções de DNA circular em cadeia dupla

denominadas Plasmídeos. Estes replicam-se independentemente da molécula de DNA

principal e não são essenciais à

sobrevivência da bactéria.

Técnica do DNA recombinante

A Técnica do DNA recombinante é utilizada em engenharia genética para possibilitar

que determinada espécie adquira características fenotípicas não inatas ao seu genoma. É

introduzida uma porção de DNA exógeno previamente seleccionado através de enzimas de

restrição. Esta técnica tem um elevado poder económico pois possibilita a produção em massa

de substâncias necessárias à sobrevivência (potencia tratamentos) das quais é exemplo a

insulina, tão necessária para insulinodependentes.

Organelo Função

Membrana Citoplasmática

Captação de elementos necessários e excreção de toxinas

Parede Celular Rigidez e Protecção

Cápsula Hidratação

Protecção contra Fagocitose Maior adesão a outras células

Pili Prender o Alimento

Flagelo Locomoção

Ribossomas Síntese Proteica

Plasmídeos Mecanismo de Defesa

Nucleóide Material Genético

Codifica as características da célula

Figura 1 - Bactéria


Para modificar geneticamente um organismo é necessário alterar todas as suas células,

já que todas elas possuem o genoma do indivíduo. Sendo assim, nesta técnica são utilizados

organismos como as bactérias ou leveduras devido à sua unicelularidade e à maior facilidade

de manipulação do seu conteúdo genético pela sua simplicidade, pelo reduzido número de

nucleótidos que o constituem e pela sua rápida e eficaz reprodução, originando clones.

É utilizado um vector (molécula capaz de transportar o gene escolhido para a célula

hospedeira) que contém o gene recolhido da molécula de DNA dadora, neste caso, o

plasmídeo. Ambos, plasmídeo e molécula dadora, são tratados com a mesma enzima de

restrição. Os fragmentos de restrição (provenientes do DNA dador), e os plasmídeos cortados

têm extremidades em cadeia simples (extremidades coesivas). Colocam-se, posteriormente, os

fragmentos de restrição junto aos plasmídeos e as extremidades coesivas de ambos

emparelham por complementaridade de bases, formando pontes de hidrogénio. É introduzida

uma enzima específica, DNA ligase, que estabelece a ligação entre as duas cadeias simples

(ligações covalente – fosfodiéster), originando uma nova molécula de DNA – rDNA (DNA

recombinante).

O plasmídeo resultante deste processo de alteração da sequência nucleotídica, agora

denominado plasmídeo recombinante, é posto em contacto com as células hospedeiras

(bactérias). Este vector recombinante é ainda portador de um gene que lhe confere resistência

a determinado antibiótico para posterior selecção das bactérias transformadas.

As bactérias que incorporaram o plasmídeo recombinante iniciam a síntese da nova

proteína codificada pelo gene exógeno introduzido no plasmídeo.

O resultado pretendido será, então, a produção em massa de determinada

biomolécula codificada pelo gene recolhido da molécula dadora.

Figura 3 -Esquematização da acção de uma Enzima de Restricção (EcoRI)

Figura 1 -União entre o grupo fosfato ligado ao carbono 5′ e o grupo hidroxila ligado ao carbono 3’ das moléculas de desoxiribose presentes no DNA.


Plasmídeo pGLO

É através da técnica resumidamente descrita acima que é sintetizado,

laboratorialmente, o plasmídeo pGLO. A constituição deste plasmídeo é responsável pela sua

utilização na experiência “Bactérias Fluorescentes” e destacam-se quatro zonas principais.

O plasmídeo em causa, posto em contacto com as células hospedeiras, iniciará a

síntese da proteína que lhes confere fluorescência

quando observadas à luz ultravioleta.

Os procariontes que integrarão o

plasmídeo pGLO, neste caso Escherichia Coli,

tornar-se-ão resistentes ao antibiótico Ampicilina

(devido ao gene bla), característica que não

possuiam naturalmente. Sendo assim, este gene

servirá para seleccionar na cultura bacteriana, os

indivíduos que incorporaram o plasmídeo,

expondo-os à ampicilina. Apenas os que

sobrevivem contêm o vector manipulado. Esta

seleção permite certificar que apenas as bactérias

modificadas se reproduzem, clonando o gene de

interesse sucessivamente.

