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I. RESUMEN
PESQUISA DE ESCHERICHIA COLI O157:H7, EN HAMBURGUESAS COMERCIALIZADAS EN LA PROVINCIA DE ÑUBLE, POR MEDIO DE DOS TÉCNICAS MOLECULARES DE PCR.
ISOLATION OF ESCHERICHIA COLI O157:H7 IN HAMBURGUERS SOLD IN ÑUBLE PROVINCE, USING TWO METHOD OF PCR.
La carne favorece el crecimiento de patógenos como Escherichia coli O157:H7.
La investigación en Canadá y los Estados Unidos de brotes ocurridos durante los
últimos años a causa de E. coli O157:H7 ha demostrado su estrecha asociación
con alimentos y han estado favorecidas por el incremento de personas
inmunosuprimidas, la expansión de la industria y el comercio de alimentos además
de los cambios en los hábitos de consumo. En nuestro país los reportes de esta
bacteria en alimentos comienzan en el año 1993 donde se pesquisó el serogrupo
O157. En este estudio se compararon dos técnicas de diagnóstico por PCR (PCR
simple y PCR multiplex), además de determinar la frecuencia del patógeno en
hamburguesas. Se analizaron 60 muestras (que representaban 4 marcas elegidas
al azar). La muestra de hamburguesa se homogenizó con agua peptona
tamponada y se incubó por 24 horas para la posterior extracción de ADN. Los
PCR fueron realizados con primers para el gen EaeA (intimina) y FliC para la
proteína flagelar (el multiplex) y otro solo con primers para gen EaeA (intimina) (el
simple). Se obtuvo de las 60 muestras analizadas por PCR, 1 que fue positiva
para ambos genes y otras 5 cepas positivas para el gen FliC (H7) en el PCR
multiplex. En el PCR simple se obtuvieron 3 muestras positivas para el gen EaeA
(intimina), coincidiendo solo en una muestra positiva para ambas técnicas.
Además la presencia de esta bacteria en alimentos que hoy son consumidos
masivamente como las hamburguesas demarca la importancia de la realización de
futuros estudios.
Palabras claves: Escherichia coli O157: H7, PCR, hamburguesas.
II. SUMMARY The meat favors the growth of pathogenic organisms like Escherichia coli
O157:H7, which could be the cause of many several clinical cases in children and
inmunological depressed people, especially for the food consumption. The Canada
and United States investigation of outbreaks occurred at the past years caused by
E. coli O157:H7 has demonstrated its narrow association with the foods, favored
also by the increment of the inmunological depressed people, the industries and
commerce of foods expansion and the changes on the consumption patterns. In
our country the reports of this bacterium in foods starts at 1993 when was founded
the serogroup O157. It was compared two PCR methods (simple and multiplex) to
determinate the pathogenicity frequence in the hamburgers. It was analyzed 60
samples from 4 randomly selected trademarks The sample’s oh hamburguer with
peptone water was incubated for 24 hours to a later DNA extraction. The multiplex
PCR realizing with the EaeA (intimin) and FliC (flagelar protein) genes primers and
the simple PCR with EaeA gene. Of the 60 examined samples by PCR, 1 was
positive for both genes and another one 5 positive just for the FliC (H7) gene by
multiplex. The simple PCR only 3 was positive samples for EaeA gene.1 sample
coincide positive for both PCR results. Also, the presence of this bacterium in food
that are at present consumed massively such as the hamburgers demarcates the
importance of the realization of future studies.
Keywords: Escherichia coli O157: H7, PCR, hamburguer.
III. INTRODUCCIÓN
Características generales Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacterias de forma bacilar,
gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, móviles o
inmóviles que fermentan la glucosa, reducen nitratos a nitritos, son citocromo -
oxidasa negativos y crecen en medios con sales biliares (Jay, 1994; Peekhaus and
Conway, 1998).
Escherichia coli, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, es parte común de
la microflora anaerobia facultativa del tracto intestinal del hombre y animales de
sangre caliente. Muchas cepas de E. coli son inocuas, sin embargo, algunas son
patógenas y causan diarrea Hemorrágica (Peekhaus and Conway, 1998). Cuando
la E. coli es aislada puede ser diferenciada serológicamente basado en los tres
principales antígenos de superficie, con esto se logra la serotipificación siguiente:
la O para el antígeno somático, la H para el flagelar y la K para el de la cápside.
Hoy en día existe un total de 167 antígenos O, 53 antígenos H y 74 antígenos K.
Además se ha considerado necesario sólo la detección de los antígenos O y H en
casos de diarrea en donde se aísle. El antígeno O identifica el serogrupo de la
cepa y el antígeno H el serotipo (Nataro and kaper, 1998)
Los aislamientos de Escherichia coli se han categorizado en distintos grupos
basados en sus propiedades de virulencia, mecanismos de patogenicidad,
síntomas clínicos y distintos serotipos de O: H. Estas categorías son: E. coli
enteropatogénica (EPEC), E. coli enterotoixigénica (ETEC), E. coli enteroinvasiva
(EIEC), E. coli de adherencia difusa (DAEC), E coli enteroagresiva (EAEC) y E.
coli enterohemorrágica (EHEC) (Nataro and kaper, 1998). Escherichia coli O157:H7 es una bacteria, perteneciente al grupo de E. coli
enterohemorrágicas que integran también otros serotipos como O26, O111 y
O157: NM también asociados a diarrea en humanos, que fue identificada como
patógeno de los alimentos en 1982 en el Centro de Control y Prevención de
Enfermedades de Estados Unidos, enmarcado en un estudio retrospectivo hasta el
año 1975 realizado a mujeres de California que presentaban diarrea con sangre.
Su primer aislamiento y caracterización fue en 1885 por el científico alemán y
pediatra Theodor Escherich. Esta bacteria es causa de enfermedad grave en
niños, ancianos e inmunodeprimidos, principalmente por el consumo de alimentos,
especialmente carnes no bien cocinadas, que porten este patógeno (Ebel et al.,
2004).
Todas las cepas de EHEC producen citotóxinas en las células de riñón del mono
verde de África (Vero) por lo cual han sido llamados Verotoxinas o Siga toxinas
(Stx) por la similitud a la toxina producida por la Shigella dysenteriae tipo 1. La
producción de Siga toxinas por la Escherichia coli O157:H7 fue reportada por
primera vez en 1983 y luego en 1985 fue asociada a infecciones severas a veces
fatales, con presentación de Síndrome Urémico (Karch and Bielaszewska, 2001).
Las manifestaciones clínicas de la diarrea por E. coli enterohemorrágica
(O157:H7) se presentan después de un periodo de incubación de 3 a 5 días y
puede causar una infección asintomática, diarrea leve o un cuadro diarreico que
se inicia no sanguinolento, hasta progresar a una diarrea francamente
sanguinolenta, acompañada de calambres abdominales. En adultos la infección es
autolimitante; sin embargo, en niños en un bajo porcentaje (2-7%), se desarrolla el
cuadro de síndrome urémico hemolítico (S.H.U.) que está caracterizado por una
anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia y falla renal aguda. E. coli
O157:H7 es el principal agente causante de falla renal en niños menores de 4
años de edad. Las personas que desarrollan S.H.U. tienen una mortalidad de 3 al
10% y las complicaciones como falla renal, cardiaca y serias complicaciones
neurológicas, se presentan entre el 4 y el 30% de los casos (FAO, 2003).
