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Marina Mori Pires de Camargo

Parâmetros morfo-funcionais de Prochilodus lineatus

submetidos a testes in situ no Ribeirão Cambé

(Londrina-PR)

Londrina 2004


Alterações morfo-funcionais de Prochilodus lineatus


(Londrina- PR)

Dissertação apresentada ao curso de Pós-

graduação em Ciências Biológicas, da

Universidade Estadual de Londrina, como

requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre.

Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Bueno

dos Reis Martinez

Londrina

2004


Alterações morfo-funcionais de Prochilodus lineatus


(Londrina- PR)

COMISSÃO EXAMINADORA

Profª. Drª. Marisa Narciso Fernandes Universidade Federal de São Carlos

Profª. Drª. Marta Marques de Souza Universidade Estadual de Londrina

Profª. Drª. Cláudia Bueno dos Reis Martinez Universidade Estadual de Londrina

Londrina,____ de__________de 2004

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Paulo Wilson e Carolina,

meus maiores colaboradores, à minhas irmãs,

Paola e Raquel, pelo apoio de sempre, à

Cláudia, por me ensinar tanto e ao João

Cezar, por todo seu amor...

AGRADECIMENTOS

À Profª. Drª.Cláudia B. R. Martinez, por tudo o que me ensinou durante esses anos e pela dedicação e cuidado, fundamentais na realização desse trabalho. À minha família, namorado e amigos, pela presença constante e apoio nas horas mais difíceis. À Profª. Drª. Marisa N. Fernandes da Universidade Federal de São Carlos, pelo auxílio em várias fases desse trabalho e por sua participação na banca examinadora. À Profª. Drª. Marta M. Souza, pelos conselhos, bom humor e apoio de sempre e por sua participação na banca examinadora. À Andressa G. Silva, por tudo o que me ensinou e por uma valorosa amizade. Aos integrantes do laboratório de Ecofisiologia Animal, principalmente a Elissandra U. Winkaler, Thiago Russel e Bruno A. Galindo, pelo apoio nos trabalhos de campo e durante as análises. Ao Prof. Dr. Júlio Hermann Leonhardt e ao Dr. Paulo César Meletti, pelas sugestões na qualificação, e, em especial a este último, por outros muitos conselhos práticos. Ao Ms. Guilherme H. D. Pinheiro, da Universidade Federal de São Carlos, pelo auxílio nas análises do cortisol. À Profª. Drª. Sílvia Helena Sofia, pelo apoio em diversas fases do trabalho, e principalmente na impressão. As amigas do mestrado Carla, Cibele, Cristina, Deise, Daniella, Karen, Marisete, pelos dias de trabalho compartilhados e grande amizade. Aos funcionários da Estação de Piscicultura (EPUEL), pela ajuda na manutenção e fornecimento dos peixes. À Profª. Drª. Célia Regina Grahen Tavares e à Profª. Drª. Eneida Sala Cossich, do Laboratório de poluição do Depto. de Engenharia Química da Universidade Estadual de Maringá e aos Profs. Misael Rodrigues e Francisco Striquer, pelo auxílio na análise do sedimento e da água. À Coordenação do curso de Mestrado em Ciências Biológicas da UEL, principalmente ao Prof. Dr. Edmilson Bianchini. A CAPES, pelo apoio financeiro. A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização desse trabalho, muito obrigada !

RESUMO

Camargo, M. M. P. Parâmetros morfo-funcionais de Prochilodus lineatus submetidos a testes in

situ no Ribeirão Cambé (Londrina-PR). 2004 Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas –

Área de Concentração Zoologia). Universidade Estadual de Londrina, Paraná.

Exemplares juvenis de Prochilodus lineatus foram submetidos a testes in situ durante 7 dias em 4

pontos em um ribeirão urbano e em um local de referência, durante inverno e verão. A saúde desses

peixes foi analisada de duas formas distintas: por meio de parâmetros funcionais, como conteúdo de

hemoglobina (Hb), concentrações plasmáticas de glicose, proteínas totais, lipídeos totais, colesterol,

triglicerídeos, cortisol, sódio, cloreto, potássio, osmolaridade plasmática e atividade hepática das

enzimas glutationa S-transferase (GST) e catalase, além da morfometria das células interrenais.

Ainda foram utilizados parâmetros histopatológicos de 3 órgãos-alvo, brânquia, rim e fígado, para

os quais foram calculados um valor médio de alteração (VMA) e um índice de alteração

histopatológico (IAH), que consideram a distribuição e a severidade das lesões nos órgãos,

respectivamente. A análise sazonal mostrou-se mais significativa nos parâmetros funcionais,

principalmente na Hb e medida da área das células interrenais, sendo importante que tais resultados

sejam levados em conta no momento da utilização dos biomarcadores em questão para a avaliação

ambiental. A incidência das alterações histopatológicas parece não ter apresentado relação com as

variações sazonais observadas. Entre as variáveis funcionais estudadas, a glicemia, a área das

células interrenais e a atividade da GST foram as que melhor se adequaram como biomarcadores

para contaminação aquática, pois diferenciaram bem os peixes confinados no ribeirão urbano

daqueles da referência. Os demais parâmetros funcionais analisados não mostraram resultados

conclusivos, seja devido à grande variação individual ou também sazonal que possam ter sofrido. A

histopatologia mostrou ser uma boa ferramenta para estudar animais de ambientes contaminados,

pois permitiu, em um curto período (confinamento de 7 dias apenas), diferenciar os animais do

ribeirão urbano do local de referência. Quanto à sua gravidade as alterações histopatológicas

encontradas nos três órgãos dos animais amostrados foram consideradas de moderadas a severas,

estando distribuídas de forma moderada a extensa pelos tecidos. Isso indica que existe um

comprometimento da água do ribeirão urbano e que a exposição a essa água causou não só danos

metabólicos como também estruturais aos peixes. Entre os órgãos analisados o fígado foi o mais

afetado. Entre os pontos estudados no ribeirão urbano, aquele a jusante dos demais foi considerado

o mais impactado, já que os peixes aí confinados apresentaram um maior número de parâmetros que

variou em relação ao local de referência. As características lênticas desse local favorecerem o

acúmulo de contaminantes tanto na água como no sedimento. Os resultados desse trabalho

mostraram que a utilização de biomarcadores para análise de animais expostos a ambientes

contaminados deve levar em conta a possível variação sazonal sobre esses parâmetros para que o

entendimento das respostas seja o melhor possível. A análise histopatológica funcionou melhor

como biomarcador quando comparada à análise funcional, pois permitiu diferenciar bem os locais

estudados, sem sofrer grandes interferências e apresentando, ainda, menor custo e facilidade de

interpretação. A espécie de peixe neotropical P. lineatus foi bastante adequada ao tipo de teste

realizado, já que respondeu bem à situação a qual foi submetida mostrando-se sensível aos possíveis

contaminantes presentes na água do ribeirão urbano.

Palavras-chave: peixe, biomarcadores, parâmetros funcionais, histopatologia, teste in situ, ribeirão

urbano.

SUMÁRIO

I APRESENTAÇÃO .................................................................................................................... 4 II ARTIGO 1 ................................................................................................................................ 14 III ARTIGO 2............................................................................................................................... 44 IV REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................... 74

APRESENTAÇÃO

1. Urbanização e o ambiente aquático

A água é um elemento fundamental para vida. Sua utilização está diretamente vinculada à

maior parte das necessidades humanas, como o abastecimento público e industrial, a irrigação

agrícola, a produção de energia elétrica, além das atividades de lazer e recreação.

Por um longo tempo, o suprimento de água para a população não foi uma questão

preocupante. Entretanto, com a crescente expansão demográfica e industrial que vem ocorrendo nas

últimas décadas em todo o mundo, essa preocupação veio à tona. Isso porque somente uma pequena

parte (cerca de 0.4%) de toda a água doce da Terra está realmente disponível para utilização,

distribuída nos rios e lagos (LLOYD, 1992). Essa água, portanto, representa um recurso escasso que

deve ser preservado.

Um dos problemas que o crescimento populacional acarreta para o ambiente é a necessidade

de urbanização. Atualmente cada vez mais pessoas moram nas cidades, deixando o campo. No

Brasil cerca de 80% da população mora nas áreas urbanas (IBGE, 2000), sendo esperado que até o

ano de 2030 mais de 60% da população mundial viva nas cidades (PAUL e MEYER, 2001).

A urbanização representa um sério risco para o ambiente, principalmente o aquático. Isso

porque a maior parte dos países não possui infra-estrutura nem recursos financeiros suficientes para

um desenvolvimento sustentável, com utilização coerente de seus recursos. Assim, rios e

reservatórios sofrem com a contaminação crescente, resultante principalmente das atividades

antrópicas (MASON, 1996).

Pouco ainda se sabe sobre as implicações que a urbanização tem sobre a ecologia dos

ambientes aquáticos. Historicamente, a maior parte dos estudos concentraram-se na avaliação dos

efeitos químicos da contaminação na água, mas poucas relações foram feitas com os organismos

vivos, e menos ainda com os efeitos sobre os peixes (MULHOLLAND e LENAT, 1992).

A poluição aquática pode ser definida como a adição de qualquer substância que altere a

composição química, microbiológica e a temperatura da água (HEATH, 1987). Segundo KLEIN

(1957) poluição é qualquer ato que cause ou induza características indesejáveis em um curso d’água

e afete, de maneira nociva, os possíveis usos que normalmente se possam fazer do líquido. Dentre

os comprometimentos deve-se ainda considerar os prejuízos que tal poluição possa causar à saúde, à

segurança e ao bem-estar das populações e da fauna ictiológica das águas (BRANCO, 1986). A

poluição pode ser gerada por efluentes domésticos e industriais, além de carga difusa de origem

urbana e agrícola (CETESB, 2001) e está comumente relacionada com descargas de efluentes que

são, em sua maioria, misturas de compostos tóxicos de vários tipos, partículas em suspensão e

matéria orgânica particulada ou em decomposição (MARTINEZ e CÓLUS, 2002).

Os efeitos que os poluentes podem causar dependem das próprias características do corpo

d’água e dos organismos que o habitam. Os casos mais notificados são os de mortalidade em massa

de organismos em decorrência da poluição, entretanto, esses são apenas acontecimentos pontuais. O

que não se pode esquecer é que ecossistemas aquáticos urbanos sofrem, freqüentemente,

contaminação crônica em níveis subletais e que tal exposição pode levar a problemas a longo prazo

na reprodução, crescimento e resistência a doenças dos organismos (JOBLING, 1995).

A qualidade da água também é resultante das condições naturais da bacia hidrográfica, além

das atividades humanas nela desenvolvidas (CONDINI, 1998). Como condições naturais entende-se

cobertura vegetal e estrutura do solo; fatores importantes, já que à medida que o solo perde

permeabilidade pela redução de sua cobertura, diminui também a infiltração de água o que

prejudica o lençol freático e aumenta, conseqüentemente, o escoamento superficial (DUNNE e

LEOPOLD, 1978). Vários estudos relacionando a permeabilidade do solo com a manutenção da

estrutura biótica de córregos urbanos mostraram que quanto mais impermeável é o solo de um local,

menor sua diversidade de peixes e invertebrados, já que toda a estrutura física dos córregos fica

alterada nessa situação (KLEIN, 1979; JONES e CLARK, 1987).

2. A cidade de Londrina e o Ribeirão Cambé

O norte do Estado do Paraná, incluindo a cidade de Londrina, possui uma vocação agrícola

muito forte, principalmente de grandes culturas como soja e milho. Segundo dados do IBGE (2000),

durante o ano de 2000, mais de 230.000 hectares de área no estado receberam aplicação de

defensivos agrícolas considerados altamente tóxicos na cultura do milho e mais de 2 milhões de

hectares na cultura da soja. Tais compostos são principalmente derivados de glicina, inseticidas

organofosforados e piretróides além de muitos hidrocarbonetos, e estão entre os mais tóxicos para o

ambiente aquático.

A cidade de Londrina (23º 08’ 47’’ - 23º 55’ 46’’ S, 50º 52’ 23’’ - 51º 19’ 11’’ O) teve um

crescimento bastante rápido já que, em 69 anos de existência, alcançou uma área de quase 1725

km2, com cerca de 600.000 habitantes em sua região metropolitana (IBGE, 2000) possuindo uma

área de influência que chega a 4,5 milhões de habitantes (CIDADE DE LONDRINA, 2003). Tal

crescimento acarretou prejuízos para grande parte de seus ribeirões urbanos e a devastação da

maioria dos fundos de vale. Os ribeirões de pequeno porte, em cujas margens normalmente existe

alta concentração humana, são os mais atingidos por dejetos de atividade antrópica, devido à falta

da coleta de esgotos apropriada. Segundo dados da Secretaria de Planejamento do Município, quase

94% dos domicílios possuem coleta de lixo e abastecimento de água pela rede pública, entretanto

cerca de 30% da população não é servida pela rede de esgoto, e o número de famílias que ainda

utiliza nascentes e poços como fontes de água é considerável (cerca de 6% da população) (CIDADE

DE LONDRINA, 2003).

A cidade de Londrina possui 7 microbacias hidrográficas, sendo a do Ribeirão Cambé uma

das mais importantes, já que possui 26 afluentes (SEMA, 2003) em uma área de drenagem de 75,8

km2.

O Ribeirão Cambé nasce a noroeste da cidade de Londrina, próximo ao encontro das rodovias

BR 369 e PR 445 (23º 15’ – 23º 18’ S, 51º 14’ – 51º 12’ W). Tem extensão de 13 km e divide os

municípios de Cambé e Londrina, cortando este último no sentido noroeste-sudeste, até desaguar no

Ribeirão Três Bocas, que é um afluente do Rio Tibagi (SANTOS, 1984; SOUZA, 1990;

ALMEIDA, 2002). É considerado um manancial urbano (SILVA, 1994) visto que toda sua extensão

encontra-se dentro de áreas urbanizadas e, já em sua nascente, há um grande parque industrial, de

onde provêm os mais diferentes tipos de efluentes. Ainda na região próxima à nascente observa-se a

presença de bairros mais pobres sem infra-estrutura adequada. O uso de fossas é bastante comum

nessas regiões, o que permite, muitas vezes, a contaminação do leito do rio pela infiltração de

poluentes, sendo que a mesma água é depois utilizada pela população para irrigação de hortaliças,

para lazer, etc. (SANTOS, 1984).

Entre as principais fontes poluidoras do Ribeirão Cambé estão indústrias como as de laticínios

(efluentes contendo soro, gordura, água de lavagem de pisos e equipamentos e matéria orgânica), as

de café solúvel (efluentes como matéria orgânica, sólidos em suspensão, NaOH, esgotos sanitários),

curtumes (efluentes contendo cromo, gordura, sulfetos), indústrias cerâmicas (que podem liberar

metais pesados), têxtil (efluentes como resíduos de corantes, esgoto, ácidos, álcalis, produtos

químicos) e oficinas mecânicas (que liberam resíduos de óleo diesel) (SANTOS, 1984). A maior

parte dessas instalações possui algum tipo de sistema de tratamento que, entretanto, não evita que

parte de seus efluentes atinjam o ribeirão. Ainda pode-se considerar como fontes adicionais de

poluentes os clubes esportivos, restaurantes, conjuntos habitacionais, chácaras e a própria

SANEPAR (Companhia de Saneamento do Paraná), em função de vazamentos de tubulações que

freqüentemente atingem os ribeirões da cidade (SANTOS, 1984).

Estudos avaliando a evolução do uso do solo da bacia do Ribeirão Cambé e região (ROCHA,

1986; SOUZA, 1990; SILVA, 1994), mostraram que desde a década de 70 essa área vem sofrendo

prejuízos com a ocupação humana, que resultou na duplicação do grau de urbanização e na redução

de metade da área de vegetação, além da superfície coberta por água que também sofreu perdas em

decorrência de aterros e assoreamento.

Um estudo realizado por YABE e OLIVEIRA (1998) identificou a ocorrência de alguns

metais em córregos de Londrina, destacando níveis extremamente altos de chumbo nas águas do

Ribeirão Cambé, próximo a uma indústria de baterias (4504 ± 418 µg Pb.L-1). Resultados

semelhantes foram encontrados para o sedimento do Ribeirão Cambé, onde foram determinados

níveis extremamente altos de chumbo no lago Igapó I (1173,33 mg Pb.Kg-1) (ALMEIDA, 2002). O

Brasil ainda não tem determinadas as concentrações permitidas de metais para o sedimento, mas em

comparação com valores determinados em outros países, os resultados do Ribeirão Cambé são

alarmantes.

3. Ecotoxicologia

O termo ecotoxicologia foi introduzido por TRUHAUT em 1969, derivado das palavras

ecologia e toxicologia, para designar uma ciência que se preocupa em estudar os efeitos prejudiciais

de substâncias químicas no ecossistema (WALKER et al., 1996).

O estudo de alterações decorrentes do estresse químico constitui um dos objetivos da

ecotoxicologia, entretanto, esta ciência tem se desenvolvido mais fortemente nos países de clima

temperado, deixando uma carência de informações a esse respeito nos países tropicais, cuja

realidade é bastante diferente (LACHER Jr. e GOLDSTEIN, 1997).

