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Marcadores Moleculares
Rodrigo Rocha Latado
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• Marcadores fenotípicosCaracterísticas do organismo - Ex. cor da pele, cor e tipo
de cabelo, presença de pelos, etc...
• Marcadores bioquímicosPresença ou ausência de compostos - Ex. isoenzimas,
proteínas ou de polissacarídeos específicos, etc...
• Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA -
Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas
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USOS• Testes de paternidade
• Exames genéticos - aberrações cromossômicas ou SNP´s)
para Humanos, animais, plantas e microorganismos
• Causas forenses (criminais, patenteamento)
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USOS• Estudos de fingerprinting
(impressões digitais) - Biochips de DNA
• Estudos básicos de genômica e proteômica
• Estudos ambientais (conservação de germoplasma, avaliação da diversidade genética)
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USOS
• Estudos evolucionários e populacional
• Melhoramento animal e vegetal (seleção assistida, seleção de progenitores)
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CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES
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Classificação por Tipo de Técnica
• Métodos sem uso de PCR• RFLP• VNTR
• Métodos com uso de PCR– PCR com primers arbitrários
• RAPD, AP-PCR, DAF; • Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP;• ISSR• TRAP
– PCR sítio-específico• CAPS, SCAR• SSRs (microssatélites)• TGGE, SSCP, DGGE
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Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo
• Seqüência de poucas cópias - codificante• RFLP
• Seqüência com cópias repetidas• VNTR• SSRs (microssatélites) • ISSR
• Seqüência com número de cópias indefinido • RAPD, AP-PCR, DAF;• AFLP;• CAPS, SCAR• TRAP
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MARCADORES MOLECULARES PARA
MELHORAMENTO DE PLANTAS
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• Sucesso no melhoramento de plantas depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis, dos ambientais
• Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples
marcadorescromossoma
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• Polimorfismo de DNA é resultado do acúmulo de mutações– pontual ou inserção/deleção– macro-rearranjos: translocações, inversões,
deleções
Ex. magnitude mutações pontuais:• Gene Opaco-2 : 1.933 pares de bases• 14% das bases polimorfismo• 26 fenômenos de Inserção/Deleção
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• Marcadores genéticos, quando associados a características de interesse, aumentam a eficiência de seleção
R cromossoma
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População de São Paulo9.291.000 habitantes em 2.600.000 domicílios
Como achar alguém? E se fosse Tokyo?
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Aplicações no Melhoramento
• Mapeamento genômico – Seleção Assistida por Marcadores -
MAS
• Diversidade genética e filogenia• Caracterização de germoplasma• Identificação de acessos• Seleção de genitores
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Histórico de Marcadores
1. 1970’s - ferramentas molecularesdesenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);
2. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)descrito para humanos
3. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)
4. RAPD por Rafalski et al. (1990)
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Histórico de Marcadores
5. Microssatélites em plantas por Akkaya et al. (1992)
6. AFLP por Zabeau & Vos (1993)
7. SCAR por Paran & Michelmore (1993)
8. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis
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DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES
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Marcadores Moleculares
• RFLP• RAPD, AP-PCR, DAF• PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS,
SCARs• AFLP• SNPs
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Restriction Fragment Length Polymorphism -
RFLP• RFLP examina diferenças no
tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos
• Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção
• Utiliza-se DNA celular total• Requer DNA puro, de alto peso
molecular
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Metodologia de RFLP1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos2. Separação dos fragmentos por gel
eletroforese3. Transferência de fragmentos de DNA
para filtro
Fonte: IPGRI
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Metodologia de RFLP
4. Visualização dos fragmentos de DNA– sondas marcadas (32P) ou a frio
5. Análise dos resultados– bandas analisadas para alelos e/ou
presença/ausência– diferenças em padrão de bandas reflete
diferenças genéticas
A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial
Fonte: IPGRI
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digestão
1
1
52
34
2
5
43
DNA
Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel
Separaçãoem gel
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Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose
1
2
3
4
5
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Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose
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Interpretação de resultados
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6
Sítio alvo para sonda
Sítio de restrição
Inserção
Fonte: IPGRI
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6 Kb
AHerança de RFLPs
8 Kb
B
6 Kb
F1
8 Kb
6 Kb 6 Kb
8 Kb
6 Kb
8 Kb 8 Kb
F2
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RFLP em Cana de Açúcar
1 5 10 15 20
Fonte: CEBMEG
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Vantagens e Desvantagens de RFLP
• Reprodutível• Marcadores co-dominantes• Simples
• Trabalhoso• Caro• Uso de sondas radioativas*
Fonte: IPGRI
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Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD
• Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários– 10 bases com >50% G+C
• PCR com um único primer• Método rápido para detecção de
polimorfismos• Marcador dominante• Problemas de reprodutibilidade
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RAPD
AA
Aa
aa
AA Aa aa
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Interpretação de RAPDs• Marcadores RAPD são anônimos• Dados binários (presença x
ausência)• RAPD são dominantes (AA = Aa)
• Problemas de co-migração– mesma banda, mesmo fragmento?– uma banda, um fragmento?
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RAPD - resumo
• Rápido• Simples• Baixo custo• Sem uso de radioisótopos
• Marcador dominante• Problemas de reprodutibilidade• Problemas de interpretação
Fonte: IPGRI
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RAPD - primer OPJ04 - Bananeira
1500 pb
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RAPD - Feijoeiro
OPAM13
OPY04