Evolução da Resistência de Escherichia coli à Ampicilina

António Delgado, Catarina Oliveira, Jorge Ferreira, Martim Lico Equipa: E. Colis

Colégio Valsassina Abstract: One of the firsts creatures living in Earth were bacteria. Nowadays we can still see many examples of beings of this family, wich means that, through all the years, they have created ways to survive their extinctions’ threats. The aim of this project is to test how E. coli bacteria survive to the ampicilin, so we followed the methodology of (Haddix et al, 2000), which lead us to watch and analyse this creature behaviour by counting the survivors that were in the recipients, each one with a different antibiotic concentration, and test Charles Darwin’s Law of Natural Selection. As the main conclusions of this project it is possible to say that:

E. coli bacteria are not naturally resistant to ampicilin. Bacteria cells became resistant after contact with this antibiotic. We can compare animals and plants evolution with bacteria natural selection.

Key-words: Resistance; Antibiotic, Bacteria, Natural selection

1. Introdução Desde a descoberta de antibióticos que o seu uso tem vindo a aumentar e a

generalizar-se para qualquer situação que o utilizador deseje. O seu uso quase descontrolado tem levado a um aumento da resistência das bactérias aos antibióticos.

No entanto, “a indiscutível e importante particularidade da terapêutica antibiótica, é que aqui o erro, não afecta apenas aquele doente, mas a curto prazo pode afectar toda a comunidade” (Carmo, 2009). Esta recorrência descontrolada leva ao aparecimento de bactérias multiresistentes pelo que nos casos em que se verifiquem patogénicas para o organismo humano, estas podem constituir uma grave ameaça para a saúde pública. Segundo a teoria evolutiva antes da introdução dos antibióticos, na década de 1940, as infecções eram raras, mas aumentaram de frequência rapidamente à medida que o uso de antibióticos aumentou.

De facto, a maioria dos antibióticos que foram utilizados pela primeira vez na década de 1940 e 1950 já não são utilizados clinicamente porque hoje em dia a resistência dos seres infecciosos a estes antibióticos é muito habitual. No entanto, ao longo do tempo têm vindo a ser desenvolvidos novos antibióticos e com a introdução de cada novo medicamento apareceram rapidamente bactérias resistentes. Hoje, mudou-se o modo de utilização e prescrição dos antibióticos com vista a tentar abrandar o ritmo implacável da evolução bacteriana, mas ainda não foi encontrada uma solução para este problema. Os microbiólogos continuam a estudar o modo como as bactérias evoluem para que possamos prever de que modo estas vão responder a tratamentos médicos e, assim, podermos gerir melhor a evolução das doenças infecciosas.

Os antibióticos têm diferentes modos de acção e, como resultado, as bactérias desenvolvem resistência aos antibióticos de diferentes maneiras. Em geral, a resistência bacteriana aos antibióticos tem uma de três formas: 1) há uma mudança na permeabilidade da membrana celular que ou impede a entrada do antibiótico na célula ou faz com que o antibiótico seja bombeado para fora da célula; 2) adquirem a capacidade de degradar e / ou inactivar o antibiótico, ou 3) adquirem uma mutação que altera o alvo de um antibiótico de modo a que o alvo não seja afectado. Existem duas formas pelas quais as bactérias podem adquirir resistência aos antibióticos: os genes de resistência podem surgir espontaneamente numa população de células, como resultado de mutação ou, noutros casos, esses genes podem ser adquiridos a partir de um outro microrganismo através de um processo denominado Transferência Horizontal do Gene.

Neste processo um gene ou genes podem ser trocados entre espécies microbianas não relacionadas (Haddix et al., 2000).

2

O que se pretende nesta investigação é observar o comportamento destes seres através da contagem das colónias sobreviventes, dispostas em vários meios de cultura com diferentes concentrações de antibiótico, testando assim o Princípio da Selecção Natural, enunciado inicialmente por Charles Darwin.

2. Material e Metodologia Os procedimentos usados neste projecto foram adaptados a partir de Haddix et al. (2000) sendo que o protocolo foi modificado nos seguintes aspectos: Substituição da bactéria original pela E.coli; Nas técnicas de esterilização (teve-se que utilizar álcool para limpar as bancadas e

alguns utensílios; uso da chama de uma lamparina para esterilizar algum material; e uma panela de água em ebulição para gobelés ou tinas, em que o uso da chama era inviável);

Na preparação da solução PBS visto não possuirmos hidrogenofosfato de sódio substituímos por o hidrogenofosfato de magnésio de modo a manter o par ácido-base H2PO4

-/HPO42- em solução responsável pelo efeito tampão;

Preparação de 10 placas com agar para cada um dos cinco grupos de teste contemplados no protocolo.

A aplicação do protocolo compreendeu o seguimento do design experimental apresentado na figura 1:

Figura 1 - Design experimental adoptado no estudo.

3. Apresentação de Resultados Tendo em conta os procedimentos adoptados obtivemos um conjunto de resultados que apresentamos nas figuras 2 a 6 e nas tabelas I a III.

