new estudo das alterações morfo-funcionais de espermatozóides … · 2010. 12. 14. · folha de...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

DEPARTAMENTO DE REPRODUÇÃO ANIMAL

Estudo das alterações morfo-funcionais de

espermatozóides bovinos submetidos à sexagem por

meio da técnica de citometria de fluxo

Priscilla Harumi Tanno São Paulo 2009

Priscilla Harumi Tanno

Estudo das alterações morfo-funcionais de

espermatozóides bovinos submetidos à sexagem por

meio da técnica de citometria de fluxo São Paulo 2009

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Departamento: Reprodução Animal Área de Concentração: Reprodução Animal Orientador: Prof. Dr. Rubens Paes de Arruda

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2168 Tanno, Priscilla Harumi FMVZ Estudo das alterações morfo-funcionais de espermatozóides bovinos

submetidos à sexagem por meio da técnica de citometria de fluxo / Priscilla Harumi Tanno. – São Paulo : P. H. Tanno, 2009.

100 f. : il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Reprodução Animal, 2009.

Programa de Pós-Graduação: Reprodução Animal. Área de concentração: Reprodução Animal.

Orientador: Prof. Dr. Rubens Paes de Arruda.

1. Sêmen sexado. 2. Bovino. 3. Fosforilação da tirosina. 4. Membrana plasmática.

5. Reação acrossômica. 6. Citometria de fluxo. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: TANNO, Priscilla Harumi Título: Estudo das alterações morfo-funcionais de espermatozóides bovinos submetidos à sexagem por meio da técnica de citometria de fluxo. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Data: ____/____/_____

Banca Examinadora

Prof. Dr. __________________________ Instituição: _______________________

Assinatura:__________________________ Julgamento: _______________________

Prof. Dr. __________________________ Instituição: ______________________

Assinatura: __________________________ Julgamento: ______________________

Prof. Dr. __________________________ Instituição: _____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: _____________________

“TUDO O QUE TEMOS DE DECIDIR

É O QUE FAZER COM O TEMPO QUE NOS É DADO.”

J. R. R. TOLKIEN

DEDICO ESTA DISSERTAÇÃO

Aos meus Pais, Roberto Toshio Tanno e Amélia Hideco Tanno e à minha irmã,Thais

Hitomi Tanno, por todo o carinho, incentivo e apoio que sempre me deram sem medir

esforços, o meu mais profundo amor e gratidão

À minha família, em especial à minha tia Edna Tomiko Kato, pelo apoio e incentivo

constantes

Ao meu marido, Pablo Eduardo Martins de Paiva,

Que esteve e continua sempre ao meu lado, me apoiando, amparando e norteando os

meus passos, que compartilhou com amor todos os momentos felizes e me confortou, nos mais

difíceis com toda a sua calma e paciência

Digo que sou uma pessoa de sorte por ter você ao meu lado e por fazer parte da sua

vida!

AMO MUITO TODOS VOCÊS!!!

AO MEU ORIENTADOR, PROF. RUBENS,

Gostaria de expressar a minha gratidão, o meu respeito e minha admiração pelo profissional ético,

justo e competente, como toda pessoa formadora de opinião deve ser.

Agradeço por ser parte integrante do seu grupo de pesquisa e espero que se estenda para o

doutorado.

Saiba que o senhor como orientador e professor foi muito importante para o meu crescimento e

amadurecimento profissional e pessoal e que se tornou um amigo dentro do meu círculo de amizades e espero

que assim continue.

AGRADECIMENTOS À DEUS, por me permitir chegar até aqui e colocar pessoas tão especiais no meu caminho. À Sexing Technologies , por permitir a realização de uma das minhas principais metas e por fazer parte desta equipe de trabalho. Aos meus amigos da Sexing Technologies, Juan Moreno, Mr. Maurice Rosenstein, Evanil Pires de Campos Filho, Osvaldo Teobaldo Filho, Cláudia Fernandes Raphael, Thaís Rose dos Santos Hamilton, Esther Furuichi Maia, Flávio Marcelo Chagas, Adriano Ronconi, Fernando Morales Salles Prestes, Rosiára Rosária Dias Maziero, Sthéfano Gaudenzio Pannazzolo, Bruna Cristina de Souza, Janeth Rosendo dos Santos, Eduardo Ramos Bennedetti, Érika Junqueira da Fonseca, pelo apoio e amizade, pois sem vocês isto não seria possível de se concretizar Aos meus amigos da CRV Lagoa, Dra. Lúcia Helena Rodrigues e Carlos Silva pela grande cooperação e incentivo Aos meus amigos pós-graduandos da USP, principalmente o André Furugen César de Andrade e a Fabiane Gilli Zaffalon que me auxiliaram muito com as análises, estatística, gráfico e ao Andres Mejia Escobar Tiquito que me ajudou com os organogramas... Muito obrigada, pois sem vocês seria impossível cumprir no prazo! À Profa. Eneiva Carla Celeghini pela presteza e eficiência em me socorrer sempre nos momentos mais não digo difíceis, mas incisivos!Muito obrigada! Ao Departamento de Reprodução Animal pela oportunidade de fazer parte desta benemérita instituição

Aos Professores do Departamento de Reprodução Animal com quem pude além de conviver, buscar

conhecimentos que foram e serão importantes em toda a minha vida profissional...Prof. Dr. Pietro Sampaio

Baruselli, Prof. Dr. Marcelo Alcindo de Barros Vaz Guimarães, Prof. Dr. José Antonio Visintin, Profa.

Dra. Valquiria Hyppolito Barnabe, Prof. Dr. Renato Campanarut Barnabe, Profa. Dra. Clair Motos de

Oliveira, Profa. Dra. Camila Infantosi Vannucchi, Profa. Dra. Mayra Elena Ortiz D’Avila Assumpção e

ao Prof. Dr. Claudio Alvarenga de Oliveira....muito obrigada

Ao Professor Dr. Paulo Henrique Mazza Rodrigues, por ter tido muita paciência e compreensão em sua disciplina e, principalmente, por me ensinar os conceitos de estatística, fundamental na pesquisa À Harumi D. Shiraishi, pela dedicação e presteza de sempre.

RESUMO

TANNO, P. H. Estudo das alterações morfo-funcionais de espermatozóides bovinos submetidos à sexagem por meio da técnica de citometria de fluxo. [Study of morpho-functions alterations in bovine spermatozoa submitted on sorting through flow cytometry technology]. 2009. 100 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações morfo-funcionais do sêmen bovino submetido

à sexagem através da técnica de citometria de fluxo e comparar com o sêmen convencional e

a diferença entre as subespécies. O sêmen foi obtido de seis touros, sendo três taurinos

(Holandês preto e branco) e três zebuínos (Gir leiteiro), com quatro ejaculados de cada animal

(n = 24). Cinco tratamentos foram realizados: sêmen convencional com diluidor L (Lagoa);

sêmen convencional com diluidor S (Sexing) e sêmen sexado (nos tempos de zero, três e seis

horas após a ejaculação para avaliar se existem alterações de membranas ao longo do tempo).

Foram avaliados pela citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e

reação acrossomal (PI/FITC-PSA); peroxidação lipídica (C11-BODIPY581/591) e capacitação

espermática através de análises da fosforilação da tirosina e aumento da fluidez e

desorganização da membrana plasmática (Merocianina 540 e Yo-Pro1). Os efeitos de

tratamentos foram avaliados por análises de variância (ANOVA), empregando-se o programa

estatístico Stat-View® (SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Foram considerados

significativos os valores com P<0,05 e com tendência a significância (P<0,10). O sêmen

proveniente da subespécie taurina teve um efeito negativo mais significante do que a zebuína

na qualidade do sêmen. O sêmen sexado apresentou maior peroxidação lipídica nos

espermatozóides com membrana íntegra e a presença de proteínas fosforiladas na superfície

da membrana plasmática, fatores que são indicativos de capacitação espermática. Porém, ao

contrário do esperado, este aumento não foi acompanhado pela quantidade de células

classificadas como capacitadas pela análise de associação de sondas Yo-Pro-1 e Merocianina

540, pois o sêmen convencional apresentou maior população espermática com membrana

plasmática íntegra desorganizada (P<0,05). Não houve piora na qualidade do sêmen sexado

devido ao tempo de espera do ejaculado (P<0,05).

Palavras-chave: Sêmen sexado. Bovino. Fosforilação da tirosina. Reação acrossômica. Citometria de fluxo.

ABSTRACT

TANNO, P. H. Study of morpho-functions alterations in bovine spermatozoa submitted on sorting through flow cytometry technology. [Estudo das alterações morfo-funcionais de espermatozóides bovinos submetidos à sexagem por meio da técnica de citometria de fluxo]. 2009. 100 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

The objective of this study was to evaluate the morpho-functions alterations in bovine semen

submitted on sorting through flow cytometry technology and compare with conventional

semen and the difference between the subspecies. Semen was obtained from six bulls, that

three were taurine (Holstein Black and White) and three were zebuine (Dairy Gir) with four

ejaculates from each animal (n = 24). Five treatments were performed: conventional semen

with L (Lagoa) media; conventional semen with S (Sexing) media and sexed semen (zero,

three and six hours after ejaculation to evaluate if there were membrane alterations over the

time). The treatments were analyzed with flow cytometry as for plasmatic membrane integrity

and acrosome reaction (PI/FITC-PSA); lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591) and sperm

capacitation through protein tyrosine phosphorylation and the increase in plasma membrane

fluidity and disorganization (Merocyanine 540 and Yo-Pro-1). The treatments effects were

evaluated by analysis of variance (ANOVA) (Stat-View®, SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC,

USA). Effects were considered significant if the values were P<0.05 and with significant

tendency (P<0.10). Semen from the taurine subspecie had a more significant negative effect

than zebuine on semen quality. Sexed semen showed more lipid peroxidation in sperm with

membrane integrity and the presence of phosphorylated proteins in plasma membrane surface

that seemed to be sperm capacitation. However, in the contrary of expected, this increase did

not accompany with quantity of cells classified as capacitated by the association probes Yo-

Pro-1 e Merocyanine 540 analyse because the conventional semen showed more sperm

population with plasma membrane integrity disorganized (P<0.05). There was not worsening

in sexed semen quality over the time ejaculate waiting (P<0.05).

Keywords: Sexed semen. Bovine. Tyrosine phosphorylation. Acrosome reaction. Flow

cytometry.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema resumido do delineamento experimental .................................................50 Figura 2 - Esquema simplificado para a obtenção da concentração espermática.....................52 Figura 3 - Aparelho de Citometria de Fluxo SX MOFLO® .....................................................56 Figura 4 - Gráfico de pontos gerado pela análise de 10.000 células por citometria de fluxo.

Amostra corada com a associação H33342, PI, FITC-PSA permitindo a classificação dos espermatozóides bovinos em quatro categorias – Pirassununga – 2009..........................................................................................................................59

Figura 5 - A. Gráfico de pontos gerado pela análise por citometria de fluxo em amostra corada

com a associação das sondas fluorescentes C11-BODIPY, H33342 e PI. Podem-se observar duas categorias distintas, sendo que o quadrante MPI contém os espermatozóides bovinos com a membrana plasmática íntegra e selecionados para a avaliação da intensidade da peroxidação das membranas. B. Histograma com a população selecionada MPI que está sendo analisada quanto à distribuição da fluorescência captada no fotomultiplicador com band pass de 530 ±15 nm (células com peroxidação lipídica). O valor obtido é indicado no quadro como a média e a mediana em unidades arbitrárias (ua) – Pirassununga – 2009 .................................60

Figura 6 - Gráfico de pontos gerado pela análise por citometria de fluxo, neste caso as células

foram coradas com a associação do H33342, Yo-Pro-1 e da Merocianina 540 permitindo a classificação dos espermatozóides bovinos em três categorias – Pirassununga – 2009 ................................................................................................62

Figura 7 - A. Gráfico de pontos gerado pela análise por citometria de fluxo em amostra corada

com a associação de H33342, com anticorpo antifosfotirosina conjugado ao FITC e a sonda fluorescente PI. Podem-se observar duas categorias distintas, sendo a MPI os espermatozóides bovinos com a membrana plasmática íntegra e selecionados para a avaliação da detecção dos resíduos de tirosina presentes na superfície da célula. B. histograma apresentando a população selecionada MPI que está sendo analisada quanto à distribuição da fluorescência captada no fotomultiplicador com band pass de 530 ±15 nm (células marcadas com o anticorpo antifosfotirosina). O valor obtido é indicado no quadro como a média e a mediana em unidades arbitrárias (ua) – Pirassununga - 2009 .....................................................................63

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal e membrana plasmática íntegra (SRAMI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009..........................................................................................67

Gráfico 2 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal e

membrana plasmática íntegra (SRAMI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009...............................................................68

Gráfico 3 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) com reação acrossomal e

membrana plasmática íntegra (CRAMI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009..........................................................................................69

Gráfico 4 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) com reação acrossomal e

membrana plasmática íntegra (CRAMI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009 ..............................................................70

Gráfico 5 - Médias ± erros padrão da porcentagem de células com membrana plasmática

íntegra (MI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009..................................................................................................................................71

Gráfico 6 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) com membrana plasmática

íntegra (MI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009 ................................................................................................72

Gráfico 7 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal (SRA)

no sêmen bovino pós-descongelação nos cinco tratamentos descritos acima – Pirassununga - 2009.................................................................................................73

Gráfico 8 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal (SRA)

no sêmen de taurinos e zebuinos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009..................................................................................................................................74

Gráfico 9 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de fluorescência

da população espermática com membrana plasmática íntegra e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPI) no sêmen bovino submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009 .............75

Gráfico 10 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de fluorescência da população espermática com membrana plasmática íntegra e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009...................................................................76

Gráfico 11 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência emitida pela população espermática com membrana plasmática lesada e coradas com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPL) do sêmen bovino submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009 ................................................................................................77


fluorescência da população espermática com membrana plasmática lesada e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPL) no sêmen de taurinos e zebuinos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009...................................................................78


fluorescência emitida pela população espermática com a membrana plasmática íntegra e marcada com o anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína (FOIFMI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009.......................79

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µL microlitro µm micrômetro µM micromolar A23187 ionóforo de cálcio AIMI membrana plasmática íntegra e acrossomo não reagido ARMI membrana plasmática lesada e acrossomo reagido C11-BODIPY581/591 4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3ª,4ª-diaza-s-indacene-3-undecanoic acid Ca2+ íon calico cAMP adenosina-monofosfato ciclica Cl- íon cloro CRAMI com reação acrossomal e membrana plasmática íntegra Diluidor L diluidor Lagoa Diluidor S diluidor Sexing DNA ácido desoxirribonucléico EROs espécies reativas de oxigênio ERK regulação de sinal extracelular FITC isotiocianato de fluoresceína FOIFMI intensidade da fluorescência emitida pela população espermática com membrana plasmática íntegra e marcada com o anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína g grama g gravidade h hora H2O2 peróxido de hidrogênio H33342 Hoechst 33342 HDL lipoproteína de alta densidade HO2 hidroperoxil HOCL ácido hipocloroso HOCl ácido hipocloroso

