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MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PERFIL PRELIMINAR DE
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DURANTE E APÓS A
GERMINAÇÃO EM Erythrina velutina
DIÊGO AUGUSTO AZEVEDO DA SILVA
Macaíba/RN
Agosto de 2020
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA ESCOLA AGRÍCOLA DE JUNDIAÍ - EAJ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS
Nº 084
ii
DIÊGO AUGUSTO AZEVEDO DA SILVA
MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PERFIL PRELIMINAR DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS DURANTE E APÓS A GERMINAÇÃO EM Erythrina velutina
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Florestais da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área
de Concentração em Ciências Florestais - Linha de
Pesquisa: Sementes, propagação e fisiologia de espécies
florestais).
Orientador:
Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt
Macaíba/RN
Agosto de 2020
iii
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Rodolfo Helinski - Escola
Agrícola de Jundiaí – EAJ
Silva, Diego Augusto Azevedo da.
Mobilização de reservas e perfil preliminar de metabólitos
secundários durante e após a germinação em Erythrina velutina /
Diego Augusto Azevedo da Silva. - 2020.
56f.: il.
Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias
Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, Macaíba, RN,
2020.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt.
1. Germinação da Semente - Dissertação. 2. Estabelecimento da
Plântula - Dissertação. 3. Espécie Pioneira - Dissertação. 4.
Mobilização de Reservas - Dissertação. 5. Mulungu - Dissertação.
I. Voigt, Eduardo Luiz. II. Título.
RN/UF/BSPRH CDU 631.53.02
iv
MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PERFIL PRELIMINAR DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS DURANTE E APÓS A GERMINAÇÃO EM Erythrina velutina
DIÊGO AUGUSTO AZEVEDO DA SILVA
Dissertação julgada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área
de Concentração em Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: Sementes, propagação e
fisiologia de espécies florestais) e aprovada pela banca examinadora em 27 de agosto de
2020.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt
DBG/CB/UFRN
Presidente
Prof. Dr. Sidney Carlos Praxedes
UAECIA/UFRN
Examinador interno
Prof. Dr. Sérgio Luiz Ferreira da Silva
UAST/UFRPE
Examinador externo à Instituição
Macaíba/RN
Agosto de 2020
v
Dedico esta dissertação a minha mãe, pelo apoio
incondicional em todos os momentos difíceis. Este
trabalho é dedicado à mulher mais importante da
minha vida.
DEDICO
vi
AGRADECIMENTOS __________________________________________________________________________
Agradeço a CAPES/CNPq e a Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela
estrutura e pelos materiais necessários para realização da pesquisa.
Ao Professor Eduardo Luiz Voigt, que com muita paciência e dedicação foi um guia
para o meu crescimento profissional e pessoal, levarei para toda a vida o seu amor ao
trabalho.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais de UFRN.
À Danilo Flademir, uma pessoa incrível e dedicada, sempre disposto a ajudar, muito
obrigado pela ajuda no planejamento, nas coletas e ensaios.
Agradeço imensamente à professora Raquel Giordani, à Ivanice Bezerra e à Daisy
Sotero pelo acolhimento e ajuda.
À equipe do laboratório de estudos em Biotecnologia vegetal, em especial à Ana
Paula, Herley Carlos, Thadeu Martins, John Santos, Jackson Fernandes e Vinicius Cruz.
Agradeço aos meus queridos amigos Alberto Cappellini, Marcos Junior, Stephano Tomaz e
Radan Elvis.
vii
RESUMO GERAL
__________________________________________________________________________
MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PERFIL PRELIMINAR DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS DURANTE E APÓS A GERMINAÇÃO EM Erythrina velutina
Considerando o potencial medicinal de Erythrina velutina Willd., uma espécie arbórea nativa
da Caatinga, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a mobilização de reservas em paralelo
com o conteúdo de metabólitos secundários durante a germinação da semente e o
estabelecimento da plântula. Assim, sementes foram escarificadas, desinfetadas e
semeadas entre folhas de papel Germitest® e cultivadas sob condições controladas. Em
seguida, plântulas foram transferidas para água destilada em hidroponia e cultivadas em
casa de vegetação. Em uma curva de tempo, o crescimento da plântula, a mobilização das
reservas e o conteúdo de açúcares solúveis e aminoácidos livres, bem como o perfil
preliminar de metabólitos secundários foram acessados nos cotilédones durante e após a
germinação. A germinação incluiu os estágios de semente embebida e protrusão da
radícula, enquanto o estabelecimento abrangeu emergência do hipocótilo, abertura do
gancho plumular, expansão das folhas cordiformes, da primeira e da segunda folha
trifoliolada. As sementes apresentaram 20% de amido, 14,5% de proteínas de reserva,
11,6% de lipídeos neutros e 5,7% de açúcares não redutores em base de massa seca. As
reservas majoritárias foram mobilizadas de forma sincrônica e mais intensa a partir da
abertura do gancho plumular, ao passo que os açúcares solúveis foram utilizados a partir da
emergência do hipocótilo. A atividade de amilases, lipases e proteases ácidas aumentou a
partir da expansão das folhas cordiformes, coincidindo com o acúmulo de aminoácidos livres
e com a mobilização de amido, lipídeos e proteínas, respectivamente. Por cromatografia em
camada delgada, sugere-se a presença de terpenos e de ácidos fenólicos ao longo do
experimento. Os resultados indicam a ocorrência de flavonoides a partir da germinação e na
expansão das folhas cordiformes. Durante todo o experimento, foi evidenciada a presença
de alcaloides, principalmente na semente embebida. O esclarecimento destes processos
pode auxiliar na compreensão das estratégias utilizadas por E. velutina para a colonização
do ambiente como espécie pioneira da Caatinga, bem como em qual estágio de
desenvolvimento pode-se obter em maior variedade e quantidade os metabolitos
secundários.
Palavras-chave: Espécie pioneira, estabelecimento da plântula, germinação da semente,
mobilização de reservas, mulungu.
viii
GENERAL ABSTRACT
__________________________________________________________________________
MOBILIZATION OF RESERVES AND PREMILINARY PROFILE OF SECONDARY
METABOLITES DURING AND AFTER GERMINATION IN Erythrina velutina
Considering the medicinal potential of Erythrina velutina Willd., a woody species native to the
Caatinga, the aim of this work was to characterize the mobilization of reserves in parallel with
the content secondary metabolites during seed germination and seedling establishment.
Hence, seeds were scarified, surface-sterilized, planted between towel paper sheets and
cultivated under controlled conditions. Then, seedlings were transferred to distilled water in
hydroponics and cultivated in a greenhouse. In a time-course experiment, seedling growth,
reserve mobilization and the content of soluble sugars and free amino acids, as well as the
preliminary profile of secondary metabolites were assessed in the cotyledons during and
after germination. Germination included the stages of imbibed seed and radicle protrusion,
whereas establishment encompassed hypocotyl emergence, plumule hook opening, and the
expansion of cordiform leaves, first trifoliate leaf and second trifoliate leaf. Seeds contained
20% starch, 14,5% storage proteins, 11,6% neutral lipids and 5,7% non-reducing sugars in
dry weight basis. The major reserves were synchronically and intensely mobilized from apical
hook opening, while non-reducing sugars were utilized from hypocotyl emergence. The
activity of amylases, lipases and acid proteases increased from cordiform leaf emergence,
coinciding with the mobilization of starch, lipids and proteins, respectively. By thin layer
chromatography, it was possible to verify the presence of terpenes and phenolic acids during
the experiment. The results indicate the occurrence of flavonoids from seed germination and
at the expansion of cordiform leaves. Throughout the experiment, it was evidenced the
presence of alkaloids, mainly in the imbibed seed. The elucidation of these processes may
help in understanding the strategies used by E. velutina to colonize the environment as a
Caatinga pioneer species.