Os ecossistemas tropicais, tanto terrestres como aquáticos, cobrem somente 25,7% da

superfície da Terra, entretanto esta área gera aproximadamente 60% da produtividade primária do

planeta (DESHMUKH, 1986), fato que justifica a preocupação com os ambientes tropicais e,

conseqüentemente, o crescente número de estudos realizados atualmente nessas regiões. Dada a

diversidade dos ecossistemas tropicais fica claro que a contaminação ambiental nesses ambientes

torna-se muito mais complexa que aquela encontrada em países de clima temperado. Assim, a

ecotoxicologia tropical não pode ser encarada como uma mera extensão dos métodos e técnicas

desenvolvidos em latitudes temperadas (LACHER Jr. e GOLDSTEIN, 1997), sendo necessário o

estudo sobre os efeitos dos contaminantes em organismos aquáticos nativos da região.

A literatura tem ressaltado a dificuldade em se prever o risco toxicológico para a comunidade

aquática somente através da análise química da água e do sedimento, já que tais análises por si só

não indicam toxicidade. Portanto, testes de toxicidade e biomarcadores têm sido propostos e

aplicados para se compreender a sobrevivência e as respostas de organismos que habitam áreas

críticas (VIGANO et al., 2001).

4. Estratégias para o monitoramento da qualidade da água

Com o intuito de se conhecer os efeitos dos contaminantes sobre a biota aquática, têm sido

desenvolvidos, nas últimas décadas, testes de toxicidade com organismos aquáticos, em condições

laboratoriais (MARTINEZ e CÓLUS, 2002). Segundo RAND e PETROCELLI (1985) os testes de

toxicidade permitem avaliar tanto o efeito letal dos agentes sobre os organismos como os subletais,

através de fenômenos bioquímicos, patológicos e fisiológicos que os animais possam apresentar.

Tais testes têm sido realizados com metais, defensivos agrícolas, efluentes industriais,

amostras ambientais de água e sedimento entre outras coisas (MELETTI et al., 2003), podendo-se

utilizar algas, bactérias, invertebrados e peixes como organismos testes. Entretanto, os testes de

toxicidade, além de não considerarem as condições que ocorrem no ambiente natural, geralmente

superestimam a magnitude e duração da exposição ao agente tóxico (WINKALER et al., 2001).

Trabalhos de campo representam mais fielmente à realidade a qual os animais estão expostos,

ou seja, levam em consideração todas as variações que possam ocorrer no local (MARTINEZ et al.,

2002), seja por mudanças de temperatura, pluviosidade ou até mesmo diferentes concentrações de

poluentes e ainda, não têm a necessidade de se extrapolar os resultados obtidos para o ecossistema,

já que refletem a realidade. Para atender essas exigências, os testes in situ têm-se mostrado muito

eficientes, sendo bastante utilizados nos EUA e Europa, desde a década de 90 (STIEN et al., 1998).

Nesse tipo de teste, organismos sadios são mantidos no local que se deseja estudar, em gaiolas

onde a água corre livremente, e o animal tem acesso também ao sedimento para alimentação. Por

determinado tempo, acompanha-se a sobrevivência ou então analisam-se parâmetros biológicos dos

animais. Nos testes in situ ainda existe a vantagem de se poder padronizar o sexo e a idade dos

animais, fatores que podem influenciar bastante as respostas apresentadas.

Apesar de toda a aplicabilidade desse tipo de teste, no Brasil ele ainda é muito pouco

desenvolvido. PEREIRA et al. (1999) desenvolveram testes in situ com espécies zooplanctônicas

(Daphnia magna e Ceriodaphnia dubia) em um reservatório contaminado por metais em São Paulo,

concluindo se tratar de um método rápido e eficiente de avaliação da contaminação ambiental.

MELLETI e ROCHA (2002) propuseram o desenvolvimento de uma câmara para se realizar testes

in situ com espécies pequenas de peixes. SILVA (2002) e WINKALER (2002) realizaram testes in

situ utilizando uma espécie neotropical de peixe (Prochilodus lineatus), e obtiveram bons resultados

ao estudar um ribeirão urbano.

5. Biomarcadores

Uma grande variedade de compostos químicos pode ser encontrada em associação com a

água. Tais compostos são definidos como xenobióticos, já que são substâncias estranhas aos

sistemas biológicos e muitas vezes podem ser tóxicas para os organismos aquáticos (JOBLING,

1995). Existem quatro rotas possíveis para um xenobiótico entrar no peixe: pelas brânquias,

através do alimento, ao beber água (nos animais marinhos) e pela pele (HEATH, 1987).

Os xenobióticos atuam em diferentes níveis organizacionais dos animais, o que pode levar a

diferentes respostas (JOBLING, 1995). É importante saber reconhecer o que é um efeito ou uma

resposta a um xenobiótico. Efeito é a ação do contaminante diretamente sobre um órgão ou função,

como, por exemplo, um agente tóxico que atue nas brânquias, causando elevação epitelial e

conseqüentemente menor captação de oxigênio. A resposta a esse efeito será um aumento na

atividade de ventilação do peixe na tentativa de captar mais oxigênio e manter a homeostase.

Contaminantes podem enfraquecer o peixe, deixando-o mais suscetível à mortalidade por

outras causas (SCHWAIGER et al., 1997) e a ocorrência de doenças em peixes tem sido usada

como indicador dos efeitos de fatores ambientais impactantes (RANZANI-PAIVA et al., 2000).

Alguns trabalhos avaliaram os efeitos da poluição na abundância de espécies de peixes,

encontrando normalmente, diminuição na diversidade e riqueza em locais impactados (YODER et

al., 1999; ONORATO et al., 2000). Entretanto são ainda raros os trabalhos que procuram identificar

alterações estruturais e funcionais nos animais expostos à poluição.

Biomarcadores podem ser definidos como respostas biológicas que podem estar relacionadas à

exposição ou ao efeito tóxico de um contaminante ambiental (PEAKALL, 1994). O uso de

parâmetros bioquímicos, fisiológicos e morfológicos como biomarcadores tem apresentado bons

resultados na avaliação do efeito dos poluentes sobre os peixes (WINKALER et al., 2001) e,

juntamente com análises químicas da água e do sedimento, podem ser úteis em programas de

monitoramento ambiental (SANCHEZ-HERNANDEZ et al., 1998).

A integração dos resultados obtidos em diferentes níveis biológicos, tais como molecular

(biotransformação, metabolismo) e celular/tecidual (efeitos histopatológicos), pode aprimorar o

conhecimento das respostas integradas nos peixes expostos à contaminação (PACHECO e

SANTOS, 2002).

Marcadores bioquímicos e fisiológicos têm a vantagem de apresentarem respostas rápidas e

específicas dos animais a determinados poluentes (TEH et al., 1997), além do que as primeiras

alterações causadas por exposições subletais costumam ocorrer nos níveis moleculares e

bioquímicos, como por exemplo na ação de enzimas (ADAMS et al., 1990).

O que não se pode esquecer ao se analisar os biomarcadores é que as respostas apresentadas

pelos animais podem sofrer interferência das variações sazonais em parâmetros como temperatura,

quantidade de oxigênio dissolvido na água, precipitação, entre outros. Tais variações devem,

portanto, ser levadas em conta durante a avaliação dos resultados, para que o entendimento seja

adequado.

5.1 Biomarcadores bioquímicos

Quando um animal entra em contato com um xenobiótico, este, normalmente, é

transportado pelo sangue até os órgãos onde será metabolizado ou armazenado (JOBLING,

1995). O processo de detoxificação ocorre em todos os tecidos animais, mas em níveis maiores

no fígado.

O fígado é um órgão de extrema importância para os peixes já que desempenha diversas funções

metabólicas, como o metabolismo de xenobióticos. Algumas enzimas que são responsáveis por

reações de detoxificação de substâncias químicas têm sua atividade no fígado (JIMENEZ e

STEGEMAN, 1990). Portanto, prejuízos a esse órgão podem levar à diminuição na produção

dessas enzimas detoxificantes, além de prejudicar o estoque de glicogênio e lipídeos como

reservas energéticas (ADAMS et al., 1990), afetando, por fim, a resposta compensatória dos

animais de ambientes impactados (WILHELM FILHO et al., 2001).

As reações de transformação de xenobióticos normalmente envolvem oxidação, redução e

hidrólise do composto tóxico (chamadas reações de fase 1). Nessa fase os compostos lipofílicos

são transformados em hidrofílicos, que são menos tóxicos por serem menos permeáveis às

membranas biológicas. Tais resíduos podem ser excretados diretamente ou passar para as reações

de fase 2. Nessa fase ocorre conjugação dos resíduos com substratos endógenos como a

glutationa, a fim de serem excretados mais facilmente (HUGGET et al., 1992).

A glutationa-S-transferase (GST) é um exemplo de enzima relacionada com a conjugação e

excreção de compostos tóxicos (fase 2) (GOKSOYR e FORLIN, 1992). Trabalhos têm relatado o

aumento na atividade dessa enzima na presença de hidrocarbonetos poliaromáticos e

policlorados (PAHs e PCBs) e sua diminuição na presença de organofosforados e carbamatos

(STIEN et al., 1998), tanto em trabalhos de campo quanto em laboratório (MACHALA et al,

1997).

Xenobióticos podem gerar também oxirradicais, como o peróxido de hidrogênio e hidroxilas, que

por sua vez, causam danos celulares e teciduais, já que são normalmente associados com

diversos processos patológicos, como mutagênese e carcinogênese (DiGIULIO et al., 1989;

HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1998).

O estudo de enzimas antioxidantes em peixes, como a catalase, mostra que elas são

estruturalmente muito semelhantes à dos mamíferos (WILHELM FILHO, 1996) e sua atividade

tem sido relacionada com o controle do estresse oxidativo em animais expostos a contaminantes

(HUGGET et al., 1992).

Dados de literatura sugerem um aumento das defesas antioxidantes em peixes durante a

primavera e o verão, quando comparados com temperaturas mais baixas (HARDIG e

HOGLUND, 1983). Períodos de altas temperaturas mostraram maior consumo de O2, e

conseqüente aumento na atividade das enzimas SOD e GST de peixes de locais não poluídos,

sendo que a atividade da catalase também tende a aumentar com o calor (WILHELM FILHO et

al., 2001).

Portanto, estudar as defesas antioxidantes juntamente com atividade de enzimas

biotransformantes no fígado dos peixes é uma boa estratégia para avaliar a poluição aquática

(ADAMS et al., 1989).

5.2. Biomarcadores endócrinos

SELYE (1956) trabalhando com mamíferos desenvolveu a idéia de que, quando um animal é

sujeito a algum tipo de estresse, ele apresenta um grupo generalizado de respostas fisiológicas.

Ocorre um rápido aumento na adrenalina e noradrenalina que mobilizam o glicogênio dos músculos

na forma de glicose para o sangue e aumentam o fluxo sangüíneo, possibilitando ao animal

responder a qualquer “perigo”. Se a situação estressante continuar, o córtex da adrenal é estimulado

a liberar grandes quantidades do hormônio cortisol no sangue. Tal hormônio é o responsável pela

manutenção das respostas iniciadas pela adrenalina, sendo que situação semelhante acontece com os

peixes (DONALDSON, 1981; MAZEUAD e MAZEAUD, 1981). Estas mudanças hormonais

decorrentes da exposição a um estressor desencadeiam outras alterações fisiológicas; as respostas

secundárias de estresse, como hiperglicemia, depleção das reservas energéticas, alterações

osmoregulatórias entre outras (JOBLING, 1995).

O cortisol é considerado o hormônio do estresse em peixes, já que rege uma série de respostas

que visam manter ou recuperar a homeostase do animal, frente às mudanças físicas e/ou químicas

que estejam comprometendo sua sobrevivência em determinado local. Estas respostas em conjunto

são denominadas respostas de estresse (ADAMS et al., 1990). Diferentemente dos mamíferos, nos

peixes o cortisol é sintetizado pelas células interrenais localizadas na porção anterior do rim

(HONTELA, 1997), também chamado de rim cefálico.

Diversos trabalhos têm mostrado que peixes amostrados em locais contaminados têm os

níveis de cortisol do plasma aumentados, confirmando que esse hormônio participa da resposta ao

estresse (LOCKHART et al., 1972). Esse hormônio possui funções químicas e fisiológicas como

depleção do glicogênio hepático, aumento da glicose plasmática, da atividade cardíaca, do fluxo de

sangue para as brânquias, além de mudanças nos eletrólitos do plasma para manutenção do balanço

hidromineral (WENDELAAR BONGA, 1997).

Peixes expostos cronicamente a baixos níveis de poluentes apresentam redução na capacidade

de elevar os níveis de cortisol no plasma em resposta ao estresse agudo, podendo ficar mais

susceptíveis às variações bióticas e abióticas do meio, o que pode comprometer sua sobrevivência

(COLBORN e CLEMENT, 1992; GIRARD et al., 1997; HONTELA, 1997).

5.3 Biomarcadores metabólicos

A contaminação aquática, tanto aguda quanto crônica, pode resultar em um estresse

metabólico devido à uma maior demanda energética, podendo afetar as reservas de nutrientes do

animal (DiGIULIO et al, 1995). Uma das primeiras respostas a esse tipo de estresse é o aumento da

glicose no sangue e a diminuição do glicogênio no fígado, na tentativa de suprir a demanda

energética (HATTINGH, 1976; ARILLO et al., 1982; MORGAN e IWAMA, 1997).

As fontes de energia provenientes da alimentação são basicamente moléculas orgânicas,

constituindo-se de carboidratos, lipídeos e proteínas (JOBLING, 1995). Normalmente os

carboidratos são a primeira fonte de energia utilizada pelos animais. Entretanto, na falta destes,

podem utilizar suas reservas e, em último caso, metabolizar as proteínas, o que pode trazer danos

estruturais para o organismo.

Os animais podem utilizar diversos meios para obter energia dependendo de cada situação. O

glicogênio geralmente representa a principal fonte de carboidratos e sabe-se que contaminantes

podem alterar sua síntese no fígado (VIGANO et al., 2001). O metabolismo de lipídeos e de

proteínas, além de informar a condição bioenergética geral do animal, também pode ser relacionado

com os efeitos dos contaminantes nesses organismos (ADAMS et al., 1990). O mesmo acontece

com o nível de colesterol plasmático, que é um indicador tanto do metabolismo nutricional quanto

dos hormônios esteróides em peixes (ADAMS et al., 1990) e os triglicerídeos totais, que refletem a

energia disponível para o organismo mediar os efeitos do estresse (LEE et al., 1983).

5.4 Biomarcadores hematológicos

Nos peixes uma membrana fina, representada pelo epitélio lamelar, separa o sangue da água,

permitindo que qualquer mudança desfavorável no ambiente seja refletida no sangue (SAMPATH

et al., 1993). Por isso o sangue dos peixes tem sido utilizado em estudos toxicológicos, para

monitoramento ambiental e como possível indicador de alterações patológicas e fisiológicas durante

o manejo e na investigação de doenças (MULCAHY, 1975).

Alterações hematológicas podem ser indicadoras do estado fisiológico do peixe já que a

função do sangue no organismo é manter a estabilidade dos tecidos e o ambiente interno constante

(PICKERING e POTTINGER, 1987; BANERJEE e HOMECHAUDHURI, 1990). Alterações

hematológicas, e também imunológicas, são um dos primeiros reflexos detectáveis de estresse

ambiental, sendo que animais que estejam enfrentando estresse contínuo podem vir a ter sua aptidão

física debilitada. O conhecimento da composição do sangue é de fundamental importância na

avaliação da condição fisiológica dos peixes, pois há uma variação morfológica e quantitativa dos

elementos do sangue frente às condições endógenas como sexo e estágio de maturação, bem como

exógenas, como temperatura, concentração de oxigênio, estresse e poluentes (McKIN et al., 1970;

SOIVIO et al., 1973).

De acordo com McDONALD e MILLIGAN (1997), estresse provoca hemoconcentração em

muitas espécies de peixes dulcícolas, o que pode ser uma resposta ao aumento da diurese

freqüentemente causada pela presença de contaminantes. Muitas vezes os peixes podem variar seu

conteúdo de hemoglobina, ou ainda o tamanho de seus eritrócitos (SILVA, 1987), como estratégia

para se adaptar aos estressores. Vários estudos têm mostrado que alguns estressores induzem

anemia (como cádmio, que prejudica a tomada de ferro e chumbo, que atua sobre a enzima ALA-D,

ambos alterando a formação da hemoglobina), enquanto outros causam aumento excessivo no

hematócrito ou conteúdo de hemoglobina, normalmente decorrente de hipóxia interna devido a

danos branquiais, ao manejo, à exposição ao cobre ou pesticidas (McKIN et al., 1970; HEATH,

1987). Ainda, medidas hematológicas são freqüentemente influenciadas pela capacidade

osmorregulatória do animal, que normalmente é prejudicada pela poluição (HEATH, 1987).

5.5 Biomarcadores osmo-iônicos

A osmorregulação é o processo pelo qual a quantidade total de eletrólitos e o volume da

água de um organismo são mantidos relativamente constantes.

Os líquidos corporais dos animais de água doce, incluindo os peixes, são hiperosmóticos em

relação ao meio externo. Vertebrados aquáticos dulcícolas tem osmolaridade sangüínea na faixa de

200 a 300 mOsm/L, sendo que a osmolaridade do ambiente externo é geralmente muito menor que

50 mOsm/L (RANDALL et al., 2000).

Para que esses animais se mantenham hiperosmóticos em relação ao seu ambiente, eles

realizam hiperregulação, que envolve a eliminação do excesso de água ganho devido ao gradiente

osmótico e à manutenção dos sais corporais, que tendem a ser perdidos para o meio aquático que os

cerca, pouco concentrado em íons (RANDALL et al., 2000).