Hz Hertz IA inseminação artificial IP iodeto de propídio K+ íon potássio LPC lisofosfatidilcolina MAPK proteínas quinases mitógenas-ativadas MEMID quantidade de células com membrana plasmática íntegra desorganizada mg miligrama Mg2+ íon magnésio MI somatória das células com membrana plasmática íntegra min minuto mL mililitro mM milimolar MP espermatozóide com médio potencial de membrana mitocondrial MP motilidade progressiva MPI células com membrana plasmática íntegra (viáveis) MPL espermatozóide com membrana plasmática lesada MT motilidade total Na+ íon sódio NCAP células viáveis não capacitadas NCMPI espermatozóide não capacitado com membrana plasmática íntegra nm nanômetro O2-• ânion superóxido OH- radicais hidroxil p nível de significância PEIFMPI intensidade da fluorescência da população espermática com membrana plasmática íntegra e coradas com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 pH concentração de íons de hidrogênio PKA proteína quinase A PSA aglutinina de Pisum sativum RA reação acrossômica

RNS espécie reativa de nitrogênio RO• alcoxil ROO- peroxil s segundos SAS Statistical Analysis System (Sistema de Análise Estatística) SNAREs soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein

receptor proteins SOD superoxido-dismutase SRA somatória das células com membrana acrossomal sem reação SRAMI sem reação acrossomal e membrana plasmática íntegra TALP meio de Tyrode suplementado com albumina, lactato e piruvato

TALPm meio de Tyrode suplementado com lactato e piruvato e sem adição de

CaCl 2H2O e NaHCO3 ua unidades arbitrárias ZP zona pelúcida

ZP3 proteína recombinante não ativa

LISTA DE SÍMBOLOS

°C graus Celsius % percentagem x vezes 106 milhões ® marca registrada < menor que > maior que ± mais ou menos - menos / negativo + mais/positivo = igual ° grau

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................22

2 REVISÃO DE LITERATURA...........................................................................................27

2.1 HISTÓRICO DA SEXAGEM........................................................................................27

2.2 DIFERENÇAS NO DNA ESPERMÁTICO ..................................................................28

2.3 O ESPERMATOZÓIDE ................................................................................................31

2.3.1 A membrana plasmática .......................................................................................32

2.3.2 Capacitação espermática ......................................................................................35

2.3.3 Fosforilação de proteínas ......................................................................................37

2.3.4 Reação acrossômica ...............................................................................................39

2.4 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO ......................................................................41

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................45

4 HIPÓTESES ........................................................................................................................47

5 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................49

5.1 LOCAL...........................................................................................................................49

5.2 ANIMAIS E MANEJO ..................................................................................................49

5.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.........................................................................49

5.4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS......................................................................50

5.4.1 Colheita do sêmen..................................................................................................51

5.4.2 Avaliações do sêmen in natura..............................................................................51

5.4.3 Congelação do sêmen pela técnica convencional ................................................54

5.4.4 Sexagem espermática pela técnica de citometria de fluxo .................................54

5.4.5 Criopreservação do sêmen sexado .......................................................................56

5.4.6 Avaliações do sêmen convencional (dois diluidores) e do sexado (três

diferentes tempos)...........................................................................................................57

5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................................63

6 RESULTADOS ....................................................................................................................66

6.1 INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA E REAÇÃO ACROSSOMAL

EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO ....................................................................66

6.2 INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA EM SÊMEN CONVENCIONAL

E SEXADO ..........................................................................................................................70

6.3 REAÇÃO ACROSSÔMICA EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO...............72

6.4 PEROXIDAÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA EM SÊMEN CONVENCIONAL

E SEXADO ..........................................................................................................................74

6.5 FOSFORILAÇÃO DO AMINOÁCIDO TIROSINA EM ESPERMATOZÓIDES COM

MEMBRANA PLASMÁTICA ÍNTEGRA EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO

..............................................................................................................................................78

6.6 ESTABILIDADE (FLUIDEZ) DA MEMBRANA PLASMÁTICA ÍNTEGRA

DESORGANIZADA EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO.................................80

7 DISCUSSÃO ........................................................................................................................84

8 CONCLUSÕES....................................................................................................................89

REFERÊNCIAS .....................................................................................................................92

1 Introdução

1 Introdução 22


1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento da sexagem de sêmen, separando-se o espermatozóide contendo o

cromossomo X do Y baseado na diferença de DNA empregando-se a citometria de fluxo, foi

largamente aceito como o principal avanço na tecnologia da reprodução (BLONDIN et al.,

2009). A pré-seleção do sexo pode acelerar o progresso genético como também, beneficiar o

manejo e a eficiência produtiva (MAXWELL et al., 2004; PARRILLA et al., 2005). Esta

técnica foi desenvolvida por Larry A. Johnson em 1989, no USDA Beltsville Agricultural

Research Center (SEIDEL JR. et al., 1999; JOHNSON, 2000; GARNER; SEIDEL JR., 2003;

WEIGEL, 2004; GARNER, 2006) e é o único método validado até o momento para a pré-

seleção do sexo antes do nascimento (GRAAF et al., 2009). Todavia, somente nos bovinos, a

tecnologia atingiu um nível de desenvolvimento que permitiu a sua aplicação comercial

(RATH; JOHNSON, 2008).

O emprego do sêmen sexado permite aumentar o impacto na eficiência produtiva de

carne e leite, produzindo uma proporção ideal de machos e fêmeas, adquirindo vantagens de

características limitadas e influenciadas pelo sexo, e ainda, obter manejos práticos e flexíveis

economicamente (RATH; JOHNSON, 2008). Adicionalmente permite selecionar entre seus

rebanhos, as matrizes potenciais, produzindo novilhas de reposição apenas de animais

geneticamente superiores (HOHENBOKEN, 1999; WEIGEL, 2004; MOCÉ et al., 2006). É

esperada a elevação do ganho genético de até 15% comparado ao sêmen convencional, além

da redução do custo de programas de teste de progênie e transferência de embrião e, aumento

do valor de marcadores genéticos (HOHENBOKEN, 1999; JOHNSON, 2000; WEIGEL,

2004; DE VRIES et al., 2008).

A precocidade sexual em gado de corte, no âmbito econômico, mostra grande

importância devido à redução de custos de produção de novilhas de reposição e retorno mais

rápido do capital investido. Na maioria dos rebanhos zebuínos, o número de novilhas que

chegam ao desafio para precocidade sexual não é suficiente para realizar toda a reposição de

fêmeas e intensificar a seleção por precocidade sexual. O uso do sêmen sexado para fêmea

poderia aumentar o número de fêmeas candidatas, acelerando tal processo de seleção.

Já na produção in vitro (PIV) de embriões, sabe-se que a proporção de produção de

embriões machos é maior do que de fêmeas e com o uso do sêmen sexado para fêmea,

inverteria esta proporção, já que as fêmeas têm um valor de mercado maior do que de machos

(WHEELER et al., 2006; RATH; JOHNSON, 2008; RATH et al., 2009). No âmbito da saúde

1 Introdução 23


humana, uma das aplicações de destaque é na prevenção de doenças genéticas ligadas ao sexo

(SEIDEL JR., 2003; MAXWELL et al., 2004; MOCÉ et al., 2006).

É importante ressaltar que as populações de bezerros resultantes do sêmen sexado não

diferem da população de animais oriundos do sêmen convencional, incluindo o tempo de

gestação, peso ao nascer, taxa de mortalidade e ganho de peso (SEIDEL JR., 2003). Não

foram encontrados até o momento efeitos genotóxicos no sêmen sexado com o uso do

Hoechst 33342 (PARRILLA et al., 2004; GARNER, 2006).

Entretanto, o espermatozóide é sensível a diferentes etapas, incluindo o processo

através do citômetro de fluxo, como a ligação ao corante nuclear Hoechst, a alta diluição,

mudanças na composição dos diluidores, a alta pressão, as forças mecânicas associadas com a

passagem através da máquina, a exposição ao laser UV, a descarga elétrica e a projeção no

tubo coletor em alta velocidade e a centrifugação (MAXWELL; JOHNSON, 1999;

JOHNSON, 2000; GARCIA et al., 2007).

Baseando-se na literatura, o sêmen sexado apresenta algumas desvantagens que estão

relacionadas à sua fertilidade, avaliada através da taxa de prenhez que variou de 70 a 80% em

relação ao sêmen convencional (SEIDEL JR. et al., 1999; GARNER, 2006; MOCÉ et al.,

2006; WHEELER et al., 2006; SEIDEL JR., 2009) em bovinos (SEIDEL et al., 1999),

eqüinos (LINDSEY et al., 2002), ovinos (HOLLINSHEAD et al., 2002) e suínos

(PARRILLA et al., 2004). Dentre eles estão: a baixa concentração (2,1 x 106

espermatozóides) por dose (ANDERSSON et al., 2004; PARRILLA et al., 2004), embora

tenha sido reportado que doses similares tanto do sexado quanto do controle inseminadas

resultaram em taxas de prenhez similares (BODMER et al., 2005); o tempo de sobrevida

menor após a criopreservação (SHENK et al., 1999; SEIDEL JR.; GARNER, 2002;

WHEELER et al., 2006; CERCHIARO et al., 2007; GARCIA et al., 2007; RATH;

JOHNSON, 2008; DE VRIES et al., 2008; SEIDEL, 2009) e aumento de danos nas

membranas (PARRILLA et al., 2005).

A capacitação é definida como uma série de transformações que o espermatozóide

normalmente sofre durante a sua migração através do trato genital feminino, a fim de atingir e

ligar-se à zona pelúcida (ZP) do oócito, sofrendo reação acrossômica e fertilizando o oócito

(LAMIRANDE et al., 1997; URNER; SAKKAS, 2003; BREIBART et al., 2005; GADELLA,

2008). Durante este processo, há extensas alterações intracelulares, ocorrendo aumento

intracelular na concentração de Ca2+, no pH, na adenosina-monofosfato cíclica (cAMP) e na

fosforilação da proteína tirosina (PONS-REJRAJI et al., 2009a; VISCONTI; KOPF, 1998).

1 Introdução 24


Todavia, todo o mecanismo que engloba a capacitação ainda não foi completamente

esclarecido.

A fosforilação da tirosina é um pré-requisito necessário para a fertilização do oócito e

tem sido associada com a capacitação em várias espécies, incluindo a bovina (LAMIRANDE

et al., 1997; BRENER et al., 2003; URNER; SAKKAS, 2003; BREIBART et al., 2005),

provocando mudanças de hiperativação da motilidade (requerida para penetrar na ZP), reação

acrossômica, ligação da ZP (URNER; SAKKAS, 2003; BREIBART et al., 2005; GADELLA,

2008) e aquisição na capacidade fertilizante (BUFFONE et al., 2005, PONS-REJRAJI et al.,

2009a).

A regulação da fosforilação da tirosina em espermatozóides é decorrente de uma série

de eventos moleculares envolvendo efluxo de colesterol que aumenta a desordem da porção

dos fosfolipídeos, resultando em um aumento da permeabilidade da bicamada lipídica

(BUFFONE et al., 2005; BREIBART et al., 2005; THOMAS et al., 2006).

A desorganização da membrana pode ser avaliada através da utilização da sonda

Merocianina 540, que é uma sonda hidrofóbica que cora mais intensamente as membranas

que possuem maior desordem de seus componentes (translocação dos fosfolipídeos na

bicamada lipídica), como ocorre no espermatozóide capacitado. Também pode ser combinada

ao Yo-Pro-1, sonda que se liga ao DNA celular, possibilitando uma análise da viabilidade

celular associada ao estado da sua membrana lipídica. Esta associação de corantes pode ser

analisada pela técnica de citometria de fluxo (RATHI et al., 2001; THOMAS et al., 2006,

ANDRADE, 2009).

A reação acrossômica dos espermatozóides com membrana plasmática íntegra pode

ser analisada pela técnica de citometria de fluxo, utilizando uma associação de sondas

fluorescentes, a aglutinina de Pisum sativum (PSA) conjugada ao isotiocianato de fluoresceína

– FITC) e iodeto de propídeo (PI) (GRAHAM et al., 1990; SILVA; GADELLA, 2006;

CELEGHINI et al., 2007; ANDRADE, 2009).

As deteriorações das membranas espermáticas estão possivelmente envolvidas na

subfertilidade e/ou infertilidade dos machos (THOMAS et al., 1998; ƠCONNEL et al., 2002;

BROWERS et al., 2005; GILLAN et al., 2005; AMBROGI et al., 2006). Dentre os fatores que

influenciam estão o processo de criopreservação, pois cerca de 50% dos espermatozóides não

sobrevive e a maioria que resiste, desenvolve várias alterações fisiológicas que afetam sua

capacidade fertilizante (THOMAS et al., 1998; PONS-REJRAJI et al., 2009b) e a produção

excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs) (BURNAUGH et al., 2007).

1 Introdução 25


A produção excessiva de EROs causa a peroxidação lipídica da membrana plasmática

celular. O C11-Bodipy581/591, uma sonda fluorescente análoga de ácido graxo insaturado que

possui a capacidade de identificar mudanças nas suas propriedades fluorescentes após a

peroxidação lipídica. A sonda emite uma fluorescência em vermelho quando intercalada

dentro da membrana íntegra, que se altera para a tonalidade de laranja (540nm) após oxidação

pelo peroxinitrito e para o verde (520nm) após ataque com outros radicais oxidativos. É uma

sonda muito apropriada para localizar a peroxidação lipídica nas células espermáticas (usando

um microscópio confocal) e para detectar subpopulações de células espermáticas com

variadas sensibilidades para a peroxidação lipídica empregando a citometria de fluxo,

distinguindo a peroxidação lipídica mediada pelo peroxinitrito das outras EROs (BROWERS;

SILVA; GADELLA, 2005; SILVA; GADELLA, 2006).

De acordo com o exposto, as análises descritas acima são importantes ferramentas

para se determinar a influência da sexagem através da técnica de citometria de fluxo no sêmen

e quais alterações esta tecnologia provoca, pois ainda não foi totalmente elucidado na

literatura qual a real causa da menor fertilidade do sêmen sexado em relação ao sêmen

convencional após a criopreservação.

2 Revisão de Literatura

2 Revisão de Literatura 27


2 REVISÃO DE LITERATURA

A sexagem de sêmen através da citometria de fluxo, baseada na diferença de DNA, tem

mostrado ser um método bastante eficaz para diferenciar a determinação sexual entre os

gametas e separá-los para que possam predeterminar o sexo em mamíferos antes da fertilização

com uma acurácia de 90% (GARNER, 2006).

O processo de comercialização de sêmen sexado tem sido acelerado nos últimos anos.

Entretanto, esta tecnologia tem sido caracterizada pelo alto custo, complexidade de

implementação e baixas taxas de prenhez em comparação ao sêmen convencional. E apesar do

sêmen sexado bovino congelado ser produzido comercialmente em vários países, o número de

touros ainda é limitado nesta técnica (SEIDEL, 2007).

2.1 HISTÓRICO DA SEXAGEM

Na primeira metade do século XX, houve grandes avanços científicos na biologia,

especialmente na genética, resultando em numerosas descobertas, incluindo a identificação dos

cromossomos sexuais. A primeira documentação de identificação microscópica dos

cromossomos sexuais encontra-se em 1910 por Guyer (SEIDEL; GARNER, 2002). Entretanto,

somente em 1970, com Barlow e Vossa, foi documentada convincentemente a existência dos

cromossomos sexuais em humanos empregando-se o corante quinacrina (SEIDEL; GARNER,

2002).