Keywords: mulungu, pioneer species, reserve mobilization, seed germination, seedling
establishment.
ix
SUMÁRIO __________________________________________________________________________
Página 1.INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
2.OBJETIVOS ................................................................................................................. 3
3. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 5
3.1. A Caatinga ........................................................................................................... 5
3.2. Espécies florestais medicinais ............................................................................. 7
3.3 Erythrina velutina Wild .......................................................................................... 7
3.4. Metabolitos secundários. ..................................................................................... 9
3.5. Germinação da semente e estabelecimento da plântula. .................................. 11
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 14
4.1. Material vegetal ................................................................................................. 14
4.2. Lipídeos neutros (LN) ........................................................................................ 14
4.3. Proteínas solúveis (PS) ..................................................................................... 15
4.4. Metabólitos solúveis .......................................................................................... 15
4.5. Amido ................................................................................................................ 15
4.6. Atividades enzimáticas ...................................................................................... 16
4.7. Cromatografia de camada delgada (CCD) ......................................................... 16
4.8. Delineamento experimental e análise estatística ............................................... 17
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 19
5.1. Resultados ........................................................................................................ 19
5.2. Discussão .......................................................................................................... 25
6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 31
7. AGRADECIMENTOS ................................................................................................. 33
8. LITERATURA CITADA .............................................................................................. 35
x
LISTA DE FIGURAS __________________________________________________________________________
Figura 1. Mapa das Áreas Suscetíveis à Desertificação e Núcleos de Desertificação. Fonte:
Amaro, Galvão e Maracajá (2017) ......................................................................................... 3
Figura 2. Estrutura básica dos alcaloides eritrínicos (A) e das subclasses dienoide (B),
alcenoide (C) e lactônica (D). Fonte: Feitosa (2014). ............................................................. 8
Figura 3. Conteúdo de amido (a), lipídeos neutros (b) e proteinas solúveis (c) nos
cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da
plântula.. .............................................................................................................................. 15
Figura 4. Conteúdo de AST (a) e ANR (b) e AALT (c) nos cotilédones de E. velutina ao longo
da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. ............................................ 16
Figura 5. Atividade de amilases (a), lipases (b) e proteases ácidas (c) nos cotilédones de E.
velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula ................. 17
Figura 6. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos obtidos a partir de
cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da
plântula. Revelação foi feita com reagente da vanilina para detecção de saponinas e
terpenos..................................................................................................................................18
Figura 7. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos obtidos a partir de
cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da
plântula. Revelação foi feita com Natural A para detecção de flavonoides e ácidos
fenólicos..................................................................................................................................19
Figura 8. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos obtidos a partir de
cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da
plântula. Revelação realizada com Dragendorff para detecção de alcaloides.......................19
xi
xii
LISTA DE ABREVIATURAS __________________________________________________________________________
AALT – Aminoácidos livres totais
ANR – Açúcares não redutores
AST – Açúcares solúveis totais
CCD – Cromatografia de camada delgada
DETER – Detecting Deforestation in Real Time
LN – Lipideos neutros
MS – Massa seca
MEV – Mevalonato
MEP – Metileritritol fosfato
OPDA – 12-oxo-fitodienoico
PMDBBS – Projeto Monitoramento do Desmatamento dos Biomas Brasileiros por Satélite
PS – Proteinas solúveis
PROBIO – Projeto de Conservação e Utilização Sustentável da Diversidade Biológica
PRODES – Monitoring Brazilian Amazon Forest by Satellite
RFOs – Oligossacarídeos da série rafinose
UV – radiação ultravioleta
xiii
Introdução
_____________________________
1
1. INTRODUÇÃO
__________________________________________________________________________
A Caatinga é um bioma exclusivo brasileiro, que ocupa predominantemente o
semiárido nordestino. Este bioma é dominado por espécies arbóreas e arbustivas de
pequeno porte com características xerofíticas, apresentando patrimônio biológico
diversificado com ocorrência de espécies endêmicas (PINHEIRO e NAIR, 2018). Estima-se
que a Caatinga está reduzida em 50% da sua área original devido à pressão antrópica,
especialmente envolvendo atividades extrativistas (DANTAS et al., 2014). De fato, o
desflorestamento visando o uso de áreas para práticas agrícolas tem resultado na
fragmentação da vegetação sob a forma de mosaico, em diferentes estágios de
regeneração natural (RODRIGUES et al., 2018).
Com relação à diversidade vegetal da Caatinga, a família Fabaceae se destaca com
374 espécies já catalogadas (Flora do Brazil, 2020). Tendo em vista o processo de
degradação do bioma, espécies desta família vêm recebendo atenção por causa do seu
papel ecológico como pioneiras (RODRIGUES et al., 2018). Além disso, elas têm sido
estudadas pelo seu potencial medicinal e, devido ao risco de redução populacional, vêm
sendo recomendadas para programas de conservação (SANTOS et al., 2017).
Dentre as espécies de Fabaceae nativas da Caatinga, Erythrina velutina Willd.,
popularmente conhecida como mulungu, tem sido estudada pelo seu potencial medicinal. É
uma árvore heliófita, decídua e pioneira, comum em formações secundárias e recomendada
para plantios mistos com fins de repovoamento (CARVALHO, 2008). Em E. velutina,
destaca-se a produção de metabólitos secundários com propriedades farmacológicas, que
são principalmente atribuídas aos alcaloides eritrínicos (RAMBO et al., 2019) Os alcaloides
têm sido caracterizados como compostos nitrogenados básicos derivados de aminoácidos
(ANISZEWSKI, 2015). Embora muitos trabalhos tenham isolado e caracterizado alcaloides
produzidos por plantas, poucos trabalhos buscam compreender inter-relações entre o uso
de reservas e a acumulação de alcaloides durante a germinação da semente e o
estabelecimento da plântula (RAMIREZ-ESTRADA et al., 2016).
2
Objetivo
_____________________________
3
2. OBJETIVO
__________________________________________________________________________
O trabalho tem como objetivo caracterizar a mobilização das reservas em paralelo
com conteúdo de metabólitos secundários nos cotilédones de E. velutina ao longo dos
estágios iniciais do seu desenvolvimento e verificar se alterações no metabolismo de
reservas podem ser relacionadas à acumulação de alcaloides.
4
Revisão de literatura
_____________________________
5
3. REVISÃO DE LITERATURA
__________________________________________________________________________
3.1. A Caatinga
O bioma Caatinga ocupa 10% de todo território brasileiro e corresponde a cerca de
1,4% de toda região árida do mundo. Com aproximadamente 1.300.000 km2 de extensão,
está distribuído em sete Estados, sendo considerado um bioma único do Brasil (AGUIAR et
al., 2010; TOMASELLA et al., 2018). A Caatinga é caracterizada pelo seu clima semiárido,
com intensa radiação solar e alto potencial de evaporação, tendo registros pluviométricos
entre 800 e 1500 mm por ano, com precipitações anuais que duram de 3 a 5 meses.
Contudo, estiagens prolongadas são registradas a cada três ou quatro décadas, podendo se
estender por até 5 anos sem chuvas significativas (TOMASELLA et al., 2018).
Este bioma é dominado por espécies arbóreas e arbustivas de pequeno porte com
características xerofíticas, as quais apresentam estratégias para sobreviver aos longos
períodos de estiagem, adaptando-se através de mudanças morfológicas e fisiológicas que
possibilitam o melhor aproveitamento da água, bem como a redução da transpiração.
Algumas espécies possuem modificações foliares, outras em período de seca perdem todas
as folhas para minimizar a transpiração, dentre outras estratégias. Muitas destas espécies
adaptadas são endêmicas da Caatinga (SANTOS et al., 2014; PINHEIRO e NAIR, 2018).
A biodiversidade entra em contraste com a recorrente devastação que ocorre na
Caatinga, pois cerca de 50% do seu território original já foi devastado. Para melhor
compreensão da extensão dos impactos e a proteção desse habitat único, foram criados
programas como o PRODES (Monitoring Brazilian Amazon Forest by Satellite), DETER
(Detecting Deforestation in Real Time), PROBIO (Projeto de Conservação e Utilização
Sustentável da Diversidade Biológica) e o PMDBBS (Projeto Monitoramento do
Desmatamento dos Biomas Brasileiros por Satélite). Mesmo com essas iniciativas, é
crescente o desmatamento e a fragmentação das áreas remanescentes, devido à pressão
antrópica, especialmente envolvendo atividades extrativistas (DANTAS et al., 2014;
MIRANDA et al., 2018). Após 500 anos de ocupação desordenada e desmatamento
contínuo, os remanescentes florestais apresentam distribuição da vegetação sob a forma de
mosaico, em diferentes estágios de regeneração natural (RODRIGUES et al., 2018;
TOMASELLA et al., 2018).
