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Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 – Seminários em Genética e Melhoramento de Plantas

AplicaAplicaçção de novos marcadores ão de novos marcadores moleculares no melhoramento de plantasmoleculares no melhoramento de plantas

Aluno: Bruno Mello Mulato

Orientador: José Baldin Pinheiro

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP:13400-9710 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Introdução

Evolução dos marcadores moleculares

• Isoenzimas

RFLP, Minissatélites

• Marcadores de DNA

RAPD, Microssatélites, AFLP

• Marcadores de DNA baseados em PCR

SNP, arrays

• Seqüenciamento de DNA

Introdução

Comparação entre marcadores moleculares

Introdução

Novos marcadores são mais informativos?

• Simples e menor custo

• Relações de dominância

• Neutralidade

• Informatividade

• Distribuição no genoma

• Confiabilidade

Introdução

Schlötterer (2004)

Introdução

• SNP

• TRAP

• NBS

• DArT

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

• Alteração de uma única base


• mutações em células germinativas:

transmitidas às gerações seguintes

podem se fixar na população

SNPFreqüência mínima de 1%

• SNP: abundante no genoma humano, animal e de plantas

Regiões não-codificadoras: freqüência de 1 SNP a cada 31 pb1 deleção a cada 85 pb

Regiões codificadoras: freqüência de 1 SNP a cada 124 pb

Ching et al. (2002)


regiões codificadoras regiões não-codificadoras

sinônimos não-sinônimos

não conservativa conservativa


Tipo Conseqüência

SNPs não-sinônimos em regiõescodificadoras

Alteração de aminoácido na proteína, problemas na conformação protéica.

Podem alterar o splicing

SNPs em regiões promotoras oureguladoras

Podem afetar o nível, localização oumomento da expressão gênica

Úteis como marcadores

SNPs Sinônimos em regiõescodificadoras

SNPs em outras regiões


Métodos de genotipagem

• Hibridização • Primers • Ligação

Kwok, 2001


Microarray de SNP


Objetivos:

• selecionar conjunto SNPs para identificação de

cultivares de soja

• estimar potencial de utilização destes marcadores

• comparar dados SNP com SSR


• Diferenciação cultivares soja: caracteres morfológicos,

fisiológicos, bioquímicosnº cultivares + difícil distinção = Marcadores Moleculares

abundantes genoma soja• SNPs: mais robustos

automatizado; multiplex (bialélico)

Soja: 4 a 5 milhões SNPs baseado no padrão de amplificação de 280 SNPs cobrindo cerca de 76.3 kpbde seqüências em 25 genótipos diferentes.

• baixo padrão mutação: SNP – 10-8 ; SSR – 10-3


• 96 cultivares soja

Metodologia

cultivares coreanas cultivares modernos Am. Nortecultivares ancestrais Am. Norte

Representam 85% variabilidade alélica do germoplasma Am. Norte

• Extração DNA

• Busca genes interesse GenBank – desenho primers

• PCR

• Seqüenciamento

• Detecção SNPs (PolyBayes SNP)

• Mapeamento SNPs

• Seleção 58 SNPs


• Seleção primária de 40 SNPs de acordo com diversidade

Distribuição da diversidade dos SNPs

Diversidade dos SNPs

Núm

ero

de S

NP

s

181614121086420

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6


mais similares

mais distintas


• Seleção 23 SNPs distribuídos por 19 GLLocos Grupos de Diversidade

ligação do SNP


nº genótipos nº genótipos nº genótipos Freqüência genótiposdistinguíveis indistinguíveis indistinguíveis

50 50 0 0100 100 0 0500 500 0 0

1,000 1,000 0 01,500 1,500 0 02,000 2,000 0 02,200 2,200 0 02,500 2,497 3 0.12

Conjunto 23 SNPs selecionados

gerados

SNPs selecionados

nº genótipos nº genótipos Freqüência genótiposdistinguíveis indistinguíveis indistinguíveis