A zona ara-C é responsável pela regulação da expressão do gene GFP, este apenas é

transcrito na presença de Arabinose (dissacarídeo). É um operão indutível, constituído por um

operador, um promotor e três genes estruturais que codificam a síntese das proteínas

necessárias à degradação da Arabinose: o araA, que codifica a isomerase, o araB que codifica a

ribulocinase e o araD, que codifica a ribulose 5-fosfato epimerase.

Zona Codifica

Ori (Origin) Origem da replicação plasmídica

Bla

( -lactamase gene) Resistência à ampicilina (antibiótico)

GFP (Green Fluorescent

Protein)

Síntese da proteína que confere fluorescência

ara-C (bifunctional

regulatory protein)

Controlo da expressão do GFP em função da presença ou ausência de Arabinose no

meio

pGLO

Figura 4 - Representação do Plasmídeo recombinante pGLO


Operão Arabinose

Um operão é a unidade regulatória completa de um conjunto de genes agrupados. É

constituído por um gene regulador, responsável pela síntese de uma proteína repressora; um

gene operador, responsável pela fixação da proteína repressora ao operão; um gene

promotor, responsável pela fixação da RNA polimerase; e um conjunto de genes estruturais,

responsáveis pela codificação dos aminoácidos que, juntos, formarão as proteínas

responsáveis pela degradação da arabinose.

Só é necessária a síntese das proteínas degradadoras do dissacarídeo se este estiver

presente no meio. Caso contrário será um desperdício de energia. Sendo que as bactérias

apenas produzem ATP através da Fermentação (o balanço final são duas moléculas de ATP)

não podem fazer desperdícios.

Na ausência de arabinose no meio a proteína repressora é sintetizada na forma activa,

fixa-se ao operador incapacitando a fixação da RNA polimerase. Não há transcrição dos genes

estruturais, consequentemente não há tradução nem síntese proteica.

Figura 5 - Esquema do Operão Arabinose I


Na presença de arabinose no meio a proteína repressora é sintetizada na forma activa,

as moléculas de lactose desactivam-na. Esta não se liga ao operador e, por isso, a RNA

polimerase fixa-se ao promotor, iniciando a transcrição, para posterior tradução. Há síntese

proteica.

Figura 6 -Esquema do Operão Arabinose II


GFP

A GFP (Green Fluorescent Protein) é uma proteína que confere fluorescência

esverdeada sintetizada pelo cnidário Aequorea Victoria. O primeiro cientista a isolar este gene,

Osamu Shimomura, ganhou o prémio Nobel da Química em 2008, quando já tinha 80 anos.

A sua descoberta foi extremamente importante para as evoluções em engenharia

genética nos últimos dois anos, mas é também utilizada em microbiologia e em fisiologia. É

devido à sua ubiquidade que se revela tão promissor no estudo da expressão génica tanto em

culturas de células como em tecidos, ou até mesmo sistemas inteiros (animais e plantas).

Funciona como uma espécie de marcador biológico devido à sua fácil detecção, não só de

organismos mas também de proteínas, organelos e outros compartimentos celulares. É, ainda,

útil na avaliação da capacidade de expressão de determinados promotores.

A sua estrutura em cilindro deve-se ao conjunto das onze cadeias- . No centro

encontra-se uma hélice- . É constituída por 238 aminoácidos.

Figura 7 - Aequorea Victoria Figura 8 -Estrutura Molecular da proteína GFP Figura 9 -Estrutura Tridimensional da

proteína GFP


Material

Micropipetas

Ansas Esterilizadas

Microtubo

Suporte de Microtubos

Recipiente com gelo

Aparelho de Banho-maria

Meio Nutritivo (LB)

Solução de Transformação

Plasmídeos pGLO

Placa de Petri contendo meio LB,

antibiótico (ampicilina) e arabinose

Câmara de Incubação

Luz Ultra-Violeta

Luvas de Latex

Método / Procedimento

Com a experiência “Bactérias Fluorescentes”, desenvolvida no Laboratório Aberto do

IPATIMUP, pretendia-se compreender o processo complexo utilizado em engenharia genética.