A região semiárida brasileira tem como uma de suas principais fontes de energia a
utilização da biomassa florestal, compreendendo cerca de 10 milhões m³ de madeira
utilizados por ano. Combinada com a retirada da madeira para produção do carvão se
encontra a queimada da área para implantação de pasto ou plantações, o que intensifica os
impactos causados na região, agravados pela falta de fiscalização e de planos de manejo
6
sustentável, não havendo tempo para a vegetação se recuperar, causando grandes danos a
todo o ecossistema (ALTHOFF et al., 2018). Outra consequência é a desertificação do
ambiente (Figura 1), que já afeta mais de 15% da área total explorada, ocasionando a perda
permanente da diversidade da fauna e flora (SANTOS et al. 2017).
FIGURA 1. Mapa das áreas suscetíveis à desertificação e núcleos de desertificação no bioma Caatinga. Fonte: Amaro, Galvão e Maracajá (2017)
Segundo Amaro (2017), a população dessas áreas tem uma grande dependência
dos recursos naturais para o consumo de subsistência, tendo em vista que, além do uso da
madeira as outras partes das plantas também são utilizadas, em especial para fins
medicinais. Assim, as espécies da Caatinga vêm sendo utilizadas para o tratamento de
enfermidades, sendo esse conhecimento passado através das gerações.
3.2. Espécies florestais medicinais
7
Há muito tempo, as plantas são utilizadas pelo homem para a manutenção da saúde.
Atualmente, este conhecimento popular é bastante difundido, principalmente em pequenas
comunidades e em áreas rurais. A população utiliza tanto as espécies nativas, como as
exóticas para a cura e o tratamento de diversas enfermidades. Dentre os diversos usos,
destacam-se as espécies utilizadas como calmantes, cicatrizantes, anestésicas e anti-
inflamatórias, para as mais diversas dores e enfermidades. Somente nos últimos anos que
foram intensificados os estudos da composição química, seus efeitos e aplicações do ponto
de vista farmacêutico. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 3,5
bilhões de pessoas de países em desenvolvimento fazem uso de plantas medicinais. Dentre
as drogas farmacêuticas, 25% são obtidas de compostos de origem vegetal e destes, 85%
são de espécies já utilizadas pela população (OLIVEIRA 2010).
Muitas plantas medicinais vêm sendo caracterizadas quanto ao seu potencial
farmacológico, apresentando ação bactericida, anti-inflamatória, antioxidante e cicatrizante
(RIBEIRO et al. 2014). As espécies medicinais têm seu uso frequente feito através de
infusão de partes da planta, em especial, de suas folhas, casca, sementes e raízes; também
são feitas outras preparações, como lambedores, sumos, raspas ou pó, cataplasma, óleo,
tinturas, suco e látex com água (LOBO et al. 2010; RIBEIRO et al. 2014; PENIDO et al.,
2016; SANTOS et al., 2018). Diversas espécies da família Fabaceae que ocorrem na
Caatinga vêm sendo exploradas para o uso medicinal e comercial, incluindo Amburana
cearenses, Anadenanthera colubrina e Hymenaea courbaril, as quais são usadas para o
tratamento de problemas respiratórios (CORDEIRO; FELIX, 2014; PENIDO et al., 2016),
Machaerium hirtum e Senna obtusifolia, empregados no tratamento de verminoses e diarreia
(CORDEIRO; FELIX, 2014) e E. velutina, que possui propriedades anti-inflamatórias,
anticonvulsivantes, calmantes e anestésicas (PEREIRA et al., 2014).
3.3. Erythrina velutina Wild.
Com relação à diversidade vegetal da Caatinga, a família Fabaceae se destaca com
89 gêneros, 374 espécies, 4 subespécies e 83 variedades (Flora do Brazil, 2020). Tendo em
vista o processo de degradação do bioma, espécies desta família vêm recebendo atenção
por causa do seu papel ecológico como pioneiras (RODRIGUES et al., 2018). Além disso,
espécies de Fabaceae têm sido estudadas devido ao seu potencial medicinal e, por causa
do risco eminente de redução populacional, vêm sendo recomendadas para programas de
conservação (SANTOS et al., 2017).
As espécies do gênero Erythrina são encontradas em regiões tropicais e
subtropicais, possuindo cerca de 115 espécies, das quais 70 são nativas da América. No
Brasil, podem ser encontradas oito espécies de Erythrina: E. mulungu, E. velutina, E. crista-
galli, E. falcata, E. verna, E. speciosa, E. poeppigiana e E. fusca. Dentre estas espécies, E.
8
velutina, popularmente conhecida como mulungu, suinã, canivete ou corticeira, tem sido
estudada pelo seu potencial medicinal. É uma árvore heliófita, decídua e pioneira, comum
em formações secundárias e recomendada para plantios mistos com fins de repovoamento
(CARVALHO, 2008).
E. velutina possui copa aberta e arredondada, o seu tronco apresenta acúleos, com
altura de 6 a 12 m. Suas folhas são compostas trifolioladas, alternas, de folíolos cartáceos,
medindo de 3 a 12 cm de comprimento. Possui flores de cor vermelho coral, grandes,
dispostas em panículas racemosas com raque pulverulenta, que se formam com a árvore
totalmente despida de folhagem. Seus frutos são do tipo legume deiscente, com vagem
medindo de 5 a 8 cm de comprimento, contendo sementes reniformes, brilhantes, bicolores,
denominadas miméticas, de coloração vermelha-escura e vermelha-alaranjada,
subquadrangulares ou oblongas, com um hilo curto de posição mediana (CARVALHO, 2008;
PALUMBO et al., 2016).
A floração da espécie ocorre entres os meses de julho e fevereiro. A frutificação vai
até março, com a dispersão das sementes e frutos por zoocoria, principalmente pela ação
das aves. As sementes do mulungu apresentam dormência física, conferindo
impermeabilidade tegumentar à água, sendo necessário tratamento para quebra da
dormência. O método mais difundido para esta espécie é a escarificação mecânica, com lixa
de papel (CARVALHO, 2008; PALUMBO et al., 2016).
De acordo com Pereira, et al. (2014), E. velutina é utilizada na ornamentação, no
paisagismo, na arborização de ruas. As flores maceradas servem como corantes para
tecido; sua madeira produz lenha de baixo poder calorífico, com maior utilização na
fabricação de palitos de fósforo, jangadas, estacas, mourões de cerca, tamancos,
brinquedos e caixotes de madeira; devido a sua alta porosidade e pouco peso, ela não é
utilizada para confecção de móveis. A casca, as sementes e as flores tem ampla utilização
na medicina popular, em especial na Região Nordeste do Brasil. Infusões da casca da
árvore apresentam ação sudorífica, calmante e emoliente, enquanto que o seu fruto seco
possui ação anestésica local e extratos hidroalcoólicos do ritidoma e de flores possuem
atividade ansiolítica, antinociceptiva e anticonvulsivante (ALVES et al., 2008; PEREIRA, et
al., 2014).
E. velutina produz compostos secundários com propriedades farmacológicas,
incluindo alcaloides, catequinas, flavonoides, fenóis, saponinas, taninos, triterpenoides e
xantonas (RAMBO et al., 2019). As propriedades farmacológicas de E. velutina vêm sendo
principalmente atribuídas aos alcaloides eritrínicos que esta espécie produz (RAMBO et al.,
2019). Estes compostos estão presentes em casca, flores, folhas e sementes, como a
eritravina e a 11-hidroxi-eritravina, que foram isoladas das cascas e folhas de E. mulungu
(FLAUSINO Jr., 2007). Outro grupo que está presente em sementes de E. velutina é o dos
9
alcaloides indólicos, por exemplo a hipaforina (N, N-dimetiltriptofana), isolada a partir de
extrato metanólico (OZAWA et al., 2008).
3.4. Metabolitos secundários
As plantas possuem mecanismos complexos para defesa contra agentes bióticos e
abióticos. Estes mecanismos incluem a produção de substâncias chamadas metabólitos
secundários ou especializados. Essas substâncias conferem à planta resistência contra
herbivoria, doenças, promovem atração de agentes polinizadores, interação com os
microrganismos simbióticos e resistência a agentes abióticos (HAMMOND-KOSACK e
JONES, 2015). Já foram descobertos cerca de 100.000 metabólitos secundários de plantas
e estima-se que aproximadamente 4.000 novos estão sendo descobertos a cada ano. Os
terpenoides, também citados como terpenos ou isoprenoides, são o maior grupo de
substâncias produzidas pelas plantas, compreendendo mais de um terço de todos os
compostos conhecidos. O segundo maior grupo é o formado pelos alcaloides, que
compreendem muitas drogas e venenos (BRANDÃO et al., 2017).
