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5/6/2018 Manual Tecnicas - Usp - slidepdf.com

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LABIOCEL 1

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA

MANUAL DE TÉCNICAS EM HISTOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR DO

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR DA FACULDADE DE MEDICINA DA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CONSOLIDAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

2002



LABIOCEL 2

ÍNDICE GERAL

Apresentação

Protocolo para obtenção e fixação de material a ser

processado no Laboratório de Biologia Celular

I. Preparo de soluções

1. Cálculos

2. Instruções gerais

3.Soluções mais usadas

II. Tampões

III. Microscopia de luz

1. Técnicas de Fixação

2. Descalcificação

3. Inclusão em Parafina

4. Microtomia

5. Preparação de lâminas e colagem de cortes

6. Digestões enzimáticas

7. Colorações (técnicas de uso corrente)

IV. Métodos histoquímicos

1. Metais e ânions

2. Detecção de radicais químicos em proteínas

3. Lípides

4. Polissacarídeos

5. Ácidos Nucleicos

6. Grânulos citoplasmáticos

7. Fibras da matriz extracelular



LABIOCEL 3

V. Historesina

VI. Processamento de Material para Microscopia Eletrônicade Transmissão

VII. Uso do Microscópio Eletrônico

VIII. Revelação e Ampliação de Micrografias

IX. Arquivos e Registros no Laboratório de Biologia

Celular

X. Guia de Trabalhos Práticos



LABIOCEL 4

Apresentação

Este texto não pretende ser enciclopédico; assim reune, de forma sistemática, a descrição

de apenas aqueles procedimentos que são utilizados rotineiramente no Laboratório de Biologia

Celular (LIM/59) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo.

Levou-nos a tomar a iniciativa de redigir este manual o fato de que os muitos profissionais

das diversas áreas de saúde que fazem estágios no nosso Laboratório utilizam grande parte do seutempo para copiar nos seus cadernos pessoais as descrições dos procedimentos que utilizamos

rotineiramente e nos quais solicitaram ser treinados. Com o objetivo de que possam aproveitar o

estágio mais racionalmente, deliberamos que seria mais apropriado fornecer a eles um texto que

reúna a descrição de todas as técnicas e assim lhes permita concentrar-se preferencialmente no

desenvolvimento de habilidades em lugar de desperdiçar tempo em longas sessões de transcrição

manuscrita de receitas.

Sugere-se ao leitor que, ao consultar o texto na busca de uma informação, tenha o cuidado

de ler toda a seção do capítulo correspondente. No processo de redação tentou-se evitar

repetições; assim, pode existir alguma informação essencial em itens complementares, logo acima ou

abaixo do assunto procurado.

Esta versão preliminar certamente poderá ser aperfeiçoada com o tempo, através da

experiência do seu uso e das sugestões que vierem, tornando-a mais sucinta e de melhor

apresentação. Assim, esperamos contribuições para seu aprimoramento.

Profa. Dra. Elia Garcia CaldiniChefe do Laboratório de Biologia Celular



PROTOCOL 1

PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO E FIXAÇÃO DE MATERIAL A SER PROCESSADO NO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR

CUIDADOS:

Tanto para microscopia de luz quanto para microscopia

eletrônica, deve-se tomar cuidado com:

1) não deixar o material secar enquanto está sendo

recortado.

2) usar sempre uma gilete nova para recortar o material.

3) o volume do fixador deve ser, pelo menos, 20 vezes

maior que o volume do fragmento a ser fixado.

1. MICROSCOPIA DE LUZ

O material deverá ser fixado em paraformaldeído a 4% em

tampão fosfato. Este fixador poderá ser obtido no

Laboratório de Biologia Celular.

O material deverá ter, pelo menos um dos lados, com, no

máximo, 3 mm de espessura, podendo ter a forma de um

paralelepípedo. Assim, o fixador poderá penetrar no

interior do fragmento.

O material deve ser deixado no fixador por, no mínimo, 24

horas e, no máximo, 48 horas, devendo ser então colocado

no álcool 70 ou ser trazido para o Laboratório de Biologia

Celular para ser processado.



PROTOCOL 2

2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA

O material deverá ser fixado em glutaraldeído a 2% em

tampão fosfato 0,15M em dois frascos, sendo que, em um

deles, deve-se dissolver ácido tânico 0,1% no

glutaraldeído.

O glutaraldeído deve ser guardado congelado até a hora da

cirurgia. Na hora de usar, em um dos frascos colocar o

ácido tânico pesado na quantidade apropriada e, antes de

colocar o glutaraldeído, etiquetar os frascos

GLUTARALDEÍDO e GLUTARALDEÍDO COM ÁCIDO TÂNICO.

Pouco antes de usar, descongelar o glutaraldeído apenas

com o calor da mão e colocá-lo, na quantidade apropriada

nos frascos.

O material deve ter, pelo menos um dos lados, com, no

máximo, 1 mm de espessura. Aconselha-se a fazer com forma

de um paralelepípedo de 10 mm x 1 mm x 1 mm.

A fixação deve durar 2 horas. Deve-se anotar a hora em que

o material foi colocado no fixador e entregá-lo no

Laboratório de Biologia Celular antes de completar o tempo

de fixação; se isto não for possível, deixar o material na

geladeira (não no congelador) e entregá-lo ao Laboratório

o quanto antes. Isto é essencial, pois cada minuto a mais

no fixador contribui para piorar a qualidade do material.

Entrar em contato conosco pelo telefone (852.2188 ou

851.4011 ramal 241) para combinar horário de entrega.