50 0 099 1 1.01

494 6 1.21981 19 1.90

1,452 48 3.201,888 112 5.602,075 125 5.702,355 145 5.81

Conjunto 23 SNPs aleatórios

SNPs aleatórios


• Comparação com 13 SSRs: correlação boa e significativa

Conclusões

• A seleção de um conjunto de marcadores SNP altamente informativo aumentou a eficiência na identificação dos cultivares• Os resultados obtidos com marcadores SNP foram semelhantes aos dados SSR, demonstrando a eficiência de ambos

• Facilidade RAPD

• Altamente reproduzível

• Polimorfismo abundante AFLP

• Seqüências expressas (ESTs)

TRAP (Target Region Amplification Polymorphism)

• Marcador funcional

• Ferramentas bioinformática


• Combinação primers

primer fixo: genes-alvo

primer arbitrário: literatura

GENE-ALVOPF

PAPA

• Genotipagem

Nitrato de prata

SeqüenciadorHu & Vick, 2003


Saccharum Miscanthus Erianthus

Crop Science 46:448-455 (2006)

Metodologia:

• Extração DNA - 30 genótipos• Desenho primers fixos: 6 genes-alvo (GenBank)


Objetivo: verificar o potencial dos marcadores TRAP em acessar a diversidade genética no germoplasma de cana

5 genes envolvidos no metabolismo da sacarose

1 gene relacionado à tolerância ao frio

• 3 primers arbitrários: obtidos em literatura• PCR: 18 combinações primers• Genotipagem• Seqüenciamento


Combinação Bandas Bandas Porcentagem Primer observadas polimórficas polimorfismo

SuSy + Arbi 1 20 20 100.00 0.32SuSy + Arbi 2 32 32 100.00 0.28SuSy + Arbi 3 15 14 93.33 0.20SuPS + Arbi 1 19 17 89.47 0.33SuPS + Arbi 2 48 47 97.91 0.24SuPS + Arbi 3 29 21 72.42 0.14SAI + Arbi 1 39 34 94.87 0.26SAI + Arbi 2 28 28 100.00 0.22SAI + Arbi 3 46 40 86.95 0.21StSy + Arbi 1 41 31 75.60 0.20StSy + Arbi 2 50 41 82.00 0.24StSy + Arbi 3 28 28 100.00 0.21PODK + Arbi 1 36 31 86.11 0.27PODK + Arbi 2 29 22 75.86 0.36PODK + Arbi 3 32 27 84.37 0.29CPDK + Arbi 1 29 29 100.00 0.11CPDK + Arbi 2 21 19 90.47 0.25CPDK + Arbi 3 58 48 82.75 0.23Total 600 529Média 33.33 29.38 88.14 0.24

PIC

88% bandas


0,36 0,51 0,65 0,79 0,94

SrSrSoSsiSbSrSbDwDwHyHySoCuCuCuCuSrSoSrCuSoSspSspSspSspSspSspSspMiEr

Grupo 2Mi – MiscanthusEr – ErianthusSsp – S. spontaneum

Grupo 1

So – S. officinarumSsi – S. sinenseSb – S. barberiSr – S. robustumDw – MutanteHy – HíbridoCu – Cultivar


S. espontaneum

S. officinarumS. robustumS. barberiS. sinenseCultivares Híbridos

ErianthusMiscanthus


Conclusão

• TRAP foi eficiente em acessar a diversidade genética do germoplasma de cana;

• permitiu distinção dos 3 gêneros;

• BLAST apresentou similaridade com genes-alvo em outras sp (ex. sorgo, milho, citronela)


Perspectivas

• Mapeamento de QTL

• Diversidade genética

• Busca genes-alvo

• Caracterização e manejo de germoplasma

• SAM

NBS (Nucleotide-Binding Site)

Melhoramento de Plantas

Obtenção de cultivares resistentes à patógenos

Melhoramento clássico Seqüenciamento

Genes de resistência (genes R)


Identificação de genes R

• Diferentes tipos de genes R

• Família NBS-LRR

• Mecanismo de defesa em plantas

ATP reconhecimento de virulência


• Marcadores moleculares

• Primers degenerados

• Análogos de genes de resistência (RGAs)