Os terpenos possuem o difosfato de isopentenila (IPP) e difosfato de dimetilalila
(DMAPP) como precursores. Sua biossíntese pode ocorrer por duas vias metabólicas
distintas, a via do mevalonato (MEV) ou a via do metileritritol fosfato (MEP) (ALICANDRI et
al., 2020). Vários terpenoides apresentam ação alelopática, permitindo uma interação com o
meio ambiente ou conferindo toxicidade como proteção contra herbivoria, microorganismos
e/ou patógenos (KARUNANITHI; ZERBE, 2019). Os terpenos, também desempenham
funções primárias essenciais como precursores de hormônios vegetais (giberelinas,
citocininas, ácido abscísico, brassinosteróides e estrigolactonas), pigmentos fotossintéticos
(carotenoides), carreadores de elétrons (ubiquinona e plastoquinona) e principais
componentes de estruturas de membrana (fitoesteróis) (ALICANDRI et al., 2020).
As saponinas são glicosídeos de esteroides ou de terpenos policíclicos. Formadas
por uma estrutura que possui uma parte lipofílica (triterpeno ou esteroide) e outra parte
hidrofílica (açúcares) (REHAN et al., 2020). São substâncias que desempenham diversos
papéis biológicos, incluindo ação alelopática, anti-inflamatória e hemolítica. A presença
destes metabólitos pode influenciar o comportamento alimentar, desenvolvimento e causar
mortalidade a insetos e outros microrganismos, conferindo proteção à planta (HUSSAIN et
al., 2019). Em estudo realizado por Shi et al. (2019), é relatado o potencial farmacêutico
atribuído as saponinas presentes em Panax ginseng por possuírem ação no sistema
nervoso central, proporcionando melhoria na memoria e aprendizado, além da utilização no
tratamento de doenças neurológicas e ação anticancerígena.
Os alcaloides constituem um vasto grupo de metabólitos com grande diversidade
estrutural, representando cerca de 20% das substâncias naturais descritas. Em uma
10
definição geral, os alcaloides são substâncias nitrogenadas de origem vegetal, possuem
ação farmacológica, encontradas predominantemente nas angiospermas (BRANDÃO et al.,
2017). Várias espécies de plantas, animais e microrganismos produzem alcaloides, como
rãs, formigas (feromônios), borboletas (defesa), bactérias, esponjas, fungos, aranhas
(neurotoxina do veneno) e organismos marinhos (KUTCHAN et al., 2015).
Desde a antiguidade, há relatos da utilização de extratos de plantas que contêm
alcaloides para fabricação de poções e venenos. A utilização do ópio, por exemplo, data de
1400-1200 a.C. no leste do Mediterrâneo e esta prática foi difundida por toda Arábia e
Europa; assim, novas formas de decocção e infusão foram descobertas. O uso destas
substâncias marcou eventos importantes na história da humanidade. Na execução do
filósofo Sócrates por meio da ingestão do chá de cicuta (Conium maculatum); a rainha
Cleópatra usava extratos de Hyoscyamus que continham atropina, para dilatar suas pupilas
e parecer mais atraente para seus rivais políticos do sexo masculino (ANISZEWSKI, 2015;
KUTCHAN et al., 2015); já durante o Império Romano, a esposa do imperador Augusto,
Lívia, arquitetava o assassinato dos inimigos políticos do marido, onde adicionava beladona
(Atropa beladona L.) aos alimentos nos banquetes oferecidos; os índios da bacia
amazônica utilizam o extrato seco da planta conhecida como “curare” (Chondodendron
tomentosum L.) em flechas usadas na pesca, caça e em guerras.
Os alcaloides podem ser encontrados nas plantas sob a forma de sais de ácidos
orgânicos, como malato, acetato e citrato, ou ainda associados com outras substâncias,
como taninos (MOREIRA et al., 2018). A síntese dos alcaloides ocorre no retículo
endoplasmático e o seu acúmulo, nos vacúolos. Sendo necessário um substrato, que é
obtido a partir de blocos de construção do metabolismo secundário, por exemplo acetil-
coenzima A (acetil-CoA), ácido chiquímico, ácido mevalônico e 1-desoxixilulose 5-fosfato
(WANG et al., 2018; ANISZEWSKI, 2015).
Os alcaloides podem ser classificados em verdadeiros, quando são sintetizados a
partir de aminoácidos aromáticos ligados ou não a uma proteína e possuem um nitrogênio
no anel heterocíclico; protoalcaloides, contendo um átomo de nitrogênio que não pertence a
um sistema heterocíclico, sendo aminas simples; e pseudoalcaloides, que são compostos
nitrogenados não derivados de aminoácidos, com átomo de nitrogênio em anel heterocíclico,
ou não, possuindo todas as características dos alcaloides verdadeiros, mas provém do
metabolismo de terpenos ou do acetato (ANISZEWSKI, 2015).
O gênero Erythrina caracteriza-se pela presença de alcaloides eritrínicos. Este grupo
de alcaloides apresenta uma estrutura tetracíclica e podem ser classificados em três
principais subclasses, os alcaloides dienoides, alcenoides e lactônicos. Os alcaloides
dienoides possuem um sistema conjugado de dieno no anel A e B, dupla ligação entre os
carbonos 1 e 2 e entre os carbonos 6 e 7, os alcenoides têm uma ligação 1,6 dupla no anel
11
A e os alcaloides lactônicos possuem um anel de lactona em vez do anel de benzeno
(FAHMY et al., 2019).
Figura 2. Estrutura básica dos alcaloides eritrínicos (A) e das subclasses dienoide (B), alcenoide (C) e lactônica (D). Fonte: Feitosa (2014)
3.5. Germinação da semente e estabelecimento da plântula
A germinação da semente pode ser descrita como um evento fisiológico que se inicia
com a absorção de água e a reativação do metabolismo, culminando com a protrusão da
radícula (BEWLEY et al. 2013). O processo germinativo é dependente de agentes internos e
externos; os internos podem ser divididos entre hormônios e substâncias inibidoras não
hormonais, enquanto os externos incluem disponibilidade de água, temperatura adequada,
luz e oxigênio (NORONHA et al., 2018; YANG; BENNING, 2018). Durante a germinação e
principalmente ao longo do estabelecimento, as reservas de carboidratos, lipídios e
proteínas são mobilizadas, dando suporte para o desenvolvimento da plântula. Estes
compostos de reserva e seus produtos de degradação são utilizados principalmente como
fontes de carbono e de nitrogênio, fornecendo energia e subsidiando a síntese de novas
proteínas, aminoácidos e metabólitos secundários (ARAGÃO et al., 2015; DANTAS et al.,
2008a).
Em condições ideais, o processo de embebição é trifásico; na fase I, as sementes
secas absorvem água pelo gradiente de potencial hídrico (Ψ), iniciando a reativação do
metabolismo; na fase II, há um decréscimo na absorção de água pelo embrião e são
12
reiniciados e/ou intensificados processos metabólicos, incluindo respiração, reparo do DNA,
transcrição e tradução. A fase III, por sua vez, é marcada pela retomada na absorção de
água, que permite a expansão do embrião e a protrusão da radícula (TAIZ et al., 2017;
BEWLEY et al., 2013). A partir deste momento, inicia-se o estabelecimento da plântula,
evento marcado pela mobilização das reservas majoritárias, que fornecem precursores
biossintéticos e energia metabólica para a plântula em desenvolvimento até que ela possa
realizar a fotossíntese e se torne autotrófica (GOMMERS; MONTE, 2017).
Dentre as reservas de carbono, os açúcares não redutores como a sacarose e os
oligossacarídeos da série rafinose (RFOs), que consistem em uma molécula de sacarose
ligada a uma ou mais moléculas de galactose, são uma fonte inicial de açúcares para
produção de energia durante a germinação (HELLMANN et al., 2008). Os RFOs são
hidrolisados pela ação α-galactosidases e a sacarose liberada, por sua vez, pode ser
degradada por duas vias, uma catalisada pelas invertases e a outra pela sacarose sintase.
As hexoses resultantes podem ser oxidadas para a produção de ATP (BUCHANAN et al.,
2015).