No caso dos peixes dulcícolas, a hiperregulação consiste na captação ativa de íons pelas

brânquias e na produção uma grande quantidade de urina diluída resultante da reabsorção de sais

nos túbulos renais (HUGGET, 1992). Vários modelos já foram propostos para explicar as vias e os

mecanismos de trocas iônicas nas brânquias de teleósteos dulcícolas. As células ricas em

mitocôndrias (também chamadas células de cloreto) parecem ser fundamentais para o processo já

que a energia necessária para a absorção ativa de Na+ e Cl- é gerada pelas enzimas ATPases da

membrana basal dessas células e os trocadores Na+/H+ e Cl-/HCO3- da membrana apical permitem a

entrada dos íons (EVANS et al., 1999). Os processos de troca funcionam muitas vezes de forma

acoplada, permitindo que o CO2 e a amônia também sejam eliminados em troca de íons

importantes, o que atende tanto às necessidades de osmorregulação como de respiração e excreção

(JOBLING, 1995).

A poluição aquática pode interferir na osmolaridade plasmática dos peixes, fazendo com que

íons importantes como sódio, potássio, cloreto, cálcio e magnésio sofram variações em suas

concentrações (McCONNELL, 1980; WANG e YIN, 1997).

Muitos poluentes interferem no processo de hiperregulação, seja por afetarem diretamente o

epitélio branquial, por causarem aumento na diurese, ou aumentarem a permeabilidade das

membranas, o que pode acarretar prejuízo na captação de íons pelas brânquias, ou ainda aumentar a

concentração iônica do animal (HEATH, 1987). Mensurações dos conteúdos plasmáticos de sódio,

cloreto e/ou osmolaridade podem elucidar alterações na osmorregulação de peixes de locais

poluídos, sendo bastante utilizadas como biomarcadores (WANG e YIN, 1997).

5.6 Biomarcadores histológicos

A contaminação aquática não afeta somente os processos fisiológicos de um animal. Na

maioria das vezes, animais que enfrentam contaminação por longos períodos apresentam também

alterações estruturais em órgãos importantes, o que pode comprometer seu crescimento,

sobrevivência e reprodução (ADAMS et al., 1990).

A análise histopatológica pode ser uma ferramenta importante na avaliação da qualidade

ambiental de determinado local (TEH et al., 1997), já que distúrbios causados pela ação de

xenobióticos geralmente levam a prejuízo celular, resultando em processos neoplásicos em órgãos-

alvo (PACHECO e SANTOS, 2002). Trabalhos têm mostrado que tecidos de peixes são indicadores

sensíveis da poluição aquática, apresentando alta bioacumulação de substâncias, como o mercúrio e

cádmio (HINTON et al., 1973; CATTANI et al., 1996; THOPHON et al., 2003).

Entre os órgãos considerados alvos para os contaminantes estão as brânquias, o rim e o

fígado que, nos peixes, costumam indicar os efeitos da poluição, apresentando alterações mais

lentas que as fisiológicas, porém de alta relevância ecológica (ADAMS et al, 1990).

As brânquias apresentam umas das maiores interfaces do peixe com a água, sendo muitas

vezes o primeiro órgão afetado pela contaminação aquática (HEATH, 1987). Segundo LAURENT e

PERRY (1991) as alterações morfológicas nas brânquias podem representar estratégias adaptativas

para conservação de algumas funções fisiológicas quando o animal enfrenta mudanças ambientais.

Como esse órgão desempenha funções tanto respiratórias como osmorregulatórias, qualquer

comprometimento em sua estrutura acarretará dificuldades para o animal responder adequadamente

aos estressores ambientais (MEYERS e HENDRICKS, 1985).

Em exposições subcrônicas à contaminação, o rim é o órgão mais afetado, quando

comparado com brânquias e fígado (THOPHON et al., 2003), ficando claro que problemas nesse

órgão decorrentes da contaminação levarão certamente a complicações ainda maiores nos demais

sistemas do animal. Nos peixes dulcícolas a maior função do rim é eliminar o excesso de água sem

perder íons importantes, portanto, esses animais possuem altas taxas de filtração glomerular sendo

que ocorre quase 100% de reabsorção dos íons Na+ e Cl- (HICKMAN e TRUMP, 1969). O rim de

peixes também é um importante órgão na elaboração da resposta imunológica, então, alterações

morfológicas nesse órgão podem induzir problemas na resposta imune, prejudicando a homeostase

do animal e seu bem-estar (ZAPATA e COOPER, 1990).

O fígado é considerado um órgão-chave como biomarcador já que, embora não seja o único

local de ação dos contaminantes, é um dos principais alvos destes. Esse órgão participa ativamente

do processo de biotransformação de xenobióticos orgânicos e, muito provavelmente, também da

excreção de metais (HEATH, 1987; HINTON e LAUREN, 1990). Entre suas funções ainda pode-se

citar a produção da bile, que carrega muitos metabólitos tóxicos e ajuda na digestão de ácidos

graxos (GINGERICH, 1982) e no armazenamento de nutrientes e compostos do catabolismo de

outros tecidos que serão posteriormente excretados, além de sua função reguladora nos processos de

reprodução e produção de ovos (MOON et al., 1985; VAILLANT et al., 1988).

KRAHN et al. (1986) mostraram que existe correlação positiva entre o aparecimento de

neoplasias e lesões no fígado com a presença de PAHs (hidrocarbonetos poliaromáticos) na água.

WILHELM FILHO et al. (2001) demonstraram que a resposta compensatória dos animais fica

comprometida em locais muito poluídos, já que o animal pode apresentar problemas no

armazenamento de reservas energéticas e na produção de enzimas detoxificantes (ADAMS et al.

1990). Devido a essa série de funções, a relevância de se estudar os efeitos que os contaminantes

possam causar no fígado é enorme, sendo muito aplicada no biomonitoramento (HINTON e

LAURÉN, 1990).

6. Biomonitoramento com espécies neotropicais

Os peixes, por serem organismos essencialmente aquáticos, são bons indicadores da qualidade da

água. Um rio só é considerado em condições satisfatórias se nele viverem e proliferarem peixes,

sendo fundamental a presença de organismos em todas as fases do desenvolvimento (BRANCO,

1983).

Entretanto poucos ainda são os ensaios toxicológicos com espécies de peixes neotropicais

realizados no Brasil, o que ocasiona uma falta considerável de resultados sobre a sensibilidade de

peixes neotropicais a agentes químicos, bem como seus possíveis efeitos sobre tais espécies.

A maior parte dos dados referentes aos efeitos de xenobióticos em peixes e no ecossistema como

um todo são provenientes de regiões não-tropicais. Assim, existe uma real necessidade de se

estabelecerem práticas e testes para a região neotropical. Dessa forma, os resultados obtidos

poderão ser usados em comparações com os dados já conhecidos das regiões temperadas

(OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2000) e, com isso, as respostas apresentadas pelos peixes serão

melhor compreendidas.

Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1847) = Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881),

conhecido comumente como curimba, é uma espécie ativa abundante na Bacia do Rio Paraná, sendo

que os exemplares jovens são muito sensíveis à contaminação, podendo, portanto, ser usados como

organismos bioindicadores para monitoramento ambiental (BENNEMANN et al., 1995; MAZON e

FERNANDES, 1999) Trata-se, ainda, de uma espécie de grande valor econômico, (ROSA Jr. e

SCHUBART, 1945) o que aumenta ainda mais sua importância como objeto de estudo para a

toxicologia.

São animais reofílicos, ou seja, que necessitam realizar grandes migrações para completar

seu ciclo reprodutivo, sendo que costumam utilizar-se de ambientes lóticos para reprodução e

lênticos (como lagoas) e semi-lênticos (como canais e represas) para alimentação e crescimento dos

jovens (TAKASUSUKI, 2000). São animais de hábitos detritívoros sendo, portanto, muito

apropriados para estudos de monitoramento de rios por meio de testes in situ, já que podem

incorporar contaminantes tanto do sedimento como da água.

Diversos trabalhos têm sido realizados sobre o efeito de contaminantes em P. lineatus,

principalmente em laboratório (MAZON e FERNANDES, 1999; MAZON et al., 2000; ALMEIDA,

2002; MARTINEZ e SOUZA, 2002) e alguns com coletas de campo (FERNANDES et al., 1995;

RANZANI-PAIVA et al., 2000). Alguns trabalhos com teste in situ com essa espécie foram

desenvolvidos no Laboratório de Ecofisiologia Ambiental da Universidade Estadual de Londrina,

na avaliação de lagos urbanos da cidade (SILVA, 2002; WINKALER, 2002).

O estudo conjunto de diversos parâmetros funcionais de peixes como indicativo de resposta

à contaminação aquática é o objetivo principal desse trabalho de dissertação. A partir desses

resultados, busca-se padronizar técnicas para a realidade neotropical e expandir o uso da

ecotoxicologia e do biomonitoramento, como práticas aplicáveis na avaliação da contaminação

ambiental em ribeirões urbanos.

ARTIGO 1

Biomarcadores funcionais de Prochilodus lineatus submetidos a testes in situ, ao longo de um

ribeirão urbano, em duas estações do ano

Marina M. P. Camargo* e Cláudia B. R. Martinez

__________________________________________________________________________

A ser submetido para publicação no periódico “Environmental Toxicology and

Pharmacology”

Resumo

O presente trabalho avaliou a interferência sazonal em alguns parâmetros funcionais de Prochilodus

lineatus e também sua utilização como biomarcadores de contaminação aquática. Para isso, foram

realizados testes in situ, com duração de 1 semana, em 4 pontos ao longo de um ribeirão urbano e

em um local de referência, durante inverno e verão. Foram analisadas as seguintes variáveis:

conteúdo de hemoglobina (Hb), concentrações plasmáticas de cortisol, glicose, proteínas totais,

sódio, cloreto e osmolaridade plasmática, além da atividade hepática das enzimas glutationa S-

transferase (GST) e catalase. Ainda foram realizadas medidas de área celular das células interrenais.

A glicemia, a morfometria das células interrenais e a atividade da GST foram os parâmetros que

melhor diferenciaram os pontos do ribeirão urbano do local de referência. As demais variáveis

estudadas não apresentaram resultados conclusivos. Os resultados encontrados no presente trabalho

forneceram informações relevantes sobre o uso de biomarcadores funcionais na avaliação da saúde

de peixes confinados em ribeirões urbanos contaminados. Dentre os pontos estudados no ribeirão

urbano, aquele localizado a jusante dos demais foi considerado o mais impactado e a espécie de

peixe neotropical P. lineatus foi considerada apropriada para esse tipo de teste.

Palavras-chave: peixe; estresse; teste in situ; biomarcadores funcionais; variação sazonal; ribeirão

urbano.

1. Introdução

Atualmente, uma grande variedade de compostos de origem industrial e agrícola é lançada

indiscriminadamente no ambiente aquático (Ahmad et al., 2000), comprometendo a qualidade

desses locais e a saúde dos organismos que aí vivem. Os peixes estão entre os organismos que mais

sofrem com a contaminação aquática. Para a avaliação da qualidade da água em áreas urbanizadas,

muitos trabalhos com peixes coletados em ambientes degradados têm sido desenvolvidos (Lohner et

al., 2001; Winkaler et al., 2001; Porter e Janz, 2003). Entre os trabalhos de campo com enfoque em

avaliação ambiental se destacam os testes in situ (Stien et al., 1998; Pacheco e Santos, 1999; Parrot

et al., 2000; Pyle et al., 2001), nos quais organismos saudáveis são levados para o campo e expostos

diretamente ao ambiente potencialmente contaminado (Olsen et al., 2001). Neste caso, a situação

real é mais facilmente identificada, dispensando a necessidade de extrapolação de resultados

laboratoriais para a realidade de cada local (Chappie e Burton, 1997).

Alterações biológicas de peixes, relacionadas com a exposição ou os efeitos de um composto

tóxico, são chamadas biomarcadores (Peakall, 1994) e sua utilização tem apresentado bons

resultados para a avaliação ambiental em áreas degradadas (McCarthy e Shugart, 1990). Entre os

biomarcadores mais utilizados destacam-se os parâmetros hematológicos (Soivio et al., 1973;

Sampath et al., 1993); parâmetros funcionais, tais como metabólitos plasmáticos (Adams et al.,

1990; DiGiulio et al., 1995), íons plasmáticos (Engelhardt et al., 1981; Alkindi et al., 1996;

Martinez e Souza, 2002), hormônios, como o cortisol (Hontela et al., 1996; Barton et al., 1998;

Hontela, 1998; Benguira e Hontela, 2000) e parâmetros bioquímicos, como atividade de enzimas

detoxificantes (Paris-Palacios et al., 2000; Olsen et al., 2001; Teles et al., 2003; Ahmad et al.,

2004). Para que um biomarcador seja empregado na avaliação ambiental, deve-se conhecer sua

amplitude de variação, ou seja, é preciso diferenciar a variabilidade natural de determinada resposta

(valores de referência) dos sinais de estresse devido à contaminação (Ranzani-Paiva et al., 2000;

Olsen et al., 2001), bem como elucidar a interferência que variações em parâmetros físicos e

químicos da água possam causar nesses biomarcadores, principalmente em ambientes tropicais, cuja

complexidade é maior que a de climas temperados (Wilhelm Filho, 1996).

No Brasil ainda são poucos os trabalhos de campo que enfocam a utilização de espécies nativas

de peixes como bioindicadores de contaminação aquática (Wilhelm Filho et al., 2001; Winkaler et

al., 2001; Martinez e Cólus, 2002; Martinez e Souza, 2002). A espécie neotropical de peixe

Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1847) (= Prochilodus scrofa Steindachner, 1881),

popularmente conhecida como curimba, tem grande importância econômica para as regiões sul e

sudeste do Brasil e, segundo Mazon e Fernandes (1999), seus espécimes juvenis são organismos

bastante apropriados para o monitoramento ambiental, por mostrarem-se sensíveis a variações na

qualidade da água.

O ribeirão Cambé, na cidade de Londrina, recebe descargas de efluentes industriais, domésticos e

agrícolas, assim como diversos outros ribeirões urbanos do Brasil. Neste contexto, este trabalho

pretendeu avaliar a interferência sazonal em alguns parâmetros biológicos (bioquímicos,

metabólicos, hematológicos) de uma espécie neotropical de peixe e também avaliar a utilização de

tais parâmetros como biomarcadores da qualidade da água. Para isso foram realizados testes in situ

em diferentes pontos do ribeirão Cambé e em um local de referência, durante o inverno e verão.

2. Material e Métodos

2.1 Animais e testes in situ

Exemplares juvenis de P. lineatus, com peso de 28,6 ± 0,8 g (média ± E.P., n=53), foram

obtidos na Estação de Piscicultura da Universidade Estadual de Londrina (EPUEL) para a

realização de testes in situ. Os testes foram realizados durante o inverno de 2002 (meses de agosto e

setembro) e verão de 2003 (meses de fevereiro e março) em três pontos no ribeirão Cambé, todos

localizados no perímetro urbano de Londrina, e um ponto no ribeirão dos Apertados, afastado da

cidade, considerado local de referência (Fig. 1). Todos os pontos estudados no ribeirão Cambé estão

sujeitos à contaminação por efluentes domésticos, agrícolas e industriais, em diferentes níveis.

Fig. 1. Mapa mostrando a região da cidade de Londrina, estado do Paraná, onde foi realizado o teste in situ no local de referência. Em detalhe, os 4 pontos de realização dos testes in situ no ribeirão Cambé (A, B, C e D).

Em cada local e nas duas estações, seis animais foram confinados durante sete dias em gaiolas

cúbicas de 125 L, mantidas em contato com o sedimento. Imediatamente após o término dos testes,

os animais foram anestesiados com benzocaína (0,1 g.L-1), para a retirada da amostra de sangue, a

partir da veia caudal e então os animais foram sacrificados por secção medular para a retirada do

fígado e da porção anterior do rim.

2.2 Análise da água e do sedimento

Em cada local de amostragem a temperatura, teor de oxigênio dissolvido, condutividade e pH

da água foram determinados imediatamente antes da colocação das gaiolas e após sua retirada. Os

dados de precipitação na região de Londrina foram fornecidos pelo Instituto Agronômico do Paraná

(IAPAR).

Amostras de água (3L) e de sedimento (50g) foram coletadas em cada local de amostragem.

Para análise de metais, tais amostras foram concentradas com ácido em placas aquecedoras e

mantidas refrigeradas (4oC) até o momento da leitura. A determinação da concentração de cromo,

cobre, zinco, níquel, alumínio e cobalto foi realizada em espectrofotômetro de absorção atômica. As

medidas de matéria orgânica na água e sedimento e alcalinidade, sulfato, fosfato, amônia, nitrito e

nitrato nas amostras de água foram realizadas segundo método padrão descrito por Rump e Krist

(1992).

2.3 Análise do sangue

O sangue coletado foi mantido no gelo até a chegada ao laboratório, onde uma alíquota de 10

µL foi usada para a dosagem do conteúdo de hemoglobina por meio do método da

cianometahemoglobina (kit comercial) em espectrofotômetro. Em seguida, o sangue foi

centrifugado por 5 min a 5000 g e o plasma obtido foi mantido congelado a -20ºC até o momento

das dosagens. A glicemia foi medida por meio do método enzimático da glicose-oxidase (kit

comercial); a concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com Lowry et al. (1951),

usando albumina de soro bovino (BSA) para a curva-padrão. As concentrações plasmáticas de sódio

foram determinadas em fotômetro de chama e de cloreto por meio de método colorimétrico (kit

comercial), em espectrofotômetro. A osmolaridade foi determinada por congelamento em

osmômetro. Para a análise do cortisol foi utilizado ensaio imunoenzimático (kit comercial –

Diagnostic Systems) e as leituras foram feitas em uma leitora de microplacas em 450 nm.