Según un estudio realizado en pacientes hospitalizados con diarrea aguda en la
Región Metropolitana, se encontró ECEH en frecuencia similar en los pacientes
con S.H.U. y enfermos con otras patologías diarreicas (42%). Sin embargo, la
diferencia radicó en las cepas aisladas, la cual en los casos de S.H.U.
correspondía principalmente al serogrupo 0157, y en menor número, a las
variedades enterohemorrágicas 0 55 y 0114. De acuerdo al Informe de enero de
1998 emitido por la Unidad de Nefrourología del Hospital Roberto del Río, se
observa en ese establecimiento una disminución en el número de pacientes
afectados por S.H.U., de 10 casos en 1995 a 4 casos en 1997 (Sotomayor et al.,
2000).
Según el último informe del lnstituto de Salud Pública (ISP), en los últimos 10 años
se ha detectado un total de 46 muestras de E. coli Enterohemorrágica, del cual el
26% se presentó en el año 1995 (12 muestras), de estas muestras, 20 pertenecen
a niños menores de un año (43%). Hasta 1991 el único serogrupo detectado fue el
0 157, sin embargo, a partir de 1993 el ISP empezó a detectar en mayor número
otros serogrupos, como el 0 26 y 0 111 (Cavagnaro et al., 2005).
No se conocen con exactitud la incidencia del S.H.U. en nuestro país, ya que por
ser una patología emergente y de reconocimiento reciente en nuestro medio,
puede existir un subdiagnóstico considerable. El tema adquiere importancia en los
últimos años, a raíz de la notificación de casos de menores afectados por este
síndrome, considerando que esta enfermedad en la edad pediátrica constituye la
principal causa de insuficiencia renal aguda tanto en Chile como el extranjero
(Zambrano et al., 2005).
Sin embargo, dos estudios realizados por distintos autores en la Región
Metropolitana entre los años 1992 y 1994, estimaron la incidencia para niños
menores de 4 años entre 3 y 4,2 casos por cien mil (cifras similares a las
observadas en USA y algunas áreas de Canadá) y para niños menores de 5 años
en los 6 Servicios de Salud, en 3,26 por cien mil niños, con un rango de variación
entre 0,86 a 7,33. Las características clínicas de los niños chilenos con este
síndrome no fueron diferentes a lo observado en otras latitudes, siendo frecuente
el factor común de pródromo de diarrea con sangre (Ministerio de Salud de Chile
b, 1998).
Escherichia coli O157:H7 en los alimentos La globalización del comercio de alimentos y los problemas cada vez mayores que
originan en todo el mundo las enfermedades emergentes y reemergentes de
origen alimentario han intensificado el riesgo de transmisión de los agentes
infecciosos (O.M.S., 1999).
Es importante comprender como se introducen y diseminan los agentes
infecciosos a través de la cadena alimentaria para prevenir o reducir al mínimo la
exposición de los consumidores a tales agentes, lo anterior subraya la necesidad
de establecer normas y reglamentos tomando como base el Codex Alimentarius,
recopilación de normas que comprenden los principales grupos alimentarios,
siendo su principal objetivo proteger la salud de los consumidores mediante la
descripción de los procesos y procedimientos de producción y almacenamiento o
mantención, previniendo o eliminando los riesgos y/o peligros que puedan
entrañar los alimentos procesados o bien, reducirlos a niveles aceptables (O.M.S.,
1999). Se ha concluido que un sistema eficiente debe estar enmarcado en el
concepto de la cadena productiva desde la granja hasta el consumidor (World
Health Organization, 2000).
La producción de alimentos de origen animal es la que conlleva el mayor peligro
de contaminación por patógenos; a diferencia de los alimentos de origen vegetal
en los que la contaminación por patógenos normalmente suele ser accidental y
externa, en los alimentos de origen animal, los propios animales pueden ser
reservorios de los patógenos (D'Sa et al., 2000; FSIS, 2000).
La contaminación posterior al faenamiento puede proceder del agua utilizada, de
las instalaciones y del equipo empleado para la preparación del producto así como
de los operarios que lo manipulan (World Health Organization, 2000).
La carne de los mamíferos constituye la base de la alimentación humana y su
industria es una de las más importantes en el ámbito de la alimentación. Se trata
de un excelente alimento por su alto valor nutritivo, principalmente debido a la
riqueza en proteínas (FSIS, 2000). Por otra parte, la carne es uno de los alimentos
más perecederos debido a sus características de actividad de agua, composición,
pH y contenido en agua, constituyéndose como un medio muy favorable para la
mayor parte de las contaminaciones microbianas. De hecho, la contaminación de
la carne comienza durante el sacrificio de la res, continúa en otras dependencias o
secciones del matadero, prosigue durante su transporte; cuando la canal llega a
los lugares de expendio, también está sujeta a nuevas contaminaciones por los
instrumentos utilizados en el despiece y otras manipulaciones, finalizando su
contaminación en los lugares donde será finalmente procesada y/o transformada
(Fegan et al., 2005).
Normalmente el músculo en profundidad de un animal recién sacrificado, contiene
una flora muy escasa, del orden de un germen por gramo, esta microflora procede,
generalmente, del intestino y es transportada al músculo por la sangre en el
momento del sacrificio o por medio de los utensilios empleados durante el
faenamiento como tal. Por el contrario, la superficie de la carne especialmente en
la canal, está mucho más contaminada y por una flora muy diversa, la que
dependerá de las condiciones higiénicas de manipulación así como del ambiente
del matadero (Fegan et al., 2005).
En el proceso de almacenamiento de la carne se pueden producir alteraciones
como consecuencia de la acción de microorganismos aerobios y anaerobios (Hew
et al., 2005). Aún cuando la congelación puede destruir algunas bacterias o inhibir
el crecimiento de otras, si la descongelación del producto se efectúa lentamente,
puede proliferar abundantemente la flora psicrófila que se ha mantenido inhibida
cuando el alimento estaba congelado (Ministerio de Salud de Chile, 2004).
Los brotes de ETA (Enfermedades Transmitidas por Alimentos) en Estados Unidos
y varios países europeos, particularmente los ocasionados por E. coli O157:H7
han determinado una revisión y modernización de los programas para el manejo
de la protección de los alimentos, en particular en los sistemas de inspección y
control. En 1998, la contaminación de carnes con E. coli O157:H7 determinó el
retiro del mercado de varios millones de estos productos en los Estados Unidos.
La investigación en Canadá y los Estados Unidos de brotes ocurridos durante los
últimos años a causa de E. coli O157:H7 y Listeria monocytogenes ha demostrado
su estrecha asociación con alimentos y su presencia en estos brotes se ha visto
favorecida por el incremento de personas inmunosuprimidas, la expansión de la
industria y el comercio de alimentos y los cambios en los organismos y en los
hábitos de consumo (OMS., 1999; Ebel et al., 2004).
Aunque las enfermedades de transmisión alimentaria, o ligadas a los alimentos, se
manifiestan generalmente al final de la cadena, es decir, en el consumidor, los
alimentos pueden contaminarse con patógenos en cualquier etapa de la cadena
de su producción (Tauxe, 1997). Muchos alimentos ya están contaminados desde
el momento de su producción (Jay, 1994), de hecho, un elemento importante a
considerar en la seguridad alimentaria es el reconocimiento de que los alimentos
sin procesar poseen microorganismos, es decir, contienen contaminación
microbiana de origen (Soriano et al., 2001). En otras oportunidades, el
microorganismo responsable de la enfermedad se introduce con la contaminación
incidental que ocurre en los productos alimentarios crudos o cocidos, sean ellos de
origen vegetal o animal
En general el número y tipo de microorganismos presentes en un producto
alimenticio terminado están influenciado por: (Jay, 1994)
I. El medio ambiente general del cual fue obtenido el alimento.
II. La calidad microbiológica del alimento.
III. Las condiciones higiénicas bajo las cuales el alimento es manipulado y
tratado.
IV. La adecuación de las posteriores condiciones de manipulación, envasado y
almacenamiento para mantener la flora a un bajo nivel.