O amido consiste na principal reserva de carboidrato de muitas sementes e é
estocado sob a forma de grânulos nos amiloplastos. Pelo menos em sementes de cereais, o
amido é degradado principalmente pela via hidrolítica, envolvendo a ação de α e a β-
amilases, enzimas desramificadoras e maltases. Os açúcares liberados por este processo
são transferidos dos tecidos de armazenamento para os tecidos em crescimento, nos quais
atuam como fontes de carbono e energia (BEWLEY et al., 2013; DANTAS et al. 2008a). Os
lipídeos, por sua vez, são as principais reservas de carbono em sementes oleaginosas, nas
quais correspondem a misturas de triacilgliceróis estocados em corpos lipídicos. A
mobilização destas reservas se inicia com a hidrólise pela ação das lipases, seguida do
metabolismo do glicerol e dos ácidos graxos. Enquanto o glicerol pode ser consumido via
glicólise no citosol, os ácidos graxos são degradados via β-oxidação e ciclo do glioxilato nos
glioxissomos. Os ácidos orgânicos oriundos dos glioxissomos são utilizados pela
gliconeogênese no citosol, permitindo a formação de açúcares que também podem ser
transportados para e utilizados pelos tecidos em crescimento (BUCHANAN et al., 2015).
As proteínas de reserva são a principal fonte de aminoácidos para a síntese de
novas proteínas e outras substâncias nitrogenadas, incluindo alguns metabólitos
secundários. Em sementes de dicotiledôneas, as proteínas de reserva são armazenadas
nos vacúolos de armazenamento de proteínas. A hidrolise destas reservas é realizada pela
ação de proteases, incluindo as endopeptidases que clivam as ligações peptídicas internas,
dando origem a cadeias polipeptídicas menores; as aminopeptidases, que hidrolisam a partir
do último aminoácido no terminal amino; e as carboxipeptidases, que realizam a hidrolise a
partir do terminal carboxila. Ao final da hidrólise, os aminoácidos resultantes podem ser
13
convertidos em amidas e transportados para os tecidos em crescimento (TAN-WILSON;
WILSON, 2011).
Aspectos bioquímicos e fisiológicos da composição das reservas e sua mobilização
nas sementes durante a germinação e o estabelecimento da plântula em espécies florestais
ainda são pouco estudados. A maior parte das informações conhecidas sobre os processos
de mobilização de reservas são oriundas de experimentos realizados com espécies
cultivadas (CORTE et al. 2006).
Material e Métodos
_____________________________
14
4. MATERIAL E MÉTODOS
__________________________________________________________________________
4.1. Material vegetal
Sementes de E. velutina foram coletadas de cinco indivíduos localizados na região
de Acari (RN), beneficiadas manualmente, acondicionadas em sacos de papel pardo e
mantidas em refrigerador. Estas sementes foram escarificadas mecanicamente com lixas,
lavadas com detergente diluído 1:500 por 30 s e enxaguadas em água corrente. Em
seguida, as sementes foram desinfetadas com etanol 70% (v/v) por 30 s e NaClO 0,25%
(m/v) por 3 min, lavadas três vezes e embebidas por 2 h em água destilada estéril. A
semeadura foi realizada entre folhas de papel toalha, do tipo Germitest®, dispostas na forma
de rolos e as sementes foram incubadas sob condições controladas (radiação
fotossinteticamente ativa de 80 μmol m-2s-1, fotoperíodo de 12 h e 28 ± 2°C) por até nove
dias.
As plântulas foram transferidas para água destilada contida em vasos plásticos com
capacidade para 1 L e estes sistemas hidropônicos foram cultivados em casa de vegetação
por até oito dias, realizando-se coletas periódicas de acordo com estágios fisiológicos
discretos. A germinação foi caracterizada no estágio de semente embebida (estágio I) e no
de protrusão da radícula (estágio II). Durante o estabelecimento da plântula, foi possível
caracterizar a emergência do hipocótilo (estágio III), a abertura do gancho plumular (estágio
IV), a expansão do par de folhas cordiformes (estágio V) e a expansão da primeira folha
trifoliolada (estágio VI) e o da segunda (estágio VII). Nas coletas, os cotilédones foram
pesados, acondicionados em envelopes de papel alumínio e congelados a -20°C até a
realização das determinações bioquímicas.
4.2. Lipídeos neutros (LN)
A quantificação dos LN foi realizada pelo método gravimétrico (SOXHLET, 1879).
Amostras de cotilédones com aproximadamente 200 mg de massa seca (MS) foram
maceradas em gral e pistilo e os LN foram extraídos com 8 mL de n-hexano a 60°C, durante
5 h, com agitação em vórtex a cada hora. O sobrenadante foi transferido para tubos do tipo
Falcon previamente pesados. Após a evaporação do n-hexano em estufa a 80°C, a massa
de LN foi calculada a partir da diferença entre a massa inicial e a final dos tubos e foi
expressa em mg cotilédone-1.
4.3. Proteínas solúveis (PS)
Para obter uma fração enriquecida em proteínas de reserva, amostras congeladas de
cotilédones com 300 a 500 mg foram maceradas em 1,5 mL de tampão Tris-HCl 100 mM pH
15
7,0 contendo NaCl 500 mM e 2-mercaptoetanol 2 mM. Os homogenatos foram centrifugados
a 10.000 xg por 10 min, os sobrenadantes foram reservados e os precipitados foram
extraídos com 1 mL do tampão de extração por mais duas vezes. Os sobrenadantes foram
combinados, totalizando 3,5 mL de extrato por amostra. Todos os procedimentos foram
realizados a 4 ºC. As PS foram determinadas de acordo com o método de Bradford (1976),
utilizando uma curva-padrão de albumina sérica bovina, e o conteúdo de PS foi expresso em
mg cotilédone-1.
4.4. Metobólitos solúveis
Para extrair os metabólitos solúveis, amostras com 300 a 500 mg de cotilédones
congelados foram fragmentadas com bisturi e extraídas com 4 mL de etanol 80% (v/v) a 60
°C por 30 min. Depois da coleta dos sobrenadantes, os resíduos foram re-extraídos com 4
mL de etanol 80% (v/v) e uma última vez com mais 6 mL de etanol 80% (v/v) nas mesmas
condições. Os sobrenadantes foram coletados e reunidos, rendendo 14 mL de extrato por
amostra. Os açúcares solúveis totais (AST) foram mensurados pelo método da antrona
(MORRIS, 1948), empregando D-glicose como padrão. Os açúcares não redutores (ANR)
foram quantificados por uma modificação do método da antrona (VAN HANDEL, 1968),
utilizando uma curva-padrão de sacarose. Os aminoácidos livres totais (AALT) foram
estimados pelo método da ninidrina (YEMM; COOKING,1954), tendo como base uma curva
padrão de L-glutamina. Os conteúdos de AST, ANR e AALT foram expressos em μmol g-1
MS.
4.5. Amido
O amido foi extraído a partir dos resíduos obtidos após a extração dos metabólitos
solúveis (AALT, AST e ANR). Estes resíduos foram macerados com 1,5 mL de HClO4 30%
(v/v) e os macerados foram centrifugados a 10.000 xg por 10 min. Os sobrenadantes foram
coletados, enquanto os precipitados foram extraídos com 1 mL de HClO4 30% (v/v) por mais
duas vezes. Os sobrenadantes foram reunidos, perfazendo 3,5 mL de extrato por amostra.
Estes procedimentos foram realizados a 4 °C. O amido foi quantificado pelo método da
antrona (MORRIS, 1948), utilizando D-glicose como padrão. Os valores calculados foram
multiplicados por 0,9 para conversão em amido (McCrEADY et al., 1950) e os resultados
foram expressos em mg cotilédone-1.
4.6. Atividades enzimáticas
As lipases foram extraídas a partir de amostras de cotilédones congelados com 300
a 500 mg, as quais foram maceradas com 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH
7,5 contendo 2-mercaptoetanol 0,01% (v/v). Depois de centrifugação a 10.000 xg por 20
16
min, os sobrenadantes foram coletados e utilizados como fontes de enzimas. Todos os
procedimentos foram feitos a 4 °C. A atividade de lipases foi determinada por meio da
hidrólise de 4-nitrofenil-palmitato, gerando 4-nitrofenol no meio de reação (MARRIOTT e
NORTHCOTE, 1975). A atividade foi calculada utilizando 4-nitrofenol como padrão e
expressa em μmol g-1 MS min-1.