Mas foi somente em 1976 que ocorreram os primeiros experimentos relacionados à

análise espermática com o citômetro de fluxo com Gledhill et al. Porém, os resultados

falharam até o desenvolvimento da análise de eritrócitos de galinha em dois feixes de líquido

de sheathfluid para resolver o problema de orientação da célula achatada (FULWYLER,

1977). Para aumentar a resolução da análise de células achatadas foi realizada uma adaptação

de um tubo de injeção para orientar forma e a inclusão de um segundo detector de luz

(GARNER; SEIDEL, 2008). Mas somente Pinkel et al. (1982) modificaram o sistema para

orientar o espermatozóide de frente para o feixe de laser. Estas modificações foram

fundamentais para detectar diferenças no cromossomo X ou Y no DNA espermático,

reportado por Garner et al. (1983); no entanto, estes procedimentos lesavam severamente a



célula espermática devido à remoção da cauda e das membranas para corar o núcleo com o

corante 4’-6-diamino-2-fenilindol (DAPI), cuja membrana plasmática íntegra é impermeável,

tornando a técnica impraticável até então (GARNER, 2006; SEIDEL 2007) .

Foi somente em 1996, com o emprego do corante de DNA que atravessa a membrana

plasmática íntegra, o bisbenzimidazol, Hoechst 33342, que houve a primeira publicação de

um método (Beltsville Sperm Sexing Technology) com repetibilidade para separar populações

de espermatozóides vivos de mamíferos (cromossomos X do Y), um sistema de sexagem em

alta velocidade e uma orientação através do nozzle (GARNER, 2006; RATH et al., 2009). Em

2001, a tecnologia foi adaptada para a produção comercial através da XY, Inc (Fort Collins,

Colorado e atualmente, Sexing Technologies Navasota, Texas, ambas nos EUA) para sêmen

bovino. O primeiro centro de produção comercial usando o sistema em alta velocidade foi a

Cogent em Chester, Reino Unido (RATH et al., 2009).

2.2 DIFERENÇAS NO DNA ESPERMÁTICO

Em bovinos, cada célula somática possui 60 cromossomos. Os gametas masculinos,

sendo células haplóides, contêm 29 cromossomos autossomos mais o cromossomo Y que

determina o sexo masculino ou o cromossomo X, já que a célula diplóide do macho é

composta dos dois cromossomos (XY ou XX) (GARNER; SEIDEL JR., 2008).

A sexagem do sêmen bovino ocorre devido ao fato do cromossomo X conter em média

3,8% mais DNA do que o cromossomo Y, porém existe uma diferença no conteúdo de DNA

das células espermáticas mesmo entre raças. Touros europeus (Bos taurus taurus) e os

originados na Ásia (Bos taurus indicus) apresentam uma diferença de tamanho no

cromossomo Y entre as duas espécies. O núcleo espermático de touros da raça Brahman, por

exemplo, possui uma diferença menor entre o cromossomo X e o Y, por volta de 3,7%; por

outro lado, a raça Jersey é a que possui a maior diferença entre eles, ao redor de 4,2%

(GARNER, 2006).

A cabeça do espermatozóide quanto mais achatada e oval for, a tendência dele ser

orientado e separado pelo citômetro de fluxo (SX MOFLO®, DakoCytomation Inc., Fort

Collins, CO) é mais rápida do que gametas possuindo cabeças com formato redondo ou

angular. O índice que avalia a qualidade de separação desses espermatozóides é obtido pela



multiplicação da diferença no DNA do cromossomo X do Y, em porcentagem, pela área da

porção achatada da cabeça do espermatozóide. O espermatozóide bovino é o que possui a

maior área (34,5 µm2) e pelo corte sagital, é um dos mais achatados entre as espécies de

mamíferos domésticos (GARNER, 2006).

A técnica utilizada na atualidade envolve um tratamento das células espermáticas com

o corante fluorescente, Hoechst 33342 (H33342) (trihidrato de trihidrocloreto, invitrogen™

Molecular probes, Eugene, Oregon, USA). É um permeador de membrana que se liga

fortemente e de maneira específica a quatro pares de bases AATT na curvatura menor da

dupla hélice do DNA (GARNER, 2009). Em seguida, as células coradas passam pelo

citômetro de fluxo através do nozzle tip (Cytonozzle™, parte integrante da MOFLO® SX)

que orienta os espermatozóides para serem expostos ao laser UV e forma as gotas na coluna

de fluido devido a vibrações estabelecidas pelo mecanismo pizoelétrico na coluna

(MAXWELL et al., 2004; SUH et al., 2005). Gotas contendo um único espermatozóide

orientado são carregadas eletricamente antes de passarem pelo fluxo eletrostático para a

separação. O feixe de gotas separadas cai em tubos coletores contendo diluidor à base de

gema de ovo com uma velocidade equivalente de 50 km/h. Posteriormente, estes tubos são

centrifugados e o sedimento contendo o sêmen é diluído na concentração desejada para a

preservação espermática (RATH et al., 2009).

As células coradas emitem uma fluorescência de cor azul de 351 e 364 nm de

comprimento de onda quando iluminadas pelo laser VanguardTM, sistema de estado sólido de

laser pulsado (Newport Corporation, Irvine, CA, USA), que evita efeitos lesivos de UV de

baixo comprimento de onda que são absorvidos pelos ácidos nucléicos e proteínas (SEIDEL;

GARNER, 2002), proporcionando uma medida precisa dos espermatozóides que contêm no

DNA o cromossomo X ou o Y, sendo separadas pelo citômetro de fluxo modificado

especificamente para o espermatozóide, ou seja, o espermatozóide corado contendo o

cromossomo X emite proporcionalmente uma maior fluorescência do que o que contém o Y

(JOHNSON; WELCH, 1999; GARNER, 2001; GARNER; SEIDEL JR., 2003; GARNER,

2006).

Quando a fluorescência dos espermatozóides é medida utilizando-se um citômetro de

fluxo, as diferenças entre os cromossomos X e Y são observadas em um histograma com

distribuição dupla Gaussiana (SHARPE; EVANS, 2009).

A eficácia do sistema de separação dos espermatozóides foi aumentada pela

identificação das células mortas ou lesadas identificadas primeiramente pela sonda iodeto de



propídeo (PI), cuja membrana plasmática íntegra é impermeável ao corante. Os gametas

comprometidos eram identificados e assim descartados junto com as células que não foram

medidas apropriadamente. A substituição do PI, que se intercala entre os pares de bases do

DNA, pelo FD&C #40 (Warner Jenkinson, St. Louis, EUA) proporcionou uma maior

segurança porque este simplesmente bloqueia a fluorescência do Hoechst e não é mutagênico

(JOHNSON; WELCH, 1999; SCHENK et al., 1999; GARNER, 2006).

Entretanto, a eficiência do H33342 nas células espermáticas bovinas é baixa, pois

somente um terço dos espermatozóides que passam pelo sistema pode ser separado e 20% dos

que são separados, são perdidos durante o processo de concentração e envase do sêmen

(SEIDEL; GARNER, 2002; GARNER, 2006; GARCIA et al., 2007).

Outros fatores citados como lesivos a espermatozóides no processo são o uso do

corante de DNA (H33342), reaquecimento e incubação, forças mecânicas durante a passagem

pelo citômetro de fluxo, a exposição intensa ao laser UV, a carga elétrica, a alta gravidade

durante a desaceleração dentro do tubo coletor, a alta diluição, pressão elevada e resistência a

mudanças na composição dos meios diluidores, podendo levar a diminuição na capacidade de

fertilização espermática na inseminação artificial e, conseqüentemente, em menor taxa de

desenvolvimento embrionário, comparado ao sêmen não-sexado (GARNER; SEIDEL JR.,

2003; GARNER, 2006; MOCÉ et al., 2006; GRAAF et al., 2007; GARCIA et al., 2007).

A alta diluição para a sexagem de sêmen por citometria de fluxo é necessária para a

identificação e separação da célula espermática. A esta etapa segue-se a concentração antes da

inseminação artificial. Entretanto, em várias espécies, como por exemplo, ratazana,

camundongo, homem e o cachaço, a centrifugação é um procedimento potencialmente lesivo

durante o processo, levando a uma redução da sobrevida do espermatozóide em conseqüência

de um efeito direto nas membranas (GARCIA et al., 2007).

Testes de viabilidade espermática com SYBR-14, que coram os espermatozóides

vivos, e o PI, células mortas ou com lesão celular, mostraram que o estresse mecânico da

separação e a centrifugação aumentam a mortalidade ou lesões aos espermatozóides (SUH et

al., 2005; GARNER, 2006; AMBROGI et al., 2006, SILVA; GADELLA, 2006).

A diminuição do sistema de pressão de 50 para 40 psi proporcionou uma melhora na

qualidade do sêmen, tais como na motilidade, espermatozóides vivos com membrana intacta,

um aumento na clivagem e desenvolvimento blastocístico sem, no entanto, diminuir a

performance das máquinas (CAMPOS-CHILLON; DE LA TORRE, 2003; SUH et al., 2005).



Embora a separação das células resulte na eliminação de espermatozóides mortos ou

lesados, aquelas células que sobrevivem ao processo de sexagem tendem a se deteriorar mais

rapidamente do que o controle, em touros e em bodes, mas, aparentemente, isso não ocorre

em sêmen de garanhões e de carneiros (MORRIS et al., 2003; GARNER, 2006).

Outro fator concomitante que pode afetar a diminuição da fertilidade, além do

processo da sexagem em si, é a baixa dose por palheta, porém isso diferiu entre touros

(FRIJTERS et al., 2009).

Parrilla et al. (2005) observaram em sêmen de cachaços que o processo através da

citometria de fluxo é capaz de manter a motilidade, viabilidade e integridade acrossomal em

ótimos níveis durante 10 horas de armazenamento após a separação dos espermatozóides,

porém a capacidade fertilizante foi mantida somente durante 5 horas após a sexagem, já em

eqüinos, a integridade acrossômica manteve-se por 24 h, equivalente ao sêmen a fresco.

Sendo que, após a sexagem, o sêmen armazenado por 12 h a 20ºC resultou em maior

motilidade do que a 4ºC. Foi observado, que o período de coloração e incubação das células

com o H33342 resultou em um decréscimo na proporção de acrossomas intactos (MORRIS et

al., 2003).

2.3 O ESPERMATOZÓIDE

Os espermatozóides são formados dentro dos túbulos seminíferos dos testículos e

armazenados na região do epidídimo, onde adquirem potencial para a motilidade e habilidade

de fertilização, caso receba o estímulo apropriado (PONS-REJRAJI et al., 2009a;

LAMIRANDE, O’FLAHERTY, 2008; SILVA; GADELLA, 2006).

Os espermatozóides completamente desenvolvidos são células alongadas, consistindo

de uma cabeça achatada contendo o núcleo com o genoma masculino e de uma cauda ou

flagelo com o aparelho necessário para a motilidade celular e envolvendo toda a célula, a

membrana plasmática, semi-permeável, que possui um papel muito ativo na capacidade de

fertilização espermática, não sendo, simplesmente, um filme lipídico disposto em bicamada,

passiva, na qual receptores recebem sinais moleculares específicos (LENZI et al., 1996;

LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008). O acrossomo, ou capa acrossomal, é uma estrutura de

parede dupla situada entre a membrana plasmática e a porção anterior da cabeça. O anel



posterior separa a cabeça do espermatozóide da peça intermediária que contém mitocôndrias,

envolvidas na produção de energia, sendo esta separada do flagelo, que é subdividido em peça

principal e terminal pelo anel anular (FLESCH; GADELLA, 2000; GARNER; HAFEZ, 2004;

LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008). O anel posterior e o annulus são estruturas físicas no

interior da membrana plasmática que funcionam como barreiras de difusão para

compartimentalizar a membrana da peça-intermediária e peça principal (JONES et al., 2007).

Até o momento, ainda não está claro como o espermatozóide fertiliza o oócito, embora

seja evidente que somente espermatozóides funcionalmente intactos sejam capazes de

fertilizar e que, de alguma forma, é realizado pela superfície da cabeça espermática

(GADELLA, 2008).

2.3.1 A membrana plasmática

A membrana plasmática é organizada por uma bicamada lipídica formada por

fosfolipídeos e esteróis, na qual as regiões apolares das moléculas dos lipídeos são orientadas

para o centro da bicamada, e os grupos polares, para a região extracelular ou em contato com

o citoplasma, de acordo com o modelo do mosaico fluido, postulado por Singer e Nicolson1

(1972 apud LEHNINGER et al., 2002, p.320); ANDRADE, 2009).

A membrana é formada por significantes níveis de ácidos graxos poliinsaturados

(PUFAs), derivados principalmente do ácido linoléico, importantes na manutenção da fluidez

e da flexibilidade da biomembrana, já que são mais flexíveis do que os saturados (LENZI et

al., 1996). A membrana plasmática tem uma distribuição de fosfolipídeos assimétrica em toda

a sua extensão. Dentre eles, a fosfatidilserina e a fosfatidiletanolamina estão localizadas

principalmente no folheto interno da membrana, e no folheto externo são encontrados a

esfingomielina e a fosfatidilcolina. Essa assimetria é mantida pela ação de várias translocases

ATP-dependente (JANUSKAUSKAS et al., 2003).

A superfície da membrana plasmática é heterogênea e de acordo com estudos

anteriores, sabe-se que as moléculas da superfície espermática exibem propriedades de

1SINGER, S. J.; NICOLSON, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, v. 175, p. 720-731, 1972.



difusão lateral, mas permanecem presas a regiões específicas da superfície. Uma

reorganização deste mosaico da superfície espermática sucede-se quando o espermatozóide

reside na proximidade do oócito, simultaneamente quando eles tornam-se competentes para

fertilizar (GADELLA, 2008).

A concentração de fosfolipídeos polinsaturados na membrana indica que os

espermatozóides são extremamente sensíveis ao estímulo externo. A função fertilizante dos

espermatozóides poderia ser explicada por que uma célula espermática tem uma fluidez,

flexibilidade e muita atividade da membrana, que pode ser facilmente desestabilizada e

ativada (LENZI et al., 1996).

2.3.1.1 Função da membrana plasmática

Durante a passagem do testículo para o sítio de fertilização na tuba uterina, os

espermatozóides de mamíferos encontram uma grande variação de fluidos de diferentes

origens e composições, como por exemplo, comparando-se o fluido testicular com o plasma

seminal e estes com as secreções do trato uterino. Estes fluidos têm principal influência nos

processos de desenvolvimento pós-testicular, como a maturação e a capacitação, e como

resultado, os espermatozóides são transformados de um estado imóvel e infértil para células

vigorosamente ativas com capacidade de se ligar especificamente e, por último, fundir-se ao

oócito. O desenvolvimento pós-testicular dos espermatozóides deve ser considerado como

uma hierarquia de sinalizações, iniciados por diferentes agonistas dentro de diversos fluidos,

que levem o espermatozóide a atingir o local da fertilização em um estado totalmente apto.

Este cenário assegura que não resolva apenas o espermatozóide completar todos os estágios

de desenvolvimento na sequência correta, mas que também não respondam a sinais externos

prematuramente (JONES et al., 2007).