2.4 Morfometria das células interrenais

Para a análise das células interrenais a porção anterior do rim dos P.lineatus foi retirada,

fixada em solução de Bouin por 12 horas e incluída em parafina. Os cortes (5µm) corados com

hematoxilina e eosina (H.E.) foram analisadas em microscópio de luz. Para cada local, em cada

estação, de 7 a 31 campos com 6 células interrenais cada, foram escolhidos para determinação da

área celular, em µm2. As medidas foram realizadas a partir de fotomicrografias obtidas por uma

câmera digital (Motic Cam 8 mm) e analisadas pelo software Motic Images (versão 1,2).

2.5 Atividade hepática das enzimas Glutationa S-Transferase (GST) e catalase

As amostras de fígado dos animais foram mantidas congeladas a -80ºC até o momento das

análises. As amostras foram homogeneizadas com tampão potássio-fosfato 10 mM, pH 7,0 (em

volume correspondente a 10x a massa do órgão), centrifugadas durante 20 minutos, a 4ºC e 15.000

g e o sobrenadante foi separado para os ensaios enzimáticos. A atividade da GST foi determinada a

partir da complexação da glutationa reduzida (GSH) com o 1-cloro 2,4 dinitrobenzeno (CDNB), a

340 nm em espectrofotômetro, de acordo com Keen e William (1976) e foi expressa em nmol.min-

1.mg de proteína hepática-1. A atividade da catalase foi determinada segundo Beutler (1975),

acompanhando-se a velocidade de decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2), em

espectrofotômetro a 240 nm, e foi expressa como µmol.min-1.mg de proteína hepática-1. A

concentração de proteína do sobrenadante foi determinada de acordo com Lowry et al. (1951).

2.6 Análise estatística

Para cada parâmetro analisado, diferenças entre os locais de amostragem no ribeirão Cambé e

o ponto de referência, para uma mesma estação, foram verificadas utilizando-se ANOVA critério

único ou o teste de Kruskall-Wallis, dependendo da distribuição dos dados (normalidade e

homogeneidade de variância). Para a localização das diferenças foi usado teste de Comparações

Múltiplas (Student-Newman-Keuls ou Dunn´s). A comparação dos resultados entre as estações do

ano foi realizada utilizando-se o teste t-Student. Foram considerados significativos valores de P<

0,05.

3 Resultados


Os resultados dos parâmetros físicos e químicos da água nos pontos amostrados estão apresentados

na Tabela 1. O oxigênio dissolvido manteve-se acima de 5 mg O2.L-1 nas duas estações e o pH

manteve-se em valores próximos de 7. Os valores de condutividade nos locais no ribeirão Cambé

foram mais altos que o do local de referência, mantendo-se acima de 100µs.cm-1. Valores mais

elevados de sulfato, fostato, nitrito e nitrato foram observados no ponto B.

Tabela 1. Valores (média ± E.P.) de oxigênio dissolvido (O.D.), temperatura, pH e condutividade da água e precipitação nos locais de realização dos testes in situ no ribeirão Cambé (pontos A, B, C e D) e no local de referência, no inverno e no verão.

Local Parâmetro Estação

Referência Ponto A Ponto B Ponto C Ponto D Inverno 9,1±1,77 5,1±0,56 6,3±0,42 7,6±0,28 7,0±0,49 O.D.

(mgO2.L-1) Verão 7,8±1,34 5,5±0,07 5,3±0,49 7,7±1,2 7,0±0

Inverno 17,7±0,07 22,1±0,35 21,9±0,56 20,6±1,13 17,4±2,34 Temperatura (ºC) Verão 21,4±0,56 26,0±0,28 25,2±0,42 22,9±0,07 24,0±0,07

Inverno 7,6±0,35 7,1±0,07 7,7±0,07 7,3±0,07 7,5±0,14 pH

Verão 7,6±0,07 7,0±0,07 7,8±0,63 7,2±0,07 6,9±0,63 Inverno 65,0±10 99,0±4,04 105,5±4,5 115,5±0,49 223,5±47,65 Condutividade

(µµµµs.cm-1) Verão 83,0±0 104,5±4,5 131,0±20,07 138,5±0,49 244,5±0,49 Inverno 0 17,2 51,4 12,4 22,0 Precipitação *

(mm) Verão 27,6 21,2 21,2 17,0 33,1 * Os valores de precipitação apresentados correspondem à soma dos 3 dias antecedentes ao início do teste e dos 7 dias de duração do teste.

3.2 Hemoglobina

Os valores do conteúdo de hemoglobina dos animais amostrados foram em média 6,41 ± 0,32

g.dL-1 (Fig. 2), e não variaram significativamente entre os pontos. Houve uma tendência dos valores

no verão serem menores que no inverno, entretanto esta diferença só foi significativa no ponto A.

Fig.2. Conteúdo de hemoglobina dos animais confinados no ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no

local de referência, durante o inverno e verão. As barras indicam a média e as linhas verticais o

erro-padrão e (#) indica média significativamente diferente (P<0,05) do resultado de inverno.

3.3 Morfometria das células interrenais

Quanto à medida da área das células interrenais, notou-se que no verão as áreas celulares

foram significativamente maiores que no inverno (Fig. 3a). Os animais confinados nos pontos A e B

no verão e no ponto C nas duas estações apresentaram área celular significativamente maior que os

peixes do local de referência.

3.4 Cortisol plasmático

O nível de cortisol plasmático dos P. lineatus foi em média 163,45 ± 13,61 ng.mL-1. Os

animais confinados no ponto C atingiram valores de até 200 ng.mL-1 (Fig. 3b). Somente nesse local

foi identificada variação sazonal, sendo que os resultados de inverno foram significativamente

maiores que os de verão. A comparação entre os locais não revelou diferença significativa de

nenhum dos pontos do ribeirão Cambé em relação ao local de referência, tanto no inverno como no

verão.

Hemoglobina

0

3

6

9

Referência Ponto A Ponto B Ponto C Ponto D

g/dL

Inverno Verão

3.5 Glicose plasmática e proteínas

A glicose plasmática foi maior no verão, em relação ao inverno, nos animais dos pontos B e C

(Fig. 3c). Os animais confinados no ponto A no inverno e nos pontos B e C no verão apresentaram

valores de glicemia significativamente maiores, em relação ao local de referência.

Os resultados da concentração plasmática de proteínas totais dos animais utilizados nos testes

não apresentaram variações sazonais, com valores médios de 2,23 ± 0,15 mg.dL-1. Também não

houve diferença significativa entre os animais confinados nos diferentes pontos do ribeirão Cambé

em relação ao local de referência.

Fig. 3. Concentração plasmática de glicose (a) e cortisol (b); área dos núcleos das células interrenais (c) e área das células interrenais (d) dos animais confinados nos 4 pontos do ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no local de referência, durante inverno e verão. As barras indicam a média e as linhas verticais o erro-padrão. (*) indica diferença significativa em relação ao local de referência, (#) indica diferença significativa do resultado de inverno (P<0,05).

Glicose

0

20

40

60

80

100


mg/dL

* #

* #*

a)Cortisol

0

50

100

150

200

250


ng/mg

#

b)

Área do núcleo das interrenais

0

30

60

90


um

2

Inverno Verão

c)

*

* #

#

Área das células interrenais

0

50

100

150

200


um

2

Inverno Verão

d)

*

* #* #

* #

#

3.7 Parâmetros osmo-iônicos

A osmolaridade plasmática dos animais utilizados nos testes in situ manteve-se em 260 ± 4,51

mOsm e foi maior no verão, em relação ao inverno, nos animais confinados nos ponto A e C. Os

peixes do ponto C também apresentaram osmolaridade maior que os do local de referência (Fig.

4a).

A concentração plasmática de sódio dos animais utilizados nos testes in situ manteve-se em

148,90 ± 2,71 mM.L-1. No local de referência os valores de verão significativamente menores do

que os de inverno. Os animais confinados nos pontos B durante o inverno apresentaram

concentração de sódio significativamente menor que os do local de referência. No verão, os animais

do ponto C apresentaram valores significativamente maiores que os do local de referência (Fig. 4b).

A concentração plasmática de cloreto não apresentou variação em relação às diferentes estações e

nem mesmo entre os pontos do ribeirão Cambé em relação ao local de referência, sendo que os

valores encontrados mantiveram-se em 108,26 ± 1,35 mM.L-1 (Fig. 4c).

Fig. 4. a) Concentração plasmática de sódio; b) concentração plasmática de cloreto, c) concentração plasmática de potássio, d) osmolaridade plasmática e e) razão entre a soma dos íons sódio e cloreto a osmolaridade dos animais confinados nos 4 pontos do ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no local de referência, durante inverno e verão. As barras indicam a média e as linhas verticais o erro-padrão. (*) indica diferença significativa em relação ao local de referência, (#) indica diferença significativa do resultado de inverno (P<0,05).

Sódio

0

50

100

150

200


mM/L

* **

*#

a) Cloreto

0

30

60

90

120

150


mM/L

b)

Potássio

0

3

6


mM/L

**

*

* #

#

#

#

c) Osmolaridade

0

70

140

210

280

350


mOsm

* # * #

d)

Razão Na + Cl / osmolaridade

0

40

80

120

160


%

Inverno Verão

e)

*#

3.8 Catalase e GST

A atividade hepática da catalase não mostrou variação em relação as diferentes estações e

tampouco variou entre os locais dos testes in situ, mantendo-se em 41 ± 1,91 µmol.min-1.mg de

proteína hepática-1 (Fig. 5a). Nos animais confinados no ponto A, a atividade da GST foi maior no

verão que no inverno. Os animais confinados no ponto C, no verão, apresentaram maior atividade

da GST (Fig. 5b).

Fig. 5. (a) atividade hepática da enzima catalase e (b) atividade hepática da enzima glutationa-S-transferase (GST) dos animais confinados no ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no local de referência, durante o inverno e verão. As barras indicam a média e as linhas verticais o erro-padrão. (*) indica diferença significativa em relação ao local de referência, (#) indica diferença significativa do resultado de inverno (P<0,05).

4. Discussão

Os parâmetros físicos e químicos são fundamentais na avaliação da qualidade da água,

fornecendo dados importantes sobre as possíveis variações decorrentes das diferentes estações do

ano. Em climas tropicais, as variações mais freqüentes são as diárias, sendo que sazonalmente

percebe-se mais variação entre inverno e verão (Esteves, 1988). Nesse trabalho, a avaliação da

temperatura e precipitação mostrou resultados esperados para climas tropicais, ou seja, temperaturas

mais altas no verão juntamente com uma maior quantidade de chuvas, em média, para os locais

Catalase

0

10

20

30

40

50

60


umol.m

in-1.mg prot hepática-1

a)

GST

0

50

100

150

200

250


nmol.min-1.mg prot hepática-1

Inverno Verão

*

#

b)

amostrados. Nenhum dos locais testados apresentou valores de oxigênio dissolvido (O.D.) menores

que 4 mgO2.L-1, considerados críticos por Esteves (1988). Os valores de condutividade no ponto C

foram mais elevados que nos demais pontos. Valores de condutividade acima de 100 ks.cm-1 têm

sido relatados para locais muito impactados (Cetesb, 2001) e podem refletir uma diminuição na

qualidade da água (Olsen et al., 2001).

Ao se estudar espécies bentônicas ou que, como o P. lineatus são detritívoras e têm

contato íntimo com o substrato, a análise de metais no sedimento é de extrema importância. As

concentrações limites para alguns metais no sedimento foram determinadas por MacDonald et al.

(2000), baseando-se em testes realizados com diferentes organismos. Estes autores determinaram

uma concentração limite (CL), abaixo da qual os efeitos tóxicos dos metais para os organismos são

pouco prováveis; e uma concentração de efeito provável (CE), acima da qual os efeitos tóxicos dos

metais são esperados. No presente trabalho, os valores encontrados para cromo, níquel e zinco em

todos os locais de amostragem foram muito menores que as concentrações limites para estes metais

(43,4 mg.kg-1; 22,7 mg.kg-1; 121 mg.kg-1 respectivamente). Entretanto, com exceção do ponto B,

os demais locais apresentaram concentrações de cobre acima da concentração limite para este metal

(31,6 mg.kg-1), mas muito abaixo da concentração de efeito provável (149 mg.kg-1). As altas

concentrações de alumínio, detectadas em todos os pontos estudados refletem as características

naturais do solo na região de Londrina. Entretanto, como o pH da água do ribeirão Cambé tende a

ser mais básico que ácido, e praticamente não sofre variação sazonal, muito pouco desse metal deve

estar disponível, já que o alumínio tem sua toxicidade aumentada em águas ácidas (Barcarolli e

Martinez, 2004).

Parâmetros hematológicos têm sido usados como indicadores do estado fisiológico, bem

como no controle de patologias e do estresse em peixes (Martínez et al., 1994). Entretanto, devido à

grande variedade de fatores que influenciam esses parâmetros (Martínez et al, 1994; Winkaler et al,

2001; Guijarro et al, 2003) tais como: estação do ano, doenças, idade, maturação sexual e ainda

alterações ambientais (Heath, 1987), muitas vezes há dificuldade em se interpretar corretamente o

status hematológico de peixes.

Os animais utilizados nesse trabalho apresentaram uma tendência de possuírem conteúdos

de hemoglobina menores no verão quando comparados ao inverno. Normalmente o que se tem

descrito na literatura é o aumento da Hb em temperaturas mais elevadas, que estaria compensando o

efeito da temperatura na redução da disponibilidade de oxigênio na água (Guijarro et al., 2003)

além de atender ao maior consumo de oxigênio devido ao aumento da demanda metabólica

(Martínez et al., 1994). Entretanto, nos nossos resultados, não foram identificados valores críticos

de oxigênio dissolvido na água em nenhum dos pontos amostrados, nem mesmo em decorrência do

aumento da temperatura no verão. Assim, outros fatores devem ter influenciado a tendência na

redução da Hb no verão, como por exemplo, a presença de alguns contaminantes carreados pelas

chuvas mais abundantes nesta estação. Winkaler et al. (2001) encontraram redução nos valores

médios de Hb em lambaris (Astyanax altiparanae) de um ribeirão urbano contaminado; Tavares-

Dias et al. (2002) encontraram diminuição na Hb de pacus (Piaracus mesopotamicus) expostos ao

sulfato de cobre por 15 dias.

O conteúdo médio de hemoglobina para P. lineatus encontrado nesse trabalho (em torno

de 6 g.dL-1) foi menor do que o descrito para essa mesma espécie em trabalhos anteriores. Mazon et

al. (2002) encontraram média de 12 g.dL-1 e Ranzani-Paiva et al. (2000) encontraram média de 9,7

g.dL-1. O curimba é uma espécie migradora quando em ambiente natural. Tal fato tem sido

considerado para a explicação dos altos valores de Hb para essa espécie (Ranzani-Paiva et al.,

2000). Os valores mais baixos nesse parâmetro encontrados no presente trabalho podem estar

relacionados com o fato dos animais utilizados nos testes serem juvenis e ainda não apresentarem as

adaptações fisiológicas para a migração, como valores mais altos de Hb. Desta forma, em

decorrência da grande quantidade de fatores que podem influenciar os parâmetros hematológicos,

como variação sazonal por exemplo, a utilização da Hb como biomarcador torna-se pouco

apropriada para avaliação em campo.

A síntese dos hormônios corticosteróides em peixes, entre eles o cortisol, é realizada pelas

células interrenais que são estruturas homólogas ao córtex da adrenal dos mamíferos (Donaldson,

1981; Wendelaar Bonga, 1997; Hontela, 1998). A morfometria das células interrenais pode revelar

alterações como hipertrofia, o que pode ser útil na avaliação do funcionamento dessas células e

também informar sobre o nível de estresse ao qual o peixe está exposto (Norris et al., 1997).

Quanto à área celular das interrenais dos P. lineatus amostrados no presente trabalho, os

valores de verão foram maiores que os de inverno no local de referência e em todos os pontos

estudados no ribeirão Cambé. Tal fato pode indicar que os animais confinados no verão tiveram sua

função endócrina estimulada e conseqüentemente produziram e liberaram mais cortisol. Em relação

ao local de referência, foi observado um aumento significativo na área das interrenais nos animais

confinados nos pontos A e B no verão e C nas duas estações. Esta hipertrofia é corroborada pelos

valores de glicemia nos animais confinados nos pontos B e C.

A resposta hiperglicêmica apresentada por animais muitas vezes está relacionada com a

mobilização de energia em decorrência de aumento na taxa metabólica, como em situações de

temperaturas elevadas. Nesse trabalho, os animais confinados nos pontos C e D apresentaram

valores mais elevados de glicemia durante o verão, resultado semelhante ao encontrado por Guijarro

et al. (2003) com exemplares de tenca analisados durante essa estação. O aumento na glicemia

também pode representar mobilização de energia para os animais responderem a eventuais

estressores, tais como manejo, variações na temperatura e pH, além de contaminantes presentes na

água (Lohner et al., 2001).