As amilases foram extraídas de amostras congeladas de cotilédones com 300 a 500
mg por maceração com 1,5 mL de tampão acetato de potássio 100 mM pH 6,0 adicionado
de CaCl2 5 mM. Após centrifugação a 10.000 xg por 20 min, os sobrenadantes foram
reservados e usados como fontes de enzimas. Estes procedimentos foram conduzidos a 4
°C. A atividade das amilases foi determinada pela liberação de açúcares redutores no meio
de reação, tendo como substrato o amido solúvel (ELARBI et al., 2009). A concentração de
açúcares redutores foi quantificada com o reagente do 3,5-dinitro-salicilato (DNS) (Miller,
1959), usando uma curva-padrão de D-glicose, e a atividade foi expressa em μmol g-1 MS
min-1.
Para extrair as proteases ácidas, amostras com 300 a 500 mg de cotilédones
congelados foram maceradas com 1,5 mL de tampão tris-HCl 50 mM pH 7,2 suplementado
com 2-mercaptoetanol 2 mM. Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 xg por 20 min
e os sobrenadantes foram usados como extratos enzimáticos. Estes procedimentos foram
realizados a 4 °C. A atividade de proteases ácidas foi mensurada pela liberação de
aminoácidos no meio de reação a partir de caseína como substrato (Beevers, 1968). A
concentração de aminoácidos livres foi dosada pelo método da ninidrina (Yemm;
Cooking,1954), utilizando como padrão a L-glutamina e a atividade foi expressa em μmol g-1
MS min-1.
4.7. Cromatografia de camada delgada (CCD)
Inicialmente, 180 mg de cotilédones congelados foram solubilizados em 1,8 mL
etanol 70% (v/v) na proporção de 1:10. Estas amostras foram mantidas em ultrassom por 30
min a 45 ºC para a extração. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 16.000 xg por
10 minutos a 25 ºC, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e o resíduo foi secado
em speedvac por 5:30 h. A massa final da amostra foi determinada por gravimetria e
solubilizada em etanol 70% (v/v), em volume fixo de 300 µL. Estas amostras foram
submetidas a cromatografia de camada delgada (CCD) (IZMAILOV e SHAIBER, 1939),
sendo aplicadas em cromatoplacas de sílica gel 60GF254 de fase normal. A fase móvel foi
composta por acetato de etila, ácido fórmico, ácido acético e água na proporção de
10:1,1:1,1:2,6 (v/v/v/v). Após a eluição e observação em luz UV a 254nm, a revelação foi
feita com reagentes para detecção de metabólitos secundários, incluindo Dragendorff,
Natural A e Vanilina.
17
4.8. Delineamento experimental e análise estatística
O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado (DIC). Os
tratamentos consistiram de sete estágios fisiológicos (estágio I - semente embebida; estágio
II - protrusão da radícula; estágio III - emergência do hipocótilo; estágio IV - abertura do
gancho plumular; estágio V - expansão de folhas cordiformes; estágio VI - primeira folha
trifoliolada e estágio VII – segunda folha trifoliolada), com coletas de cotilédones em cada
um desses estágios representativos. A parcela experimental (repetição) consistiu de um
vaso contendo uma plântula e cada tratamento foi representado por três para a análise de
metabólitos secundários ou cinco repetições para as demais análises. Os resultados foram
avaliados por estatística descritiva, utilizando média e desvio padrão.
18
Resultados e Discussão
19
_____________________________
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
__________________________________________________________________________
5.1. Resultados
Nas sementes de E. velutina, foram encontrados conteúdos significativos de LN,
amido, ANR e PS. Quando estes conteúdos foram calculados como porcentagem de MS, foi
possível verificar que o amido foi a reserva majoritária de carbono, perfazendo
aproximadamente 20% da semente. O segundo maior conteúdo de reservas de carbono foi
o de lipídeos, equivalente a cerca de 11,6%. Como esperado, os ANR foram as reservas
minoritárias de carbono, representando em torno de 5,7% da semente. A fração enriquecida
em proteínas de reserva permitiu estimar que cerca de 14,5% da MS da semente
correspondeu a este tipo de reserva.
Na semente embebida (estágio I), o conteúdo de amido (Figura 3a) foi equivalente a
40,7 mg cotilédone-1, o qual se manteve praticamente inalterado até a abertura do gancho
plumular (estágio IV). A mobilização do amido foi mais rápida entre a abertura do gancho
plumular e a emergência das folhas cordiformes (estágio V), uma vez que o conteúdo desta
reserva decaiu 64% durante este período. Em comparação, a mobilização do amido foi mais
lenta a partir de então até a expansão da segunda folha trifoliolada (estágio VII), tendo em
vista que o conteúdo de amido foi igual a 14,4 mg cotilédone-1 no estágio V e diminuiu para
9,1 mg cotilédone-1 no final do experimento.
Figura 3. Conteúdo de amido (a), lipídeos neutros (b) e proteínas solúveis (c) nos cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. As coletas foram feitas em estágios fisiológicos discretos, incluindo semente embebida (estágio I), protrusão da radícula (estágio II), emergência do hipocótilo (estágio III), abertura do gancho plumular (estágio IV) e expansão das folhas cordiformes (estágio V), da primeira folha trifoliolada (estágio VI) e da segunda folha trifoliolada (estágio VII). Os pontos representam a média e as barras verticais representam o desvio padrão de cinco repetições.
20
O conteúdo inicial de LN (Figura 3b) foi equivalente a 24,1 mg cotilédone-1,
observado na semente embebida. A mobilização dos lipídeos de reserva se iniciou a partir
da abertura do gancho plumular e foi mais intensa até a expansão da primeira folha
trifoliolada, considerando que o conteúdo de LN diminuiu cerca de 82,4% neste intervalo. No
entanto, o conteúdo destas reservas se manteve praticamente inalterado da expansão da
primeira folha trifoliolada até o último estágio fisiológico estudado.
A semente embebida apresentou um conteúdo de PS (Figura 3c) de 35,5 mg
cotilédone-1, o qual se manteve estável até a abertura do gancho plumular. A degradação
das proteínas de reserva foi mais rápida até a expansão das folhas cordiformes, seguindo o
padrão de mobilização verificado para o amido. Ao final do experimento, restaram apenas
3,2% do conteúdo inicial de PS, de forma que as proteínas foram as reservas mais
intensamente mobilizadas durante o estabelecimento da plântula.
Embora a mobilização das reservas majoritárias de carbono (amido e lipídeos de
reserva) tenha ocorrido de forma mais intensa a partir do estágio IV, a utilização dos
açúcares teve seu início no estágio anterior, durante a emergência do hipocótilo. De fato, o
conteúdo de AST (Figura 4a) e ANR (Figura 4b) na semente embebida foi de 558,4 e 172,3
μmol g-1 MS, respectivamente, mantendo-se quase inalterado até o estágio III. Entre a
21
emergência do hipocótilo e a abertura do gancho plumular, o conteúdo de AST e ANR teve
decréscimo de 50 e 69,5%, nesta ordem, evidenciando a utilização destes metabólitos. A
partir do estágio IV até o estágio VII, não foi possível constatar alterações significativas no
conteúdo de AST e ANR.
Diferente dos açúcares solúveis, o conteúdo de AALT aumentou nos cotilédones
durante a germinação e o estabelecimento das plântulas (Figura 4c). O conteúdo de AALT
foi de 2,37 μmol g-1 MS nas sementes embebidas e aumentou 2,6 vezes na protrusão
radicular (estágio II). Coincidentemente, os AALT foram acumulados quando a hidrólise das
proteínas de armazenamento foi intensificada (Figura 5c). De fato, o conteúdo desses
metabólitos aumentou 3,7 vezes do estágio II para V e diminuiu 27% do estágio V para VII
(Figura 4c).
Figura 4: Conteúdo de AST (a), ANR (b) e AALT (c) nos cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. Os pontos representam a média e as barras verticais representam o desvio padrão de cinco repetições.
22
A atividade de amilases nos cotilédones apresentou um padrão bifásico de aumento
(Figura 5a). Na semente embebida, a atividade mensurada foi de 6,39 μmol g-1 MS min-1, a
qual aumentou progressivamente até a emergência do hipocótilo, alcançando 11,61 μmol g-1
MS min-1. No entanto, a atividade de amilases foi intensificada a partir da abertura do
gancho plumular até a expansão da segunda folha trifoliolada, atingindo 31,86 μmol g-1 MS
min-1. Embora a atividade destas enzimas tenha aumentado em paralelo com a degradação
do amido (Figura 5a), é curioso que ela tenha se mantido alta mesmo nos estágios mais
tardios do estabelecimento da plântula, quando o conteúdo de amido se manteve mais
baixo.
