Profa. Renata Faier Calegario

Profº Bruno Portela Brasileiro

Marcadores Moleculares

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

Marcadores genéticos

• Marcador: função de identificar ou etiquetar;

• Marcadores genéticos: marcar alelos cuja expressão seja de difícil identificação;

• Selecionar o alelo de interesse de forma indireta, por meio do marcador;

Marcadores genéticos

• Deve ser herdável e de fácil avaliação;

• Deve estar intimamente ligado ao alelo que deseja-se selecionar;

• Estudos de divergência genética, teste de paternidade, seleção etc.

• Marcadores genéticos:– Morfológicos;

– Moleculares.

Marcadores moleculares

• Década de 70: engenharia genética (biologia molecular);

• Marcadores moleculares:

– Proteínas (produtos diretos dos alelos);

– DNA (seqüências de DNA situadas próximas aos genes que queremos marcar).

Características que permitem a distinção de indivíduos

geneticamente diferentes

Marcadores

(BORÉM, 1997).

INTRODUÇÃO

Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares

Marcadores Genéticos

Melhoramento Genética

mendeliana

Genética de

populações

Genética

molecular Organização do

genoma

Sequenciamento

Transferência

gênica

Aplicações: diversas áreas do conhecimento

Constituição genética de um organismo

=> o conjunto de genes

Fenótipo

Características visíveis de um indivíduo

Sofre influência:

• Genótipo

• Fatores ambientais

Genótipo

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

DiplóideHaplóide

Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos

Local ocupado pelo

gene no cromossomo

Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo

Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene

em ambos os cromossomos homólogos

Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene

em ambos os cromossomos homólogos

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

Gene Recessivo (a)

• Só manifesta o fenótipo

quando em homozigose (aa)

• Presente em dose dupla

(dois alelos iguais)

Gene Dominante (A)

• Manifesta o mesmo

fenótipo em homozigose

(AA) e heterozigose (Aa)

DOMINÂNCIA

A1A1 A1A2 A2A2

Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose

MARCADORES “ DOMINANTES”

=> exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto

2 alelos recessivos no mesmo

loco: Ausência de banda – só

amplifica locus com alelos

dominantes

A1= alelo dominante

Presença de bandas

A1A1 A1A2 A2A2

Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose

MARCADORES “ CO-DOMINANTES”

=> Expressão de ambos os alelos no heterozigoto

Genes no mesmo

locus

Monomorfismo e Polimorfismo

✓ Marcadores MorfológicosCaracterísticas fenotípicas do organismo

Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala

✓ Marcadores BioquímicosPresença ou ausência de compostos

Ex. isoenzimas e proteínas

✓ Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA

Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas

TIPOS DE MARCADORES

CONCEITO DE MARCADOR dominante e co-dominante

Dominante Co-Dominante

Tipos de Marcadores

✓Reprodutibilidade

✓Amplamente distribuído através do genoma

✓Poder de discriminação

✓Ausência de influências ambientais

✓Barato

✓Fácil de mensurar

CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR

✓ Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA

✓ Características polimórficas herdáveis que refletem

diferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos

MARCADORES MOLECULARES

Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade

Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene

expresso ou de um segmento específico de DNA

APLICAÇÕES

✓ Diversidade genética de organismos

✓Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de

qualquer outra variedade da mesma espécie

✓ Análise da pureza genética de semente

✓Mapeamento de genes e características (associação do marcador

com os genes de interesse)

✓Seleção de genitores

✓ Retrocruzamento assistido...

MARCADORES MOLECULARES

• Não sofre influência do ambiente

• Neutros em relação a efeitos fenotípicos

• N° ilimitado de marcadores e de polimorfismo

• Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta

• Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis

Vantagens

• Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos

Desvantagens

Enzima de restriçãoEnzima de restriçãoPCR

TermocicladorPCR

TermocicladorEletroforese

TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL

Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares

EletroforesePCR

Enzimas de Restrição

DNA ligase

Técnicas para obtenção de padrão polimórfico de DNA

• Marcadores baseados em PCR

– PCR (Reação da polimerase em cadeia).

– RAPD

– ISSR

– Microssatélites

– Minissatélites

– AFLP, etc.

PCR - REPLICAÇÃO IN VITRO

Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S, Scharf, SJ,

Higuchi, R, Horn, GT, Mullis, KB & Erlich, HA.

1988. Primer-direct enzymatic amplification of

DNA with a thermostable DNA polymerase.

Science. 239: 478-494.

•NOBEL

PCR - REPLICAÇÃO IN VITRO

•Promove a síntese específica de certos

segmentos do DNA genômico;

•Necessidade de síntese de primers;

•Cada molécula produz duas moléculas filhas

idênticas a cada ciclo (2n).