O espermatozóide é uma célula altamente diferenciada e como tal, a superfície da

membrana é altamente compartimentalizada o que resulta na presença restrita de certos

lipídeos e proteínas (LENZI et al., 1996; JONES et al., 2007). De acordo com estudos em

outros tipos celulares, sabe-se que a ligação com agonistas e ativação do receptor

correspondente, frequentemente envolve um complexo grupo multi-molecular, que transmite

sinais externos através da membrana plasmática para o interior do citoplasma, onde são



amplificados para provocar uma resposta (JONES et al., 2007). Como o espermatozóide não

sintetiza novas proteínas de membranas, a formação de complexos de sinalização requer que

moléculas separadas espacialmente, possivelmente de diferentes regiões da célula trabalhem

em conjunto. Estes complexos podem mostrar migrações polarizadas de regiões onde eram

áreas inativas para áreas onde se tornam completamente funcionais (HOWES et al., 2001).

Estes complexos ou em sua forma individual estão sujeitos a forças de difusão que em muitas

situações são geradas por migrações polarizadas controladas por mecanismos ainda

desconhecidos, mas que podem envolver o citoesqueleto (JONES et al., 1990).

2.3.1.2 Alterações da membrana plasmática

As alterações de membrana podem variar na mudança de organização, fluidez,

permeabilidade e composição lipídica da bicamada à total ruptura de membrana

(JANUSKAUSKAS et al., 2003).

Mudanças na estrutura e na integridade da membrana plasmática parecem ser um

importante componente associado com a redução da fertilidade dos espermatozóides pós-

descongelamento (THOMAS; MEYERS; BALL, 2006).

Sabe-se que a membrana plasmática é adversamente afetada pela citometria de fluxo e

pelo processamento do sêmen, o que limita a viabilidade, a capacidade de armazenamento, a

habilidade de fertilização e, além disso, pode acelerar o processo de reação acrossômica após

a criopreservação (MOCÉ et al., 2006; GARCIA et al., 2007).

Uma das funções da membrana plasmática é regular o volume celular, que é crucial

durante a criopreservação (PETRUNKINA et al., 2005).

Foi observada uma correlação entre deterioração de membrana induzida pela

criopreservação e perda da integridade acrossômica e motilidade e a resposta do sêmen a

fresco ao ionóforo de cálcio em ejaculados de cães (PETRUNKINA et al., 2005). O mesmo

foi revelado em uma análise por meio da citometria de fluxo, no qual o sêmen sexado e não-

sexado a fresco possuíram, significativamente, porcentagens menores de reação acrossômica,

lesão de membrana e de atividade mitocondrial, quando comparados com o sêmen congelado

e descongelado sexado e não-sexado (BLONDIN et al., 2009). Januskauskas et al. (2001)

utilizaram H33258 para detectar espermatozóides de touros não-viáveis através da citometria



de fluxo, observou uma correlação negativa entre a porcentagem de células com membrana

lesada e fertilidade a campo (r= 0.57).

Foi demonstrado que a translocação da fosfatidilserina para a área externa da

membrana, pode ser utilizada como um marcador para a função de membrana deteriorada

pós-descongelação em humanos e bovinos através da anexina-V (cálcio-dependente)

combinada ao iodeto de propídeo (PI), permitindo a detecção simultânea de apoptose celular

e/ou células necróticas, ou células com membrana plasmática comprometida

(JANUSKAUSKAS et al., 2003). Verificou-se que a lesão de membrana causada pelo

processo de criopreservação foi mais pronunciada no sêmen sexado do que no grupo controle

porque exibiu estágios mais avançados de capacitação do que o segundo. Resultados similares

têm sido observados em sêmen de carneiros. Com isso, é razoável que o sêmen sexado

apresente uma fertilidade inferior in vivo comparado ao sêmen convencional (MOCÉ;

GRAHAM; SCHENK, 2006).

2.3.2 Capacitação espermática

Após a saída dos testículos, espermatozóides de mamíferos de muitas espécies são

morfologicamente diferenciados, no entanto, não possuem a capacidade para fertilizar o

oócito em metáfase II. Durante o trânsito epididimário, os espermatozóides adquirem a

habilidade de mover-se progressivamente, entretanto eles ainda são incapazes de fertilizar um

oócito logo após a ejaculação. Essa capacidade é adquirida no trato reprodutivo da fêmea em

um período finito de tempo. As mudanças fisiológicas que conferem a capacidade fertilizante

ao espermatozóide são coletivamente denominadas de capacitação (VISCONTI et al., 1995;

VISCONTI; KOPF, 1998; BREIBART; NAOR, 1999; GADELLA, 2008; WERTHEIMEIR

et al., 2008; PONS-REJRAJI et al., 2009a; PONS-REJRAJ et al., 2009b).

A capacitação foi descrita primeiramente por Chang e Austin, independentemente, em

1951. Eles descobriram que os espermatozóides eram incapazes de fertilizar o oócito a menos

que eles residam no trato genital feminino durante um período específico para sofrer

transformações para tornarem-se férteis; todavia, até o momento a definição de todo o

fenômeno ainda não foi totalmente elucidado (DE LAMIRANDE et al., 1997; VISCONTI;

KOPF, 1998; PONS-REJRAJI et al., 2009b).



A capacitação envolve aumento na fluidez da membrana plasmática associado a

modificações lipídicas, aumento na permeabilidade de vários íons na cabeça espermática e no

flagelo, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) pelo espermatozóide, assim como a

fosforilação de proteínas (serina, treonina e tirosina) (LAMIRANDE et al., 1997b; RATHI et

al., 2001; LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008; PONS-REJRAJ et al., 2009a).

Em mamíferos, a capacitação pode ocorrer in vitro espontaneamente em um meio

definido sem a adição de fluidos biológicos, sugerindo que este processo seja intrinsecamente

modulado pelo espermatozóide, desde que seja incubado em um meio apropriado. Embora

não haja um diluidor de capacitação universal, certos componentes são fundamentais,

incluindo a albumina sérica, Ca2+ e o HCO3-, tendo papéis regulatórios importantes para

promover a capacitação, induzindo a fosforilação da tirosina (VISCONTI; KOPF, 1998;

FLESCH; GADELLA, 2000; GADELLA, 2008).

A albumina sérica, geralmente a albumina bovina sérica (BSA), presente no meio de

capacitação in vitro para espermatozóides de mamíferos (camundongo, hamster, bovino,

humano), funciona como um carreador de colesterol, ligando-se e removendo-o da membrana

plasmática, alterando a fluidez da membrana, que ocorre durante a capacitação (VISCONTI;

KOPF, 1998).

O papel do Ca2+ na iniciação e/ou regulação da capacitação é controverso até o

momento. Alguns autores têm descrito um aumento intracelular de Ca2+ durante a

capacitação, enquanto outros têm mostrado que o Ca2+ intracelular não se altera durante este

evento de maturação (VISCONTI; KOPF, 1998). No espermatozóide de camundongos, há a

evidência de que o Ca2+ seja requerido para a capacitação, embora estes autores não tenham

mensurado a concentração de Ca2+ intracelular (DASGUPTA et al., 1993; VISCONTI et al.,

1995). A ação do Ca2+ em nível de enzimas efetoras envolve transdução de sinais no

espermatozóide, como na adenil ciclase, no nucleotídeo de fosfodiesterase cíclico, sugerindo

que este cátion bivalente tem uma importante função na capacitação (VISCONTI; KOPF,

1998).

O bicarbonato (HCO3-) é um dos principais componentes do meio e sua omissão não

somente inibe a fosforilação da tirosina, mas também reduz a capacidade dos espermatozóides

se ligarem às proteínas solubilizadas da zona pelúcida (ZP). O efluxo de colesterol pode

induzir a entrada de bicarbonato, que ativa diretamente uma adenilato ciclase (AC)

espermática específica e, desse modo, induz ao aumento dos níveis de cAMP na célula



espermática (FLESCH et al., 1999; FLESCH; GADELLA, 2000; HARRISON; GADELLA,

2005).

A subsequente ativação da proteína quinase A (PKA) induz via mecanismo de

sinalização ainda desconhecido, a fosforilação da tirosina de diversas proteínas (FLESCH et

al., 1999).

A célula espermática é submetida a severas condições durante o processo de sexagem,

podendo induzir a uma capacitação parcial (BLONDIN et al., 2009). Em vários trabalhos,

tem-se relatado uma capacitação prematura do sêmen sexado em relação ao controle

semelhante ao que ocorre com o sêmen de caprinos quando congelados (JONHSON, 2000).

Foi observada uma correlação significativa existente entre a porcentagem de reação

acrossômica detectada pela análise através de citometria de fluxo e a porcentagem resultante

de blastocistos produzidos (r = 0,74) (BLONDIN et al., 2009).

Recentemente, foi demonstrado em cachaços que o período de incubação com H33342

induz a uma mudança de pré-capacitação na membrana plasmática, indicado pela

redistribuição da proteína “heat shock” (Hsp70) (SPINACI et al., 2006), enquanto que a

passagem através do citômetro de fluxo e a exposição ao laser foram menos lesivos à

membrana. Entretanto, a carga elétrica e a subseqüente deflecção induziram ainda mais a

relocalização da Hsp70, como também durante o seu armazenamento no fluido de “catch”

(RATH, 2009).

Sinalizadores celulares nos espermatozóides de eqüinos capacitados in vitro parecem

ser dependentes do processo de ativação do ciclo AMPc/PKA, enquanto que as células

espermáticas criopreservadas seguem através de caminhos alternativos, sugerindo que a idéia

de capacitação e criocapacitação não sejam processos equivalentes (THOMAS; MEYERS;

BALL, 2006).

2.3.3 Fosforilação de proteínas

A fosforilação de proteínas é uma modificação pós-translacional de proteínas que

permite à célula controlar vários processos celulares. O estado de fosforilação de

fosfoproteínas é controlado pela atividade de proteínas quinases e fosfatases (URNER;

SAKKAS, 2003).



Espermatozóides maduros possuem sua própria idiossincrasia particular como células

altamente especializadas. Eles são altamente compartimentalizados, transcricionalmente

inativos e incapazes de sintetizar novas proteínas. Durante a fertilização, a função espermática

é regulada pela ativação intracelular de sistemas de sinalização que controlam a fosforilação

de proteínas. Nos espermatozóides, ocorrem a fosforilação de serina/treonina e tirosina, mas

somente algumas proteínas fosforiladas podem ser identificadas. Embora a via do cAMP

dependente da proteína quinase A represente um papel central na função espermática e tenha

sido estudada em detalhe (VISCONTI; KOPF, 1998), o conhecimento profundo sobre tirosina

quinases e outras serina/treonina quinases permanece limitado (URNER; SAKKAS, 2003).

A fosforilação da proteína tirosina aumenta no espermatozóide durante a capacitação

em várias espécies, incluindo ratos, humanos, bovinos, suínos, hamsters e gatos (VISCONTI;

KOPF, 1998; FLESCH; GADELLA, 2000; URNER; SAKKAS, 2003). A fosforilação da

tirosina parece ser um pré-requisito necessário para um espermatozóide fertilizar um oócito

(URNER; SAKKAS, 2003).

Os processos regulados pela fosforilação da tirosina incluem capacitação,

hiperativação da motilidade, a reação acrossômica e a afinidade à zona pelúcida, sendo que

todas elas são requeridas para que o espermatozóide alcance e fusione-se ao oócito (FLESCH;

GADELLA, 2000; URNER; SAKKAS, 2003). Em geral, a fosforilação de proteínas em

espermatozóides de mamíferos tem sido estudada através do exame de proteínas fosforiladas

em populações espermáticas durante a capacitação e após a exposição aos agentes indutores

de reação acrossômica pela técnica do western blot (FLESCH et al., 1999; URNER;

SAKKAS, 2003; PONS-REJRAJI, 2009a; PONS-REJRAJ, 2009b). Estes estudos levaram ao

acúmulo de informações sobre o peso molecular das proteínas fosforiladas e sua regulação

durante a capacitação e reação acrossômica. A fosforilação no espermatozóide pode ser

avaliada também pela imunocitoquímica, que revela a compartimentalização das

fosfoproteínas no espermatozóide individual e em populações heterogêneas de

espermatozóides (URNER; SAKKAS, 2003).

A fosforilação da tirosina pode induzir a mudanças conformacionais nas proteínas,

desta maneira, leva a uma ativação ou inativação das proteínas (FLESCH et al., 1999). A

fosforilação da tirosina tem sido claramente associada com a aquisição de motilidade e a

indução da capacitação. O papel do monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) no controle dos

eventos de fosforilação da tirosina é bem documentada em várias espécies via uma cascata de

transdução de sinais que parece ser única para o gameta masculino. Este mecanismo da



proteína quinase A-tirosina quinase parece ser regulado através de redução-oxidação (LEWIS;

AITKEN, 2001).

2.3.4 Reação acrossômica (RA)

Espermatozóides capacitados são submetidos à reação acrossômica quando eles

entram em contato com a zona pelúcida que envolve o oócito. A reação acrossômica é

desencadeada naturalmente pela ZP3 que é uma das principais proteínas da zona pelúcida.

Porém, não está disponível comercialmente (a proteína recombinante não é ativa), mas pode

ser reproduzido in vitro utilizando substâncias modelo, tais como ionóforo de cálcio

(A23187), agentes perturbadores de membrana (lisofosfatidilcolina, LPC), ou progesterona

(LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008).

A reação acrossômica é um evento irreversível, rápido e exocitótico, essencial para o

espermatozóide ligar-se à zona pelúcida e, em seguida, fundir-se com a membrana plasmática

do oócito (RATHI et al., 2001). É um processo complexo, que parece ser controlado por

várias quinases e vias de bloqueio através dos inibidores de PKC, PKA, PTK, P13K, Akt e da

via do ERK, é regulada também pelo processo de regulação redox (DE LAMIRANDE;

O’FLAHERTY, 2008). Está associada com modificações celulares que parecem similares

àquelas da capacitação, como as fosforilações, influxo de Ca2+, geração de EROs, mas os

agentes iniciantes, a cinética, a amplitude das modificações, enzimas, compartimentalização

celular são diferentes (VISCONTI; KOPF, 1998; RATHI et al., 2001; GILLAN et al., 2005;

DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008; BLONDIN et al., 2009).

Ocorrem várias mudanças na superfície da membrana plasmática que são

provavelmente requeridas para permitir ao espermatozóide ligar-se à matriz extracelular do

oócito (ZP), que induz à reação acrossômica (GADELLA, 2008). No momento em que o

espermatozóide encontra o oócito na tuba uterina [ou durante a fertilização in vitro (FIV)

quando se mistura com o oócito], a superfície apical da cabeça do espermatozóide contém

complexas proteínas de membrana funcionais que reconhecem e ligam-se à ZP (GADELLA,

2008). A membrana plasmática apical da cabeça do espermatozóide começa a se fusionar com

a membrana externa do acrossomo subjacente em múltiplos lugares, resultando na dispersão

do conteúdo acrossomal (FLESCH; GADELLA, 2000).



A maquinaria enzimática requerida para a exocitose e o início da penetração da zona

pelúcida é somente operante funcionalmente na região apical da superfície da cabeça

espermática na proximidade da interação com a zona pelúcida (GADELLA, 2008). Durante a

reação acrossômica enzimas hidrolíticas e proteolíticas são secretadas para liberar, hidrolizar

e dissolver a matriz da ZP localmente na direção imediata da penetração da célula espermática

que, finalmente, assegura a entrada do espermatozóide dentro do espaço perivitelino

(FLESCH; GADELLA, 2000).

A reação acrossômica não deve prosseguir antes da ligação com a ZP porque a parte

do maquinário enzimático desta organela requerida para o sucesso da penetração da ZP será

perdida. Reações acrossômicas preliminares das células espermáticas são consideradas

incompetentes para fertilizar o oócito. Células espermáticas que chegam ao espaço

perivitelino são sempre células com o acrossomo reagido, capazes de se fusionar com o oócito

(FLESCH; GADELLA, 2000).