Los alimentos crudos, particularmente los de origen animal, pueden contener
microorganismos patógenos. Si los alimentos crudos se someten a una cocción o
tratamiento térmico suficiente y se consumen inmediatamente después no son, en
principio, peligrosos (World Health Organization, 2000).
Las cecinas, sin otra denominación, son aquellos productos elaborados a base de
carne y grasa de vacuno o cerdo, adicionados o no de aditivos, condimentos,
especias, agua o hielo (Ministerio de Salud de Chile, 2004).
Hamburguesa es el producto elaborado con carne picada o molida, adicionada o
no de grasa animal, pan, sal, aditivos permitidos y especias. (Ministerio de Salud
de Chile, 2004). Previo a la cocción, su contenido de grasa no podrá exceder de
24 %. En la elaboración de hamburguesas se permitirá usar como extensor de la
carne proteínas no cárnicas autorizadas. En el caso de usar proteínas texturizadas
su proporción máxima será de 10% en base seca. Según el reglamento sanitario
de los alimentos, los límites microbiológicos establecidos para carnes y productos
cárnicos comercializados en nuestro país, en este caso para las cecinas crudas
(hamburguesas), son los siguientes: (Ministerio de Salud de Chile, 2004).
Tabla N°1 Carnes y productos cárnicos (incluidas carnes de aves y de caza) Cecinas crudas (cecinas crudas frescas y hamburguesas)
Plan de muestreo Límite por gramo
Parámetro Categoría Clases n C m M Rcto.Aerobios Mesóf. C. perfringens S. aureus Salmonella en 25 g
1 6 6
10
3 3 3 2
5 5 5 5
3 1 1 0
106
102
102
0
107
103
103
---
(Ministerio de Salud de Chile, 2004). De esta tabla podemos decir que “n” corresponde al número de unidades de
muestras a ser examinadas, “c” número máximo de unidades de muestra que
puede contener un número de microorganismos comprendidos entre “m” y “M”
para que el alimento sea aceptable, “m” es el valor del parámetro microbiológico
para el cual o por debajo del cual el alimento no representa un riesgo para la salud
y “M” corresponde al valor del parámetro microbiológico por encima del cual el
alimento representa un riesgo para la salud.
En el procesado de alimentos se utilizan tratamientos que destruyen
microorganismos (por ejemplo aplicación de temperaturas elevadas o aplicaciones
de sales de curado), pero si se produce una recontaminación con
microorganismos patógenos después del procesado, éstos resultan ser en
extremo peligrosos puesto que no existe una flora competitiva que los controle ya
que ha sido eliminada con el tratamiento térmico. Además la sobre vivencia de E.
coli a pH ácido esta sujeto al medio en que se encuentra (Arnold et al, 2001). El
peligro que supone el consumo de alimentos difiere considerablemente según el
tipo de alimento y su destinatario final (World Health Organization, 2000),
Las carnes desmenuzadas y en especial las hamburguesas, contiene un número
de microorganismos más elevado que las carnes no desmenuzadas o cortes
determinados (Jay, 1994).
Con respecto a los subproductos de la carne como las hamburguesas (carnes
desmenuzadas o picadas), existen 5 puntos importantes de contaminación (Naim
et al, 2003):
1. Las carnes picadas generalmente están compuestas de recortes del desposte
o la limpieza de cortes. Estos trozos han sido excesivamente manipulados y en
consecuencia normalmente contiene una cantidad de microorganismos mayor
que la que contiene otros cortes de carne.
2. La carne picada ofrece una mayor extensión superficial, hecho que por si solo
posibilita el aumento de la flora microbiana (se debe recordar que conforme
disminuye el tamaño de la partícula de carne, la extensión de la superficie
aumenta).
3. Esta mayor extensión de la superficie de la carne picada favorece el crecimiento
de las bacterias aeróbicas, que son las que constituyen la flora habitual que
crece a bajas temperaturas y que es causante de su alteración.
4. En algunos establecimientos comerciales, las picadoras de carne, cuchillos y
utensilios, propios de la labor se limpian e higienizan con baja frecuencia.
5. Un trozo de carne contaminado es suficiente para contaminar otros trozos, así
como la totalidad del lote a través de contaminación cruzada (Jay, 1994; Hew
et al, 2005).
En nuestro país los reportes de esta bacteria en alimentos comienzan en el año
1993 en una muestra de queso de cabra enviada por el Servicio de Salud
Metropolitano Oriente, donde se pesquisó el serogrupo O157. Posteriormente, en
el año 1997, 3 muestras de hamburguesas enviadas por el Servicio Salud Osorno
presentaron un serogrupo no tipificable (Ministerio de Salud de Chile b, 1998).
En Chile, a través de una red de vigilancia de brotes de gastroenteritis que se
inició en Santiago en enero de 1996, y que incorporó la identificación de ECEH a
partir del año 2000, entregando sus primeros resultados en julio de ese año donde
se documenta un brote de diarrea en un jardín infantil causado por una cepa de
ECEH que afecta a 44 niños y un adulto. El alimento sospechoso en este caso es
una comida de tallarines con carne molida y el patrón de transmisión fue de
persona a persona. El ECEH es responsable aproximadamente del 32% de las
diarreas alimentarias con una Tasa de incidencia de SUH en Santiago de 3.2
casos por 100.000 niños menores de 5 años, 82% de ellos con edades entre 4 y
24 meses (Cavagnaro et al, 2005).
Métodos de diagnóstico de Escherichia coli O157:H7 Diversas Metodologías están disponibles para determinar cualitativamente y
cuantitativamente la presencia de múltiples microorganismos, como la Escherichia
coli O157: H7, en muestras de alimentos, es por esto que la elección del método a
utilizar dependerá de las condiciones en que el microorganismo se encuentre
después del proceso al que ha sido sometido el alimento. Si bien algunos métodos
analíticos son mejores que otros, cada uno de ellos tiene ciertas limitaciones
intrínsecas relacionadas con su utilización (Miyamoto et al, 2002). Es así como el
método utilizado para el recuento y aislamiento de microorganismos en los
alimentos no líquidos requiere el tratamiento previo de la muestra, para liberar en
el medio fluido los microorganismos que pueden estar aprisionados en el interior o
adheridos en las superficies secas o gelatinosas del alimento (Ministerio de Salud
de Chile a, 1998).
En el caso de Escherichia coli O157:H7, su aislamiento requiere de etapas de pre
enriquecimiento selectivo y siembra sobre medios específicos, para
posteriormente realizar la identificación de los serotipos específicos, procedimiento
que resulta ser incompleto y que en total demanda de 6 a 8 días. Hasta 1998 los
métodos tradicionales de cultivo podían discriminar las posibles cepas de E. coli
O157:H7, ya que no fermentan el hidrocarbono sorbitol adicionado a los medios de
cultivo. Es por esto que la búsqueda de E. coli 0157:H7 en un principio se veía
facilitada por el empleo de medios diferenciales (por ejemplo MacConkey-sorbitol)
y realizar su identificación presuntiva por su carácter betaglucuronidasa-negativa,
lo que permitía, en la práctica, restringir la serotipificación a las cepas que
presentan las dos características señaladas, es decir ser negativas al sorbitol y a
la betaglucuronidasa (Prats et al., 1996). Sin embargo, diversos estudios han
reportado el aislamiento de cepas de E. coli O157:H7 que son capaces de
fermentar el sorbitol, razón por la cual esta propiedad ya no es útil para discriminar
este serotipo (Moon et al, 2004; Terrance et al, 2005).