No presente trabalho, os animais confinados nos pontos A, B e C apresentaram valores

significativamente maiores de glicemia em relação ao local de referência. Exemplares de

Prochilodus lineatus também apresentaram valores elevados de glicemia quando expostos ao

chumbo por 24 h, (Martinez et al., in press). Neste mesmo trabalho foram determinados valores

controle de glicemia bastante semelhantes aos animais do local de referência descritos aqui.

Tavares-Dias et al. (2002) também encontraram valores elevados de glicemia em pacus expostos

por 8 dias ao sulfato de cobre e Barcarolli e Martinez (2004) identificaram hiperglicemia em

piavuçus (Leporinus macrocephalus) expostos ao alumínio por 24 h. Peixes confinados em lagos

contaminados por efluentes de óleo também apresentaram hiperglicemia (Martin e Black, 1996). O

aumento da glicemia como forma de obtenção de energia para a manutenção da homeostase é uma

resposta bastante comum em animais que estejam enfrentando algum tipo de estressor, já que é um

dos principais efeitos da liberação de catecolaminas e de hormônios corticosteróides secretados

nesse tipo de situação (Brown, 1993).

O cortisol é o principal hormônio corticosteróide em peixes, sendo sintetizado e secretado

pelas células interrenais, localizadas na porção anterior do rim (Hontela, 1998). Elevações nos

níveis plasmáticos de cortisol têm sido comumente utilizadas como sinais de estresse em peixes

(Wendelaar Bonga, 1997). Em situações de estresse agudo, tais aumentos ocorrem poucos minutos

após a exposição ao estressor, sendo retomados os níveis normais dentro de poucas horas. Os

valores de cortisol encontrados para P. lineatus no presente trabalho foram bastante elevados,

quando comparados com valores basais descritos para teleósteos, que variam de 5 a 50 ng.mL-1

(Pickering, 1981). Provavelmente tal resultado foi decorrente do estresse do próprio confinamento e

também devido ao manuseio no momento da amostragem (Wendelaar Bonga, 1997). Rotlland et al.

(2001) encontraram aumento significativo no cortisol em perca dourada (Sparus aurata) submetidos

a 1 hora de estresse de manuseio e confinamento e os valores permaneceram elevados, embora

menores em magnitude, nos animais expostos por 7 dias ao mesmo tipo de estresse. Já foi também

descrita variação sazonal na resposta deste hormônio para várias espécies de peixes, sendo

normalmente encontrados valores elevados durante o inverno, tendência também mostrada pelos

nos animais do presente trabalho.

Aumentos nos níveis de cortisol também têm sido relatados em peixes expostos a diversos

tipos de estressores químicos (Norris et al., 1999). Ruyet et al. (2003) encontraram aumentos nos

níveis desse hormônio em um tipo de linguado (Scophthalmus maximus) expostos a concentrações

elevadas de amônia por 7 e 14 dias; Ytrestoyl et al. (2001) encontraram aumento no cortisol em

salmão (Salmo salar) expostos ao alumínio, Donaldson (1981) encontrou aumento no cortisol

quando expôs salmões ao cobre por até 48 horas e Hontela et al. (1996) encontraram aumento no

cortisol em trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) expostas ao cádmio de 2 a 96 horas, sendo que

os valores permaneceram elevados depois de 7 dias de exposição. No presente trabalho não foi

verificada variação no cortisol dos animais confinados nos diferentes pontos do ribeirão Cambé em

relação ao local de referência, em nenhuma das estações analisadas. Entretanto, a hiperglicêmica

observada nos animais do ponto A, no inverno, e dos pontos B e C no verão pode ser encarada

como uma resposta secundária ao estresse, desencadeada pela liberação do cortisol nesses animais.

Ou seja, como o pico do cortisol decorrente de um estresse agudo ocorre momentos após a

exposição e logo retoma os níveis basais, a amostragem do sangue após 7 dias pode não ter

detectado esse pico hormonal, entretanto, observou-se um de seus efeitos, o aumento da glicose nos

animais confinados nesses locais.

No presente trabalho, os resultados de cortisol não mostraram correlação com a hipertrofia

observada nas células interrenais. As células interrenais devem ter mantido seu funcionamento

aumentado por mais tempo que a resposta do cortisol devido, provavelmente, a persistência do

estímulo estressor. McBride et al. (1979) encontraram resposta semelhante com trutas arco-íris

expostas a efluente de aterros sanitários, sendo que o aumento do cortisol ocorreu poucas horas após

a exposição, entretanto, os efeitos sobre as interrenais só foi notado em animais expostos por 7 dias.

Os dados no presente trabalho levam a crer que os animais utilizados nos testes in situ sofreram

algum tipo de estresse agudo e foram aptos a responder a tal situação, como mostraram os

resultados de glicemia, cortisol e de morfometria das células interrenais.

A mobilização de reservas energéticas inclui também lipólise e inibição da síntese protéica,

significando um mecanismo adaptativo a situações de estresse agudo (Heath, 1987). Assim, o

metabolismo de proteínas além de informar a condição bioenergética geral do animal também pode

estar relacionado com os efeitos dos contaminantes nesses organismos (Adams et al, 1990). Os

animais utilizados nos testes in situ do presente trabalho apresentaram valores normais de proteína,

compatíveis com os valores anteriormente mencionados para essa espécie por Martinez et al. (in

press).

A concentração plasmática de íons individuais e também a osmolaridade plasmática são

exemplos de variáveis fisiológicas utilizadas como indicadores de efeitos de poluentes em peixes

(Abel, 1989). Alterações no balanço hidromineral podem ser decorrentes dos efeitos de

contaminantes nos órgãos envolvidos na osmorregulação, no sistema endócrino, no metabolismo ou

nos processos de transporte ativo (Martinez e Cólus, 2002).

No presente trabalho houve diminuição significativa dos níveis de sódio dos animais

confinados no ponto B durante o inverno em relação ao local de referência. Esse padrão de resposta

do sódio plasmático pode ser decorrente da própria resposta generalizada ao estresse (Martinez e

Cólus, 2002), sendo que a diminuição desse íon inicialmente pode significar uma maior entrada de

água devido ao aumento da permeabilidade branquial, ou ainda inibição das enzimas

Na+/K+ATPases das brânquias desencadeada por muitos poluentes (Cerqueira e Fernandes, 2002;

Martinez et al., in press). Os níveis do íon cloreto mantiveram-se inalterados e foram semelhantes

aos descritos anteriormente para P. lineatus (Cerqueira e Fernandes, 2002; Mazon et al., 2002).

Os animais confinados no ponto C apresentaram valores elevados de sódio e osmolaridade.

Isso provavelmente ocorreu devido aos altos valores de condutividade encontrados nesse local,

normalmente associados a recebimento de grandes quantidades de carga salina, como a proveniente

de esgotos domésticos e industriais (Winkaler et al, 2001).

Alguns autores têm descrito aumento na osmolaridade plasmática em peixes sujeitos a

estresse, tanto em situações de confinamento (Waring et al.,1996), como na presença de

contaminantes na água (Lohner et al., 2001; Ruyet et al., 2003). No presente trabalho observou-se

aumento da osmolaridade nos animais dos pontos A e C, durante o verão. Normalmente a

osmolaridade plasmática está relacionada com as concentrações iônicas individuais do plasma

(Lohner et al., 2001), entretando, no ponto C, como já mencionado anteriormente, a alta

condutividade da água desse local deve ter sido o principal fator que influenciou na medida desse

parâmetro. Já no ponto A, a osmolaridade aumentada no verão deve ter relação com a presença de

outros osmólitos, que não os íons Na+ e Cl-, já que não houve aumento significativo nas

concentrações desses íons. Nesse caso, alguns compostos endógenos, como aminoácidos e glicose,

ou ainda substâncias exógenas, como contaminantes devem ter influenciado a medida de

osmolaridade nesse local.

Glutationa S-transferases são uma família de enzimas com ação detoxificante, ou seja,

participam da fase II do metabolismo de detoxificação de compostos tóxicos (Pesonen et al., 1999;

Paris-Palacios et al., 2000; Van der Oost et al., 2003) catalisando a conjugação da glutationa-

reduzida com compostos eletrofílicos (Olsen et al., 2001), que podem incluir organoclorados,

nitrocompostos e organofosfatos. Além disso, também já foi mostrada que essas enzimas possuem

ação antioxidante (Bartling et al., 1993). Valores elevados de GST têm sido associados à resistência

e adaptação do organismo a uma variedade de estressores presentes no ambiente (Gallagher et al.,

2001).

Neste trabalho, a atividade hepática da GST de P. lineatus apresentou uma tendência em ser

maior durante o verão nos animais confinados no ribeirão Cambé. Ronisz et al. (1999) encontraram

correlação positiva entre a atividade da GST em fêmeas de um tipo de perciforme (Zoarces

viviparus) e a temperatura da água. Valores elevados de GST também foram encontrados por

Wilhelm Filho et al. (2001) em acarás (Geophagus brasiliensis) amostrados em local não poluído,

durante o mês de novembro no Brasil. Segundo os autores, as temperaturas mais elevadas desse mês

promovem um maior consumo de oxigênio, e conseqüentemente, uma elevação nas defesas

antioxidantes dos animais, como atividade das enzimas superóxido dismutase e GST.

Os animais confinados no ponto C durante o verão apresentaram valores de GST (200

nmol.min-1.mg proteína hepática-1) significativamente maiores que no local de referência. Vigano

et al. (2001) encontraram valores semelhantes para linguados (Platichtys flesus) expostos a

sedimento contaminado por efluentes domésticos e industriais por 6 dias. Aumentos na atividade

hepática de GST já foram relatados em vários outros trabalhos após exposição de peixes a PAHs,

PCBs e pesticidas (Van der Oost, 2003), a água contaminadas por efluentes domésticos, metais

pesados e compostos orgânicos(Ahmad et al, 2004) e em peixes residentes em local com forte

influência antropogênica (Vigano et al, 1998). A maior atividade da GST nos peixes confinados no

ponto C do ribeirão Cambé indica que esses animais tiveram sua atividade detoxificante estimulada

em decorrência da provável presença de contaminantes neste local.

Muitos poluentes (ou seus metabólitos) são tóxicos devido ao estresse oxidativo que podem

causar (Van der Oost et al., 2003). A toxicidade do oxigênio deve-se a compostos como radicais

livres ou oxiradicais (O2-, H2O2 e OH

-), que normalmente reagem com macromoléculas celulares,

podendo causar inativação de enzimas, peroxidação de lipídeos além de danos no DNA e até morte

celular (DiGiulio et al., 1989). A catalase é uma enzima que atua exclusivamente sobre o H2O2,

facilitando sua remoção das células e formando O2 e água. A atividade hepática da catalase dos

peixes submetidos aos testes in situ não apresentou variação sazonal e tampouco diferenças entre os

pontos amostrados. Wilhelm Filho et al. (2001) também não encontraram variações sazonais,

quando compararam a atividade da catalase em acarás amostrados em meses de temperaturas

diferentes. Ronisz et al. (1999) não encontraram correlação entre a atividade da catalase de fêmeas

de um perciforme (Zoarces viviparus) e a temperatura da água.

Van der Oost et al. (2003) comparando os resultados de vários trabalhos sobre a atividade da

catalase em peixes, encontraram que cerca de 60% dos trabalhos de laboratório e 40% dos trabalhos

de campo não detectaram variações na atividade desta enzima quando animais expostos a agentes

tóxicos foram comparados aos animais controle, sendo que os trabalhos que mostraram aumento da

atividade hepática da catalase foram realizados com peixes expostos a PAHs, PCBs e resíduos de

fábrica de papel e celulose. Entretanto, Paris-Palacios et al. (2000) encontraram aumento na

atividade da catalase proporcional ao tempo de exposição e à concentração de cobre testada em

paulistinhas e Ahmad et al. (2004) constataram aumento na atividade da catalase em enguias

expostas a testes in situ num porto contaminado com efluentes diversos em Portugal. Assim, o curto

tempo de confinamento bem como a possível atividade antioxidante da GST podem ter influenciado

a atividade da catalase no presente trabalho, de modo que ela não variasse significativamente nos

animais dos diferentes pontos e tampouco apresentasse variação sazonal. Portanto, entre os

parâmetros bioquímicos analisados, a atividade hepática da enzima GST mostrou-se um

biomarcador mais apropriado que a catalase para a situação em questão.

5. Conclusões

• Dos parâmetros analisados, a glicemia, a área das células interrenais e a atividade da

GST foram os que melhor distinguiram os locais mais impactados da referência.

• Devido à variação entre as estações e mesmo individual em alguns parâmetros como

Hb e atividade da catalase, ou a falta de um padrão de resposta conclusivo, como na

dosagem das proteínas e dos íons, a utilização desses parâmetros como biomarcadores

de contaminação aquática não foi apropriada, sendo necessários estudos mais

aprofundados para cada caso.

• Considerando-se o número de parâmetros (glicemia, área das células interrenais e

GST) que apresentaram variação em relação ao local de referência, o ponto C se

mostrou o local mais comprometido no ribeirão Cambé.

• O aprimoramento de algumas técnicas de amostragem torna-se necessário para que o

estresse de manuseio seja diminuído e interfira menos nos resultados de parâmetros

como o cortisol.

• A espécie P. lineatus, bem como a realização de testes in situ com esta espécie,

mostraram-se apropriadas para avaliação da qualidade da água de um ribeirão urbano

impactado, podendo ser utilizada em programas de biomonitoramento de ambientes

tropicais.

Agradecimentos

À Estação de Piscicultura da UEL (EPUEL), pelo fornecimento dos peixes, ao IAPAR, pelos

dados de precipitação, a CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado para Camargo, M.M.P., à

Profª Dra. Marisa N. Fernandes e ao Ms. Guilherme H. D. Pinheiro da Universidade Federal de São

Carlos, pelo auxílio na dosagem do cortisol; ao Dr. Paulo C. Meletti pelo auxílio nas análises de

água e sedimento e ao Programa de Mestrado em Ciências Biológicas do CCB/UEL.

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ARTIGO 2

HISTOPATOLOGIA BRANQUIAL, HEPÁTICA E RENAL DE Prochilodus lineatus

SUBMETIDOS A TESTES IN SITU, AO LONGO DE UM RIBEIRÃO URBANO.

Marina M. P.Camargo e Cláudia B. R. Martinez

Artigo a ser submetido à publicação na revista “Environmental Research Section A” - Elsevier

HISTOPATOLOGIA BRANQUIAL, HEPÁTICA E RENAL DE Prochilodus lineatus

SUBMETIDOS A TESTES IN SITU, AO LONGO DE UM RIBEIRÃO URBANO.

Marina M. P.Camargo* e Cláudia B. R. Martinez1

*Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina; 1Laboratório de Ecofisiologia Animal, Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Estadual de Londrina.

Paraná. C.P. 6001. CEP: 86051-990. E-mail: [email protected]

Resumo Parâmetros histopatológicos foram utilizados na avaliação da saúde de uma espécie neotropical de peixe, Prochilodus lineatus, submetida a testes in situ por 7 dias em um Ribeirão urbano e em um local de referência, no inverno e verão. Para brânquia, rim e fígado foram calculados um valor médio de alteração (VMA) e um índice de alteração histopatológica (IAH) que mostram a distribuição e a severidade das lesões, respectivamente. As lesões branquiais mais freqüentemente encontradas nos animais confinados no Ribeirão urbano foram: elevação epitelial, dilatação do canal marginal, hiperplasia e hipertrofia do epitélio respiratório, fusão lamelar e ainda alguns casos de ruptura das células pilares e aneurisma. As alterações renais mais freqüentes foram: aumento do volume corpuscular, redução do espaço de Bowman, oclusão da luz tubular e degeneração granular e hialina. Já no fígado dos animais estudados foram identificadas lesões como aumento do volume dos hepatócitos, deformação do contorno celular, degeneração citoplasmática e nuclear, vacuolização citoplasmática, presença de melanomacrófagos, estagnação biliar e até um caso de necrose focal. A histopatologia mostrou ser uma técnica bastante apropriada para utilização juntamente com testes in situ na avaliação da saúde de peixes de locais impactados, pois praticamente não sofreu interferência da variação sazonal e permitiu diferenciar bem os pontos do Ribeirão urbano do local de referência. O fígado parece ter sido o órgão mais sensível à contaminação, já que mostrou os maiores valores de VMA e IAH e a espécie P. lineatus foi muito apropriada ao tipo de teste utilizado, podendo ser empregada em estudos futuros. Palavras-chave: Prochilodus lineatus, teste in situ, histopatologia, brânquia, rim e fígado. 1. Introdução

Os ribeirões urbanos estão entre os ecossistemas que mais sofrem com a contaminação

decorrente da atividade humana (PAUL e MEYER, 2001), já que a maior parte dos efluentes de

origem agrícola, industrial e doméstica são, invariavelmente, despejados em pequenos rios e

córregos, sem tratamento adequado. Esses resíduos normalmente contêm uma grande variedade de

poluentes orgânicos e inorgânicos, tais como solventes, óleos, fenóis, metais pesados, pesticidas e

sólidos em suspensão (PANDEY et al., 2003). A presença desses contaminantes na água altera suas

características, ocasionando uma série de problemas para os peixes, como doenças e alterações

estruturais (CHANG et al., 1998).