Antes da fusão para a fertilização, o espermatozóide precisa secretar suas enzimas

acrossomais para penetrar na zona pelúcida. Esta então chamada de reação acrossômica é

desencadeada pela ZP e possuem múltiplos pontos de eventos de fusão entre duas membranas

posicionadas bem próximas. Nas células somáticas, as SNAREs (soluble N-ethylmaleimide-

sensitive factor attachment protein receptor proteins) estão envolvidas na fusão das

membranas, responsável pela secreção das células (GADELLA, 2008). SNAREs requeridas

para a exocitose têm sido identificadas em espermatozóides de mamíferos (GADELLA,

2008). Foram identificadas em espermatozóides de rato, suíno, humano, camundongo. Todas

as SNAREs que foram requeridas para formar complexo de SNARE envolveram fusão de

membrana (GADELLA, 2008). Em espermatozóides de suínos, estas sintaxes (membrana

plasmática SNAREs) mostraram agregação similar para a área do cume apical da superfície

plasmática, como também, foi observado na região para a zona de ligação de proteínas

quando os espermatozóides são capacitados (GADELLA, 2008). Um importante canal de K+

foi identificado no complexo da zona de ligação, que pode estar indiretamente envolvido no

influxo de cálcio para o interior da cabeça do espermatozóide que é, por sua vez, requerido

pela SNARE para que elas se juntem e tenham mudanças conformacionais para que haja a

fusão das membranas do acrossomo (GADELLA, 2008).



2.4 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROs)

Os espermatozóides, como qualquer célula aeróbia, produzem EROs, sendo a maior

parte originada da atividade metabólica normal. As EROs são reconhecidas por seus efeitos

deletérios em quase todos os tecidos e células. Dentre as EROs formadas, podemos citar o

anion superóxido (O2-•), peróxido de hidrogênio (H2O2), os radicais hidroxil (OH•),

hidroperoxil (HO2•), peroxil (ROO-) e alcoxil (RO•), e ainda o ácido hipocloroso (HOCl)

(AITKEN, 1995; DE LAMIRANDE et al, 1997; LEWIS; AITKEN, 2001; SANOCKA;

KURPISZ, 2004; DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008).

Entretanto, foi somente no início dos anos 90, que pesquisadores descobriram que

baixas concentrações de EROs, produzidas no momento da ativação celular, poderiam fazer o

papel de segundo mensageiros e por conseguinte, ter um desempenho positivo nas cascatas de

transdução de sinais (DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008). A geração de EROs pelos

espermatozóides de mamíferos tem um importante papel fisiológico no controle tanto da

capacitação espermática como na reação acrossômica (LEWIS; AITKEN, 2001).

O peróxido de hidrogênio em baixas concentrações induz a capacitação pela promoção

da fosforilação da tirosina, mas altas concentrações (>500 µM) bloqueiam este processo. Por

outro lado, o sêmen tratado com um coquetel oxidante contendo 100 µM de ácido ascórbico,

20 µM de FeSO4 e 500 µM de H2O2 provocou uma peroxidação lipídica da membrana

plasmática, oxidação intracelular e mitocondrial (SILVA et al., 2007).

Um dos principais mecanismos de ação que as EROs agem na transdução de

elementos e vias é pela modulação redox dos pares de sulfidril/dissulfeto nas proteínas.

Condições oxidativas promovem a formação de pontes de dissulfeto, a liberação de Zn2+,

resultando em uma modificação na atividade enzimática. Vários oxidantes de grupos de

sulfidril, como o N-etilmaleimida e a diamida, desencadeiam a capacitação e a geração de O-

•2, inversamente, redutores de dissulfeto, como a glutationa e ditiotreitol, previnem estes

processos (DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008).

As espécies reativas de oxigênio (EROs), tais como o ânion superóxido (•O2-),

peróxido de hidrogênio (H2O2) e o óxido nítrico (NO•), são consideradas elementos

regulatórios. Sabe-se que as EROs, em baixas concentrações, ativam diferentes vias de

transdução de sinal, levando à fosforilação da tirosina (reconhecida como um componente

bioquímico fundamental do processo de capacitação), serina e treonina, mais provavelmente



via cAMP/proteína quinase (PKA), regulação de sinal extracelular de quinase (ERK), família

de proteínas quinases mitógenas-ativadas (MAPK) e vias PKC (VISCONTI et al., 1995;

LEWIS; AITKEN, 2001; DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008; PONS-REJRAJI et al.,

2009a).

O tratamento dos espermatozóides com antioxidantes [superóxido dismutase (SOD) e

catalase] ou inibidores de NOS (L-NAME, L-NMMA) inibe o aumento de cAMP, necessário

para a capacitação, por outro lado, o aumento de EROs causa um aumento no cAMP,

provavelmente por causa da estimulação da adenil ciclase, pois a atividade das

fosfodiesterases não é afetada (LEWIS; AITKEN, 2001; DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY,

2008). Entretanto, os mecanismos através dos quais as EROs influenciam a reação

acrossômica e as fosforilações relacionadas ainda não foram totalmente elucidados. Todavia,

o real conhecimento na duração e na modulação através das quinases, sugere que os

mecanismos regulatórios da capacitação e da reação acrossômica são definitivamente

complexos e diferentes (DE LAMIRANDE; O’FLAHERTY, 2008).

As células espermáticas são particularmente susceptíveis ao estresse oxidativo (EROs)

porque elas contêm uma alta quantidade de ácidos graxos polinsaturados na membrana

plasmática, já as provenientes de manipulação laboratorial são ainda mais sensíveis

(DRUMMEN et al., 2002; BROUWERS et al., 2005; ARRUDA et al., 2006; SILVA et al.,

2007; HENDRICKS; HANSEN, 2009). Brouwers et al. (2005) observaram que a peroxidação

lipídica é mais proeminente na peça intermediária e em menor extensão na parte posterior da

cauda, mas virtualmente ausente na cabeça do espermatozóide.

EROs e espécies reativas de nitrogênio (RNS) têm efeitos lesivos, refletidos pela

peroxidação lipídica, prejuízo da função protéica e dano no DNA, comprometendo a

integridade das membranas dos espermatozóides e a viabilidade espermática (SILVA et al.,

2007).

A peroxidação lipídica foi, particularmente, forte na peça intermediária e na cauda de

espermatozóides congelados/descongelados e, significativamente, menos intenso na cabeça

espermática. Entretanto, a membrana plasmática do espermatozóide está significativamente

correlacionada com a capacidade de desenvolvimento do zigoto pós-fertilização. O estresse

oxidativo não induz um dano significativo no DNA das células espermáticas, a viabilidade

espermática e a membrana acrossomal (BROUWERS et al., 2005; SILVA et al., 2007).

O C11-BODIPY581/591 é uma sonda fluorescente para detectar peroxidação lipídica e

eficácia antioxidante em modelos de sistema de membrana e em células vivas, com excelentes



características. Possui emissão em um alcance visível, com bom espectro de separação da

forma não-oxidada (595 nm) com a oxidada (520 nm), tem um alto rendimento, necessita de

baixo volume do corante, boa fotoestabilidade, produz poucos artefatos fluorescentes, é

virtualmente insensível a alterações ambientais, como pH e polaridade do solvente, é

lipofílico, entrando facilmente nas membranas, e uma vez oxidado, o C11-BODIPY581/591

permanece lipofílico e não sai espontaneamente da bicamada lipídica, o C11-BODIPY581/591

localiza-se em dois lugares distintos dentro da bicamada lipídica, um é superficial a 18Ǻ e o

outro é profundo a 7,5Ǻ do centro para a bicamada, não é citotóxico, é sensível a vários oxi-

radicais e peroxinitritos, mas não é para o superóxido, óxido nítrico, íons de metais de

transição e hidroperóxidos (DRUMMEN et al., 2002).

3 Objetivos

3 Objetivos 45


3 OBJETIVOS

Levando-se em consideração a necessidade de informações mais precisas sobre os

efeitos da sexagem espermática em bovinos pela técnica de citometria de fluxo, os objetivos

desta pesquisa foram:

1. Avaliar os efeitos da sexagem sobre a integridade da membrana plasmática, reação

acrossomal, peroxidação lipídica e capacitação dos espermatozóides bovinos e entre

subespécies taurinas (Bos taurus taurus) e zebuínas (Bos taurus indicus),

2. Comparar possíveis diferenças entre o sêmen convencional e sexado quanto a

integridade da membrana plasmática, reação acrossomal, peroxidação lipídica e

capacitação dos espermatozóides bovinos e entre subespécies taurinas (Bos taurus

taurus) e zebuínas (Bos taurus indicus) e

3. Avaliar se o tempo de espera do ejaculado para a sexagem provoca alterações na


capacitação dos espermatozóides bovinos e entre subespécies taurinas (Bos taurus

taurus) e zebuínas (Bos taurus indicus).

4 Hipóteses

4 Hipóteses 47


4 HIPÓTESES

1 A sexagem de sêmen pela técnica de citometria de fluxo provoca alterações na


capacitação dos espermatozóides bovinos, e estas alterações são mais severas nas

subespécies taurinas (Bos taurus taurus) do que nas zebuínas (Bos taurus indicus).

2. Os espermatozóides bovinos submetidos à técnica de sexagem por citometria de

fluxo apresentam maior porcentagem de lesão da membrana plasmática, reação

acrossomal, peroxidação lipídica e capacitação do que os espermatozóides

submetidos à técnica convencional, sendo os espermatozóides da subespécie taurina

(Bos taurus taurus) mais sensíveis do que os da zebuína (Bos taurus indicus).

3. O tempo de espera do ejaculado para a sexagem provoca alterações na integridade

da membrana plasmática, reação acrossomal, peroxidação lipídica e capacitação

dos espermatozóides bovinos, sendo os da subespécie taurina (Bos taurus taurus)

mais sensíveis que os da zebuína (Bos taurus indicus).

5 Material e Métodos

5 Material e Métodos 49


5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 LOCAL

O presente trabalho foi realizado em duas etapas, sendo que a primeira consistiu na

sexagem e congelamento do sêmen no laboratório da Sexing Technologies do Brasil,

localizada na Central CRV Lagoa, na cidade de Sertãozinho, SP; e a segunda, referente às

análises laboratoriais, realizada no Laboratório de Biotecnologia do Sêmen e Andrologia do

Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal do Departamento de Reprodução Animal da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, localizado no

Campus Administrativo de Pirassununga, SP.

5.2 ANIMAIS E MANEJO

Foram utilizados seis touros em idade reprodutiva, sendo três taurinos da raça

Holandesa Preta e Branca (Bos taurus taurus) e três zebuínos da raça Gir Leiteira (Bos taurus

indicus), mantidos sob as mesmas condições ambientais, ou seja, em piquetes individuais com

água e sal mineral ad libitum e alimentação nutricional balanceada. Os animais foram pesados

quinzenalmente e realizados os controles de endo e ectoparasitas regularmente.

5.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Baseado nos objetivos deste trabalho foi delineado um experimento, no qual foram

congeladas 12 palhetas de sêmen de 6 touros (3 taurinos e 3 zebuínos), quatro ejaculados por

touro e cinco tratamentos (12 x 6 x 4 x 5 = 1440 palhetas). Cada ejaculado foi dividido em

cinco alíquotas (cinco tratamentos) para produzir sêmen convencional (não sexado)

utilizando-se dois diluidores diferentes denominados de diluidor (L) Lagoa (T1) e outro com

o diluidor utilizado para a sexagem do sêmen pela técnica de citometria de fluxo, diluidor (S)



Sexing (T2). Ainda, produzir sêmen sexado, subdivididos em três tratamentos (T3, T4 e T5),

de acordo com o tempo de espera do sêmen antes da técnica de sexagem espermática. Os

tratamentos T3, T4 e T5 significavam sêmen in natura, submetidos à técnica de citometria de

fluxo após os tempos zero, três e seis horas, respectivamente. Em todos os cinco tratamentos a

concentração na palheta (0,25 mL) foi de 2,1 milhões de espermatozóides. Para as avaliações

espermáticas entre tratamentos foram utilizadas: - integridade de membrana plasmática,

reação acrosomal, peroxidação lipídica, avaliação da fluidez da membrana plasmática e

detecção da fosforilação do aminoácido tirosina.

Um esquema resumido do delineamento experimental encontra-se na figura 1.

Figura 1 - Esquema resumido do delineamento experimental

0 hora 3 horas 6 horas

Integridade de Membrana plasmática e reação acrosomal

Avaliação da peroxidação lipidica Avaliação da fluidez da membrana

plasmática Detecção da fosforilação do aminoácido

tirosina



5.4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

5.4.1 Colheita do sêmen

As colheitas de sêmen foram realizadas com vagina artificial, com auxílio de uma vaca

como manequim devidamente contida. Foram utilizados seis touros sendo, três taurinos da

raça Holandesa Preta e Branca (Bos taurus taurus) e três zebuínos da raça Gir Leiteira (Bos

taurus indicus). Foram realizadas quatro colheitas de sêmen de cada animal, com intervalos

semanais (6 touros × 4 ejaculados, n = 24).

Após a colheita, o ejaculado foi encaminhado rapidamente ao laboratório para análise.

5.4.2 Avaliações do sêmen in natura

O ejaculado foi analisado quanto ao volume, concentração espermática, motilidade,

vigor e alterações morfológicas. Todo material utilizado na colheita de sêmen e avaliação do

sêmen foi mantido aquecido, na temperatura à 37ºC para evitar o choque térmico e alterações

das características seminais.

5.4.2.1 Volume

O volume foi determinado pela leitura direta do tubo de 15 mL graduado com fração

de 0,1 mL.

5.4.2.2 Concentração espermática

A concentração espermática foi determinada por um contador nuclear denominado

NucleoCounter® SP-100™ System com software versão 1.21 (CM part no. 900-0100) –



Chemometec A/S DK – 3450 Allerod, Dinamarca), calibrado para o programa DF 401, para o

qual diluiu-se 25 µL de sêmen em 10 mL de reagente S100 (CM part no. 910-0100),

responsável pela lise da membrana celular, em um tubo de 15 mL.

Em seguida, foi homogeneizado em um vortex durante 12 segundos,

aproximadamente, e uma alíquota foi separada para a leitura em um SP1 - Cassette™ (CM

part no. 941-0006) - Chemometec. O SP1 - Cassete™ contendo iodeto de propídio (PI), que

identifica as células lesadas pelo reagente S100 e realiza a contagem nuclear celular (Figura

2).

Figura 2 - Esquema simplificado para a obtenção da concentração espermática

5.4.2.3 Motilidade, vigor e turbilhonamento

Uma alíquota de 10 µL de sêmen in natura foi diluída em 500 µL de diluidor à base de

Tris e gema de ovo pré-aquecido (37º C) para a avaliação da motilidade. A motilidade foi

avaliada em uma gota de 10 µL da alíquota diluída colocada entre lâmina e lamínula e

25 µLde sêmen 10 mL de S100

VORTEX (12 s)

Cassete

Nucleo Counter

DF 401 Concentração espermática (106 / mL)

Ejaculado



visualizada em aumento de 100 x sob microscopia de contraste de interferência diferencial

(DIC).