Además la mayoría de los métodos convencionales de detección de patógenos
demoran tiempo que para la industria alimentaria, es valioso, por esto se ha hecho
común con el tiempo el desarrollo de técnicas de diagnostico rápido, como la PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa), que puedan analizar varias muestras que
tal vez presenten pequeñas dosis infectantes (Moon et al., 2004; O” Brien et al.,
2005). La PCR es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula
de duplicar el ADN, ya que genera múltiples copias de una secuencia específica
de nucleótidos de un organismo, de esta forma provee un mecanismo para
detectar cantidades diminutas de organismos con alta especificidad, además de
entregar resultados en el mismo día para organismos que normalmente tomarían
varias semanas usando tecnologías convencionales. Esta técnica ideada por Kary
Mullis, y publicada por primera vez el año 1985 en la revista científica Science, es
reconocida como una de las herramientas más poderosas de la Biología
Molecular. (Willoughby, 2003).
Su utilización en diagnóstico clínico, se basa en la posibilidad de poder tomar
muestras mínimas de material genético, copiar la secuencia de interés las veces
necesarias y generar suficiente cantidad de muestra para detectar la presencia o
ausencia de patógenos y en muchos casos realizar la cuantificación del mismo.
Destaca su gran potencial diagnostico frente a otras pruebas utilizadas hoy, por su
alta especificad y simplicidad, pero presenta el inconveniente de su fácil
contaminación (Moon et al., 2004).
La PCR es un proceso que consta de tres pasos (desnaturalización, unión
(alineación) y extensión) que forman un ciclo, el que se repite un número
determinado de veces. Este proceso se lleva a cabo en un termociclador, un
instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante
períodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos (usualmente
30-40 ciclos) (Foley et al., 2004).
Se reconoce a la PCR como el mayor avance en diagnóstico molecular de
microorganismos patógenos, incluyendo a la E. coli. Destacando dentro de sus
ventajas que presenta una gran sensibilidad de detección “in situ” en muestras
blanco (Kim et al., 2005). Con el paso del tiempo se han desarrollado con éxito
partidores de PCR para diferentes categorías de Escherichia coli, esta
diferenciación se ha logrado en base a estudios que han apuntado a su
caracterización por medio de sus mecanismos de patogenicidad, así lo muestra la
siguiente tabla:
Tabla 2. Secuencias nucleotídicas de partidores oligonucleotidos para la detección
de cepas de Escherichia coli mediante PCR.
(Nataro and Kapper, 1998)
Categoria Factor Oligonucleotidos PCR Tamaño ampliconETEC STI TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 492
CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC LT GGCGACAGATTATACCGTGC 581
CCGAATTCTGTTATATATGTCEPEC EAF CAGGGTAAAAGAAAGATGATAA 214
TATGGGGACCATGTATTATCABFP AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC 268
GCCGCTTTATCCAACCTGGTAEHEC eae CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAA 234
TCAGCGTGGTTGGATCAACCT (O157:H7-specifico)SLTI TTTACGATAGACTTCTCGAC 223
CACATATAAATTATTTCGCTC (SLT-I y II)SLTII Como arriba
Plasmid ACGATGTGGTTTATTCTGGA 223CTTCACGTCACCATACATAT
EIEC ial CTGGATGGTATGGTGAGG 579GGAGGCCAACAATTATTTCC
EAEC Plasmid CTGGCGAAAGACTGTATCAT 576CAATGTATAGAAATCCGCTGTT
Así también, para la detección especifica de Escherichia coli O157:H7 los estudios
han apuntado especialmente a la caracterización genómica de los factores de
virulencia de esta bacteria (Huguet et al., 2002). La siguiente tabla muestra los
trabajos hechos por el laboratorio de referencia de Escherichia coli ubicado en la
Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, España; y perteneciente a la Red
mundial de diagnostico e investigación de Escherichia coli O157:H7 llamada
COLIRED en donde se han establecido los siguientes juegos de primers para la
detección de Escherichia coli O157:H7 por medio de la PCR.
Tabla 3. Secuencias nuclotidicas de partidores oligonucleotidos para la detección
de cepas de Escherichia coli O157:H7.
(Laboratorio de Referencia de E. coli, Universidad de Santiago de Compostela)
Poco a poco los estudios a nivel mundial han apuntado al desarrollo de Multiplex
PCR para la detección de Salmonella spp., Listeria monocytogenes y Escherichia
Gen Primer Secuencia nucleotídicaa Tamaño amplicon
VT1 VT1-A CGCTGAATGTCATTCGCTCTGC 302VT1-B CGTGGTATAGCTACTGTCACC
VT2 VT2-A CTTCGGTATCCTATTCCCGG 515VT2-B CTGCTGTGACAGTGACAAAACGC
EntHly HlyA1 GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG 1.551HlyA4 TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA
EAEc EAE-1 GAGAATGAAATAGAAGTCGT 772-776EAE-2 GCGGTATCTTTCGCGTAATCGCC
EAEd AE19 CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAA 1.087AE20 TCAGCGTGGTTGGATCAACCT
MFSe MFS1F ACGATGTGGTTTATTCTGGA 166MFS1R CTTCACGTCACCATACATAT
O157f O157-AF AAGATTGCGCTGAAGCCTTTG 497O157-AR CATTGGCATCGTGTGGACAG
H7g H7-F GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC 625H7-R CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC
coli O157:H7, así como también al establecimiento de PCRs en tiempo real para el
diagnostico de esta bacteria en alimentos (Kawasaki et al., 2005).
Por otro lado, las técnicas serológicas sólo pueden discriminar el antígeno
somático O157, sin embargo, presentandose en algunos casos reacciones como
positivo (en forma cruzada) con bacterias como Citrobacter freundii y Escherichia
hermanii. A su vez, el serotipo H7 permanece sin posibilidad de ser pesquisado,
ya que es un anticuerpo de alto costo. Actualmente, en el análisis de productos
cárnicos, los resultados positivos a la seroaglutinación del serotipo O157 deben
informase como muestras “presuntamente positivas” (Ministerio de Salud de Chile
b, 1998).
Estas muestras deben esperar un diagnóstico definitivo en el Laboratorio de
Referencia Nacional de E. coli diarreogénico que se encuentra en el ISP, el cual,
recibe cepas de los distintos laboratorios del país y realiza los estudios de
confirmación microbiológica en base a pruebas bioquímicas, serológicas y de
biología molecular. Desde 1997 el laboratorio de referencia complementó el
diagnóstico de SHU con la técnica de biología molecular basada en PCR, para
Stx1 y Stx2. Posteriormente fue incorporado en el diagnóstico, PCR para gen eae
y estudio para toxina enterohemolisina (E-Hly) (Sotomayor et al., 2000).
Hipótesis La pesquisa de Escherichia coli O157:H7 en hamburguesas comercializadas en la
provincia de Ñuble, entregará resultados diferentes al utilizar dos técnicas de PCR
distintas.
Objetivos Objetivo general.
Pesquisar Escherichia coli O157: H7 a través de dos técnicas de PCR
diferentes en hamburguesas comercializadas en la provincia de Ñuble.
Objetivos específicos.
Determinar la frecuencia de pesquisa de cepas de Escherichia coli O157:
H7 en productos cárnicos, como hamburguesas, comercializadas en la provincia
de Ñuble.
Determinar si existe concordancia entre los resultados obtenidos al utilizar
dos técnicas diferentes de PCR en la pesquisa e identificación de cepas de
Escherichia coli O157: H7 en hamburguesas comercializadas en la provincia de
Ñuble.
IV. MATERIALES Y MÉTODO
Descripción general
El procedimiento de detección de Escherichia coli O157:H7 en alimentos por
técnicas moleculares tiene básicamente tres etapas, que consisten en una primera
de procesar la muestra, una segunda etapa de extracción de ADN y una tercera
etapa que se basa en la realización del PCR.