A histopatologia tem sido bastante usada como biomarcador na avaliação da saúde de peixes

expostos a contaminantes, tanto em trabalhos de laboratório (WESTER e CANTON, 1991;

THOPHON et al., 2003) como nos trabalhos realizados em campo (HINTON et al., 1992;

SCHWAIGER et al., 1997; TEH et al., 1997). Uma das grandes vantagens da utilização dos

biomarcadores histopatológicos na avaliação ambiental é que esse tipo de análise permite detectar

os efeitos dos contaminantes em órgãos-alvo, como brânquia, rim e fígado. Tais órgãos são

responsáveis por funções vitais como respiração, excreção, acumulação e biotransformação de

xenobióticos nos peixes (GERNHOFER et al., 2001) sendo que o estudo de sua morfologia permite

integrar melhor as respostas do animal facilitando seu entendimento (SCHWAIGER et al., 1997;

TEH et al., 1997). Ainda, normalmente, as alterações nestes órgãos são mais facilmente

identificadas do que as alterações funcionais (FANTA et al., 2003), podendo servir como sinais de

alerta para o comprometimento da saúde do animal (HINTON e LAURÉN, 1990).

Uma grande variedade de fatores, incluindo contaminantes ambientais pode causar danos

estruturais às brânquias (HAAPARANTA et al., 1997). A importância desse órgão para os peixes

não se dá apenas por suas funções respiratórias, mas também devido ao fato de participar de

processos como excreção, osmorregulação e manutenção do equilíbrio ácido-básico (POLEKSIĆ e

MITROVIĆ-TUTUNDŽIĆ, 1994). As brânquias costumam ser o primeiro órgão afetado pela

exposição a contaminantes devido sua grande área de contato com a água. Isso faz com que este

órgão seja também responsável pela acumulação de diversos tipos de poluentes bem como pela

transferência destes para os compartimentos internos do animal, via corrente sangüínea

(THOPHON et al., 2003). Todas essas características fazem das brânquias um órgão bastante

apropriado para indicação da qualidade da água (MALLATT, 1985; POLEKSIĆ e MITROVIĆ-

TUTUNDŽIĆ, 1994; FANTA et al., 2003).

A histopatologia do rim de teleósteos pode revelar importantes informações sobre a qualidade da

água, já que esse órgão recebe a maior parte do sangue proveniente das brânquias (HINTON e

LAURÉN, 1990) e, portanto, alterações que eventualmente sejam encontradas no rim podem ter

relação com a presença de contaminantes ambientais. Estudos têm revelado que o tecido renal sofre

grandes variações estruturais em decorrência de exposição a estressores e, sendo esse órgão também

importante na elaboração da resposta imune, alterações morfológicas no rim podem levar a

comprometimento da homeostase e saúde do peixe (VEIGA et al., 2002).

O fígado tem grande importância para os peixes já que participa ativamente de processos como

tomada, acumulação, biotransformação e excreção de xenobióticos (GERNHOFER et al., 2001;

THOPHON et al., 2003), sendo que os efeitos de contaminantes nesse órgão podem ser observados

não só estruturalmente (HINTON e LAURÉN, 1990; TEH et al., 1997; CHANG et al., 1998) mas

também a partir de modulações metabólicas, como atividade de enzimas (PESONEN et al., 1999;

PARIS-PALACIOS et al., 2000; PACHECO e SANTOS, 2002).

Os testes in situ, onde animais saudáveis são levados para o campo e expostos diretamente ao

ambiente potencialmente contaminado, têm sido bastante utilizados na avaliação ambiental

(OLSEN et al, 2001). Esse tipo de trabalho é muito adequado quando se deseja utilizar

biomarcadores histopatológicos para avaliar a qualidade de determinado ambiente, pois, como são

utilizados animais cuja procedência é conhecida, fica mais fácil discernir as alterações ocasionadas

por doenças, daquelas relacionadas aos contaminantes (SCHWAIGER et al., 1997). COUTINHO e

GOKHALE (2000) estudaram a histopatologia de carpas (Cyprinus carpio) e tilápias (Orechromis

mossambicus) submetidas a testes in situ em uma estação de tratamento de esgoto na Índia e

GIENSY et al. (2003) realizaram estudos semelhantes com douradinho (Carassius auratus) nos

EUA. No Brasil, entretanto, ainda são raros os trabalhos realizados com testes in situ enfocando o

uso da histopatologia como biomarcador para contaminação aquática.

Considerando-se a falta desse tipo de trabalho com espécies nativas no Brasil, os objetivos do

presente trabalho foram avaliar as alterações histopatológicas encontradas no fígado, brânquia e

rim de Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1847) (= Prochilodus scrofa Steindachner, 1881),

submetidos a testes in situ ao longo de um Ribeirão urbano impactado, durante inverno e verão.

2. Material e Métodos 2.1 Animais e testes in situ

Exemplares juvenis de P. lineatus, com peso de 28,59 ± 0,82 g (média ± E.P., n=53), foram

obtidos na Estação de Piscicultura da Universidade Estadual de Londrina (EPUEL) para a

realização de testes in situ em quatro pontos (A, B, C e D) do Ribeirão Cambé, todos localizados no

perímetro urbano de Londrina (PR), e em um local de referência (Ribeirão dos Apertados). Os

testes foram realizados durante o inverno de 2002 (meses de agosto e setembro) e verão de 2003

(meses de fevereiro e março). O ponto A, próximo à nascente, está sujeito principalmente ao

despejo de esgoto doméstico; o ponto B recebe efluentes de uma indústria de café solúvel, além de

também receber efluentes domésticos e agrícolas; o ponto C caracteriza-se por ser um local bastante

impactado que recebe efluentes de uma cooperativa agroindustrial; o ponto D recebe descargas de

esgoto doméstico e industrial. O Ribeirão dos Apertados, que atravessa o Parque Estadual da Mata

dos Godoy, apresenta mata ciliar preservada e está afastado da cidade; por estar relativamente livre

da ação antrópica foi considerado como local de referência (Fig. 1).

Em cada local e nas duas estações, seis animais foram confinados durante sete dias em gaiolas

cúbicas de 125 L, confeccionadas com tubos de PVC e revestidas com tela plástica. As gaiolas

foram mantidas em contato com o sedimento por meio de pesos, para que os animais pudessem se

alimentar durante o confinamento.

Imediatamente após a semana de teste, os animais foram anestesiados com benzocaína (All

Chemistry) na concentração de 0,1 g.L-1 e posteriormente sacrificados por secção medular para a

retirada do fígado, da brânquia e rim para as análises histopatológicas.


Fig. 1. Mapa mostrando a região do município de Londrina, Estado do Paraná, onde foram realizados os testes in situ no local de referência (seta) e no Ribeirão Cambé, no detalhe. Limites do município de Londrina (------); limites da cidade de Londrina (·······).

Em cada local de amostragem alguns parâmetros físicos e químicos da água foram

determinados, imediatamente antes da colocação das gaiolas e após sua retirada: temperatura e teor

de oxigênio dissolvido por meio de oxímetro (Orion, 810); condutividade por meio de

condutivímetro de bolso (Corning, CD-30) e pH (Quimis, Q400A). Os dados de precipitação na

região de Londrina, durante a realização dos testes, foram fornecidos pelo Instituto Agronômico do

Paraná (IAPAR).

Para a determinação da concentração de metais e matéria orgânica da água e do sedimento

foram coletados aproximadamente 50 g de sedimento e 3 L de água em cada local amostrado, no

mês de março de 2003. Para análise de metais na água e sedimento, as amostras foram inicialmente

concentradas com ácido em placas aquecedoras e mantidas refrigeradas (4oC) até o momento da

leitura. A determinação da concentração de metais (cromo, cobre, zinco, níquel, alumínio e cobalto)

foi realizada em espectrofotômetro de absorção atômica (Varian, Spectr AA-10 plus) em triplicatas.

Para a determinação da matéria orgânica (M.O.) foi utilizado o método gravimétrico, sendo o

material resultante da filtração das amostras de água (500 mL) e o sedimento (2 g) incinerados em

mufla por 1 hora, a 400ºC. As análises foram feitas em triplicatas.

2.3 Procedimentos histológicos

As brânquias, o rim e o fígado de P.lineatus confinados nas gaiolas foram fixados em solução

de Bouin por 6, 12 e 8 horas respectivamente. As brânquias foram descalcificadas, retirando-se o

segundo arco branquial direito e mantendo-o por 15 minutos em uma solução de EDTA (7%, pH

7,2) a 60ºC. Após esse processo, o material descalcificado foi mantido em álcool 70% até o

momento da inclusão. Todos os órgãos foram incluídos em parafina para depois serem cortados

com 5 µm de espessura em micrótomo manual (American Optical, 820). As lâminas foram coradas

com Hematoxilina-Eosina (HE) para descrição morfológica e, cerca de 10 cortes para cada animal,

foram analisados em microscópio de luz (Olympkus, CH30). No caso das lâminas de fígado alguns

cortes foram submetidos à reação histoquímica de PAS (Periodic Acid Schiff) para detecção de

glicogênio nos hepatócitos, segundo MELLO e VIDAL (1980). A ocorrência de alterações

histopatológicas nos órgãos foi avaliada semi-quantitativamente de duas formas: a) Cálculo do

Valor Médio de Alteração (VMA), com base na incidência de lesões, de acordo com SCHWAIGER

et al. (1997). Para tanto, atribuiu-se um valor numérico para cada animal conforme a escala: grau 1

(ausência de alteração histopatológica), grau 2 (ocorrência de lesões pontualmente localizadas) e

grau 3 (lesões amplamente distribuídas pelo órgão); b) Cálculo do Índice de Alteração

Histopatológica (IAH), com base na severidade de cada lesão (POLEKSIĆ e MITROVIĆ-

TUTUNDŽIĆ, 1994). Para tanto, as alterações foram classificadas em estágios progressivos quanto

ao comprometimento das funções teciduais: alterações de estágio I, que não comprometem o

funcionamento do tecido; de estágio II, mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do

órgão; e de estágio III, muito severas e irreversíveis. Um valor de IAH foi calculado para cada

animal através da fórmula: IAH =100 ΣI + 101 ΣII + 102 ΣIII, sendo I, II e III correspondente ao

número de alterações de estágio I, II e III, respectivamente. Os valores de IAH entre 0 e 10 indicam

um funcionamento normal do órgão; valores entre 11 e 20 indicam danos de leves a moderados no

órgão; valores entre 21 e 50 indicam danos de moderados a severos e valores maiores que 100

indicam danos irreparáveis no tecido.

A quantidade de glicogênio nos hepatócitos foi determinada de acordo com a seguinte escala:

0 para lâminas sem glicogênio; 1 para lâminas com pouco glicogênio; 2 para uma quantidade

mediana de glicogênio e 3 para lâminas com muito glicogênio. Após a análise foi calculado um

valor médio para o conteúdo de glicogênio de cada local, em cada estação.

Foram realizadas medidas da área (em µm2) e diâmetro (em µm) dos núcleos dos hepatócitos

dos animais amostrados. Para isso foram medidos aleatoriamente 10 núcleos para cada animal, no

inverno e no verão. As medidas foram realizadas a partir de fotomicrografias obtidas por uma

câmara digital (Motic Cam 8mm ) e analisadas pelo software Motic Image 2000 (versão 1,2).

2.4 Análise estatística

Para cada parâmetro analisado, eventuais diferenças entre os locais de amostragem no

Ribeirão Cambé e o ponto de referência, para uma mesma estação, foram verificadas utilizando-se

ANOVA critério único ou o teste de Kruskall-Wallis, dependendo da distribuição dos dados

(normalidade e homogeneidade de variância). Para a localização das diferenças foi usado o teste de

Comparação Múltipla (Student-Newman-Keuls). A comparação dos resultados entre as estações do

ano foi realizada utilizando-se o teste t-Student. Foram considerados significativos valores de

P<0,05.

3 Resultados

3.1. Parâmetros físicos e químicos

Os resultados dos parâmetros físicos e químicos da água nos pontos de coleta (Tabela 1)

permitiram caracterizá-los nas duas estações do ano: a temperatura no verão foi mais elevada que

no inverno, assim como o total de precipitação. O oxigênio dissolvido dos locais de amostragem

manteve-se acima de 5,0 mg O2.L-1 nas duas estações, apresentando o maior valor no local de

referência durante o inverno. O pH dos locais amostrados praticamente não variou entre as duas

estações, mantendo valores próximos de 7,0. Houve uma tendência da condutividade apresentar

valores maiores no verão do que no inverno, em todos os pontos estudados. Esse parâmetro também

foi maior nos locais amostrados no Ribeirão Cambé do que no local de referência, destacando os

valores do ponto D, que foram, em média, o dobro dos demais locais.

Tabela 1. Valores de oxigênio dissolvido (O.D.), temperatura, pH e condutividade da água e

precipitação nos locais de realização dos testes in situ no Ribeirão Cambé (pontos A, B, C e D) e

no local de referência, no inverno e no verão.

Local

Parâmetro Estação Referência Ponto A Ponto B Ponto C Ponto D

Inverno 9,1±1,77 5,1±0,56 6,3±0,42 7,6±0,28 7,0±0,49 O.D. (mgO2.L

-1) Verão 7,8±1,34 5,5±0,07 5,3±0,49 7,7±1,2 7,0±0

Inverno 17,7±0,07 22,1±0,35 21,9±0,56 20,6±1,13 17,4±2,34 Temperatura

(ºC) Verão 21,4±0,56 26,0±0,28 25,2±0,42 22,9±0,07 24,0±0,07

Inverno 7,6±0,35 7,1±0,07 7,7±0,07 7,3±0,07 7,5±0,14 pH

Verão 7,6±0,07 7,0±0,07 7,8±0,63 7,2±0,07 6,9±0,63

Inverno 65,0±10 99,0±4,04 105,5±4,5 115,5±0,49 223,5±47,65 Condutividade

(µµµµs.cm-1) Verão 83,0±0 104,5±4,5 131,0±20,07 138,5±0,49 244,5±0,49

Inverno 0 17,2 51,4 12,4 22,0 Precipitação

(mm) Verão 27,6 21,2 21,2 17,0 33,1

Valores correspondem à média ± E.P, com exceção dos valores de precipitação, que correspondem à soma dos 3 dias antecedentes ao início do teste e dos 7 dias de duração do teste.

As análises de matéria orgânica (M.O.) da água e do sedimento, bem como as determinações

de metais estão mostradas na Tabela 2. Os resultados de M.O. na água não se diferenciam entre os

pontos. Já no sedimento, obtiveram-se valores maiores no local de referência e no ponto D, sendo o

sedimento do ponto C, o menos rico em matéria orgânica. A determinação dos metais na água dos

pontos amostrados mostrou resultados muito abaixo dos níveis de detecção do espectrofotômetro

utilizado, razão pela qual os resultados dessa análise não estão mostrados na Tabela 2. Quanto aos

metais no sedimento, destacam-se os valores de alumínio, em média 1650,00 mg.Kg-1 e de cobre,

em média 45,5 mg.Kg-1. Comparando os diferentes locais de amostragem notou-se que o sedimento

do ponto D foi o que apresentou, em média, os maiores níveis de metais e o do ponto C, os menores

valores.

Tabela 2. Concentração de matéria orgânica e metais na água e no sedimento dos locais amostrados

no Ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no local de referência.

Matéria Orgânica Metais no sedimento (mg.kg-1) *

Local H2O

(mg.dL-1)

Sedim

(mg.g-1) Alumínio Níquel Cobre Zinco Cromo Cobalto

Referência 0,004 150 1798,25 5,75 69,00 20,25 2,25 1,49

Ponto A 0,004 90 1470,75 3,75 37,75 38,00 2,00 0,64

Ponto B 0,003 95 2009,25 4,50 49,50 49,50 1,75 0,81

Ponto C 0,002 10 934,25 1,75 16,00 23,50 1,50 0,30

Ponto D 0,003 110 2048,25 5,50 55,25 44,00 4,00 0,95

* As análises de metais na água dos locais amostrados mostraram resultados abaixo do limite de detecção do aparelho, e portanto não estão apresentados.

Foram utilizados seis exemplares de P. lineatus em cada teste in situ, entretanto, alguns

animais morreram durante a semana de realização dos testes: no Ponto D foram dois óbitos, um no

inverno e um no verão e no Ponto B e C cinco mortes ocorreram durante o verão, três animais no

ponto B e dois no ponto C. Como o número de animais no ponto B ficou bastante reduzido no verão

(n=3), o teste in situ foi repetido nesse local, entretanto, no dia de amostragem constatou-se o furto

da gaiola e dos peixes.

3.2. Histopatologia branquial

As brânquias de P. lineatus possuem o mesmo tipo de estrutura descrita para os teleósteos em

geral, ou seja, quatro arcos em cada lado da faringe, onde se apoiam as lamelas primárias ou

filamentos. As lamelas secundárias, que se dispõem acima e abaixo de cada filamento, consistem

em duas camadas finas de células epiteliais pavimentosas, envolvendo os espaços vasculares

formados pelas células pilares. A estrutura normal da brânquia de P. lineatus está mostrada na

Figura 2a e as alterações histopatológicas branquiais encontradas nos animais testados estão

apresentadas na Tabela 3. As alterações mais freqüentes foram as de estágio de severidade I, como

por exemplo a dilatação do canal marginal, a hiperplasia do epitélio respiratório e a elevação das

células epiteliais (Fig. 2b). Foram encontrados alguns casos de hiperplasia mais severos, que

resultaram na fusão de algumas das lamelas secundárias (Fig. 2c e 2d). Freqüentemente também

foram encontradas alterações como congestão vascular (Fig. 2c), hipertrofia do epitélio respiratório,

constrição do seio sangüíneo e desarranjo lamelar (Fig. 2d). Entre as alterações mais graves

encontradas nas brânquias dos animais estudados, consideradas de estágio II, estão a ruptura das

células pilares (Fig. 2e), o aneurisma e a hemorragia com rompimento lamelar (Fig. 2e e 2f). Não

foram encontradas alterações consideradas de estágio III nos animais estudados.