3

0

1

2

3

4

5

10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹ 10⁻¹⁰Nº

de c

olón

ias p

or p

laca

Diluição do meio de cultura

Média

Média + Desvio Padrão

-50

0

50

100

150

200

10⁻² 10⁻³ 10⁻⁴ 10⁻⁵ 10⁻⁶Nº

de c

olón

ias p

or p

laca

Diluição do meio de cultura

Média

Média + Desvio Padrão

Média - Desvio Padrão-10

0

10

20

30

40

Nº

de c

olón

ias p

or p

laca

Diluição do meio de cultura

Média

Média + Desvio Padrão

Média - Desvio Padrão

-10

0

10

20

30

10⁻² 10⁻³ 10⁻⁴ 10⁻⁵ 10⁻⁶

Nº

de c

olón

ias p

or p

laca

Diluição do meio de cultura

Grupo B -AP

Média

Média + Desvio Padrão

Média - Desvio Padrão -40

-20

0

20

40

60

80

10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹ 10⁻¹⁰

Nº

de c

olón

ias p

or p

laca

Diluição do meio de cultura

Grupo B +AP

Média

Média + Desvio Padrão

Média - Desvio Padrão

Cultura mãe +AP

10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹ 10⁻¹⁰

Média 0 0 0 0 0 Desvio Padrão 0 0 0 0 0

- AP A +AP A

10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹ 10⁻¹⁰ 10⁻² 10⁻³ 10⁻⁴ 10⁻⁵ 10⁻⁶

Média 15 9 10 8 8 27 35 25 28 62 Desvio Padrão 22 14 14 15 11 34 66 48 46 86

-AP B + AP B

10⁻² 10⁻³ 10⁻⁴ 10⁻⁵ 10⁻⁶ 10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹ 10⁻¹⁰

Média 6 8 12 8 7 5 7 15 17 3 Desvio Padrão 5 6 15 7 6 15 16 47 37 7

Figura 2 – Contagem das colónias existentes nas placas da cultura-mãe +AP

Figura 3 - Contagem das colónias existentes nas placas do Grupo A -AP Figura 4 - Contagem das colónias existentes nas placas do Grupo A +AP

Figura 5 - Contagem das colónias existentes nas placas do Grupo B -AP Figura 6 - Contagem das colónias existentes nas placas do Grupo B +AP

Tabela I – Contagem das colónias existentes nas placas da cultura-mãe +AP

Tabela II – Contagem das colónias existentes nas placas do Grupo A

Tabela III – Contagem das colónias existentes nas placas do Grupo B

4

4. Discussão

A aplicação do protocolo experimental nas suas diversas etapas permite identificar os seguintes objectivos para cada grupo de placas que serviram de meio de cultura à espécie de bactérias em teste:

O grupo da cultura-mãe serve para determinar a frequência, à partida, de bactérias resistentes à ampicilina que existiam na cultura parental.

As placas com ampicilina (+AP) do grupo A (que implica a ausência de ampicilina no tubo de cultura inicial) permitem verificar se após um dia de incubação ocorreram mutações significativas nas bactérias que façam variar a sua taxa de crescimento visto estarem sujeitas às mesmas condições em que se colocaram inicialmente as bactérias da cultura-mãe.

As placas sem ampicilina (-AP) deste mesmo grupo indicam como reage o crescimento das bactérias na ausência de pressões selectivas (relativas à presença de antibióticos).

As placas com ampicilina (+AP) do grupo B (que implica a presença de ampicilina no tubo de cultura inicial) revelam como é influenciado o crescimento das bactérias resistentes a este antibiótico num meio de cultura que também contém o antibiótico.

As placas sem ampicilina (-AP) deste mesmo grupo mostram a taxa de crescimento das bactérias resistentes na ausência de pressões selectivas provocadas pelo antibiótico em teste.

Da análise dos resultados sobre o número de colónias contabilizadas, em média, por cada caixa de petri para cada diluição conclui-se o seguinte:

a) A frequência de bactérias resistentes que nos é dada para as placas da cultura-mãe é nula em todas as diluições (fig. 2 e tab. I). Em virtude disto pode-se especular que nenhuma das bactérias provenientes da amostra retirada da cultura-mãe fosse resistente a este antibiótico. Por outro lado, face à radicalidade destes resultados em comparação com os verificados para os restantes grupos de placas, admite-se que seja possível que tenha ocorrido algum erro na aplicação do protocolo.

b) Ao contrário do que se poderia especular, o crescimento de bactérias nas culturas +AP foi superior ao que se verificou nas culturas – AP, em especial destaque no grupo A (figs. 3 e 4 e tab II). Eventualmente isto acontece porque a mutação que promove a resistência das bactérias ao antibiótico estimula a taxa de crescimento destes seres. No grupo B (figs. 5 e 6 e tab. III), o crescimento terá sido semelhante em ambos os grupos visto as bactérias utilizadas terem sido extraídas de um meio que por si já continha ampicilina, pelo que a sua inoculação em meios com diferente constituição não terá influenciado significativamente o seu crescimento verificando-se semelhante para ambas as situações.