Obtención de la muestra
Para este estudio se contempló un total de 60 muestras de carne de
hamburguesas de vacuno (tamaño mínimo de muestreo es de 40, calculado según
Simple size calculador, 2003) que se obtuvieron de muestreos realizados desde
una vitrina (góndola) de alimentos congelados de un céntrico supermercado de la
ciudad de Chillán, ya que este ofrecía la mayor cantidad de marcas diferentes a
los consumidores. De los muestreos realizados en periodo estival, en forma
aleatoria y aséptica se obtuvieron 15 muestras por marca de un total de 4 marcas
elegidas al azar, considerando un n = 5 y realizados de la siguiente forma:
Tabla 4. Organigrama “tipo” de muestreos:
”MARCA A”
• Tomando como ejemplo a la “Marca A”, el organigrama de muestreos se
realizó de esta manera (mismo procedimiento para restantes 3 marcas)
Estas muestras fueron transportadas al Laboratorio de Microbiología de los
Alimentos en un sistema de transporte a 4° C, donde posteriormente fueron
procesadas.
Semana 1 Lunes n = 5
Semana 2 Miércoles n = 5
Semana 3 Viernes n = 5
Tratamiento de la muestra
El tratamiento a las 60 muestras de hamburguesa de vacuno se realizo de la
siguiente forma, el primer paso consistió en tomar 10 gramos de cada muestra,
estos se mezclaron con 90 ml de agua peptona tamponada para posteriormente
pasarlo por el stomacher (equipo ocupado para homogenizar muestras) por
aproximadamente un minuto para luego ser depositada en un frasco. La muestra
en agua peptona tamponada se mantuvo a 35º ± 1º C por 24 horas para la
posterior extracción de ADN.
Método de identificación Diagnóstico molecular de E. Coli O157:H7 mediante PCR
Para la extracción de DNA de la muestra se utilizó el siguiente protocolo:
1. Obtener 1.5 ml. de muestra homogenizada y depositarlo en tubo eppendorf.
2. Colocar los tubos a 6000 rpm. por 5 minutos.
3. Eliminar sobrenadante de cada tubo
4. Resuspender con 1 ml de PBS y pasar a Vortex.
5. Colocar los tubos a 6000 rpm. por 5 minutos.
6. Eliminar sobrenadante.
7. Resuspender con 50 µl de agua ultra pura
8. Calentar en termo block a 100° C por 3 minutos.
9. Colocar los tubos a 14000 rpm. por 10 minutos.
10. Tomar sobrenadante y poner en tubo eppendorf nuevo.
11. Guardar a – 20° C.
Estas muestras (las 60) de ADN se sometieron a amplificación, ocupando los
siguientes oligonucleotidos:
Para gen EaeA (intimina): (368 Pb tamaño del amplicon a encontrar)
IntF, 5'- GACTGTCGATGCATCAGGCAAAG -3'
IntR, 5'- TTGGAGTATTAACATTAACCCCAGG -3' (Hu et al., 1999).
Para gen FliC de la proteína flagelar: (Pb 625)
FLICh7-F, 5'-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3'
FLICh7-R, 5' -CAACGGTGACTTATCGCCATTCC-3'. (Hu et al., 1999).
La mezcla para este PCR multiplex comprendía un volumen total de 25 µl por
muestra, donde las concentraciones eran de 1x de Buffer 10x, 0.2mM de dNTPs,
2.5 mM de Mg++, 0.075 µM de IntF, 0.075 µM de IntR, 0.06 µM de FLICh7-F, 0.06
µM de FLICh7-R, 2.5 U de Taq polimerasa y 2 µl de volumen de ADN de la
muestra. En cuanto a las temperaturas y tiempos que se utilizaron, los valores
para la desnaturalización inicial fueron de 94º C por 8 min. Los valores durante los
35 ciclos que consistían en pasos de desnaturalización, alineamiento y extensión,
fueron de 94ºC por 30 seg., 59ºC por 60 seg. y 72ºC por 60 seg., respectivamente.
Para la extensión final fueron de 72º C por 5 min.
Las 60 muestras fueron sometidas a un nuevo PCR pero con los siguientes
oligonucleotidos que detectan sólo O157 y son ocupados generalmente en
técnicas de screening:
Para gen EaeA (intimina): (Pb 120)
VS8, 5´-GGCGGATTAGACTTCGGCTA-3’
VS9, 5´-CGTTTTGGCACTATTTGCCC-3’ (Kawasaki et al., 2005).
La mezcla para este PCR comprendía un volumen total de 25 µl por muestra,
donde las concentraciones eran de 1x de Buffer 10x, 0.2 mM de dNTPs, 2mM de
Mg++, 0.5 µM de VS8, 0.5 µM de VS9, 2.5 U de Taq polimerasa y 5 µl de volumen
de DNA de la muestra. En cuanto a las temperaturas y tiempos se utilizaron en los
40 ciclos que duró el proceso, para la desnaturalización inicial 94º C por 10 min.,
para la desnaturalización 94º C por 1 min., para el alineamiento de 60 º C por 1
min., para la extensión 72º C por 1 min. y para la extensión final 72º C por 7 min.
En cada una de las PCRs se utilizó una cepa O157:H7 de Invitrogen (BIOSChile)
como control positivo y un control negativo (establecido por un tubo eppendorf solo
con la mezcla maestra sometido a los mismos procedimientos). Una vez
realizados los ciclos de extensión, los productos del PCR (10 µl) fueron sembrados
en un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio (2µl) más 2 µl de buffer
de carga (azul bromo fenol), ocupando estándares de peso molecular de 100 pb
(0,4 µg). Los geles obtenidos fueron sometidos a 90 volts en buffer TAE 1x por 1
hora y 20 minutos y visualizados mediante luz ultravioleta (apéndice figuras).
Análisis estadístico:
Se realizó un análisis de los datos obtenidos (datos de tipo categórico) buscando
establecer una relación de comparación entre los dos métodos de diagnóstico
para Escherichia coli O157:H7 utilizados en este experimento, para esto se utilizó
el índice de concordancia Kappa, con el fin de determinar hasta qué punto la
concordancia observada es superior a la que es esperable obtener por puro azar.
Este índice se puede calcular con diferentes programas estadísticos, existiendo
además diferentes recursos en Internet para ello, en este caso se utilizo el
entregado por Simple Interactive Statistical Análisis (SISA), que lo calcula en base
a una tabla de 2x2 de la siguiente manera:
Tabla N°5: Cuadro esquemático de cálculo de índice kappa
(Simple Interactive Statistical Análisis,1998)
TIPO A+ - Total
TIPO B + A B A+B - C D C+D
Total A+C B+D N
Donde N representa el número total de muestras y “Tipo” representaría a nuestros
métodos de diagnósticos y según si la muestra resultó positiva o negativa a uno o
a otro análisis o “tipo” se completa el cuadro (ejemplo: “A” corresponde al número
de muestras que resulto positiva a ambos métodos y “D” las negativas). El índice
Kappa que obtendremos siempre va estar en un rango comprendido entre O a 1.
El grado de concordancia medido por el índice Kappa toma el valor cero si no se
puede esperar concordancia entre los dos métodos o “tipos” comparados y se
esperaría que sus resultados sean en base al azar. Cuando Kappa adquiere el
valor 1, se dice que hay un grado de concordancia perfecto y que todas las
observaciones se encuentran en la diagonal de acuerdo (“diagonal de la parte
superior izquierda a la inferior derecha”). Se considera que los valores de Kappa
inferiores a 0,4 representan un grado de concordancia bajo, los valores entre 0,4 y
0,75 un grado de concordancia aceptable y valores superiores a 0,75 indicarían un
grado de excelente concordancia. Un valor Kappa negativo indica un problema de
aplicación
Financiamiento
* Proyecto INNOVA Bío - Bío 04 – b1 – 235
Dpto. Patología y Medicina Preventiva.