Como introduzir um plasmídeo numa bactéria? Como torná-la resistente a determinado

antibiótico?

A actividade proposta permite, recorrendo à técnica do DNA recombinante, a

manipulação de bactérias e a sua comparação com bactérias não manipuladas.

Após toda a informação teórica recolhida e percebida, criaram-se as seguintes hipóteses:

As bactérias geneticamente modificadas, ou seja, que incorporaram o plasmídeo

recombinante, emitem fluorescência quando observadas à luz Ultra Violeta se

estiverem na presença de Arabinose; expostas ao antibiótico (Ampicilina), estas

bactérias sobrevivem.

As bactérias que não foram postas em contacto com o plasmídeo recombinante, não o

incorporaram, logo não sobreviverão em meios de cultura onde esteja presente o

antibiótico Ampicilina. Da mesma forma, não apresentarão fluorescência devido à

ausência do GFP.

Com o objectivo de validar estas hipóteses foi executada a experiência da seguinte

maneira.

1. Micropipetação de 250 l de Solução de Transformação (CaCl2) para o microtubo.

2. Recolha de uma pequena porção de Bactérias da espécie Escherichia Coli com a Ansa

descartável e inserção das mesmas no microtubo.

3. Recolha de uma película de plasmídeos pGLO com outra Ansa descartável e inserção

dos mesmos no microtubo.

4. Incubação do microtubo em gelo, após devida identificação1, durante

aproximadamente 3 minutos.

1 Sendo que o microtubo continha plasmídeos pGLO foi identificado com um + (=mais), todos os que não continham

DNA plasmídico foram identificados com um – (=menos).


5. Transferência do microtubo para o Banho Maria a 42oC durante aproximadamente 1

minuto.

6. Nova incubação em gelo durante aproximadamente 2 minutos.

7. Agitação do microtubo

8. Micropipetação de 100 l da preparação contida no microtubo para a placa de Petri

previamente preparada com meio nutritivo (LB – Luria Bertani broth), ampicilina e

arabinose.

9. Utilização de uma nova Ansa descartável para uniformizar a preparação, agora contida

na placa de Petri

10. Incubação das placas de Petri, invertidas, a 37oC durante 24h.

11. Observação das placas à Luz Ultravioleta

12. Registo dos resultados

Resultados2

Substâncias contidas na placa

de Petri

Reacção das Bactérias

+ pGLO - pGLO

Crescimento Fluorescência Crescimento Fluorescência

LB + Ampicilina Sim Não Sem alterações

LB Não testado Sim Não

LB + Ampicilina + Arabinose

Sim Sim Não testado

Discussão

Após observação dos resultados pôde observar-se que o único meio de cultura em que

são expressos, na totalidade, os genes presentes no plasmídeo recombinante é o que é

constituído por LB (meio nutritivo), Ampicilina e Arabinose.

Depois de observados e tratados os resultados, pode, então, passar-se à análise e

exploração dos mesmos, bem como ao aprofundamento da compreensão de toda a

experiência.

A escolha de bactérias como a Escherichia Coli deve-se à sua unicelularidade e

simplicidade. Para além disso, esta espécie de bactérias tem outras características que as

situam à frente de muitas outras espécies bacterianas em Engenharia Genética. As bactérias

Escherichia Coli reproduzem-se a cada 20 min., ou seja, de 20 em 20 minutos, cada indivíduo

dá origem a dois novos clones. Pode, assim, concluir-se que este facto constitui, mais uma vez,

uma vantagem para a técnica de rDNA, que pretende que o gene responsável pelo novo

fenótipo seja transcrito vezes suficientes para a produção em massa de proteínas.