c) A taxa de crescimento das bactérias não foi decrescente com a diluição como era esperado. Este até foi bastante semelhante para as diferentes concentrações de placas dentro do mesmo grupo. Tal facto pode ser explicado devido ao tempo de incubação ter sido alargado face a não terem existido resultados no tempo previsto. Isso poderá ter conduzido a que as colónias de bactérias nas diferentes concentrações atingissem um estado terminal de crescimento onde se verifica uma estabilização do seu processo de multiplicação que a partir de um determinado momento se torna independente do tempo de incubação.

d) O protocolo experimental seguido evidencia que a cultura-mãe terá sido iniciada a partir de uma única célula. Como indicam os dados referentes às placas da cultura-mãe, se esses resultados forem considerados válidos, realmente a célula inicial em questão não deveria ser resistente à ampicilina. No entanto, como indicam os resultados referentes aos grupos A e B, necessariamente que terão surgido na cultura-mãe células resistentes a este antibiótico. O aparecimento desta característica pode ser explicado pela ocorrência de mutações em indivíduos desta população de bactérias que os terão tornado resistentes à ampicilina, permitindo desse modo a sua reprodução ainda que esta substância esteja presente no meio de cultura.

5

As células resistentes terão portanto surgido da acção de pressões selectivas provocadas pela ampicilina nesta população que terá levado os indivíduos mais aptos (resistentes a esta substância) a reproduzirem-se diferencialmente e a aumentarem a sua frequência naquele agregado.

e) Poder-se-á comparar a evolução das plantas e dos animais a este processo de aquisição de resistência a antibióticos por parte de bactérias, uma vez que as leis da selecção natural são universais e incidem sempre sobre os indivíduos mais aptos de uma população. No entanto, o seu processo de evolução pode diferir do das bactérias nas formas como se verifica, por exemplo, o aumento da variabilidade genética dentro das suas populações, onde se incluem agora os fenómenos de reprodução sexuada e menores taxas de mutação decorrentes de agentes reparadores do material genético presentes nas células destes indivíduos. Acrescenta-se ainda o factor da multicelularidade que condiciona a evolução desses seres a diversos níveis e requer organizações celulares mais complexas para poder satisfazer eficientemente as necessidades de todas as células do indivíduo. Contudo, estes seres terão surgido de seres eucariontes como as bactérias testadas nesta investigação, pelo que pode ser um bom ponto de partida partir do estudo evolutivo destes organismos mais primitivos para chegar à evolução das plantas e dos animais.

Em suma, este projecto permitiu-nos verificar as leis da selecção natural que regem o mundo vivo num caso real e concreto passível de ser desenvolvido no estabelecimento de ensino. Como é referido por (Hodson, 1992) e (Hodson, 1994), no ensino, a componente experimental tem uma grande importância visto desenvolver atitudes científicas nos estudantes, melhorar a sua aprendizagem do conhecimento e do método científico, ensinar as técnicas de laboratório, desenvolver a capacidade de levar a cabo uma investigação científica e dela adquirir experiência, e motivar os alunos despertando o interesse e o sentido crítico. O desenvolvimento deste trabalho foi portanto fundamental para consolidar e aprofundar os conhecimentos que previamente tinham sido abordados numa vertente meramente teórica.

Por sua vez, é importante referir que a resistência aos antibióticos é hoje uma realidade em todo o mundo e constitui um problema sério no tratamento das doenças infecciosas. Ainda que não se conheça a grandeza deste problema, estima-se que, a nível mundial, o custo do tratamento de infecções causadas por bactérias com resistência aos antibióticos é de muitos milhões de euros por ano. Deste modo, a investigação científica e a utilização cuidadosa dos antibióticos pode reverter esta tendência.

5. Conclusões O objectivo desta investigação foi a verificação das leis da selecção natural através da

observação do comportamento das bactérias, considerando vários meios de culturas com diferentes concentrações de antibiótico, de forma a verificar as reacções dessas mesmas bactérias e no que se refere à sua resistência face ao antibiótico utilizado.

Os resultados obtidos mostram uma tendência para considerar a existência de uma crescente resistência das bactérias à ampicilina. Neste contexto, pode-se considerar que existem duas formas pelas quais as bactérias podem adquirir resistência aos antibióticos: as mutações ou a partir de um processo denominado Transferência Horizontal do Gene.

A investigação por nós conduzida permitiu uma maior aprendizagem baseada em factos e na sua observação, permitindo com isso o desenvolvimento de novas competências ancoradas na experimentação.

6. Bibliografia Haddix, P.; Paulsen, E.; Werner, T. (2000). Bioscene. v26, p1-21. Hodson, D. (1992). Assessment of practical work. Some considerations in philosophy of science. Science

and Education Review, 1, 115-144. Hodson, D. (1994). Hacia un enfoque más crítico del trabajo de laboratorio. Enseñanza de las Ciencias,

22, 85-142. Carmo, G. (2009). Princípios e problemas do uso de antibióticos. in Jornadas 30 anos de SNS. Disponível,

e consultado on line, em 10 de Fevereiro de 2010, em www.hsm.min-saude.pt/.../Uso%20de%20Antibióticos_Germano%20do%20 Carmo.ppt