O vigor, referente à velocidade progressiva uniforme das células em movimento foi

classificado em escores de 1 a 5, sendo o escore 1 o mais lento e aumentando gradativamente

até o escore 5, correspondendo ao mais veloz movimento progressivo e uniforme. Foi

observado em uma gota de 10 µL da alíquota diluída entre lâmina e lamínula em aumento de

100 x em DIC.

Para avaliação do turbilhonamento, uma amostra de 10 µL de sêmen fresco foi

depositada em lâmina pré-aquecida a 37oC e a análise foi efetivada sem lamínula, sob

microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) em aumento de 100 x. O

movimento de massa das células foi classificado em escala que variou de 0 (movimento

ausente) a 5 (máximo).

5.4.2.4 Análise da morfologia espermática

Para a avaliação das alterações morfológicas, foram adicionados 10 µL de formol

salino tamponado no tubo pré-diluído para a avaliação prévia da motilidade. Em seguida, foi

realizada a leitura da morfologia em preparação úmida com aumento de 1000 x sob

microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) (OLYMPUS AX70, Olympus

True Reserch System Microscoper model AX70, Melville, NY), contando 100 células por

amostra. As porcentagens das diversas alterações morfológicas foram agrupadas e

classificadas em defeitos maiores e defeitos menores.

Somente ejaculados com concentração igual ou superior a 1000 x 106 espermatozóides

por mililitros, 60% de motilidade progressiva, vigor maior do que o escore 3 e menos de 20%

de defeitos totais foram utilizados no experimento.



5.4.3 Congelação do sêmen pela técnica convencional

Após as avaliações do sêmen in natura, duas alíquotas do ejaculado foram retiradas

para o preparo do sêmen convencional (não sexado) utilizando-se dois tipos de diluidores

denominados de diluidor (L) Lagoa (à base de TRIS-gema de ovo) (T1) e outro com o

mesmo diluidor utilizado para a sexagem do sêmen pela técnica de citometria de fluxo,

diluidor (S) Sexing (à base de TRIS-gema de ovo centrifugado®) (T2).

Logo após a diluição, os tubos contendo sêmen convencional, previamente

identificados, permaneceram em banho-maria a 34°C por uma hora e 30 minutos. Em seguida,

foram encaminhados para a câmara-fria a 5°C por aproximadamente quatro horas, protegidos

da luz para aguardar o envase e congelação.

Foram envasadas 12 palhetas por tratamento, as quais foram cuidadosamente

identificadas com o nome do touro, subespécie, partida do ejaculado e tratamento. A

quantidade de espermatozóides por palheta (0,25 mL) foi de 2,1 milhões.

As palhetas foram congeladas em caixa de isopor contendo 7 cm de altura de

nitrogênio líquido a uma distância de 4 cm das palhetas durante 20 minutos, sob vapor do

nitrogênio líquido. Em seguida, as palhetas foram retiradas e imersas em nitrogênio líquido (-

196ºC). Imediatamente após, as palhetas foram raqueadas e armazenadas em botijões

criogênicos para posterior análise.

5.4.4 Sexagem espermática pela técnica de citometria de fluxo

Após as avaliações do sêmen in natura, três alíquotas do ejaculado foram preparadas

para produzir o sêmen sexado, sendo que cada alíquota foi retirada nos tempos zero, três e

seis horas, respectivamente (T3, T4 e T5) de acordo com o tempo de espera do sêmen.



5.4.4.1 Diluição e incorporação do Hoechst 33342

Para a sexagem dos espermatozóides uma solução estoque de Hoechst 33342 foi

preparada a 8,89 mM (5 mg/mL) com água nanopura, corante cuja função foi penetrar na

membrana celular e ligar-se a regiões específicas do DNA, que são os 3 pares de bases ricos

em adenina-timina das menores depressões da hélice de DNA (GARNER, 2009). O sêmen foi

diluído nos tempos zero, três e seis horas na concentração de 200 x 106/mL, em TALP

modificado (meio Tyrode com albumina, lactato e piruvato) em pH de 7,4 visando alcançar

maior eficiência do corante Hoechst 33342. Após a amostra foi incubada a 34ºC durante 45

minutos protegida dos efeitos da luz.

Em seguida, foi adicionado TALP contendo 4% de gema de ovo clarificada e 0,002%

de “food colouring dye” (FD&C#40 Power, Waner Jenkinson Company Inc., St Louis, MO,

USA), que teve como objetivo diminuir o pH, prevenindo dano celular e, também, apagar o

H33342 dos espermatozóides com as membranas celulares comprometidas (SCHENK et al.,

1999; GARNER, 2001; GARNER, 2009), permitindo o descarte destas células no momento

da separação no citômetro de fluxo.

Cada amostra foi filtrada à unidade gravitacional em um filtro de nylon com poros de

50 µm (CellTrics™, Partec GmbH, Germany) para a remoção de debris ou espermatozóides

aglutinados, formando uma solução final de 4 mL com uma concentração de 80 x 106

espermatozóides/mL e mantidas em temperatura à 21ºC durante a separação espermática no

citômetro de fluxo.

O citômetro de fluxo usado no experimento foi o SX MOFLO®, operando a 40 psi

(Figura 3). A fluorescência que foi emitida pelas células quando excitadas pelo laser

Vanguard TM, sistema de estado sólido de diode-pumped (Newport Corporation, Irvine, CA,

USA) passou por dois detectores de fluorescência (PMT), localizados a 0° e a 90°, um com a

função de orientar corretamente as células e, outro para medir o valor da fluorescência.

Dependendo da onda emitida, foi dada uma carga elétrica na célula, ou seja, o espermatozóide

contendo o cromossomo X recebeu uma carga negativa, sendo atraído pelo campo positivo e o

oposto para os espermatozóides contendo o cromossomo Y.

Um diluidor (Sheath Fluid) a base de TRIS (hidroximetil aminometano - TRIS 197,0

Mm), ácido cítrico monohidratado (55,4 mM) e frutose (47,5 mM) foi utilizado para formar o

fluxo hidrodinâmico onde as células espermáticas percorreram.



As células separadas pelo citômetro de fluxo (SX MOFLO®) foram coletadas em tubos

cônicos graduados para centrífuga de 50mL, contendo diluidor sem glicerol, denominado de

catch (meio TRIS - 2% gema de ovo – Sexing Technologies, Navasota, USA) que foi diluído

com 16% de água, até atingir o volume de 20 mL. A concentração final de um tubo foi de

aproximadamente 8,0 x 105 espermatozóides/mL, como conseqüência da mistura dos

diluidores durante a separação, catch e o sheath fluid.

Em seguida, foram colocados sob refrigeração a 5ºC por um período de 90 minutos.

Figura 3 - Aparelho de Citometria de Fluxo SX MOFLO®

5.4.5 Criopreservação do sêmen sexado

Após a refrigeração, foi adicionado ao sêmen, diluidor TRIS contendo 12% de glicerol

em duas etapas, com intervalo de 15 minutos (9,5 mL cada). O sêmen foi levado à centrífuga

refrigerada à 5º C, SORVALL® RC-4 (Heareus Sorvall Revco, Asheville, NC), a 850 x g

durante 20 minutos.



O sobrenadante foi desprezado e o sedimento formado foi homogeneizado e colocado

em um único tubo, com uma concentração aproximada de 40 x 106 espermatozóides/mL. Em

seguida, foi retirada uma alíquota de 25 µL para a determinação da concentração através do

NucleoCounter® SP-100™ system AN-103 (ChemoMetec A/S Gydevang 43, DK-3450

Allerod, Dinamarca), visando a adição do restante do diluidor TRIS-gema até atingir

concentração final de 9,4 x 106 de espermatozóides/mL (considera-se em torno de um milhão

de espermatozóides perdidos durante o envase).

Logo após a diluição com TRIS-gema de ovo, o sêmen permaneceu protegido da luz à

temperatura de 5ºC durante 3 horas (tempo de equilíbrio) para então, ser envasado em

palhetas de 0,25 mL (IMV®, Aigle, France). As palhetas foram congeladas em caixa de isopor

contendo 7 cm de altura de nitrogênio a uma distância de 4 cm das palhetas durante 20

minutos, sob vapor do nitrogênio liquído. Em seguida, as palhetas foram retiradas e imersas

em nitrogênio líquido (-196ºC). Imediatamente, as palhetas foram raqueadas e armazenadas

em botijões criogênicos para posterior análise.

5.4.6 Avaliações do sêmen convencional (dois diluidores) e do sexado (três diferentes

tempos)

Para a avaliação do sêmen três palhetas do mesmo animal, partida e tratamento foram

descongeladas a 37oC por 30 segundos. Todas as técnicas que serão descritas a seguir foram

realizadas segundo metodologias citadas por Andrade (2009).

5.4.6.1 Avaliação da integridade da membrana plasmática e reação acrossomal por citometria

de fluxo

Uma alíquota foi retirada das amostras e adicionada ao TALP sperm (BAVISTER;

LEIBFRIED; LIEBERMAN, 1983) modificado (TALPm, Anexo A) em tubos de

microcentrifugação (1,5 mL) pré-aquecidos a 37°C, a fim de se obter amostras com

concentração de 5 x 106 espermatozóides por mL em um volume final de 148 µL. A seguir,

adicionou-se 2 µL de Hoechst 33342 (H33342; 40 µg/mL, H-1399, Molecular Probes Inc.,



Eugene, Oregon, EUA) com posterior incubação por 10 minutos a 37°C. O uso desta sonda

teve como objetivo, corar o DNA das células espermáticas para que não houvesse a contagem

de forma equivocada de partículas com o mesmo tamanho e granulosidade do

espermatozóide. Passado o período de incubação, foram adicionados a amostra 3 µL de Iodeto

de Propídio (PI-0,5 mg/mL, 28,707-5, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, Missouri, EUA),

conjuntamente com a adição de 10 µL de aglutinina de Pisum sativum conjugada ao

isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA-100 µg/mL, L-0770, Sigma-Aldrich Co., Saint

Louis, Missouri, EUA) estas sondas foram adicionadas com os seguintes objetivos: corar as

células com membrana plasmática lesada (PI positivo) (CELEGHINI et al., 2007; ANDRADE

et al., 2007) e com a membrana acrossomal reagida (FITC-PSA positivo). Após 10 minutos de

incubação a 37°C, os espermatozóides foram diluídos com a adição de 150 µL de TALPm e

transferidos para tubos graduados até 15 mL (37°C). Com isso, as amostras apresentavam

uma concentração de 2,5 x 106 espermatozóides por mL no momento de serem analisadas pela

técnica de citometria de fluxo. Todas as amostras tiveram 10.000 células analisadas. Na figura

4 está apresentado um exemplo de gráfico de pontos gerados pelo software BD FACSDiva 6.0

após a contagem da amostra. A coloração com FITC-PSA diferenciou a população

espermática viável (IP-negativo) em dois grupos distintos (Figura 4). Os espermatozóides que

não se apresentavam corados com FITC-PSA, estes sendo os que possuíam a membrana

acrossomal intacta (AIMPI), ou os positivos para a coloração com FITC-PSA indicando que

estes espermatozóides ou possuíam o acrossomo em processo de exocitose ou já estavam

reagidos (ARMPI).



Figura

4 - Gráfico de pontos gerado pela análise de 10.000 células por citometria de fluxo. Amostra corada com a associação H33342, PI, FITC-PSA permitindo a classificação dos espermatozóides bovinos em quatro categorias – Pirassununga – 2009

5.4.6.2 Avaliação da peroxidação das membranas espermáticas por citometria de fluxo

Foram retiradas alíquotas de sêmen durante as etapas de análises a fim de obter

amostras diluídas em TALPm com 5 x 106 espermatozóides/mL e com um volume final de

499,5 µL. Estas foram então coradas com 0,5 µL da sonda C11-BODIPY581/591(1 mg/mL, D-

3861, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) por 30 minutos a 37°C. Passado o

período de incubação, foi transferida para outro microtubo 145 µL desta solução, agora,

corada com a sonda C11-BODIPY581/591. A esta amostra foi adicionado 2 µL de Hoechst

33342 (40 µg/mL, H-1399, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) com posterior

incubação por 10 minutos a 37°C. O uso desta sonda teve como objetivo, corar o DNA das

células espermáticas para que não houvesse a contagem de forma equivocada de partículas

com o mesmo tamanho e granulosidade do espermatozóide. Então, adicionou-se a amostra

3 µL de Iodeto de Propídio (0,5 mg/mL, 28,707-5, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, Missouri,

EUA) a fim de servir como um marcador das células com membrana plasmática lesada. Após

AIML-membrana plasmática lesada e membrana acrossomal não reagida. ARML-membrana plasmática lesada e membrana acrossomal reagida. AIMI-membrana plasmática íntegra e membrana acrossomal não reagida. ARMI-membrana plasmática íntegra e membrana acrossomal reagida.



5 minutos de incubação a 37°C, os espermatozóides foram diluídos com a adição de 150 µL

de TALPm e transferidos para tubos graduados de 15 mL (37°C). Com isso, as amostras

apresentavam uma concentração de 2,5 x 106 espermatozóides por mL no momento de serem

analisadas por citometria de fluxo. Foram analisadas 10.000 células por amostra. Na figura 5

estão apresentados um exemplo de gráfico de pontos (Figura 5A) e de um histograma (Figura

5B) gerados pelo software BD FACSDiva 6.0 após a contagem da amostra. As células com

membrana plasmática intacta (PI negativo) e coradas com a sonda C11-BODIPY581/591 foram

analisadas quanto à média da emissão de fluorescência captada no fotomultiplicador com long

pass de 502 e band pass de 530 ±15 nm (Figura 5B), esta faixa captada corresponde às células

que estão sofrendo ação da peroxidação.

Figura 5 - A. Gráfico de pontos gerado pela análise por citometria de fluxo em amostra corada com a associação das sondas fluorescentes C11-BODIPY, H33342 e PI. Podem-se observar duas categorias distintas, sendo que o quadrante MPI contém os espermatozóides bovinos com a membrana plasmática íntegra e selecionados para a avaliação da intensidade da peroxidação das membranas. B. Histograma com a população selecionada MPI que está sendo analisada quanto à distribuição da fluorescência captada no fotomultiplicador com band pass de 530 ±15 nm (células com peroxidação lipídica). O valor obtido é indicado no quadro como a média e a mediana em unidades arbitrárias (ua) – Pirassununga – 2009

B A



5.4.6.3 Avaliação da estabilidade (fluidez) da membrana plasmática por citometria de fluxo

Para a análise da estabilidade da membrana plasmática pela técnica de citometria de

fluxo as amostras foram incubadas em solução de TALPm na concentração de

5 x 106 espermatozóides/mL em um volume final de 147 µL. Foram então adicionados 2 µL

de Hoechst 33342 (40 µg/mL, H-1399, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) com

posterior incubação por 10 minutos a 37°C. O uso desta sonda teve como objetivo, corar o

DNA das células espermáticas para que não houvesse a contagem de forma equivocada de

partículas com o mesmo tamanho e granulosidade do espermatozóide. Em seguida 0,5 µL da

sonda fluorescente Yo-Pro-1 foi adicionado a amostra (7,5 µM-Molecular Probes Inc.,

Eugene, Oregon, EUA) obtendo-se uma concentração final de 25 nM. A membrana

plasmática íntegra é impermeável ao Yo-Pro-1, o qual se liga ao DNA das células com a

membrana plasmática lesada. Então, a amostra foi incubada por 20 minutos para

posteriormente ser adicionada da sonda fluorescente merocianina 540 (810 µM-Molecular

Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) a fim de se obter uma concentração de 2,7 µM em uma

solução final de 150 µL, em seguida estas foram incubadas por 70 segundos. Foram então

diluídas em 150 µL de TALPm e analisadas por citometria de fluxo, no qual foi avaliado as

porcentagens de espermatozóides com membrana plasmática íntegra (Yo-Pro-1 negativo) com

aumento na desordem da bicamada lipídica (Merocianina 540 positivo). Na figura 6 está

apresentado um exemplo de gráfico de pontos gerados pelo software BD FACSDiva 6.0 após

a contagem da amostra. A coloração com Merocianina 540 mostrou duas populações distintas

de células viáveis (Yo-Pro-1 negativa), uma que é caracterizada pelas células com emissão de

baixa fluorescência e outra que é caracterizada por alta (captado no long pass-595 e band-

pass-610/20). Os espermatozóides com baixa emissão de fluorescência são considerados não

capacitados, enquanto que as células que apresentam alta emissão de fluorescência são

caracterizadas como capacitadas (alto grau de desorganização da bicamada lipídica; Figura 6).