2 Estão presentes os resultados de todos os grupos de trabalho, para posterior análise e discussão.


Outra característica favorável à utilização da Escherichia Coli é o facto de esta ser

inofensiva ao organismo humano, tanto é que vive em simbiose com este e com outros

animais saudáveis, impedindo o crescimento de espécies bacterianas nocivas e sintetizando

apreciáveis quantidades de vitaminas (K e do complexo B). Assim, a sua rápida multiplicação

em laboratório é completamente inócua tanto para humanos como para o ambiente. Por

outro lado, esta espécie não sobrevive se não estiver num meio de cultura favorável, o que

impossibilita a sua expansão e colonização fora do laboratório.

A Engenharia Genética é, de facto, uma componente essencial na ciência da

actualidade e abre todo um conjunto de portas e respostas a problemas do dia a dia.

O plasmídeo pGLO é um dos frutos desta engenharia. É um plasmídeo genéticamente

modificado muito utilizado em actividades práticas destinadas a alunos de ciências com o

objectivo de desenvolver o pensamento crítico e a criatividade em Biologia. É fácil de perceber

a sua utilização numa experiência destinada ao Ensino Secundário, já que, considerando a

complexa imensidão do mundo genético, este plasmídeo é relativamente simples, com quatro

zonas principais e necessárias à experiência em causa. O gene que codifica a GFP é outro factor

importante, já que é facilmente observável a fluorescência das bactérias modificadas, podendo

ser distinguidas a olho nu.

Quanto ao Operão Arabinose, tão necessário à expressão do gene GFP, pode dizer-se

que foi bastante útil a aplicação dos conhecimentos das aulas de Biologia relativas ao operão

Lactose. Foi essencial perceber a aplicação do que é um operão indutível numa biomolécula

completamente diferente.

Para que o plasmídeo recombinante entre nestes unicelulares, é necessário provocar

reações que tornem a sua membrana permeável. A este processo chama-se Competência

Adquirida, e pode ser conseguido de duas maneiras: Electroporação ou Choque Térmico.

Na Electroporação as células são submetidas a um pulso eléctrico, formando poros na

membrana celular destas. Apesar de esta ser a técnica mais eficaz, também é a mais cara

devido à necessidade da utilização de um Electroporador. Assim, na nossa experiência

utilizámos o método do Choque Térmico, no qual se submetem as bactérias a uma Solução de

Transformação (CaCl2) que destabiliza a membrana celular e permite a aproximação do

plasmídeo recombinante à mesma. Depois, as bactérias sofrem choques térmicos sendo

incubadas em gelo, e depois em banho-maria a 42oC. Este choque permite o aumento da

porosidade da membrana e, consequentemente, a entrada do plasmídeo recombinante na

célula. Voltaram a ser incubadas em gelo para que a membrana estabilizasse e os poros

fechassem, impedindo a saída da molécula de rDNA.

O passo seguinte foi a micropipetação do conteúdo do microtubo (bactérias na

presença do pGLO ou não) para placas de Petri com diferentes meios de cultivo. O objectivo foi

verificar em que condições o gene de interesse (gene GFP) se expressava.

Foram incubadas as quatro caixas de Petri invertidas a 37oC, o que faz todo o sentido e

confirma o que já havia sido dito. Sendo que as bactérias Escherichia Coli vivem em simbiose

no organismo humano, que temperatura poderia ser mais eficaz na sua reprodução do que a


desse próprio organismo. Assim, 37oC, a temperatura do corpo humano, é também a

temperatura ideal para o desenvolvimento das culturas bacterianas de Escherichia Coli.

As duas caixas de Petri, onde foram colocadas as bactérias não modificadas, serviriam

como montagens de controlo. Deste modo, foi possível observar que, no seu genoma natural,

as Escherichia Coli , não possuem o gene que lhes confere resistência à Ampicilina, sendo que

na caixa de Petri que continha meio nutritivo LB e Ampicilina não se verificou alteração no

crescimento. Como no meio de cultivo que apenas continha LB se deu crescimento e formação

de colónias, a morte da outra montagem terá sido, inequivocamente, devida à presença de

Ampicilina no meio.

Por outro lado, ambas as montagens que continham as células modificadas, tinham

presente Ampicilina, e em ambas se verificou o crescimento populacional das bactérias,

formando colónias. Estes resultados permitem concluir que as bactérias modificadas através

da incorporação do plasmídeo pGLO adquirem resistência à Ampicilina, devido ao gene -

lactamase (Bla).