Facultad de Medicina Veterinaria.
Universidad de Concepción.
* Proyecto DIUC – 2004. 204.163.017-1.0
Dpto. Patología y Medicina Preventiva.
Facultad de Medicina Veterinaria.
Universidad de Concepción.
V. RESULTADOS
La tabla que se presenta a continuación, nos muestra los resultados positivos
obtenidos para las 60 muestras, clasificadas por empresas y otorgándoles a cada
una letra para diferenciarlas (empresa 1 = “a”, empresa 2 =”b”, empresa 3 = “c” y
empresa 4 = “d”), también se aprecia las pruebas diagnosticas a las que fueron
sometidas las muestras (según si se aplicó un PCR multiplex o sencillo)
Tabla N° 6 Resultados positivos de las 60 muestras a las diferentes técnicas de
diagnostico aplicadas.
En la tabla N° 6 se señalan las respuestas de las muestras a las dos pruebas
diagnosticas ocupadas otorgándole el valor (-) cuando la muestra fue negativa a
esa prueba, el valor (0157:H7) cuando la muestra resulto positiva para ambos
genes (apéndice figura N°2) y el valor (H7) cuando la muestra resulto positiva para
ese gen en el PCR multiplex (apéndice figura N°1). En el PCR simple el valor
(0157) corresponde a las muestras positivas para ese gen (apéndice figura N°3).
Solo la muestra “11b” resulto positiva para ambas pruebas moleculares realizadas.
Análisis estadístico:
Como se mencionó anteriormente, al obtener datos de tipo categórico y buscando
establecer una relación de comparación entre los dos métodos de diagnóstico
para Escherichia coli O157:H7 utilizados en este estudio, se utilizó el índice de
concordancia Kappa.
N' Muestra PCR Multiplex PCR Simple 1b H7 - 3b - O157 6b H7 -
11b O157:H7 O157 10c - O157 12c H7 - 3d H7 -
13d H7 -
Cálculo del Índice kappa entre PCR multiplex y PCR sencillo:
Colocando en nuestra tabla de 2x2 los datos obtenidos, quedaría de la siguiente
forma:
Tabla N°7: Cuadro de cálculo del índice kappa
Al ingresar estos datos al programa SISA, nos entrega un valor para el índice
kappa de 0.487.
Tanto en el cálculo del tamaño de la muestra como en estos cálculos del índice
kappa se utilizó un índice de confianza del 95% y una frecuencia de esta bacteria
en los productos a analizar de 3%.
PCR N°1 Total PCR N° 2 1 2 3
0 57 57Total 1 59 60
VI. DISCUSIÓN
Elección de Muestreo:
Según estudios previos sobre la pesquisa y aislamiento de Escherichia coli
O157:H7 en animales, canales y subproductos cárnicos, se procedió al análisis de
muestras de carnes de hamburguesas de bovino comercializadas en la provincia
de Ñuble durante una época estival, ya que es en esta fecha donde los brotes y la
presentación en carnes crudas picadas de este patógeno alcanzan el máximo
número (Naugle et al., 2005; Marzocca et al., 2006).
Efecto de factores ambientales en el aislamiento de Escherichia coli
Naim et al., (2003) señala que a diferencia de la mayoría de los patógenos
transmitidos por los alimentos, Escherichia coli O157:H7 es bastante tolerante a
los ambientes ácidos, sus estudios realizados con alimentos contaminados
experimentalmente han revelado que E. coli O157:H7 sobrevive durante 2 meses
a 4º C en embutidos fermentados secos con únicamente una reducción de unas
cien veces el inóculo inicial. Según Nataro and Kaper, (1998) concentraciones de
1,5% de ácido acético, cítrico y láctico en carne no parecen afectar
significativamente a este serotipo, además la bacteria sobrevive cuando se
inoculan dosis elevadas en mayonesa (pH 3,6 a 3,9) durante 5 a 7 semanas a 5º
C y de 1 a 3 semanas a 20º C; en sidra (pH 3,6 a 4,0) sobrevive de 10 a 31 días a
8º C y de 2 a 3 días a 25º C. El mecanismo de tolerancia al ácido todavía no se ha
descrito, pero parece estar relacionado con la síntesis de las proteínas de
membrana externa cuya expresión se induce en ambientes ácidos (Sharma et al.,
2004). En este estudio no se consideró el factor pH ya que como se sabe el valor
de este en una hamburguesa es cercano a 5.8 (Elguezabal et al., 1997), por ende
este factor no sería un limitante en el crecimiento de la posible flora patógena y la
hamburguesa representaría una fuente estable de crecimiento para una bacteria
gram negativa (enterobacteria).
Los estudios realizados por Black and Jaczynski, (2006) en cuanto a la
sensibilidad térmica de E. coli O157:H7 en carne picada de vacuno han revelado
que este patógeno no tiene una resistencia especial al calor, con valores D (valor
D = tiempo en minutos para alcanzar un 90% o una reducción de un logaritmo en
una población microbiológica a una temperatura dada) a 57.2, 60, 62.8 y 64,3º C
de 270, 45, 24 y 9.6 segundos, respectivamente. No obstante, la presencia de
grasas incrementa ligeramente la tolerancia termal. Algunos estudios señalan que
tratamientos térmicos capaces de destruir cepas típicas de Salmonella, también lo
harían con cepas de E. coli O157:H7 (Huang, 2004). Es por esto que un punto
crítico de prevención muy importante es alcanzar al menos los 68.3º C en la parte
más interna de los alimentos de origen animal que son sometidos a un proceso
térmico, en algún momento de su cadena de producción o sencillamente en el
momento de ser cocinado por el consumidor para reducir o disminuir el riesgo de
contaminación por este patógeno (Grzadkowska y Griffiths., 2001). En este
estudio y con respecto al factor temperatura, se consideró el transporte de las
muestras, desde la misma “góndola” de distribución hasta el laboratorio donde se
procesaba, en un sistema a 4° C buscando disminuir al mínimo las condiciones de
cómo este factor afectara al alimento.
Técnicas de pesquisa de Escherichia coli O157:H7
En este estudio se evaluaron 2 métodos de diagnóstico basados en técnicas
moleculares de PCR. El proceso de diagnostico estándar se inicia con una
identificación presuntiva de E. coli O157:H7 que debe ser confirmada, si se
presenta como sorbitol negativo en agar SMAC y aglutina en antisuero O157,
remitiéndolas a un laboratorio para buscar la presencia de toxinas y tipificación de
H (Griffin y Tauxe, 1991). Por otro lado y como se mencionó anteriormente
técnicas moleculares como la PCR permiten entregar un diagnostico más certero y
rápido, facilitando así la confirmación de este patógeno.
Técnicas moleculares por PCR:
Las diversas técnicas de PCR son altamente sensitivas y específicas cuando son
usadas con medios de preenrequecimiento o en base a colonias bacterianas. Por
PCR se pueden detectar los genes que codifican para las verotoxinas (stx1 y stx2)
y para los factores de virulencia adicionales de las cepas de EHEC (eae,
pCVD419 y EntHly). Por PCR también se pueden detectar los genes que codifican
para el antígeno somático O157 y para el antígeno flagelar H7. Estos siete genes
(stx1, stx2, eae, CDV419, EntHly, O157 y H7) se emplean por PCR múltiplex para
detectar Escherichia coli O157:H7 (Paton y Paton, 2002).