Figura 6 - Gráfico de pontos gerado pela análise por citometria de fluxo, neste caso as células foram coradas com a associação do H33342, Yo-Pro-1 e da Merocianina 540 permitindo a classificação dos espermatozóides bovinos em três categorias – Pirassununga – 2009

5.4.6.4 Detecção por citometria de fluxo da fosforilação do aminoácido tirosina

As amostras de sêmen foram diluídas em TALPm a fim de se obter uma concentração

final de 1 x 106 espermatozóides/mL em um volume final de 141 µL. Foram então

adicionados 2 µL de Hoechst 33342 (40 µg/mL, H-1399, Molecular Probes Inc., Eugene,

Oregon, EUA) com posterior incubação por 10 minutos a 37°C. Em seguida, foi adicionado

6 µL do anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína (100 µg/mL-CLONE PY-

20, F0426, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, Missouri, EUA) a esta suspensão, obtendo-se

uma concentração final de 2 µg/mL de anticorpo. Neste mesmo momento foi adicionado à

amostra 3 µL de Iodeto de Propídio (0,5 mg/mL, 28,707-5, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis,

Missouri, EUA) a fim de retirar da análise as células que apresentavam lesão na membrana

plasmática. Em seguida a amostra foi incubada por 5 minutos a 37°C para então ser submetida

à análise por citometria de fluxo (ANDRADE et al., 2008). A figura 7 é constituída por um

exemplo de gráfico de pontos (Figura 7A) e de um histograma (Figura 7B) gerados pelo

software BD FACSDiva 6.0 após a contagem da amostra. As células com membrana

NCMPI- espermatozóide não capacitado com membrana plasmática íntegra. MPL - espermatozóide com membrana plasmática lesada. CAPAC- espermatozóide capacitado e com membrana plamática íntegra.



plasmática íntegra (PI negativo) e marcadas com o anticorpo antifosfotirosina foram

analisadas quanto à média da emissão de fluorescência captada no fotomultiplicador com long

pass de 502 e band pass de 530 ±15 (Figura 7B), esta faixa captada corresponde às células

que estão marcadas pelo anticorpo.

Figura 7 - A. Gráfico de pontos gerado pela análise por citometria de fluxo em amostra corada com a associação de H33342, com anticorpo antifosfotirosina conjugado ao FITC e a sonda fluorescente PI. Podem-se observar duas categorias distintas, sendo a MPI os espermatozóides bovinos com a membrana plasmática íntegra e selecionados para a avaliação da detecção dos resíduos de tirosina presentes na superfície da célula. B. histograma apresentando a população selecionada MPI que está sendo analisada quanto à distribuição da fluorescência captada no fotomultiplicador com band pass de 530 ±15 nm (células marcadas com o anticorpo antifosfotirosina). O valor obtido é indicado no quadro como a média e a mediana em unidades arbitrárias (ua) – Pirassununga - 2009

5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados das médias e seus respectivos desvios erros padrão foram apresentadas

forma de gráficos. Para as análises estatísticas, os valores em porcentagem foram

transformados em arco-seno. Os dados foram analisados empregando-se o programa Stat-

View® (SAS Institute, Inc. 1998). Os efeitos de tratamento, subespécies e tempo de espera para

A B



a sexagem espermática, bem como suas respectivas interações, foram avaliados por meio de

análises de variância (ANOVA). Quando o principal efeito foi significativo, as médias foram

comparadas individualmente pelo teste de Fisher. A hipótese testada foi considerada

significativa quando P<0,05 e com tendência a significância quando P >0,05 e <0,10.

6 Resultados

6 Resultados 66


6 RESULTADOS

Nesta seção encontram-se descritos os resultados obtidos no presente experimento. 6.1 INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA E REAÇÃO ACROSSOMAL EM

SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO

Após a descongelação das amostras, foi observado que houve tendência a significância

(P<0,10) da quantidade de espermatozóides sem reação acrossômica e com membrana

plasmática íntegra entre o T1 (sêmen convencional com diluidor L) e T3 (sêmen sexado no

tempo zero), porém não foi encontrada diferença entre os grupos T1, T2 (sêmen convencional

com diluidor S), T4 (sêmen sexado no tempo três horas após) e T5 (sêmen sexado no tempo

seis horas após) e entre os tratamentos T2, T3, T4 e T5, no sêmen bovino pós-descongelação,

submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) (Gráfico

1).

6 Resultados 67


Letras diferentes sobre as barras indicam tendência a significância (P<0,10). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 1 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal e

membrana plasmática íntegra (SRAMI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009

Foi observada diferença estatística (P< 0,05) entre as subespécies. Os zebuínos

apresentaram quantidade maior de espermatozóides com membrana plasmática íntegra e sem

reação acrossômica do que os taurinos nos tratamentos T2, T3, T4 e T5. Numericamente, foi

marcante a diferença entre as subespécies, com exceção do T1, no qual os taurinos obtiveram

maior quantidade de células sem reação acrossômica e membrana plasmática íntegra,

observado no gráfico 2.

6 Resultados 68


Letras diferentes sobre barras significam diferenças estatísticas entre as subespécies(P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 2 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal e

membrana plasmática íntegra (SRAMI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009

Foi observada uma pequena população espermática com membrana plasmática íntegra

e reação acrossômica que variou de 0,3 a 1,0%. Embora os diluidores do sêmen convencional

tenham sido diferentes (T1 e T2) não houve diferença entre eles, no entanto, quando

comparado ao sêmen sexado (T3, T4, T5), houve diferença significativa (P< 0,05). O sêmen

sexado mostrou reação acrossômica e membrana plasmática íntegra menor do que o

convencional. Já entre os tratamentos do sêmen sexado, não houve diferença ao longo do

tempo (zero, três e seis horas após), presente no gráfico 3.

6 Resultados 69


Letras diferentes sobre as barras indicam diferença estatística (P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação.

Gráfico 3 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) com reação acrossomal e membrana plasmática íntegra (CRAMI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009

A porcentagem de células com reação acrossomal e membrana plasmática íntegra não

variaram entre taurinos e zebuínos (P>0,05). Provavelmente, a diferença estatística não foi

encontrada, devido à maior variação entre as médias, caracterizado pelo maior erro padrão

(Gráfico 4).

6 Resultados 70


Não houve diferença estatística (P> 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 4 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) com reação acrossomal e

membrana plasmática íntegra (CRAMI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009

6.2 INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA EM SÊMEN CONVENCIONAL E

SEXADO

Houve tendência a significância (P<0,10) na avaliação da integridade de membrana

plasmática, sendo que o sêmen convencional com diluidor L (Lagoa) apresentou menor

quantidade de membrana plasmática íntegra em relação aos outros tratamentos. Já o sêmen

convencional com diluidor S (Sexing) não apresentou diferença na comparação entre o sêmen

sexado nos tempos zero, três e seis horas. Além disso, não houve variação do sêmen sexado

ao longo do tempo quanto à integridade de membrana plasmática, visualizado no gráfico 5.

6 Resultados 71


Letras diferentes sobre as barras indicam tendência a significância (P<0,10). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à tecnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à tecnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à tecnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 5 - Médias ± erros padrão da porcentagem de células com membrana plasmática

íntegra (MI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009

Foi notada uma diferença significativa (P<0,05) na quantidade de espermatozóides

com membrana plasmática íntegra no sêmen. Houve diferença nos grupos T2, T3, T4 e T5,

sendo que os zebuínos apresentaram percentual maior de células com membrana plasmática

íntegra do que os taurinos, com exceção do sêmen convencional com diluidor L (T1) que

ocorreu o oposto. A porcentagem de membrana plasmática íntegra variou de 25,8 a 38,2%

(Gráfico 6).

6 Resultados 72


Letras diferentes sobre barras significam diferenças estatísticas entre as subespécies(P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído e submetido à tecnica de citometria de fluxo no tempo zero. T4 – Sêmen diluído e submetido à tecnica de citometria de fluxo após três horas. T5 – Sêmen diluído e submetido à tecnica de citometria de fluxo após seis horas Gráfico 6 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) com membrana plasmática

íntegra (MI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009

6.3 REAÇÃO ACROSSÔMICA EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO

Houve tendência a significância (P<0,10) na avaliação da reação acrossômica. O

sêmen sexado no tempo zero (T3) e no tempo seis horas após (T5) apresentaram,

numericamente, uma quantidade maior de células sem reação acrossômica (P<0,10) do que o

sêmen convencional com o diluidor S (Sexing – T2). No entanto, não houve diferença entre o

sêmen convencional com diluidor L (Lagoa – T1) e com o sêmen sexado nos tempos zero

(T3), três horas após (T4) e seis horas após (T5) (Gráfico 7).

6 Resultados 73


Letras diferentes sobre as barras indicam tendência a significância (P<0,10). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 7 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal (SRA)

no sêmen bovino pós-descongelação nos cinco tratamentos descritos acima – Pirassununga - 2009

Não houve diferença estatística (P>0,05) entre os tratamentos, quanto à quantidade de

células sem reação acrossomal (SRA) no sêmen tanto de taurinos como de zebuínos. A

variação foi de 69,0 a 79,3 (Gráfico 8).

6 Resultados 74


Não houve diferença estatística (P> 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 8 - Médias ± erros padrão da quantidade de células (%) sem reação acrossomal (SRA)

no sêmen de taurinos e zebuinos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009

6.4 PEROXIDAÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA EM SÊMEN CONVENCIONAL

E SEXADO

Foi observado que houve aumento significativo (P<0,05) na intensidade da

fluorescência captada pelo fotomultiplicador, que corresponde à maior peroxidação em

espermatozóides com membrana plasmática íntegra nos tratamentos T3, T4, T5 (sêmen

sexado), comparado com os tratamentos T1 (sêmen convencional com diluidor L – Lagoa),

T2 (sêmen convencional com diluidor S – Sexing). Entretanto, não houve diferença ao longo

do tempo (0, 3 e 6 horas) na sexagem espermática (Gráfico 9).

6 Resultados 75


Letras diferentes sobre as barras significam diferenças estatísticas (P < 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 9 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de fluorescência

da população espermática com membrana plasmática íntegra e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPI) no sêmen bovino submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009

As amostras de sêmen sexado dos taurinos e dos zebuínos após a descongelação

apresentaram, em média, um aumento dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência da população espermática com membrana plasmática íntegra e corada com a

sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (P<0,05) nos tratamentos T3, T4 e T5 (sêmen sexado

nos tempos zero, três e seis horas após, respectivamente) em relação aos grupos T1 e T2

(sêmen convencional com diluidor L e S, respectivamente). Todavia, não apresentou

diferença ao longo do tempo no sêmen sexado. Já entre taurinos e zebuínos, houve maior

peroxidação lipídica (P<0,05) nos taurinos (variou de 101,6 a 240,9 u.a.) do que nos zebuínos

(variou de 91,1 a 225,3 u.a.) (Gráfico 10).

6 Resultados 76


Letras diferentes sobre barras significam diferenças estatísticas entre as subespécies (P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 10 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência da população espermática com membrana plasmática íntegra e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009

Na análise da peroxidação lipídica em células com membrana plasmática lesada,

houve diferença estatística (P<0,05) entre o sêmen convencional e o sêmen sexado. Porém,

não houve diferença estatística entre os tratamentos (T3, T4 e T5) ao longo do tempo.

Também não existiu diferença entre o sêmen convencional com diluidores diferentes (T1 e

T2), assim como não houve entre os grupos T2 (sêmen convencional), T4 e T5 (Gráfico 11).

6 Resultados 77


Letras diferentes sobre as barras significam diferenças estatísticas (P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 11 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência emitida pela população espermática com membrana plasmática lesada e coradas com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPL) do sêmen bovino submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009

Foi observada diferença estatística (P<0,05) entre as subespécies taurina e zebuína,

sendo que a taurina apresentou maior quantidade de peroxidação lipídica do que a zebuína em

todos os tratamentos. Houve variação de 137,5 a 173,0 u.a. No entanto, não houve diferença

estatística entre os tratamentos (Gráfico 12).

6 Resultados 78


Letras diferentes sobre barras significam diferenças estatísticas entre as subespécies (P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 12 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência da população espermática com membrana plasmática lesada e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (PEIFMPL) no sêmen de taurinos e zebuinos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009

6.5 FOSFORILAÇÃO DO AMINOÁCIDO TIROSINA EM ESPERMATOZÓIDES COM

MEMBRANA PLASMÁTICA ÍNTEGRA EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO

As amostras de sêmen sexado apresentaram, em média, um aumento na emissão da

intensidade de fluorescência (FOIFMI - P< 0,05), o que significa que houve uma elevação na

ligação do anticorpo antifosfotirosina na superfície da membrana plasmática íntegra do

espermatozóide nos tempos 0, 3 e 6 horas após em relação ao sêmen convencional (T2). No

entanto, não houve diferença significativa entre o T1 e T2. Foi feita a associação da sonda IP

com a finalidade de excluir os espermatozóides com a membrana plasmática lesada, evitando

assim a contagem destas células durante a análise (Gráfico 13).

6 Resultados 79


Letras diferentes sobre as barras significam diferenças estatísticas (P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 13 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência emitida pela população espermática com a membrana plasmática íntegra e marcada com o anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína (FOIFMI) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009

Não houve diferença estatística nos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência emitida pela população espermática com membrana plasmática íntegra e

marcada com anticorpo antifosfotirosina entre as subespécies taurina e zebuína (P>0,05). A

variação da fosforilação do aminoácido tirosina foi de 109,0 a 155,2 u.a. (Gráfico 14).

6 Resultados 80


Não houve diferença estatística (P>0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 14 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade de

fluorescência emitida pela população espermática com a membrana plasmática íntegra e marcada com o anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína (FOIFMI) no sêmen de taurinos e zebuínos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h). Os valores estão representados em unidades arbitrárias (u.a.) – Pirassununga – 2009

6.6 ESTABILIDADE (FLUIDEZ) DA MEMBRANA PLASMÁTICA ÍNTEGRA

DESORGANIZADA EM SÊMEN CONVENCIONAL E SEXADO

Foi realizada a análise da quantidade de espermatozóides com membrana plasmática

íntegra desorganizada mensurada através da intensidade de fluorescência emitida pela sonda

merocianina 540, que indica a desorganização da membrana e não-corada com a sonda Yo-

Pro-1, porque não penetra em células com membrana plasmática íntegra. Não houve diferença

estatística entre o T1 e T5 e ao longo do tempo no sêmen sexado (T3, T4, T5), que apresentou

menor desorganização na membrana plasmática íntegra quando comparado com o sêmen

6 Resultados 81


convencional (T1 e T2), mas existiu diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos T1 e

T2; T1, T2 e o sêmen sexado (T3, T4 e T5) (Gráfico 15).