A última observação feita das caixas de Petri é precisamente a expressão, ou não, do

gene GFP. Não se esperava que nenhum dos meios que contêm as bactérias não modificadas

evidenciasse fluorescência, e assim se verificou. No entanto, ambos os meios com bactérias

modificadas, ou seja, portadoras no plasmídeo recombinante pGLO, dariam resposta às

hipoóeses propostas anteriormente. A única diferença entre os dois meios era a presença ou

ausência de Arabinose. Ao serem observadas à luz ultravioleta, verificou-se que apenas o meio

que continha Arabinose emitia fluorescência. Isto veio provar outro facto: a expressão do gene

GFP depende do operão Arabinose. Se este último for transcrito (arabinose presente no meio)

o gene GFP é transcrito e a proteína é sintetizada conferindo à Escherichia Coli uma

fluorescência esverdeada que não é característica do seu genoma natural; no caso deste

operão não ser transcrito (ausência de arabinose no meio) o gene GFP também não o é, não

havendo síntese da GFP. Desta forma as bactérias não emitem fluorescência.


II. Técnica de Gram

Fundamentos Teóricos

Como já foi referido na parte I deste paper, as bactérias são seres procariontes

unicelulares muito simples. No entanto, estas possuem membrana celular, tal como todas as

células, e a composição dessa membrana é variável. O conhecimento dessa membrana

depende a Técnica de Gram.

A técnica de Gram consiste na coloração de preparações histológicas que permite

distinguir os dois principais grupos de bactérias por observação ao microscópio óptico. Esta

coloração trata-se de um método diferencial já que permite diferenciar microorganismos com

base na composição química e integridade da sua parede celular, bem como a sua morfologia

(cocos ou bacilos). Com base na cor que adquirem são classificadas em Gram positivas ou

Gram negativas. As bactérias mais patogénicas são reconhecidas, por terem Gram negativo, na

maior parte dos casos. Estas últimas são ainda constituídas por lipopolissacarídeos que

agravam as infecções.

Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista

obteve com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de

material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este

método o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu

em 1935 sem ter conseguido que fosse dada a devida importância ao seu método de

coloração.

No entanto, com o tempo foi dada a devida importância a esta técnica, sendo muito

utilizada em algo tão importante como a Taxonomia e identificação de bactérias, sendo uma

técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

A principal diferença entre Gram positivas e Gram negativas é o teor lipídico da sua

membrana. A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor lipídico elevado na sua

membrana externa e uma camada de peptidoglicano que envolve a membrana plasmática.

A parede celular das bactérias Gram positivas é principalmente constituída por uma

grossa camada de peptidoglicano. O seu teor lipídico é muito baixo, ou mesmo nulo

(característica rara em espécies bacterianas).


Material

Lâmina

Lamela

Suporte de Tubos de Ensaio

Corante Violeta de Genciana

Corante Soluto de Lugol

Corante Safranina

Garrafa de Esguicho com Água

Destilada

Garrafa de Esguicho com Etanol

MOC

Lamparina

Suporte de Lâmina

Ansa Esterilizada

Pipeta de Pasteur descartável

Método / Procedimento

Antes de efectuar a experiência e baseados nos conhecimentos teóricos anteriormente

descritos, elaboraram-se as seguintes hipóteses:

Se as bactérias Escherichia Coli forem Gram positivas, prevê-se que adquiram uma

coloração arroxeada, devido ao Corante Primário (Violeta de Genciana)

Se as bactérias Escherichia Coli forem Gram negativas, verificar-se-á uma cor

avermelhada, devido ao Corante Secundário (Safranina).

A experiência seguiu-se da seguinte maneira:

1. Colocação de uma gota de água na lâmina, com o auxílio do esguicho.

2. Recolha de uma porção da colónia de bactérias Escherichia Coli, com a ansa

esterilizada, e colocação da mesma na lâmina.