A atividade das lipases durante a germinação e o estabelecimento da plântula
corrobora o padrão de mobilização verificado para os LN (Figura 5b), segundo o qual a
atividade enzimática na semente embebida (estágio I) foi de 22,45 μmol g-1 MS min-1, tendo
um aumento de 493% entre abertura do gancho plumular (estágio IV) e a emergência das
folhas cordiformes (estágio V). Ao final do estabelecimento, com a expansão da segunda
folha trifoliolada (estágio VII), foi verificada a atividade enzimática ainda mais elevada,
chegando a 211,27 μmol g-1 MS min-1.
Figura 5. Atividade de amilases (a), lipases (b) e proteases ácidas (c) nos cotilédones de E.
velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. Os pontos
representam a média e as barras verticais representam o desvio padrão de cinco repetições.
23
Em contrate ao verificado com as outras hidrolases, a atividade das proteases ácidas
foi de apenas 0,068 μmol g-1 MS min-1 no início do experimento, ocorrendo um aumento de
14 vezes entre os estágios I a VI e posteriormente uma diminuição de 48% do estágio VI ao
VII (Figura 5c), este padrão de aumento condiz com a diminuição dos conteúdos de PS e o
acúmulo de AALT nos cotilédones de E. Velutina.
Após a realização da CCD, as cromatoplacas foram coradas com diferentes
reveladores. O perfil cromatográfico obtido por coloração com vanilina sugeriu a presença
de saponinas (bandas marrons - 1) e terpenos (bandas violetas - 2) (Figura 6) (WAGNER;
BLADT, 1996). Até o estágio IV, foi possível observar a presença de bandas características
de saponinas, as quais não estão presentes nos estágios posteriores. Além disso, foi
possível perceber a presença de pelo menos três bandas majoritárias de terpenos ao longo
da germinação da semente e do estabelecimento da plântula.
Figura 6. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos obtidos a partir de cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. A revelação foi feita com reagente da vanilina para detecção de saponinas (bandas marrons - 1) e terpenos (bandas violetas - 2).
24
O reagente Natural A foi utilizado para detecção de flavonoides (bandas amarelas -
1), ácidos fenólicos (bandas azuis - 2) e clorofilas (bandas vermelhas - 3) (Figura 7)
(WAGNER; BLADT, 1996). Uma banda amarela foi detectada a partir do estágio II, enquanto
outra banda surgiu a partir do estágio V, ambas permanecendo presentes até o final do
experimento, indicando a presença de flavonoides. Três bandas azuis foram observadas em
todos os estágios, evidenciando a presença de ácidos fenólicos. Coincidindo com a
aquisição da cor verde pelos cotilédones, foi possível visualizar uma banda vermelha do
estágio V até o estágio VII, correspondente às clorofilas.
Figura 7. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos obtidos a partir de cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. A revelação foi feita com Natural A para detecção de flavonoides (bandas amarelas - 1), ácidos fenólicos (bandas azuis - 2) e clorofilas (bandas vermelhas - 3).
A partir da revelação da CCD com o reagente Dragendorff (Figura 8), foram
detectadas bandas características que sugerem a presença de alcaloides. Apenas no
estágio I foi possível observar a presença de quatro bandas distintas. Uma banda majoritária
permaneceu presente durante todo o experimento e uma banda minoritária foi passível de
ser observada nos estágios III e V.
25
Figura 8. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos obtidos a partir de cotilédones de E. velutina ao longo da germinação da semente e do estabelecimento da plântula. A revelação foi realizada com Dragendorff para detecção de alcaloides, dentre os quais compostos azotados heterocíclicos e aminas terciárias aparecem como precipitados alaranjados.
5.2. Discussão
As sementes de espécies cultivadas são comumente classificadas de acordo com o
conteúdo de reservas majoritárias em amiláceas, aleuro-amiláceas, oleaginosas e aleuro-
oleaginosas (MARCOS-FILHO et al. 2015). Tendo em vista que as sementes de E. velutina
apresentam cerca de 20% de amido, 14,5% de proteínas e 11,6% de lipídeos em base de
MS, elas não se adequam perfeitamente a este sistema de classificação, pois apresentam
conteúdos balanceados destas reservas. Embora o conteúdo de lipídeos verificado neste
estudo tenha coincidido com aquele encontrado por outros autores (AURÉLIO et al. 1998;
CARVALHO et al. 2011), houve discrepância em relação ao conteúdo de proteínas, pois
Aurélio et al. (1998) e Carvalho et al. (2011) encontraram conteúdo de aproximadamente
39%, muito superior ao encontrado neste trabalho. Esta discrepância possivelmente se deve
à metodologia utilizada para a mensuração das proteínas, já que estes autores mediram o
conteúdo de nitrogênio total pelo método de Kjeldahl, enquanto o método empregado no
presente trabalho reflete o conteúdo de uma fração enriquecida em proteínas de reserva
(BARROS-GALVÃO et al. 2016).
Segundo os resultados deste trabalho, o amido foi a reserva mais frequente nas
sementes de E. velutina. Em comparação, Carvalho et al. (2011) inferiram que
aproximadamente 10% da MS da semente é composta por carboidratos digestíveis.
Novamente, discrepâncias nos conteúdos mensurados refletem a metodologia empregada,
uma vez que neste estudo o amido foi quantificado pelo método químico de McCready et al.
(1950) e Carvalho et al. (2011) estimaram o conteúdo de carboidratos digestíveis por
subtração de outros compostos determinados. Apesar disso, o conteúdo ANR, estimado
26
neste trabalho em 5,7% da MS da semente, condiz com aqueles previamente determinados
em sementes de outras espécies, os quais variam entre 2 e 6% em base de MS segundo
Black et al. (2006).
Durante a germinação da semente de E. velutina, não foi verificada mobilização
significativa das reservas majoritárias, considerando que os conteúdos de amido (Figura 4a),
LN (Figura 3b) e PS (Figura 3c) se mantiveram praticamente inalterados da semente
embebida (estágio I) à protrusão da radícula (estágio II). Estes resultados corroboram a
noção de que a mobilização de reservas é um processo primordialmente pós-germinativo
(BEWLEY et al. 2013). De forma semelhante à E. velutina, não houve diminuição do
conteúdo de amido e proteínas em Caesalpinia peltophoroides (CORTE et al. 2006), assim
como não foi constatada a utilização do amido em Enterolobium contortisiliquum
(VERONESI et al. 2014) ou o consumo de proteínas em Aniba rosaeodora (LIMA et al. 2008)
ao longo da germinação. Assim sendo, é possível que a germinação de sementes de E.
velutina tenha sido sustentada pela utilização das reservas contidas no eixo embrionário, as
quais não foram determinadas. No entanto, alguns trabalhos demonstram que a mobilização
de reservas majoritárias pode ser iniciada antes do estabelecimento da plântula em algumas
espécies florestais. Por exemplo, há degradação de amido durante as fases I e II da
embebição em sementes de Caesalpinia pyramidalis (DANTAS et al. 2008a) e Schinopsis
brasiliensis (DANTAS et al. 2008b).
Curiosamente, as reservas majoritárias de carbono e nitrogênio foram mobilizadas de
forma sincrônica nos cotilédones de E. velutina durante o estabelecimento da plântula
(Figura 3). De fato, os processos de mobilização do amido (Figura 3a), dos lipídeos (Figura
1b) e das proteínas de reserva (Figura 3c) foram mais expressivos desde a abertura do
gancho plumular (estágio IV) até a emissão da primeira folha trifoliolada (estágio VI),
indicando possível interdependência destes processos. Estes resultados contrastam com
aqueles previamente descritos para outras espécies florestais, pois a degradação dos
lipídeos e das proteínas de reserva ocorre de forma simultânea nos cotilédones de
Caesalpinia peltophoroides (CORTE et al. 2006), Anacardium occidentale (VOIGT et al.
2009) e Morinda citrifolia (PAULA et al. 2016), mas não é acompanhada pela mobilização do
amido. É possível que estas diferenças nos perfis de utilização das reservas estejam
relacionadas ao fato de que as sementes de E. velutina apresentam conteúdos balanceados
de amido, lipídeos e proteinas, enquanto que as sementes de C. peltophoroides (CORTE et
al. 2006), A. occidentale (VOIGT et al. 2009) e M. citrifolia (PAULA et al. 2016) podem ser
consideradas oleaginosas. Em espécies oleaginosas, a degradação dos lipídeos está
comumente associada à acumulação de amido nos tecidos de armazenamento, como
resultado da gliconeogênese. Pelo menos em A. occidentale (VOIGT et al. 2009) e M.