En este estudio se decidió utilizar los genes eae de intimina (representativo factor
de virulencia del conocido efecto de “adherencia y borramiento” en la célula
intestinal) y del antígeno flagelar H7 (que otorga el serótipo H7) en el PCR
multiplex (apéndice figuras N°1 y 2). El PCR sencillo realizado a las muestras fue
con el objetivo de obtener resultados que permitan establecer una técnica de
screening de múltiplex PCR para detectar Listeria monocytogenes, Salmonella spp
y Escherichia coli O157:H7 en una sola reacción de amplificación en muestras de
alimentos. El oligo para el gen eae, que por su temperatura de alineamiento,
puede ser utilizado junto a otros dos juegos de oligos para pesquisar los
patógenos anteriormente mencionados y generar productos de PCR de diferente
tamaño para cada bacteria, lo que permitiría un diagnóstico diferencial para la
presencia de cada uno. A continuación se procede a especificar las características
de los genes utilizados y otros existentes para la detección de Escherichia coli
O157:H7.
Detección del gen eae. Las mismas sondas eae usadas para identificar a EPEC
también pueden ser utilizadas para identificar a EHEC si derivan de la parte
altamente conservada del extremo 5 ' del gen. La sonda de 1-kb descrita por Jerse
et al., (1990) ha sido utilizado en muchos estudios por ser altamente sensitiva y
específica. Otras sondas dobles han sido desarrolladas para detectar secuencias
del extremo 5 ' del gen eae (Gannon et al., 1993; Willshaw et al., 1994). El extremo
3 ' del gen eae puede establecer diferencias entre distintos serotipos. Es por esto
que pruebas específicas de oligonucleotidos (Willshaw et al., 1994) y PCRs (Karch
et al., 1987; Gannon et al., 1993) han sido desarrollados para detectar secuencias
del extremo 3 ' del gen eae de EPEC O127:H6 (Gannon et al., 1993), EHEC
O157:H7 (Gannon et al., 1993; Schmidt et al., 1993; Willshaw et al., 1994), y
cepas EHEC O111. En relación a esto algunos estudios señalan que cepas
O157:H45, O157:H8, y O157:H39 negativas a stx poseen una secuencia 3 ' eae
casi idéntica a las encontradas en EPEC O127:H6 pero muy diferentes de las
secuencias eae de O157:H7 (Schmidt et al., 1993, Willshaw et al., 1994). En otras
investigaciones los partidores para eae han sido combinados con primers para
stx1 y stx2 en PCRs múltiplex (Fratamico et al., 1995). En este estudio en el PCR
multiplex se utilizaron sondas del extremo 3 ' del gen eae ya que como se
mencionaba esta puede diferenciar entre serotipos, en el caso del PCR sencillo se
utilizaron sondas del extremo 5 ' del gen eae explicándose así las diferentes
respuestas que presentaron las muestras que resultaban positivas a una técnica
de PCR pero no a la otra (tabla N° 6).
Detección el gen fliC, que codifica el antígeno H7. Estos primers de fliC también
han sido combinado con primers para stx y eae en PCRs múltiplex desarrollando
una identificación específica de Escherichia coli O157:H7, O157: NM, y otras
cepas EHEC (Gannon et al., 1997). En este estudio las diferentes respuestas de
las muestras a PCR con distintos primers se debe a que VS (PCR sencillo) tendría
mayor selección por O157 que por H7, además el serotipo H7 se puede presentar
asociado a serogrupos diferentes de O157 como por ej: O22:H7, O159:H7 (Pollard
et al., 1990; Kawasaki et al., 2005;). Detección de genes de verotoxinas. Estos genes (stx) se han utilizado en PCR
simple, como también en técnicas de múltiplex PCR, existiendo numerosos
oligonucleotidos y protocolos para la amplificación de estos genes. Algunos
estudios anteriores usaron solo un par de oligos para detectar ambas verotoxinas
stx1 y stx2; sin embargo, la mayoría de los métodos actuales incluye dos pares de
oligonucleotidos que generan productos de amplificación de tamaños diferentes
para stx1 y stx2 respectivamente (Pradel et al., 2000). No todos los pares de
oligonucleotidos diseñados para stx2 detectan todas las variantes de este gen.
Karch et al., (1992) probó la estabilidad del gen stx en 45 cepas que fueron stx
positivo en un aislamiento inicial. Después de pasar las cepas por agar tripticasa
de soja y otros medios de laboratorio comúnmente ocupados, 15 de las 45 cepas
habían perdido los genes, ya sea stx1 o stx2, esta pérdida de genes stx también
ha sido observada en cultivos seriados (Karch et al., 1992). En otros estudios la
PCR se ha usado para detectar niveles bajos de stx en carne molida y otras
comidas. De 0.5 a 1 UFC de E. coli positivas a stx por gramo de carne molida
pueden ser detectados después de aplicar un caldo de enriquecimiento (Witham et
al., 1996). En este estudio no se buscó la presencia de estos genes ya que como
se menciona la producción de verotoxinas no es específica de este serotipo y por
que además su estabilidad es variable entre diferentes cepas.
Detección de pO157 plasmidio/hemolisina. El plasmidio pO157 está presente casi
en todas las cepas O157:H7 y muchas otras cepas EHEC. Un fragmento de 3.4-kb
derivado de este plasmidio (designado CVD419), se ha usado extensamente para
identificar y caracterizar cepas EHEC a pesar de desconocerse la función de las
secuencias contenidas en esta sonda. Este plasmidio se encontró que contenía
los genes ehxA (hlyA) que codifican para la hemolisina de EHEC. Con el paso del
tiempo pruebas de oligonucleotidos y técnicas de PCR han sido desarrolladas
para detectar el plasmidio pO157 y también genes que codifican la hemolisina
(Fratamico et al., 1995; Tozzoli et al., 2005). Pero en este estudio no se pesquiso
por no ser característico del serotipo.
En relación al indicador kappa obtenido al ingresar los datos al programa SISA y
utilizando un índice de confianza del 95% (con una varianza de 0.01228 un error
estándar de 0.11083), este programa nos entrega un valor de 0.487 para este
indice, además nos define nuestro kappa entre un rango, de la siguiente forma:
0.27 <índice kappa <0.704, esto quiere decir que el valor obtenido al comparar las
dos técnicas, señala que su grado de concordancia se encuentra entre un nivel
bajo o aceptable y que por ende no se podría reemplazar la utilización de una
técnica, por otra, en este caso el multiplex por el sencillo. Si fuera el caso y
debiéramos tomar una desición, con estos valores (tabla N° 7), deberíamos optar
por el PCR multiplex si queremos realizar una pesquisa especifica de Escherichia
coli O157:H7 y ocupar, como se ha mencionado anteriormente, en forma de
screening el protocolo del PCR sencillo.
Frecuencia de aislamiento de Escherichia coli O157:H7
En el caso de pesquisa de Escherichia coli O157:H7 en alimentos es importante
destacar que análisis retrospectivos de alimentos asociados con brotes de colitis
hemorrágicas han revelado que la dosis infectiva es muy baja (Levine et al., 1993).
Entre 0,3 y 15 bacterias por gramo de Escherichia coli O157:H7 fueron detectadas
en varios lotes de carne de vacuno congelada implicada en un brote importante
ocurrido en Estados Unidos, además en un salami asociado con otro brote se
detectaron de 3 a 4 células por 10 gramos (Ebel et al., 2004). Se a señalado
también que desde 1996 ha habido un desplazamiento hacia otras fuentes de
alimentos por parte de este patógeno, tales como alfalfa, jugo de manzana no
pasteurizado y lechuga.