PCR

- Pequena quantidade de DNA genômico (10ng);

- Solução tampão contendo magnésio;

- Dois primers específicos;

- dATP, dTTP, dCTP, dGTP;

- DNA polimerase.

DNA Polimerase

• DNA polimerase comum (E. coli);

• Taq polimerase (bactérias termofílicas –Thermus aquaticus);

• Possibilidade de automação do processo;

• Surgimento de várias metodologias para detectar marcadores moleculares do DNA.

PCR - Termociclador

• 940 separação das fitas de DNA (desnaturação);

• 550 os primers pareiam aos sítios que flanqueiam a

região a ser amplificada;

• 720 a enzima DNA polimerase estende o primer, ou

seja, adiciona nucleotídeos ao terminal 3’-OH dos primers;

• Depois de 40 ciclos (1 a 4 h);

• Região amplificada pode ser visualizada em gel de eletroforese.

Técnica da PCR

Consiste na síntese in vitro de fragmentos de DNA;

Reagentes e moléculas utilizadas:

- DNA a ser amplificado;

- Primers;

- DNTps;

- Taq DNA polimerase;

- Co-fatores necessários para a síntese;

Técnica da PCR

Termociclador;

Ciclos ( 40);

Eletroforese;

Luz U.V.;

TERMOCICLADOR

Polimerização de DNA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

5’

5’3’

3’

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

|||||||

5’3’

ATGCTTC5’ 3’

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

TTT T

T T

T

T

T

T

T

G

G

GG

G

G

G

G

G

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

|||||||||

5’3’

ATGCTTC5’ 3’

A

A

A

A

AA

A

A

A

A

TTT T

T T

T

T

T

TT

G

G

GG

G

G

G

G

G

C

C

C

CC

C

C

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||

5’3’

ATGCTTCTG5’ 3’

A

A

A

A

A A

A

A

A

A

TT

T

T

T T

T

T

T

T

T

G

G

GG

G

G

G

G

G

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

|||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCT5’ 3’

A

A

A

A

AA

A

A

A A

T TT

T

TT T

T

T

TT GG

GG G

G

G

G G

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

|||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCT5’ 3’

A

A

A

A

AA

AA

A

A

T

TT

T

TT

T

T

T

TT

G

G

GG

G G

G

G

G

C

C

C

CC

CC

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA5’ 3’

A

A

A

A

A

A

AA

A

A

TT

T

TT

T

TT

TT

T

G

GG

G

GG

G

GG

CCC

CC

C

C

CC

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT5’ 3’

A

A

A AA

A

AA

A

A

TT

T

T

TT

TT

T T

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GG

G

GG

G

GG

C

C

CC

C

C

C

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG5’ 3’

A

A

AA

A

A

AA

A

AT

TT

TT

TT

T

TT

T

G

GG

G

GG

G

GG

C

CC

C

C

C

C

C

C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT5’ 3’

A

A

A

A

A

A

AA

A

A

T

TT

T

T

TT

T

T

TT

G

G

G

G

GG

G

GG

C

C CC

C

CC

CC

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT5’ 3’

A A

A

A

AA

AA

A

A

TT

T

T

T

TT T

T

T T

G

G

G

G

G

G

G

G

G C CCCC

C C

CC

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT5’ 3’

A A

A

A

A

A AA

A

A

T

TT

T

T

T T

TT

T T

G

G

G

G

GG

G

GG

C CCC C

CC

C C

C

C

Polimerização de DNA

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

5’3’

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT5’ 3’

AA

A

A

A

AAA

A

A

T

TT

T

T

TT

TT

TT

G

G

G

G

GG

G

GG

CC CCC

CC

CC

C

C

AFLP

Restrição e

Hibridização de

sequências DNA

PCR

PCR + restrição...

CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES

RFLP

RAPD, Microssatélites

=> Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo

A partir 1980...

Marcadores isoenzimáticos

• Marcadores de proteína mais utilizados são representados pelas isoenzimas (esterase, fosfatase, peroxidase etc);

• Como são produtos diretos dos alelos, basta identificá-los para selecionarmos os indivíduos com o fenótipo desejado;

• Possuem reduzida variabilidade (polimorfismos);

Marcadores isoenzimáticos

• Os alelos responsáveis pelas proteínas facilmente identificáveis não ocorrem em número suficiente para marcar um grande número de alelos de interesse.

• Ex. Em cevada– Isoenzima esterase para selecionar plantas

resistentes ao vírus do mosaico amarelo.

• Vantagem: menores custos.

Restriction Fragment Length Polymorphism

Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição

✓ Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição

✓ Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA

✓ Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção

✓ Requer conhecimento sequência

RFLP

RFLP

Southern

Blot

Hibridização

Planta, fungo, organismos...