27
citrifolia (PAULA et al. 2016), possivelmente ocorre conversão de lipídeos em amido durante
o estabelecimento da plântula.
A utilização dos açúcares solúveis ocorreu mais precocemente, em relação às
reservas majoritárias, nos cotilédones de E. velutina, pois o conteúdo de AST (Figura 4a) e
ANR (Figura 4b) diminuiu a partir da emergência do hipocótilo (Estágio III). Dentre os
açúcares solúveis depositados em sementes, os ANR têm sido considerados reservas
minoritárias, os quais correspondem à sacarose e aos oligossacarídeos da família da
rafinose. Aos ANR são comumente atribuídas as funções de manutenção do estado vítreo e
estabilização das membranas em sementes durante a dessecação, bem como o
fornecimento inicial de energia durante a germinação (BEWLEY et al. 2013; ROSENTAL et
al. 2014). Embora não tenha sido constatada a utilização dos ANR nos cotilédones de E.
velutina durante a germinação, estes compostos, juntamente com os AST, provavelmente
atuaram como fontes acessíveis de energia durante os momentos iniciais do processo de
estabelecimento. De forma semelhante, os açúcares solúveis também sustentam o
estabelecimento inicial de C. peltophoroides (CORTE et al. 2006) e M. citrifolia (PAULA et al.
2016).
O processo de degradação das reservas envolve a ação de diversas enzimas, dentre
elas as lipases e as amilases, que participam do processo de hidrólise, dando início à
conversão das reservas majoritárias de carbono em açúcares, que podem ser transportados
para as partes da plântula em desenvolvimento (BEWLEY et al. 2013). Tendo em vista que o
amido é armazenado em maiores quantidades que as demais reservas nos cotilédones de
E. velutina (Figura 3a), é notável a contribuição das amilases no estabelecimento da
plântula, pois o aumento da sua atividade (Figura 5a) coincide com a mobilização do amido
(Figura 3a). Curiosamente, este processo é sincrônico com o decréscimo no conteúdo de LN
(Figura 3b) e PS (Figura 3c) e o aumento da atividade das lipases (Figura 5b) e proteases
ácidas (Figura 5C) no inicio do estabelecimento da plântula, podendo haver uma
interdependência nos processos de mobilização das reservas majoritárias.
É importante ressaltar que o aumento da atividade das hidrolases não é
acompanhado pela acumulação de AST e ANR (Figura 4a e b, respectivamente) nos
cotilédones. Considerando que estes processos geram açúcares livres que podem ser
consumidos nos tecidos de armazenamento ou utilizados na produção de sacarose para
transporte aos tecidos em crescimento (DONG e BECKLES, 2019), o fato de que os
conteúdos de AST e ANR se mantiveram praticamente inalterados em paralelo com o
aumento da atividade de amilases e lipases, provavelmente está relacionado à alteração da
relação fonte-dreno durante o estabelecimento da plântula. No estágio V, a expansão das
28
folhas cordiformes ocorre em paralelo com o crescimento das raízes secundárias,
exercendo força de dreno sobre a mobilização das reservas nos cotilédones. Estes
resultados corroboram aqueles previamente verificados em outras dicotiledôneas não
endospérmicas, nas quais as hidrolases apresentam um importante papel na degradação
das reservas majoritárias, iniciando o processo de mobilização (BUCHANAN et al., 2015;
BEWLEY et al. 2013). É interessante que diferindo da assincronia verificada entre as
hidrolases e os açúcares solúveis, o conteúdo de AALT acompanhou o aumento da atividade
das proteases, o que possivelmente pode estar relacionado ao aumento da renovação das
proteínas nos cotilédones, subsidiando o crescimento inicial da plântula.
Após a realização de CCD a partir de extratos cotiledonares de E. velutina, foi
verificado em concordância à estudos realizados por Rambo et al. (2019), a presença de
terpenos (Figura 6), flavonoides, ácidos fenólicos (Figura 7) e alcaloides (Figura 8) durante a
germinação e nos estágios iniciais do estabelecimento. Dentre estes compostos, os
flavonoides desempenham um papel fundamental na proteção contra agentes oxidantes e
radiação ultravioleta (UV) (BUCHANAN et al., 2015). Em E. velutina, foi detectada uma
banda característica de flavonoides a partir do estágio II e, após o estágio V, uma outra
banda de flavonoides foi observada (Figura 7). Levando em consideração as funções
conhecidas dos flavonoides, é possível que a presença desses compostos seja justificada
pela exposição à radiação UV, tendo em vista que, a partir do estágio V, a plântula já possui
folhas e realiza fotossíntese.
Por outro lado, os derivados terpenoides são detectados durante a germinação das
sementes e o estabelecimento inicial das plântulas (Figura 6). O perfil cromatográfico obtido
por coloração com vanilina usada na CCD não é suficiente para definição exata da classe de
derivado terpenoide presente nas amostras. Dentre os possíveis terpenoides, a ocorrência
de saponinas e esteroides pode ser a mais plausível. Como os flavonoides, as saponinas
também podem estar envolvidas na defesa das plântulas, pois apresentam atividade
antifúngica (NABOULSI et al. 2018).
Sabe-se que o gênero Erythrina é amplamente utilizado para fins farmacológicos,
devido à acumulação de alcaloides em todas as partes da planta, principalmente nas
sementes. Estes compostos comumente estão relacionados à defesa contra herbivoria e
doenças. (ANISZEWSKI, 2015; GARCIA-MATEOS, 1996). Em extratos cotiledonares de E.
velutina, foram detectadas quatro bandas majoritárias de alcaloides, durante o estágio I,
sendo que as mesmas não estão presentes após a germinação, permanecendo apenas uma
banda até o final do estabelecimento (Figura 8). Esses resultados corroboram aqueles
anteriormente verificados em sementes de Erythrina americana, nos quais Garcia-Mateos
29
(1996) verificaram a maior concentração de alcaloides nas sementes secas. Curiosamente,
alguns dos alcaloides encontrados nas sementes de E. velutina desaparecem ao longo da
germinação e do estabelecimento (Figura 8). Tendo em vista que os alcaloides são
compostos nitrogenados, eles poderiam atuar como reservas de nitrogênio durante e após a
germinação (NAIK; AL-KHAYRI, 2016; ALI et al 2019).
Em estudo realizado por Centenaro et al. (2009), é constatada atividade alelopática
de extratos de E. velutina sobre a germinação de sementes de Lactuca sativa.
Considerando que o desaparecimento de alguns alcaloides após a germinação da semente
de E. velutina (Figura 8) pode envolver a sua exsudação para o meio externo, é possível
que estes compostos tenham algum papel como alelopáticos. De fato, estes compostos
podem ter sido liberados para o meio externo, pois é observada a liberação de um exsudato
de cor alaranjada pelas sementes embebidas, tanto na água de embebição, quanto no
substrato usado no experimento. Esta sugestão corrobora aquelas levantadas por Aoyama e
Labinas (2012), as quais vinculam a presença de alcaloides em sementes como uma
estratégia para enfrentar a herbivoria.
30
CONCLUSÕES
_____________________________
31
6. CONCLUSÕES
__________________________________________________________________________
De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho, é possível concluir que
as sementes de E. velutina apresentam conteúdos balanceados de reservas majoritárias,
incluindo amido, lipídeos e proteínas de reserva. As reservas minoritárias de açúcares
solúveis são utilizadas mais precocemente, a partir da emergência do hipocótilo, enquanto
que as reservas majoritárias são degradadas mais tardiamente, a partir da abertura do
gancho plumular. No entanto, amido, lipídeos e proteínas de reserva são mobilizados mais
intensamente e sincronicamente quando ocorre a expansão das folhas cordiformes,
coincidindo com o aumento da atividade de hidrolases. Dentre os metabólitos secundários
verificados ao longo do experimento, é possível constatar que há maior variedade e
quantidade destas substâncias nas sementes embebidas, indicando que os cotilédones de
sementes não germinadas são fontes mais ricas em terpenos, flavonoides, ácidos fenólicos
e alcaloides, em comparação com os cotilédones de plântulas em estabelecimento.
32
Agradecimentos
_____________________________
33
7. Agradecimentos
__________________________________________________________________________
O presente estudo foi em parte financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código 001.
34
Literatura citada
_____________________________
35
8. Literatura Citada
__________________________________________________________________________
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