Letras diferentes sobre as barras significam diferenças estatísticas (P< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 15 - Médias ± erros padrão da quantidade de células com membrana plasmática

íntegra desorganizada (%), corada com a sonda fluorescente merocianina 540 e não-corada com o Yo-Pro-1 (MEMID) no sêmen bovino pós-descongelação submetido ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga – 2009

Na avaliação da quantidade de espermatozóides com membrana plasmática íntegra

desorganizada mensurada através da intensidade de fluorescência emitida pela sonda

merocianina 540 e Yo-Pro-1, foi observado que houve diferença significativa (P<0,05) entre

as subespécies nos tratamentos T2, T3, T4 e T5, com os zebuínos apresentando maior

quantidade de células com membrana plasmática íntegra desorganizada do que os taurinos,

com exceção do T1 que os resultados foram iguais para ambas.

6 Resultados 82


Letras diferentes sobre barras significam diferenças estatísticas entre as subespécies(p< 0,05). T1 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor L (Lagoa). T2 – Sêmen criopreservado pela técnica convencional com diluidor S (Sexing). T3 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo no tempo zero e posterior criopreservação. T4 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo três horas após e posterior criopreservação. T5 – Sêmen diluído, submetido à técnica de citometria de fluxo seis horas após e posterior criopreservação. Gráfico 16 - Médias ± erros padrão da quantidade de células com membrana plasmática

íntegra desorganizada (%), corada com a sonda fluorescente merocianina 540 e não-corada com o Yo-Pro-1 (MEMID) no sêmen de taurinos e zebuinos pós-descongelação submetidos ao tratamento convencional (diluidores L e S) e sexado (tempos 0, 3 e 6 h) – Pirassununga - 2009

7 Discussão

7 Discussão 84


7 DISCUSSÃO

O processo de sexagem de sêmen pela técnica de citometria de fluxo envolve várias

etapas que são susceptíveis a alterações morfo-funcionais nos espermatozóides, como o uso do

corante de DNA (Hoechst 33342), reaquecimento e incubação, forças mecânicas de vibração

para a formação da gota durante a passagem da célula espermática pelo nozzle tip, a exposição

ao laser UV, a carga elétrica, a alta gravidade durante a desaceleração do espernatozóide

dentro do tubo coletor, a alta diluição, pressão elevada (40 psi) e resistência a mudanças na

composição dos meios diluidores, a centrifução, a refrigeração e o processo de criopreservação

(GARNER; SEIDEL JR., 2003; GARNER, 2006; MOCÉ et al., 2006; GRAAF et al., 2007;

GARCIA et al., 2007). Desta forma, neste experimento foram testados os efeitos que todas

estas etapas causam aos espermatozóides considerando lesões na membrana plasmática, reação

acrossomal, peroxidação lipídica e capacitação espermática; conjunto de avaliações ainda não

descrito na literatura.

Pela observação dos resultados apresentados no gráfico 1, pôde-se notar uma tendência

do sêmen sexado criopreservado com o diluidor S avaliado logo após a descongelação (T3)

apresentar mais alta porcentagem de espermatozóides com membrana plasmática intacta e

acrossomo sem reação acrossomal do que aquele sêmen convencional criopreservado com

diluidor L (T1); todavia, esta diferença não foi notada quando comparou-se os outros grupos

de tratamento. Esses resultados podem sugerir algum efeito do diluidor, já que numericamente

o sêmen criopreservado com o diluidor L (T1) apresentou os mais baixos percentuais de

células com membrana plasmática intacta e sem reação acrossomal (25,6%) do que os outros

grupos de tratamento (29,9%; 31,6%; 29,1% e 29,7%; respectivamente para os grupos: T2, T3,

T4 e T5). Os efeitos do diluidor sobre as membranas plasmática e acrossomal já vem sendo

observados em vários outros trabalhos (AMIRAT et al., 2004; ARRUDA et al., 2005;

CELEGHINI et al., 2008).

Com as técnicas de análise realizadas no presente experimento, foi possível verificar

que o sêmen convencional (T1 e T2) apresentou maior população de células com reação

acrossômica e membrana plasmática íntegra do que o sêmen sexado (T3, T4 e T5); apesar da

diferença estatística, o percentual desta população foi baixo (Gráfico 3). Estes resultados são

divergentes daqueles encontrados por Oliveira (2009) e Oliveira et al. (2009) que observaram

maior percentual de espermatozóides com membrana plasmática íntegra e lesão de acrossoma

7 Discussão 85


após o processo de sexagem (33,8%) do que no sêmen convencional (0,0%). Esta discrepância

se explica pelo fato de que Oliveira et al. (2009) utilizaram a técnica de sexagem por gradiente

de Percoll, a qual poderia induzir a reação acrossomal precocemente. Por estes dados pode-se

dizer que há diferença entre a técnica de sexagem por citometria de fluxo quanto à preservação

da reação acrossômica precoce em relação à outra técnica citada.

Quando foi considerada somente a integridade de membrana plasmática, observou-se

menor percentual (26,7%) para sêmen convencional criopreservado com diluidor L (T1) do

que para o sêmen sexado no tempo zero (T3; 32,0%), nenhuma diferença foi encontrada entre

os outros grupos de tratamento (Gráfico 5). É importante ressaltar que a integridade da

membrana plasmática é fundamental para que ocorra o desencadeamento da capacitação

espermática com a finalidade de fecundar o oócito (FLESCH; GADELLA, 2000).

Quanto à reação acrossômica, tanto o sêmen convencional quanto o sêmen sexado

apresentaram um valor alto na população de células sem reação acrossômica, com variação de

72,8 a 77,9% e tendência a significância (P<0,10) do sêmen sexado (T3 e T5) apresentar mais

alto percentual de células sem reação acrossomal. Com estes resultados, pode-se notar neste

trabalho, que a membrana plasmática é muito mais sensível ao processo de sexagem e

criopreservação do que a membrana acrossomal, tanto no sêmen convencional como no

sexado.

A peroxidação lipídica nos espermatozóides com membrana plasmática íntegra foi mais

alta no sêmen sexado (T3, T4 e T5) com valores de 224,1 a 233,1 u.a., comparado ao sêmen

convencional (T1 e T2) que variou de 99,0 a 99,3 u.a. (Gráfico 9). A peroxidação lipídica é

conseqüência da ação de espécies reativas de oxigênio (EROs) em baixas concentrações, que

funcionam como segundo mensageiros na capacitação espermática e reação acrossômica,

através do aumento dos níveis de cAMP intracelular e a subsequente ativação da proteína

quinase A (PKA), estimulando a fosforilação do aminoácido tirosina de diversas proteínas

(VISCONTI; KOPF, 1998; FLESCH; GADELLA, 2000; LEWIS; AITKEN, 2001;

LAMIRANDE; FLAHERTY, 2008). Provavelmente, isto se deve ao processo de sexagem do

sêmen, pois não houve efeito do diluidor e nem do tempo de espera do ejaculado para a

sexagem. Porém, ainda não foi elucidado até que ponto este aumento interfere na fertilidade,

sabe-se que concentrações excessivamente altas de EROs são associadas a efeitos tóxicos,

levando a lesão de membrana, resultante da depleção de ATP e até morte celular (FLESCH;

GADELLA, 2000; LAMIRANDE, FLAHERTY, 2008).

7 Discussão 86


Neste trabalho, pode-se observar no gráfico 11 que o sêmen convencional apresentou

quantidades menores de subpopulação de células com membrana plasmática lesada com

peroxidação lipídica (145,5 – 156,1 u.a.) em relação ao sêmen sexado (161,7 -171,1 u.a.),

porém este valor foi maior comparado com as células com membrana plasmática íntegra com

peroxidação no sêmen convencional (99,0 -99,3 u.a.). No entanto, segundo Gadella

(comunicação pessoal, 2009), a sonda C11-BODIPY581/591 possui uma afinidade menor em

células com membrana plasmática lesada, por isso pode mostrar valores mais baixos de

peroxidação. As células lesadas liberam o seu pequeno, mas existente conteúdo, podendo

alterar o meio em que as células se encontram, desta maneira suprindo os fatores necessários

para que ocorra a capacitação (VADNAIS; ROBERTS, 2007).

Outro fator indicativo de capacitação espermática é a presença de proteínas fosforiladas

na superfície do espermatozóide, que apresentou um aumento significativo (P<0,05) no sêmen

sexado (Gráfico 13), ao contrário do esperado por Rathi et al. (2001), este aumento não foi

acompanhado pela quantidade de células classificadas como capacitadas pela análise de

associação de sondas YO-PRO-1 e Merocianina 540 (Gráfico 15), pois o sêmen convencional

apresentou maior população espermática com membrana plasmática íntegra desorganizada

(P<0,05). De acordo com Flesch et al. (1999), a fosforilação da tirosina pode induzir a

mudanças conformacionais nas proteínas, levando desta maneira, a uma ativação ou inativação

das proteínas. E, segundo Rathi et al. (2001), a sonda Merocianina 540 tem mostrado que cora

células com membrana íntegra mais intensamente se seus componentes lipídicos estiverem em

um alto estado de desordem, como é o caso do espermatozóide capacitado.

Embora o sêmen in natura partisse de um padrão mínimo de características normais, ou

seja, de boa qualidade, tanto para a subespécie taurina quanto para a zebuína, foi possível

observar nestes resultados que os zebuínos parecem ser melhores e mais resistentes do que os

taurinos devido à maior quantidade de espermatozóides com integridade de membrana

plasmática sem reação acrossômica (Gráfico 2), integridade de membrana plasmática (Gráfico

6), à menor população espermática com peroxidação lipídica tanto com membrana plasmática

íntegra (Gráfico 10) quanto lesada (Gráfico 12). Estes resultados diferem daqueles observados

por Lucio et al. (2009) e Oliveira (2009), que não observaram diferença nos percentuais de

lesão de membrana plasmática e acrossomal, nem função mitocondrial de sêmen sexado e

convencional entre taurinos e zebuínos.

No entanto, entre os taurinos e zebuínos, não foram encontradas diferenças estatísticas

(P>0,05) na análise da população espermática com membrana plasmática íntegra e reação

7 Discussão 87


acrossômica (Gráfico 4) e nem na quantidade de células sem reação acrossômica (Gráfico 8).

Somente na análise de associação das sondas Merocianina 540 e Yo-Pro-1 (Gráfico 16)

ocorreu o contrário do que seria o esperado, os zebuínos apresentaram maior quantidade de

espermatozóides com membrana plasmática desorganizada do que os taurinos nesta

característica, significando que possuem mais espermatozóides capacitados devido ao aumento

da fluidez da membrana, como descrito por Rathi et al. (2001).

Em relação à fosforilação da tirosina, não houve efeito de subespécie, apenas de

tratamento. No entanto, não foi encontrada nenhuma comparação entre as subespécies

associada a este trabalho na literatura, somente de diferenças de DNA existentes entre as raças

(GARNER, 2006).

Um fato importante observado neste experimento é o de que o sêmen sexado não piora

com o tempo de espera do ejaculado (zero, três e seis horas após) em relação a todas as

análises realizadas, nas quais houve tendência a significância (P<0,10) nas populações de

células sem reação acrossomal e com membrana plasmática íntegra (SRAMI), com membrana

plasmática íntegra (MI) e espermatozóides sem reação acrossomal (SRA). Houve significância

(P<0,05) na quantidade de espermatozóides com reação acrossomal e membrana plasmática

íntegra (CRAMI), peroxidação lipídica com membrana plasmática íntegra (PEIFMI),

peroxidação lipídica com membrana plasmática lesada (PEIFMPL), espermatozóides com

fosforilação da tirosina e membrana plasmática íntegra (FOIFMI) e membrana plasmática

íntegra desorganizada (MEMID). Isto vem a comprovar que o ejaculado mantido à temperatura

ambiente (21°C) por até seis horas para a produção do sêmen sexado vendido comercialmente

aparentemente não altera a taxa de prenhez, visto que não há reclamações de partidas

específicas, ou seja, de acordo com o tempo de espera do ejaculado para o início do processo

de sexagem.

É importante ressaltar que as partidas de sêmen sexado sejam comercializadas com

uma quantidade mínima de células mortas, pois estas produzem altas quantidades de EROs,

que associadas à baixa concentração por palheta interferem na fertilidade a campo. A

vantagem do sêmen sexado é que a técnica de citometria de fluxo reduz a população de células

mortas e com lesão celular através do descarte de gametas comprometidos identificados pelo

corante food colour (FD&C 40).

8 Conclusões

8 Conclusões 89


8 CONCLUSÕES

- A sexagem pela técnica de citometria de fluxo não provoca lesões na membrana

plasmática, nem causa reação acrossomal, sendo o percentual de espermatozóides com

membrana plasmática íntegra e sem reação acrossomal semelhante ao sêmen

convencional com tendência a ser melhor.

- O sêmen sexado pela técnica de citometria de fluxo sofre maior peroxidação lipídica

das membranas espermáticas e fosforilação do aminoácido tirosina quando comparado

ao sêmen convencional.

- O sêmen sexado pela técnica de citometria de fluxo apresenta menor quantidade de

espermatozóides com membrana plasmática desorganizada, quando comparado ao

com a técnica convencional.

- Os espermatozóides de zebuínos são mais resistentes a lesão de membrana plasmática,

reação acrossomal e peroxidação lipídica do que espermatozóides de taurinos, quando

submetidos à sexagem pela técnica de citometria de fluxo.

- A fosforilação do aminoácido tirosina de espermatozóides submetidos às técnicas de

sexagem (citometria de fluxo) ou convencional é semelhante para animais de raças

zebuínas e taurinas.

- O sêmen de taurinos quando submetido à sexagem pela técnica de citometria de fluxo

apresenta menor quantidade de espermatozóides com membrana plasmática

desorganizada, quando comparado com o de zebuínos.

- Não existem diferenças na integridade ou desorganização da membrana plasmática,

reação acrossomal, peroxidação lipídica e fosforilação do aminoácido tirosina nos

espermatozóides bovinos, bem como entre zebuínos e taurinos, quando o ejaculado, in

natura, é mantido por zero, três ou seis horas antes de iniciar a sexagem pela técnica

de citometria de fluxo.

8 Conclusões 90


- Uma vez que a desorganização da membrana plasmática, reação acrossomal,

peroxidação lipídica e fosforilação do aminoácido tirosina são eventos envolvidos com

a capacitação espermática, os resultados obtidos neste experimento em relação à

sexagem pela técnica de citometria de fluxo merecem maiores estudos.

Referências

Referências 92


REFERÊNCIAS

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AMIRAT, L.; TAINTURIER, D.; JEANNAAU, L.; THORIN, C.; G´ERARD, O.; COUNTERS, J. L.; ANTON, M. Bull semen in vitro fertility after cryopreservation using egg yolk LDL: a comparison with Optidyl®, a commercial egg yolk extender. Theriogenology, v. 61, p. 895–907, 2004.

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new estudo das alterações morfo-funcionais de espermatozóides … · 2010. 12. 14. · folha de...

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