1 . DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos

2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose)

3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda

4. Visualização dos fragmentos na membrana

▪ sondas marcadas (32P) ou Fluorescência

5. Análise dos resultados

▪ presença/ausência de bandas

▪ diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada

RFLP - METODOLOGIA

Southern blot

ANÁLISE DOS RESULTADOS

RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate

Fonte: Mello et al., 2007.

Fragmentos que hibridizarem com a

sonda

+ + + + + +T T T T T T

+ Grupo 16 SrIII

118

194234

271 281

603

872 1078 1353

pb

310

Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9

Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4

Eletroforese do DNA cortado

com enzima de restrição

Gel revelado com EtBr => UV

Visualização de arraste contínuo

de fragmentos de DNA

Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética

=> representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético

✓ Trabalhoso

✓ Caro

✓ Uso de sondas radioativas

RFLP

✓ Reprodutibilidade

✓ Marcadores co-dominantes

✓ Simples

Vantagens

Desvantagens

Random Amplification of Polymorphic DNA

Fragmentos de DNA amplificados por PCR

✓ Método mais rápido para detecção de polimorfismos

✓ DNA genômico amplificado por PCR

✓ Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F

✓ Não requer conhecimento da sequência

✓ Marcador dominante

RAPD

1 . DNA é amplificado via PCR com primer aleatório

=> Gera fragmentos pequenos

2. Separação dos fragmentos por eletroforese

5. Análise dos resultados

▪ presença/ausência de bandas

▪ diferenças em padrão de bandas reflete diferenças

genéticas

RAPD - METODOLOGIARAPD - METODOLOGIA

A

A B

B

RAPD - METODOLOGIA

DNA

✓ Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos)

✓ Quando se anela em direções opostas = Amplificação

✓ Anelamento em pequenas distâncias

PRIMERS ALEATÓRIOS

Vários Fragmentos

Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum

RAPD - Feijoeiro

marcador

ligado à Co-1

Resistentes à

raça 65

Fonte: Moura, 2005

550 pb

1000 pb

1200 pb

• Rápido e simples - não envolve hibridização

• Baixo custo

• Sem uso de radioisótopos

• Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA

Fonte: IPGRI

RAPD

Vantagens

Desvantagens

• Marcador dominante

• Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são

conhecidos

• Problemas de interpretação: co-migração

- mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro!

- uma banda: um fragmento? Pode ser dois!

• Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em

tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto

Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC

Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC

Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC

Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC

MICROSSATÉLITES

• Amplificadas por PCR

• Marcador Co-dominante

• Classe de marcador com maior grau de polimorfismo

• Requer conhecimento prévio da sequência

Sinonímias

• SSR (Simple Sequence Repeats);

• STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

• SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???

• Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)

• Plantas: (AT)n

• Mitocôndrias

• Cloroplastos

MICROSSATÉLITES

MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA

1 . Digestão DNA – Enzimas de Restrição

2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor

3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por

hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas)

4. Sequenciamento dos clones

5. Desenho dos primers

M

homozigotoheterozigoto

M

homozigotoheterozigoto

Marcador Co-dominante

MICROSSATÉLITES

Gel de poliacrilamida

=> Perceber diferenças de nucleotídeos

CACACA

GTGTGT

CACACA

GTGTGT

(CA)3

(CA)3

Amostra 1 Amostra 3Amostra 2

DETECÇÃO DE LOCUS SSR

Simple Sequence Repeats = Microssatélites

Homozigoto Heterozigoto Homozigoto

MICROSSATÉLITES

cada “ilha” microssatélite

constitui um locus,

multialélico

Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo

diferente do mesmo locus

Marcador multialélico

Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus)

MICROSSATÉLITES

Marcador Molecular com maior conteúdo de informação

de polimorfismo

MICROSSATÉLITES

Vantagens

• Reprodutibilidade

• Requer pequena quantidade de DNA

• Baixo custo

• Grande poder de resolução

• Alto nível polimorfismo – útil para germoplasmas aparentados e de

baixa variabilidade

Desvantagens

• Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers

aleatórios)