A análise histológica das brânquias de P. lineatus mostrou que as alterações encontradas

estão pontualmente localizadas nesse órgão, já que o VMA (Fig. 6a) ficou em torno de 2,1 e não

apresentou variação entre as estações do ano nem entre os locais analisados.

O índice de alteração histopatológica (IAH) das brânquias (Fig. 6b) ficou em torno de 10,9.

Nos testes realizados no inverno os animais dos pontos B, C e D apresentaram IAH

significativamente mais altos que o do local de referência. Já no verão não houve diferença

significativa entre os locais amostrados.

c d

*

e

a

L

* C

b

f

*

Fig. 2. Fotomicrografias de brânquias de P. lineatus submetidos aos testes in situ. a) aspecto normal das brânquias, mostrando filamento (seta grossa), lamela secundária (L), canal de água (*), célula de cloreto (seta com C), célula pilar (seta) e célula pavimentosa (cabeça de seta); b) lamelas com canal marginal dilatado (seta), hiperplasia do epitélio respiratório (seta branca) e elevação epitelial (cabeça de seta); c) fusão de três lamelas secundárias (seta branca) e congestão vascular (seta); d) desarranjo lamelar (setas pequenas), fusão parcial das lamelas secundárias (seta curva) e hipertrofia do epitélio respiratório (seta); e) aneurisma (seta branca), ruptura das células pilares (seta) e dilatação do canal marginal (*); f) aneurisma (seta) e ruptura do epitélio respiratório com hemorragia (*) ( 20 � m, H.E.)

Tabela 3. Principais alterações histopatológicas encontradas no fígado, brânquia e rim dos P. lineatus submetidos aos testes in situ e seus respectivos estágios de severidade.

Alterações histopatológicas branquiais Estágio

Hiperplasia do epitélio respiratório I Hipertrofia do epitélio respiratório I Dilatação do canal marginal I Congestão vascular I Elevação do epitélio respiratório I Rompimento das células pilares II Hemorragia com rompimento do epitélio II Aneurisma II

Alterações histopatológicas renais Estágio

Aumento do volume nuclear I Vacuolização celular I Desarranjo celular I Deformação do contorno corpuscular I Degeneração granular I Degeneração hialina II Redução do espaço de Bowman II Oclusão da luz tubular II

Alterações histopatológicas hepáticas Estágio

Aumento do volume nuclear I Aumento do volume celular I Deformação do contorno nuclear I Deformação do contorno celular I Núcleos na periferia da célula I Presença de melanomacrófagos I Vacuolização citoplasmática I Vacuolização nuclear II Degeneração nuclear II Degeneração citoplasmática II Núcleos picnóticos II Rompimento celular II Estagnação biliar II Hiperemia II Necrose focal do tecido III

3.3. Histopatologia renal

O rim de P. lineatus apresenta as mesmas características descritas para a maioria dos

teleósteos. Possui porção anterior e posterior bem definidas, sendo que a porção posterior, que foi

estudada nesse trabalho, possui uma grande quantidade de corpúsculos renais (constituídos por

glomérulo repleto de capilares sanguíneos e a cápsula de Bowmam) e de túbulos renais (proximais,

distais e ducto coletor) como mostram as Figuras 3a e 3e. As principais alterações glomerulares

encontradas no rim de P. lineatus (Tabela 3) submetidos aos testes in situ foram redução do espaço

de Bowman e aumento do volume corpuscular (Fig. 3b). Quanto às alterações encontradas nos

túbulos renais, as mais freqüentes foram: degeneração granular (Fig. 3a detalhe e 3c), oclusão da luz

tubular (Fig. 3c) e degeneração hialina (Fig. 3d). Menos freqüentemente foram encontrados túbulos

em regeneração (Fig. 3c), melanomacrófagos e novos néfrons (Fig. 3e). No presente trabalho não

foram encontradas alterações de estágio III, como necrose no rim de P. lineatus. O valor médio de

alteração histopatológica (VMA) encontrado para o rim (Fig. 6c) ficou em torno de 2,2 indicando

que as alterações, como nas brânquias, estão pontualmente distribuídas no órgão. Houve variação

sazonal apenas nos animais do ponto D, sendo que o VMA de verão foi maior que o de inverno.

Esse parâmetro foi significativamente maior nos animais do ponto A, no inverno, quando

comparados com os do local de referência. Já durante os testes de verão, somente os animais do

ponto D apresentaram aumento significativo do VMA em relação ao local de referência.

O índice de alteração histopatológica (IAH) para o rim (Fig. 6d) mostrou valores maiores que

os encontrados para a brânquia, em média 37,1 e não houve variação sazonal nesse parâmetro. Nos

testes realizados no inverno, nenhum ponto no Ribeirão Cambé apresentou IAH significativamente

diferente do local de referência. Já durante o verão, os animais confinados nos pontos A, C e D

apresentaram valores de IAH significativamente maiores que os do local de referência.

d

* *

*

*

a

b

*

*

c

e

*

Fig. 3. Fotomicrografias de rim de P.lineatus submetidos aos testes in situ. a) Corpúsculo renal mostrando glomérulo e espaço de Bowman definido (seta), túbulos proximais (*) mostrando luz com borda em escova e túbulos distais (cabeça de seta), o detalhe mostra túbulos distais com degeneração granular; b) corpúsculo renal com volume aumentado e ausência do espaço de Bowman e túbulo com núcleos aumentados (cabeça de seta); c) túbulo em regeneração (seta branca), oclusão da luz tubular (seta escura) e degeneração granular (*); d) detalhe de túbulos com degeneração hialina (*); e) túbulo coletor (*), melanomacrófagos (seta branca) e novo néfron praticamente formado (cabeça de seta).( 10 µm, H.E.)

3.4. Histopatologia hepática

Microscopicamente, o fígado dos P. lineatus analisados no local de referência apresentaram,

no geral, hepatócitos com formas hexagonais, citoplasma com aspecto granular e vacuolizado e um

grande núcleo arredondado e central, com nucléolo evidente (Fig. 4a). Os hepatócitos dispõem-se

em forma de cordões margeando os sinusóides. As principais alterações histopatológicas hepáticas

observadas neste trabalho foram: deformação no contorno nuclear, aumento de volume nuclear,

vacuolização nuclear e presença de grânulos eosinófilos no citoplasma (Fig. 4b). O conteúdo de tais

grânulos não foi identificado, contudo sua presença foi mais expressiva nos animais confinados no

Ribeirão Cambé e, em alguns casos mais graves, levando a um processo de degeneração extensa do

tecido. A estagnação biliar (Fig. 4c) foi identificada a partir da presença de grânulos castanho-

amarelados no citoplasma. Degeneração citoplasmática e nuclear (Fig. 4d) também foram alterações

bastante comuns encontradas nos animais confinados no Ribeirão Cambé; os melanomacrófagos

(Fig. 4e) foram identificados como agregados de células contendo grânulos escuros de tamanho

variados, normalmente próximo aos vasos. A grande maioria das alterações identificadas pertence

aos estágios I e II (Tabela 3), o que corresponde a alterações que comprometem de leve a

moderadamente o tecido, mas que ainda permitem sua recuperação no caso de melhora da qualidade

ambiental. Uma única alteração de estágio III (necrose focal, Fig. 4f) foi encontrada em um animal

no Ponto A, durante o verão. Essa alteração, por sua vez, é extremamente severa e compromete o

funcionamento do órgão irreversivelmente.

A freqüência de ocorrência de alterações histopatológicas no fígado, quantificada pelo VMA,

não apontou a ocorrência de variação sazonal (Fig. 6e). Os animais confinados no Ribeirão Cambé

apresentaram, em média, valores de VMA maiores que os do local de referência, porém as

diferenças não foram significativas. Os valores de VMA foram em média 2,4, o que corresponde à

presença de alterações localizadas de forma pontual até amplamente distribuídas pelo tecido.

Os resultados médios de IAH (Fig. 6f) para esse trabalho apresentaram média de 53

(amplitude dos dados individuais de 33 a 174), indicando que na grande maioria dos casos as lesões

hepáticas observadas promovem danos funcionais de moderados a severos. Os valores de IAH

foram significativamente maiores nos animais confinados em todos os pontos do Ribeirão Cambé,

durante o inverno, em relação ao local de referência, indicando nível elevado de lesões nesses

órgãos. Houve variação sazonal significativa nos Pontos C e D, onde os animais confinados no

inverno apresentaram danos mais severos que os confinados no verão. O grande erro-padrão

mostrado no resultado de verão no Ponto A foi decorrente de um único animal em que foi

encontrada necrose focal, o que elevou muito seu IAH (IAH= 174, VMA= 3) em comparação com

os demais.

Houve uma tendência de redução na quantidade de glicogênio dos hepatócitos dos animais

confinados no verão em relação ao inverno (Fig. 5a, 5b e 5c). Essa redução foi significativa nos

pontos B e C (Tabela 4), entretanto, não houve diferença significativa entre os pontos amostrados

em relação ao local de referência.

Em relação à área dos núcleos dos hepatócitos não foi observada variação sazonal, porém, o

diâmetro dos núcleos apresentou uma tendência em ser maior no verão que no inverno, sendo essa

variação significativa no local de referência e também no ponto C (Tabela 4). A comparação entre

os diferentes locais de amostragem indicou que os animais do ponto C destacaram-se por apresentar

área do núcleo do hepatócito significativamente maior que o local de referência no verão e

hepatócitos com diâmetros significativamente maiores que o local de referência tanto no inverno

como no verão (Tabela 4).

Tabela 4. Medidas da área e diâmetro dos núcleos dos hepatócitos e quantidade de glicogênio no fígado dos

animais confinados nos quatro pontos do Ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no local de referência.

Local Glicogênio Área (µµµµm2) Diâmetro (µµµµm)

Inverno Verão Inverno Verão Inverno Verão

Referência 2,00 ± 0,36 1,50 ± 0,22 38,80 ± 1,25 37,62 ± 0,83 6,60 ± 0,13 6,99±0,09#

Ponto A 2,80 ± 0,20 2,16 ± 0,30 42,05 ± 2,57 36,38 ± 1,37 6,92 ± 0,20 6,75±0,12

Ponto B 2,50 ± 0,22 1,33 ± 0,33 # 34,36 ± 1,43 34,42 ± 0,16 6,31 ± 0,13 6,71±0,06

Ponto C 2,66 ± 0,21 2,00 ± 0,00 # 42,99 ± 1,12 46,11 ± 1,31 7,20 ± 0,08 * 7,85±0,19*#

Ponto D 2,60 ± 0,24 2,40 ± 0,24 38,97 ± 1,11 37,33 ± 1,77 7,02 ± 0,13 6,70±0,11

Valores indicam média ± E.P. No inverno n=6 para Referência, Ponto A, ponto B e Ponto C e n=5 para o Ponto D. No verão n=6 para Referência e Ponto A, n=3 para ponto B, n=4 para o Ponto C e n =5 para o Ponto D. * indica média significativamente diferente do local de referência. # indica média significativamente diferente do que no Inverno (P<0,05).

a

*

b

*

c

d

* *

e

*

*

f

Fig. 4. Fotomicrografias de fígado de P. lineatus submetidos aos testes in situ. (a) Aspecto do tecido hepático normal, mostrando hepatócitos com citoplasma granular (*) e núcleos (seta) arredondados e centralizados; (b) deformação do contorno nuclear (setas), grânulos eosinófilos no citoplasma (cabeças de seta), vacuolização nuclear (seta branca) e aumento do volume nuclear (*); (c) estagnação biliar no citoplasma (setas); (d) degeneração nuclear (setas) e degeneração citoplasmática (*); (e) agregado de melanomacrófagos próximo a um vaso (seta branca) e vacuolização citoplasmática (*); (f) tecido hepático mostrando necrose focal (seta branca) e núcleos picnóticos (cabeças de setas) (H.E. 10 µm)

b

c

a

Fig. 5. Fotomicrografias de fígado de P. lineatus submetidos aos testes in situ. a) hepatócitos sem glicogênio, b) hepatócitos com quantidade moderada de glicogênio (setas) e c) hepatócitos com muitos grânulos de glicogênio (setas). (P.A.S. 10 µm).

Brânquia

0

1

2

3


a) Brânquia

0

15

30

45

60

75

90


b)

*

* *

Rim

0

1

2

3


** #

c) Rim

0

15

30

45

60

75

90


* * *

d)

Fígado

0

1

2

3


Inverno Verão

e) Fígado

0

15

30

45

60

75

90


Inverno Verão

*

*

*

*

# #

f)

Fig. 6. Valores médios de alteração (VMA) e índice de alteração histopatológica (IAH) para brânquia (a e b), rim (c e d) e fígado (e e f) dos animais confinados nos 4 pontos do Ribeirão Cambé (A, B, C e D) e no local de referência, durante inverno e verão. As barras indicam média e as linhas verticais o erro-padrão. * indica média significativamente diferente do local de referência na mesma estação e # indica valores significativamente diferentes do inverno (P < 0,05).

4. Discussão

4.1 Características da água e do sedimento dos locais de estudo

Os parâmetros físicos e químicos são fundamentais na avaliação da qualidade da água,

fornecendo dados importantes sobre as possíveis variações decorrentes das diferentes estações do

ano. Em climas tropicais, as variações mais freqüentes são as diárias, sendo que sazonalmente

percebe-se mais variação entre inverno e verão (ESTEVES, 1988). Nesse trabalho, a avaliação da

temperatura e precipitação mostrou resultados esperados para climas tropicais, ou seja, temperaturas

mais altas no verão juntamente com uma maior quantidade de chuvas, em média, para os locais

amostrados.

Nenhum dos locais testados apresentou valores de OD considerados críticos (menores que

4,0 mg O2.L-1). No local de referência, onde a temperatura foi a mais baixa no inverno, obtiveram-

se os maiores valores de O.D. No ponto D, apesar da diferença de temperatura entre inverno e verão

ter sido relativamente grande, os valores de OD praticamente não variaram, o que provavelmente

tem relação com uma maior demanda bioquímica por oxigênio na água nesse local. Esse resultado

ainda é corroborado pelos valores de M.O. e condutividade, que no ponto D são mais elevados.

Valores de condutividade acima de 100 µs.cm-1 têm sido relatados para locais muito impactados

(CETESB, 2001) e podem refletir uma diminuição na qualidade da água (OLSEN et al., 2001).

No Brasil ainda não foram estabelecidas as concentrações máximas aceitáveis de metais

para o sedimento. Ao se estudar espécies bentônicas ou que, como o P.lineatus, são detritívoras e

têm, portanto, contato íntimo com o sedimento, têm sido utilizados os limites existentes nas

legislações de outros países ou valores limites para compostos químicos propostos em alguns

trabalhos.

MacDONALD et al. (2000) determinaram as concentrações limites para metais, PAHs,

PCBs e pesticidas organoclorados, baseando-se em testes realizados com diferentes organismos,

como anfípodas, insetos, microcrustáceos e bactérias. Nesse trabalho, os autores determinaram uma

concentração limite (CL), abaixo da qual os efeitos tóxicos dos compostos para os organismos são

pouco prováveis; e uma concentração de efeito provável (CE), acima da qual os efeitos tóxicos dos

compostos são esperados. No presente trabalho, os valores encontrados para cromo, níquel e zinco

em todos os locais de amostragem foram muito menores que as concentrações limites para esses

metais (43,4 mg.kg-1; 22,7 mg.kg-1; 121 mg.kg-1 respectivamente). Com exceção do ponto C, os

demais locais apresentaram concentrações de cobre acima da concentração limite para esse metal

(31,6 mg.kg-1) mas muito abaixo da concentração de efeito provável (149 mg.kg-1).

Tais resultados classificam o sedimento dos locais amostrados como não tóxicos para

organismos vivos em relação aos metais presentes, mas, avaliações mais abrangentes sobre a

composição do sedimento são necessárias. Cobalto e alumínio não foram considerados no trabalho

de MacDONALD et al. (2000), o que dificulta a análise desses metais. Para o alumínio, porém, as

altas concentrações encontradas podem ser reflexo das características naturais do solo na região de

Londrina. Como o pH da água do Ribeirão Cambé tende a ser mais básico que ácido, e

praticamente não sofre variação sazonal, muito pouco desse metal deve estar disponível, já que o

alumínio tem sua toxicidade aumentada em águas ácidas (BARCAROLLI e MARTINEZ, 2004).

4.2 Histopatologia branquial

Devido ao fato das brânquias participarem de funções de grande importância para o peixe, tais

como respiração, osmorregulação e excreção, e ainda possuírem grande contato com o meio

externo, elas são particularmente sensíveis às mudanças na qualidade da água, podendo, portanto,

ser consideradas um dos principais órgãos-alvo de peixes de ambientes contaminados (POLEKSIĆ

e MITROVIĆ-TUTUNDŽIĆ, 1994; MAZON et al., 2002; FERNANDES e MAZON, 2003).