Genes R

• Regiões altamente conservadas


• Marcador funcional

• Multilocos

• Dominante


Lactuca sativa

Hordeum vulgareSolanum tuberosum

Lycopersicon esculentum


Metodologia

• Digestão do DNA

• Ligação dos adaptadores

• Amplificação: primers âncora e específico

• Genotipagem

• Seqüenciamento

• Blast


nº bandas sequenciadas nº bandas com (nº enzimas) homologia à RGAs

NBS2 12 (4) 8 3 1 (retrotransposon)NBS5 25 (4) 22 2 1 (proteína quinase)NBS7 6 (3) 3 1 proteína quinase; 5S rDNA

Não identificado Outros genes

Tabela 1. Similaridade das bandas seqüenciadas com genes R e RGAs

nº Primer Similaridadebanda Enzima (nº nt)

Batata 51 NBS3/Rsa I NL27 ( batata) 92% (100) Synchytrium endobioticum (Schilb.) PercBatata 162 NBS5/Hae III Hero (tomate) 87% (270) Globodera pallida (Stone) BehrensTomate 107 NBS5/Mse I Mi ( tomate) 99% (308) Meloidogyne incognita (Chitwood 1949)Tomate 118 NBS2/Rsa I Mi (tomate) 93% (270) Meloidogyne incognita (Chitwood 1949)Tomate 251 NBS5/Rsa I Hero (tomate) 92% (229) Globodera pallida (Stone) BehrensTomate Le 8.6 NBS2/Rsa I Prf (tomate) 100% (278) Pseudomonas syringae (van Hall 1902)Tomate Le.1.2 NBS2/Rsa I I2C2 (tomate) 100% (300) Fusarium oxysporum f.sp. lycopersiciCevada 89 NBS5/Rsa I PIC25 (cevada) 98% (281) Puccinia graminis Pers.Alface 5.04 NBS5/Rsa I RCG2 (alface) 80-90% (200) Bremis lactucae Regel

Resistência contraEspécies Homologia

Tabela 2. Bandas NBS-Profiling com alta similaridade a genes R e RGAs


Figura 1. Alinhamento da seqüência de aa traduzidos das bandas obtidas com NBS5. Área cheia: motivo de aa típico dos domínios NBS-LRR dos genes de R. Área tracejada: primer NBS5.


Figura 2. Alinhamento da seqüência de aa traduzidos das bandas obtidas com NBS2. Área cheia: motivo conservado P-loop do gene R, flanqueado pelo primer NBS2.


Cevada Alface Tomate

Figura 3. Padrão NBS utilizando primer NBS5 e enzima RsaI em cevada (A), alface (B) e tomate (C). Setas: bandas que se mostraram idênticas ou muito próximas dos genes R e RGAs conhecidos e mapeados.


Conclusões

• NBS foi eficiente em gerar marcadores próximos a genes R

• Pode ser utilizado em diferentes espécies

• Importante ferramenta: estratégia de melhoramento

caracterização germoplasma

estudos de biodiversidade

DArT (Diversity Arrays Technology)

• Dependentes de gel

• Pré-identificação de polimorfismo

• Dificuldades em relacionar bandas em gel

Métodos de Genotipagem

• Trabalhosos e lentos


• Plantas de pouco retorno econômico

• SNPs

• Custo proibitivo

• Recursos financeiros limitadosManihot esculenta


• Comparação de representações genômicas

• Não necessita seqüências

• Independência de géis

• Genomas de qualquer tamanho

• Baixo custo


Metodologia

• Métodos de redução de complexidade

Enzimas de restrição (ER), digestão, adaptadores, PCR

Representações

• Biblioteca Genômica

• Microarrays


Metodologia

• Construção de Painéis de Diversidade

• Marcação por fluorescência

• Hibridização

• Análise da imagem


• Perfis genéticos


Objetivos:

• testar a metodologia em cevada, uma planta de genoma complexo.

• gerar e analisar a qualidade do mapa genético

PNAS, 29 de Junho, 2004 VOL 101 n°26 9915-9920


Objetivos:

• relações genética entre cultivares de trigo.

• mapa integrado de DArT, SSR, RFLP,AFLP e STS


Objetivos:

• Analisar a diversidade genética entre diferentes acessos do gênero Mahinot


Perspectivas

• Caracterização de germoplasma

• SAM

• Genes alvos

• Mapas Genéticos

• QTLs

Obrigado!

[email protected]

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