Marzocca et al., (2006) pesquisó la presencia de Escherichia coli 0157:H7 en
carnes picadas frescas y hamburguesas congeladas, las que fueron obtenidas de
supermercados en un total de 37 y 43, respectivamente. Estas muestras se
procesaron utilizando el caldo EC modificado con novobiocina, seguido de la
aplicación de un método de inmunocaptura y posterior aislamiento en agar
MacConkey sorbitol suplementado con cefixima y telurito de potasio. Las cepas
sospechosas fueron caracterizadas genotípicamente mediante la detección de los
genes de virulencia stx1, stx2, eaeA y EHEC-hlyA por PCR. De todas las muestras
aisladas solo una de carne picada fresca resultó ser E. coli O157:H7,
caracterizada como positiva a los oligos para los genes eae y stx2 y negativa para
el oligo del gen hlyA.
Gomez et al., (2002) determinó la frecuencia de ECEH en 95 muestras de
hamburguesas supercongeladas y en 114 quesos de pasta blanda, siendo esta de
8,4% y 0,9%, respectivamente. Las cepas fueron caracterizadas genotípicamente
para la detección de los genes de virulencia stx1, stx2, eaeA y hlyA, por PCR.
Todas las cepas STEC fueron caracterizadas como negativo para eaeA y positivo
para hlyA. El genotipo prevalente fue stx2 (77,8%), y los serotipos en orden de
frecuencia fueron: O8:H19 (5 cepas), O113:H21 (1 cepa), O8:H16 (1 cepa), y
O39:H49 (1 cepa),
Chen et al., (1998) en su estudio, señala que al aislar e identificar Escherichia coli
O157:H7 de muestras de carne molida por medio de separación inmunomagnética
y PCR, con una incubación previa en caldo de preenriquecimiento no selectivo de
a lo menos 10 horas permite la detección de 10 UFC/mL.
Johnson et al., (1998) en su estudio a base de muestras de carne picada
inoculadas con Escherichia coli 0157:H7 comparó la capacidad de pesquisa de
esta bacteria por métodos de cultivo tradicional (SMAC), inmunodifusión y un
método de sreening, obteniendo como resultados una tasa de detección de 39%,
71.5% y 96.5% respectivamente. También Kim and Doyle, (1992) utilizaron un
inmuno ensayo para la detección de esta bacteria en 76 muestras de carne molida
obtenidas desde sus puestos de venta, encontrando solo 1 positiva.
Estimaciones de Tilden et al., (1996), señalan que en un estudio en salames, de
32 muestras solo 1 resultó positiva a Escherichia coli 0157:H7.y que la presencia
de este patógeno seria de 3 organismos por 10 gramos.
Como se observa la frecuencia de aislamiento de Escherichia coli 0157:H7 desde
muestras de subproductos cárnicos es relativamente baja, considerando
variaciones tanto en los números muéstrales como las técnicas utilizadas, lo que
concuerda con los resultados obtenidos en este estudio (1 positiva de 60 muestras
por medio de técnicas moleculares, ósea 1.6%) (Tabla N° 6), La respuesta que
sugieren algunos autores como principal explicación, es la mayor preocupación
que existe por parte de las empresas de entregar alimentos inocuos al consumidor
estableciendo programas como normas ISO 22000:2005 (HACCP) en sus
sistemas de producción. En Chile la presencia de E. coli en los alimentos en cifras
suficientemente elevadas como 102/g en carne fresca se utiliza para indicar una
probable contaminación fecal y la posible presencia de otros microorganismos
enteropatógenos como, por ejemplo, Salmonellas (Ministerio de Salud de Chile,
2004). Pero como enteropatógeno, las cifras generalmente aceptables adquieren
un nuevo significado, ya que solamente la presencia de una bacteria de
Escherichia coli O157:H7 por gramo representa un grave riesgo de infección. En
relación a los resultados de este estudio y analizar la tabla N° 6 donde se ve que
las 60 muestras presentaron distintos resultados a los diferentes juegos de
oligonucleotidos y procedimientos de PCR ocupados, se observo que para el PCR
multiplex resultó sólo 1 muestra positiva a ambos genes (O157:H7) y 5 a sólo uno
(H7), además se puede mencionar que en este caso la empresa “b”, que fue la
que presentó la muestra positiva a ambos oligonucleotidos, también fue la que
mostró una mayor cantidad de muestras que reaccionaron a algún partidor. En
cuanto al PCR sencillo utilizado, la empresa “b” vuelve a ser la que presenta
mayor cantidad de muestras positivas, en este caso a los oligonucleotidos vs8 y
vs9 (que identifica únicamente al serogrupo O157). También es importante
destacar que solo la muestra “11b” resulto positiva para ambas pruebas
moleculares realizadas. En resumen estos resultados indicarían que de las cuatro,
la empresa “b” presentaría un grado de contaminación en las muestras
analizadas, debido tal vez a falencias en los procedimientos de sanitazación en
sus líneas de procesos.
Por otro lado en una evaluación de métodos de diagnóstico de E. coli 0157:H7
hecha por Terrance et al., (2005) encontró que dos cepas de O55:H7 generaban
reacción cruzada en la detección por un test comercializado tipo screening de
PCR por el serotipo H7, pero que esto no se apreciaba cuando a la extracción de
ADN se le agregaba separación inmunomagnética, además menciona que no
hubo falsos positivos al probar los métodos con cepas O157 de diferente H.
Fegan et al., (2005) menciona que en muestreos realizados en mataderos a
vacunos en diferentes etapas de faenamiento en busca de E. coli O157, de 606
muestras, 66 fueron positivas a este patógeno detectándose además en todas
estas muestras la presencia del gen eae.
Hussein and Bollinger, (2005) comentan el aislamiento de diferentes cepas de E.
coli en ganado vacuno, donde destaca el hecho de haber encontrado cepas
O157:H8 productoras de stx2 y portadoras del gen eae. Además dentro de las
STEC encontradas menciona a O104:H7, O121:H7, O108:H7, O113:H7, O117:H7.
Como se a mencionado diversos tipos de Escherichia coli (que pueden presentar
serotipos H7 ó serogrupos O157) han sido aislados de muestras tanto de animales
bovinos como de subproductos cárnicos, lo que dificultaría la detección de E. coli
O157:H7 en estas muestras haciendo necesario considerar la utilización, de a lo
menos, dos pares de oligonucleotidos para la realización de técnicas moleculares,
como un multiplex PCR, que permitiría la identificación especifica del patógeno,
logrando utilizarla así, como método de diagnóstico confirmatorio de la presencia
de esta bacteria. Es importante destacar el hecho de que la PCR utilizada en este
estudio sólo evalúa la presencia de genes en la muestra, en este caso de E. coli,
pero no determina la viabilidad de ella (claro ejemplo tenemos en este estudio
donde la muestra “11b” que resultó positiva a ambos PCRs realizados no creció
cuando se sembró en una placa de agar Endo), tampoco permite hacer un
recuento del número de microorganismos presente en la muestra; sin embargo
estos aspectos son resueltos por las técnicas tradicionales de cultivo, en base a
los cuales se permite determinar si el alimento es apto para consumo o no.
Como último aspecto a mencionar podemos decir que según los resultados
obtenidos en este estudio se aceptaría la hipótesis planteada en un comienzo ya
que dichos resultados evidencian que al pesquisar Escherichia coli O157:H7
utilizando dos técnicas de PCR distintas, estas entregaran diferentes resultados.
VII. CONCLUSIONES
Las cepas del serotipo O157:H7 presentaron una baja frecuencia de
aislamiento en las hamburguesas muestreadas (1.6%, ósea 1 de 60 muestras).
Las dos técnicas diferentes de PCR utilizadas para la pesquisa e
identificación de cepas de Escherichia coli O157: H7 en hamburguesas
comercializadas en la provincia de Ñuble presentaron un grado de concordancia
entre bueno y aceptable, señalando que los resultados obtenidos variaran según
la técnica a utilizar.