Alterações como elevação epitelial, hiperplasia e hipertrofia do epitélio respiratório, além de

fusão parcial de algumas lamelas secundárias são exemplos de respostas de defesa, já que de modo

geral, aumentam a distância entre o meio externo e o sangue, servindo como barreira para a entrada

de contaminantes na corrente sanguínea (MALLATT, 1985; HINTON e LAURÉN, 1990;

POLEKSIĆ e MITROVIĆ-TUTUNDŽIĆ, 1994; FERNANDES e MAZON, 2003). Essas alterações

foram as mais freqüentes entre as encontradas nos animais submetidos aos testes in situ no Ribeirão

Cambé. COUTINHO e GOKHALE (2000) encontraram elevação epitelial em brânquias de carpas

(Cyprinus carpio) e tilápias (Oreochromis mossambicus) expostas aos efluentes de uma estação de

tratamento de esgoto; ENGELHARDT et al. (1981) observaram elevação epitelial e fusão lamelar

em trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) expostas a resíduos de petróleo. Ainda, outros autores

têm descrito alterações semelhantes em brânquias de peixes expostos a metais (OLIVEIRA

RIBEIRO et al., 2000; CERQUEIRA e FERNANDES, 2002; MARTINEZ et al., in press) e

contaminantes orgânicos (ROSETY-RODRÍGUEZ et al., 2002; FANTA et al., 2003).

Tais alterações são respostas não-específicas que podem ser induzidas por diversos tipos de

contaminantes (MALLATT, 1985). Uma conseqüência do aumento da distância entre a água e o

sangue é que a tomada de oxigênio fica prejudicada, entretanto, os peixes, a partir da habilidade de

aumentar a taxa de ventilação, conseguem diminuir os prejuízos do aumento da barreira de difusão

(FERNANDES e MAZON, 2003).

A maior parte das lesões decorrentes de exposições subletais encontradas nas brânquias

afetam o epitélio da lamela secundária (HINTON e LAURÉN, 1990), contudo, algumas alterações

vasculares também podem ocorrer, quando os animais sofrem estresse mais severo. Nesses casos,

danos às células pilares podem levar a um maior fluxo de sangue para o interior da lamela,

ocasionando dilatação do canal marginal, congestão ou até mesmo aneurisma (TAKASHIMA e

HIBIYA, 1995; ROSETY-RODRÍGUEZ, 2002). A formação de um aneurisma está relacionada

com o rompimento das células pilares (HEATH, 1987; MARTINEZ et al., in press) devido ao

maior fluxo de sangue ou mesmo à ação direta dos contaminantes sobre essas células. Esse é um

tipo de lesão considerada mais grave cuja recuperação do tecido é possível, porém mais difícil

(POLEKSIĆ e MITROVIĆ-TUTUNDŽIĆ, 1994). Vários animais confinados no Ribeirão Cambé

apresentaram alterações vasculares, sendo a dilatação do canal marginal e congestão as mais

freqüentes.

Assim como o aneurisma, necrose e ruptura do epitélio branquial podem ser interpretadas

como reflexo da ação direta dos agentes tóxicos sobre o órgão (TEMMINK, 1983). No presente

trabalho, nenhum animal amostrado apresentou necrose no tecido branquial, entretanto, um animal

confinado no ponto B durante o inverno mostrou indícios de ruptura do epitélio lamelar, o que

ocasionou hemorragia num ponto da brânquia desse animal.

Como MALLATT (1985) já afirmou, é bastante difícil estabelecer relações entre as lesões

branquiais e determinados tipos de estressores, já que, por não se tratarem de lesões específicas,

animais expostos a diversos tipos de estresse apresentam alterações branquiais semelhantes.

Curimbas expostos a metais como o cobre (CERQUEIRA e FERNANDES, 2002; MAZON et al.,

2002) e chumbo (MARTINEZ et al, in press) mostraram lesões branquiais semelhantes aos animais

do presente trabalho. Ainda, WINKALER et al. (2001) encontraram alterações como hiperplasia,

hipertrofia, dilatação do canal marginal e aneurismas em lambaris (Astyanax altiparanae) coletados

no Ribeirão Cambé, o que leva a crer que a qualidade da água desse Ribeirão está mesmo

comprometida e causa danos estruturais aos animais expostos a ela.

4.3 Histopatologia renal

O rim de teleósteos recebe a maior parte do sangue vindo das brânquias (HINTON e

LAURÉN, 1990) e é um dos primeiros órgãos afetados no caso de exposição a contaminantes

(THOPHON et al., 2003). O rim posterior é muito importante para teleósteos dulcícolas, pois a

partir da produção de grande quantidade de urina diluída ele participa tanto das funções excretoras

como reguladoras do balanço osmo-iônico e ácido-básico (HINTON e LAURÉN, 1990).

Apesar de toda a importância desse órgão, estudos sobre a relação de alterações estruturais no

rim de peixes com a qualidade da água são ainda recentes, especialmente em trabalhos de campo

(GERNHOFER et al., 2001). A pouca quantidade de estudos nessa área faz com que exista um

pequeno número de biomarcadores histopatológicos para esse órgão já determinados (HINTON et

al., 1992). Entre as alterações renais mais freqüentemente relatadas em peixes expostos à

contaminação do ambiente estão a degeneração tubular, do tipo granular e hialina, e alterações

corpusculares, como dilatação dos capilares e redução do espaço de Bowman (TAKASHIMA e

HIBIYA, 1995).

Assim como para as brânquias, os mesmos tipos de alterações têm sido descritos para o rim de

peixes em decorrência da exposição a vários contaminantes, o que leva a crer que as lesões renais

também não são específicas a um determinado tipo de estressor. Exposição a metais causa

freqüentemente distúrbios tubulares e glomerulares como os descritos por THOPHON et al. (2003)

para a perca gigante (Lates calcarifer) exposta ao cádmio; HANDY e PENRICE (1993)

encontraram principalmente inchaço nas células da cápsula de Bowman e melanomacrófagos no rim

de trutas (Salmo trutta) e tilápias (Oreochromis mossambicus) expostas ao cloreto de mercúrio.

Resultados semelhantes foram encontrados por OLIVEIRA RIBEIRO et al. (1996) com o

siluriforme Trichomycterus braziliensis exposto ao mercúrio inorgânico. Há ainda relatos das

mesmas alterações em peixes expostos a contaminantes orgânicos (VEIGA et al., 2002);

antibióticos (KIRYU e MOFFITT, 2001) e misturas de contaminantes ambientais (SCHWAIGER et

al., 1997; PACHECO e SANTOS, 2002).

Os animais estudados no presente trabalho mostraram muito freqüentemente a ocorrência de

degeneração granular nas células tubulares. Tal alteração pode ser identificada pela hipertrofia das

células e presença de grânulos pequenos no citoplasma, que fica com aspecto de rede. Esse estágio

inicial do processo degenerativo pode progredir para a degeneração hialina, que se caracteriza pela

presença de grânulos maiores e eosinófilos dentro das células. Tais grânulos podem ser formados

dentro das próprias células ou ainda resultarem da reabsorção de excessos de proteína plasmática

perdidos pela urina, indicando danos no glomérulo (HINTON e LAURÉN, 1990; TAKASHIMA e

HIBIYA, 1995). Nos casos mais severos o processo degenerativo pode levar à necrose do tecido

(TAKASHIMA e HIBIYA, 1995). A presença de degeneração granular e hialina, mas a ausência de

necrose no rim dos peixes estudados, indica que esse tecido sofreu danos devido à exposição à água

do Ribeirão Cambé, entretanto o curto tempo de exposição pode não ter permitido o

desenvolvimento de necrose no tecido renal.

O desenvolvimento de novos néfrons ocorre somente no período neo-natal em alguns

mamíferos, todavia, nos peixes esse processo transcorre por toda a vida, sendo também mais

freqüente em animais jovens e de crescimento rápido (REIMSCHUESSEL, 2001). Além disto,

alguns estudos têm apontado o aumento na ocorrência de novos néfrons e túbulos em regeneração,

como processo de recuperação após danos ao tecido renal em peixes (HINTON e LAURÉN, 1990;

CORMIER et al., 1995). Tais estruturas já foram observadas em um siluriforme (Ameiurus

nebulosus) e em um tipo de bacalhau (Microgadus tomcod) coletados em ribeirões contaminados

(CORMIER et al., 1995), e também em douradinhos (Carrassius auratus), trutas arco-íris

(Oncorhynchus mykiss), paulistinhas (Brachidanio rerio) e tilápias (Oreochromis mossambicus)

expostos a diferentes tipos de contaminantes como mercúrio, antibióticos e ao solvente

hexaclorobutadieno que é conhecido por causar necrose e vacuolização em túbulos proximais

(REIMSCHUESSEL, 2001). Nos animais confinados no Ribeirão Cambé a presença de tais

estruturas foi bastante sutil e pode estar relacionada apenas com o processo normal de

desenvolvimento do tecido renal, e não com a qualidade da água desse Ribeirão, visto que foram

utilizados somente peixes jovens nos testes in situ. Deve-se considerar também que o curto período

de exposição pode não ter sido suficiente para que ocorresse a regeneração, já que esse processo

costuma iniciar-se de 2 a 4 semanas após a exposição ao agente tóxico (REIMSCHUESSEL, 2001).

Segundo GERNHOFER et al. (2001) o tecido renal de trutas-marrom (Salmo trutta) e um tipo de

carpa (Barbatula barbatula) expostos à água de ribeirões contaminados na Alemanha recuperou-se

totalmente somente após 2 meses na água limpa.

4.4 Histopatologia hepática

O órgão mais comumente associado aos processos de detoxificação e biotransformação de

xenobióticos é o fígado e devido à sua função, posição e suprimento sanguíneo (VAN der OOST et

al., 2003) também é um dos órgãos mais afetados por alterações morfológicas decorrentes de

exposição a contaminantes (RODRIGUES e FANTA, 1998).

A morfologia normal do parênquima hepático de P. lineatus é semelhante à descrita para

diferentes espécies de peixes, como a espécie marinha de perca gigante (Lates calcarifer)

(THOPHON et al., 2003); a enguia européia (Anguilla anguilla) estudada por PACHECO e

SANTOS (2002); dourado (Salminus maxillosus) descrito por RODRIGUES et al. (2002) e para um

tipo de siluriforme (Trichomycterus braziliensis) (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 1996).

Alterações na forma e volume dos núcleos dos hepatócitos têm sido normalmente relatadas em

animais expostos a contaminantes (BRAUNBECK et al, 1990). Hepatócitos hipertrofiados (média

de 45 µm2) já foram descritos por PARIS-PALACIOS et al. (2000) em paulistinhas (Brachydanio

rerio) expostos ao cobre durante 7 dias, e em um tipo de salmonídeo (Coregonus clupeaformis)

exposto a metais por COOLEY et al. (2002). No presente trabalho, foi observado aumento

significativo da área e diâmetro dos hepatócitos dos animais confinados no ponto C. Esse tipo de

lesão costuma ser associado ao aumento da atividade metabólica do órgão, o que pode ter relação

com o comprometimento da qualidade da água deste local, levando a uma estimulação dos

processos de detoxificação e excreção de xenobióticos pelo fígado.

Alterações como deformação no contorno dos hepatócitos, vacuolização citoplasmática e

núcleos na periferia da célula foram também descritas para siluriformes (Corydoras paleatus)

contaminados por pesticidas organofosforados (FANTA et al, 2003). Vacúolos no citoplasma dos

hepatócitos podem conter lipídeos e glicogênio, o que está relacionado com o metabolismo normal

do animal. A depleção de glicogênio nos hepatócitos costuma ser encontrada em animais expostos a

estressores (HINTON e LAURÉN, 1990; WILHELM FILHO et al., 2001), já que nesses casos o

glicogênio funciona como reserva de glicose para suprir a maior demanda energética ocasionada

nesse tipo de situação (PANEPUCCI et al, 2001). No presente trabalho não foi observada variação

de glicogênio entre os animais confinados no Ribeirão Cambé e no ponto de referência, entretanto,

houve uma tendência geral dos animais apresentarem quantidades menores de glicogênio no verão

em relação ao inverno. Essa variação deve estar relacionada com a maior taxa metabólica

decorrente das temperaturas mais altas dessa estação.

Alguns autores têm descrito, ainda, o aumento da vacuolização nos hepatócitos como sinal de

processos degenerativos, que sugerem problemas metabólicos, possivelmente relacionados com

exposição a contaminantes (PACHECO e SANTOS, 2002). Contudo, os vacúolos observados nos

hepatócitos nos animais confinados no Ribeirão Cambé continham predominantemente glicogênio

(como evidenciado pela reação de PAS) e, portanto, neste trabalho a vacuolização observada não

deve estar relacionada com processos degenerativos.

O parênquima do fígado dos animais expostos à água do Ribeirão Cambé mostrou ainda sinais

de degeneração (degeneração citoplasmática, nuclear e vacuolização nuclear) e até necrose, que foi

encontrada em um animal do ponto A. Essas alterações são consideradas mais graves e já foram

relatadas para animais sujeitos à contaminação por metais, como o cobre (PARIS-PALACIOS et al,

2000) e o mercúrio (OLIVEIRA RIBEIRO et al, 1996), além de bifenilas policloradas (PCBs)

(CHANG et al., 1998) e mistura de efluentes de usina nuclear (TEH et al, 1997). Como no presente

trabalho não foi identificada a presença significativa de metais na água nem no sedimento do

Ribeirão Cambé, e a necrose foi um caso pontual, é de se pensar que essa alteração não foi

necessariamente ocasionada pela exposição à água do Ribeirão Cambé, e que, provavelmente esse

animal estava debilitado por outras causas.

As alterações hepáticas descritas anteriormente causam não só comprometimento estrutural,

como também metabólico; como pôde ser identificado pela presença de estagnação biliar na grande

maioria dos hepatócitos dos animais amostrados. Essa alteração, que se caracteriza pelo acúmulo de

bile nos hepatócitos e que pode ser reconhecida pela presença de grânulos castanho-amarelados no

citoplasma (PACHECO e SANTOS, 2002), indica que a bile não está sendo liberada do fígado,

ficando acumulada em seu tecido, indicando que o metabolismo hepático está comprometido,

possivelmente em decorrência da presença de contaminantes (FANTA et al, 2003).

O aumento da densidade de agregados de melanomacrófagos, como observado no fígado dos

curimbas neste trabalho, está normalmente associado a importantes lesões hepáticas (PACHECO e

SANTOS, 2002), como processos degenerativos e necróticos, e também foi relatado para um tipo

de linguado, Pleuronectes americanus, contaminados por PAHs e pesticidas em áreas urbanizadas

da costa dos EUA (CHANG et al, 1998). A função dos melanomacrófagos em fígado de peixes

permanece inconclusiva, entretanto, alguns estudos têm sugerido que sua função está relacionada

aos processos de destruição, detoxificação ou reciclagem de compostos endógenos e exógenos

(HAAPARANTA et al., 1996).

A presença de estagnação biliar e melanomacrófagos em grande quantidade no fígado dos P.

lineatus amostrados é um forte indício de que este órgão sofreu tanto danos estruturais como

metabólicos em decorrência da exposição à água do Ribeirão Cambé, o que colabora com a hipótese

de comprometimento da água desse Ribeirão.

Os tipos de lesões histopatológicas observadas na brânquia, rim e fígado dos curimbas nesse

estudo indicam que os peixes estão respondendo tanto aos efeitos diretos dos agentes tóxicos

presentes na água e sedimento como aos efeitos secundários causados pelo estresse.

A análise sobre interferência sazonal nos parâmetros histopatológicos permitiu observar que

as alterações encontradas nos três órgãos estudados não apresentaram relação direta com as estações

do ano, nem quanto à incidência e distribuição das lesões nem quanto à severidade das mesmas. Tal

fato releva a utilidade da histopatologia como biomarcador de contaminação ambiental, podendo ser

bem utilizada, inclusive, em ambientes tropicais que estão naturalmente sujeitos a uma

multiplicidade de variações ambientais. Deve-se ressaltar ainda a validade das alterações

histopatológicas como forma de avaliar os efeitos e as respostas decorrentes de exposições agudas a

estressores ambientais. em exposições agudas a estressores.

Entre os pontos estudados no Ribeirão Cambé, o local que mais se destacou foi o ponto D, por

apresentar valores de VMA e principalmente IAH para os três órgãos estudados maiores que os do

local de referência. Isso provavelmente está relacionado com a localização desse ponto, à jusante

dos demais, e também por suas características lênticas, que favorecem o acúmulo de contaminantes,

principalmente no sedimento.

5. Conclusões

• A histopatologia mostrou-se um biomarcador muito apropriado para a avaliação

ambiental, já que diferenciou bem os pontos mais contaminados do Ribeirão Cambé do

local de referência e não sofreu grandes interferências da variação sazonal;

• No presente trabalho o fígado mostrou ser o órgão mais afetado pelo tipo de

contaminação ao qual os animais foram expostos, pois apresentou os maiores valores

de VMA e de IAH;

• A espécie neotropical de peixe, P. lineatus, mostrou-se muito apropriada para a

realização dos testes in situ podendo ser utilizada no monitoramento ambiental.

Agradecimentos

Á Estação de Piscicultura da UEL (EPUEL), pelo fornecimento dos peixes, ao IAPAR, pelos

dados de precipitação; a CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado para Camargo, M.M.P.; aos

integrantes do Laboratório de Ecofisiologia Ambiental (LEFA) da UEL, pelo auxílio nos

experimentos e trabalhos de campo; ao Dr. Paulo César Meletti pelo auxílio nas análises de água e

sedimento e ao Programa de Mestrado em Ciências Biológicas do CCB/UEL.

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