3. Fixação da preparação com o auxílio da lamparina.

4. Colocação de 1ml de corante Violeta de Genciana.

5. Lavagem da lâmina com o esguicho.

6. Colocação de 1ml de corante Soluto de Lugol.

7. Escorre-se o corante Soluto de Lugol.

8. Lavagem da lâmina com Etanol.

9. Colocação de 1ml de corante de Safranina.

10. Lavagem da lâmina com água destilada.

11. Colocação da lamela por cima da preparação.

12. Observação ao MOC (Microscópio Óptico Composto).

13. Utilização de Óleo de Imersão quando ampliado a 100x3

3 O Objectivo do Óleo de Imersão é melhorar a nitidez da imagem.


Resultados

Após todo o procedimento efectuado correctamente, observaram-se as bactérias ao

MOC. Os resultados foram completamente claros. As bactérias Escherichia Coli apresentaram

uma coloração avermelhada, e têm, nitidamente, forma de Bastonete (ou Bacilos).

Discussão

Durante todo o procedimento recorre-se a lavagens sucessivas da lâmina que contém

a porção colonial de Escherichia Coli. Todos esses passos têm o objectivo de caracterizar a

parede celular destes procariontes.

Como foi já referido, a parede celular de uma bactéria é constituída por

peptidoglicanos, podendo também ser circundada por uma bicamada fosfolipídica.

Figura 10 - Bactéria Escherichia Coli ao ME 10 000x Figura 11 - Bactéria Escherichia Coli ao MOC 100x

Figura 12 - Parede Celular Gram Negativa Figura 13 -Parede Celular Gram Positiva


Bactérias Gram negativas têm, na constituição da sua parede celular, uma fina camada

de peptidoglicanos, sendo esta revestida por uma bicamada fosfolipidica. Sendo assim,

durante o procedimento experimental, quando se recorre à lavagem da preparação com

Etanol, parte dos lípidos são dissolvidos pelo ácool, formando poros na parede celular. O

Corante Primário, anteriormente absorvido pelas células, sai do interior das mesmas. Estas

ficam transparentes, sendo posteriormente coradas novamente pelo Corante Secundário.

Nas bactérias Gram positivas isto não se verifica, pois a parede celular destas é

constituída por uma espessa camada de peptidoglicanos, sem ser revestida pela bicamada

fosfolipidica. A camada de peptidoglicanos actua como barreira, impedindo a saída do corante

primário. Assim sendo, a cor destas células será a do Corante Primário.

Com os resultados obtidos, pôde verificar-se que, tendo as E.Coli adquirido uma

coloração avermelhada, estas são Gram negativas. Assim, a sua parede celular é constituída

por uma fina camada de peptidoglicanos, que está circundada por uma bicamada fosfolipídica,

idêntica à da membrana celular.


Agradecimentos

Agradecemos sinceramente aos professores Manuel Leite e Manuela Pereira, por

terem sido os únicos disponíveis a acompanhar-nos na visita de estudo. Agradecemos,

também, ao Laboratório Aberto do IPATIMUP que nos proporcionou condições para a

sedimentação dos conhecimentos teóricos abordados nas aulas de Biologia de 12º ano.

Referências

www.microbiologybytes.com

www.cientic.com

www.e-escola.pt

biotecnologia-na-escola.up.pt

www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/Ecolinet.htm

www.science.uva.nl/research/molphot/research/sm/peterSMS.html

onubiol217.blogspot.com/2011/01/module-3-lab-08-section-2-genetic.html

NASCIMENTO, A., ESPREAFICO, E., LARSON, M., MONESI, N., ROSSI, N. – “Tecnologia

do DNA recombinante”, Universidade de S.Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, 2003

Correia, R., “Controlo da Expressão Genética em Procariotas”, Licenciatura em

Bioquímica ISCS-N, Biotecnologia – 3º ano

Martins, C., Ferreira, J., Siqueira, L., Ferreira, L., Bazzo, M., Franchini, M., Berro, O.,

Valle, S., “Técnica de Coloração de GRAM”, Ministério da Saúde, Secretaria de Políticas

de Saúde, Programa Nacional de DST e Aids, Brasília, 2001

http://www.microbiologybytes.com/

http://www.cientic.com/

http://biotecnologia-na-escola.up.pt/

paper científico-transformação genética em escherichia coli

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