• Trabalhoso

• Porém: uma vez desenvolvido é fácil

• Caro

Atributos

Isoenzimas

Proteínas

de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatélites

AFLPs

Nível de

Polimorfismo

baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto

Estabilidade

ambiental

moderada alta alta alta alta alta

Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto

Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante

Número de alelos por

loco

2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2

Distribuição no

genoma

regiões de cópia

única

regiões de cópia

única

várias ao acaso ao acaso ao acaso

Acessibilidade

tecnológica

muito alta muito alta média muito alta muito baixa média

Aplicabilidade no

melhoramento

rápido,

baixo custo

rápido,

baixo custo

lento,

custo médio

rápido, baixo

custo

lento, custo alto rápido, custo

baixo

Identificação de

genótipos

baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta

Avaliação de

germoplasma

média baixa alta alta alta muito alta

Mapeamento

genético

baixa muito baixa alta alta muito alta alta

Mapeamento de

regiões específicas

baixa inadequado média muito alta média muito alta

Mapeamento

comparativo

baixa inadequado muito alta baixa alta baixa

Genética de

Autógamas

baixa baixa média alta muito alta muito alta

Genética de

Alógamas

média baixa média alta muito alta muito alta

Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média

Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

Marcadores de DNA

• Exemplo: Espécie humana– Estimativa: 2.900.000.000 pares de

nucleotídeos;• Em cada 100 nucleotídeos um deve ser diferente

(polimórfico);

• Espera-se 30.000.000 de pares de nucleotídeos diferentes quando se comparam dois indivíduos tomados ao acaso na população.

Distâncias e Dissimilaridades

DISSIMILARIDADE utiliza dadosbinários para o cálculo, ou seja,marcadores dominantes. É o complementoda similaridade (Dis= 1- Sim), é um índicede divergência.

DISTÂNCIA utiliza freqüências alélicaspara seu cálculo, ou seja, marcadorescodominantes. Utilizam-se de conceitosgenéticos e/ou geométricos.

Medidas de Dissimilaridades

Objetivo: representar o grau de divergência

entre diferentes populações ou indivíduos.

Os marcadores são interpretados como

dados binários (1 e 0) presença ou

ausência da banda.

Principais índices:

- Jaccard

- Simple Matching (Coincidência simples)

- Dice (Sorensen ou Nei-Li)

Distâncias genéticas

• Marcadores codominantes (RFLP, SSR, isoenzimas) discriminam o genótipo heterozigoto do homozigoto e se prestam ao cálculo das frequências alélicas.

• Distância genética de Nei, Rogers e Reynolds

• TFPGA, GDA, NTSYS, ARLEQUIM...

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Medidas de Similaridades

Medidas de Similaridades

Medidas de Dissimilaridades

Matriz de Similaridade

Distância genética de Nei

Calculando a distância

Arquivo marcador codominante

Distância Nei: Loco 1

Distância Nei: Locos 1, 2 e 3

Análise de Agrupamento

Construção de dendrogramas;

Análise de Agrupamento

UPGMA (Unweighted Pair Grouping

Method with Aritimetical Means) – entre

populações e entre indivíduos/populações.

Correlação cofenética

A análise de correlação tem como objetivo determinar o grau de relacionamentoentre duas variáveis, isto é, a covariabilidade entre elas.

n

i

i

n

i

i

i

n

i

i

xy

YYXX

YYXX

YVXV

YXCovR

1

2

1

2

1,

Algumas observações importantes devem ser feitas em relação ao coeficiente decorrelação:

- O coeficiente de correlação é adimensional.

1110 2 xyrer

- Um coeficiente de igual a zero não implica falta de relação entre duas variáveis,apenas reflete a ausência de relação linear entre essas variáveis.

X2

X1

X1

X2 X2

X1 X1

X2X2

X1

Considerando que os resultados dos agrupamentos sofrem acúmulo de erro a cadaciclo de inclusão de um indivíduo, isto se reflete na construção do dendrograma,conduzindo a interpretações distorcidas dos resultados obtidos.

Em que:

Cij = valor de similaridade entre os indivíduos, obtidos a partir da matriz cofenética; e

Sij = valor de similaridade entre os indivíduos, obtidos a partir da matriz desimilaridade.

019.1618.1212.419.1039.13

033.1906.1750.744.6

029.1604.1219.13

053.1274.15

023.3

0

F

E

D

C

B

A

FEDCBA

D

063.2660.1712.463.2663.26

063.2663.26216.8216.8

060.1763.2663.26

063.2663.26

023.3

0

F

E

D

C

B

A

FEDCBA

D

Matriz dissimilaridade

Matriz cofenética

Rolph (1992) considera a partir do coeficiente de correlação cofenético:

Muito bom: r 0,9;

Bom: 0,8 r < 0,9;

Ruim: 0,7 r < 0,8; e

Péssimo: r 0,7.

Há que se ressaltar que um baixo coeficiente de correlação cofenético nãosignifica que o dendrogama não tem utilidade; apenas indica que algumadistorção deve ter ocorrido.

BIBLIOGRAFIA

1. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares

Viçosa, MG, 2006

2. Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados

a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA

Cerrados, Planaltina , DF, 2007.

3.http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-

extras/marcadores-moleculares/