PROTOCOL 3



PREP-SOL 1

I. PREPARO DE SOLUÇÕES

1. CÁLCULOS

1.1. CÁLCULO DA NORMALIDADE DE UM LÍQUIDO (ml/l)

PESO MOLECULAR1N= -------------------------------------

VALÊNCIA x PESO ESPECÍFICO x concent.(densidade) (%)

Ex.: Ac. Sulfúrico:98,078

1N = ------------------ = 28,032 ml/litro2 x 1,83 x 0,96

1.2. CÁLCULO DA MOLARIDADE

1M = 1 mol/l = P.M./1 litro

1.3. CÁLCULO PARA DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES

Ex: para obterem-se 100 ml de solução 0.15M a partir deuma solução estoque 1M.

Deve-se, primeiro, dividir a molaridade da soluçãoestoque pela molaridade da solução desejada. O resultadorepresenta o número de diluições.

1M/0.15M = 6.66

Em seguida, deve-se dividir o volume desejado pelo númerode diluições.

100 ml/6.66 = 15,01

Portanto, necessita-se de 15,01 ml da solução estoque 1M e84,99 ml de água para obter-se 100 ml da solução a 0.15M.



PREP-SOL 2

2. INSTRUÇÕES GERAIS

- Em qualquer solução que envolva a mistura de ácido e

água, deve-se sempre ter o cuidado de jogar o ácido naágua.

- As diluições não alteram o pH de uma solução; o que sealtera quando se dilui uma solução é a sua molaridade.

3. SOLUÇÕES MAIS USADAS:

3.1. SOLUÇÃO SULFOCRÔMICA (PARA LIMPAR VIDRARIA)

Bicromato de Potássio......... 50 g

Água destilada................500 mlÁcido sulfúrico conc......... 150 ml

Dissolver o bicromato de potássio na água destiladaquente. Resfriar. Colocar o balão dentro da pia cheia deágua e adicionar lentamente o ácido sulfúrico.Deixar o material a ser limpo mergulhado na solução poralgumas horas ou de um dia para outro.

3.2. PREPARO DO COLÓDIO A 1%

Álcool Absoluto..............50 mlÉter Etílico.................50 mlCeloidina em pó...............1 g

3.3. NaOH 1 NORMAL

NaOH pastilhas....................40 gÁgua destilada..................1000 ml

3.4. HCL 1 NORMAL

Ácido clorídrico comercial................82 ml

Água destilada..........................1000 ml

3.5. ÁLCOOL-ÁCIDO

Ácido clorídrico....................1 mlÁlcool 70°.........................99 ml



TAMPÃO 1

II. TAMPÕES

1. PBS (SOLUÇÃO SALINA TAMPONADA)

Cloreto de sódio............................9 gTampão Fosfato 0,1M (pH 7,2 a 7,3).......100 mlÁgua destilada............completar para 1000 ml

2. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,1M a diferentes pHs.

Solução A: solução 0,2M de fosfato de sódio monobásico(NaH2PO4H20; PM = 138,01):

27,6 g/1000 ml de água destilada.

Solução B: solução 0,2M de fosfato de sódio bibásico(Na2HPO4; PM = 141,98):

28,4 g/1000 ml de água destilada.

Misturando-se os volumes indicados na tabela abaixo ecompletando-se para 200 ml com água destilada pode-sefazer tampão fosfato 0,1M a diferentes pHs.

ml A ml B pH92,0 8,0 5,890,0 10,0 5,9

87,7 12,3 6,085,0 15,0 6,181,5 19,5 6,277,5 22,5 6,373,5 26,5 6,468,5 31,5 6,562,5 37,5 6,656,5 43,5 6,751,0 49,0 6,845,0 55,0 6,939,0 61,0 7,033,0 67,0 7,128,0 72,0 7,223,0 77,0 7,319,0 81,0 7,416,0 84,0 7,513,0 87,0 7,610,5 89,5 7,78,5 91,5 7,8



TAMPÃO 2

3. TAMPÃO VERONAL HCl

Solução A: ácido dietil barbitúrico (sal disódico) 0,2M

(PM= 206).Para obter-se a solução A, pesar 2,06 g do ácido edissolver em 30 ml de água destilada. Completar para 50 mlcom água destilada.Observação: deve-se usar sempre o ácido dietil barbitúricoe não o barbiturato de sódio, pois este não dissolve emágua.

Solução B: 0,2N de HCl (1,65 ml de HCl em 100 ml de água).

Para pH 8,8 misturar:

50 ml de A4 ml de B146 ml de água destiladaA molaridade final do tampão é 0,05M.

4. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,02M, pH 4,7 (para digestãocom papaína)

Solução A: solução 0,02M de NaH2PO4.H2O (PM= 138,01) pH

4,0:

0,276g/100 ml de água destilada

Solução B: solução 0,02M de Na2HPO4.7H2O (PM= 267,98) pH

8,0:0,536g/100 ml de água destiladaousolução 0,02M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) pH 8,0:

0,356g/100 ml

Titular uma solução com a outra até que o pH seja 4,7.

5. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,05M pH 8,9 (para digestão comtripsina)

Solução A: fosfato de sódio monobásico 1MSolução B: fosfato de sódio bibásico 1MMisturar 0,25 ml da solução A com 9,75 ml da solução B ecompletar para 200 ml com água destilada.



TAMPÃO 3

6. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO

Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09):

13,6 g/100 ml de água destilada34,0 g/250 ml de água destilada

Solução B:solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98)

17,8 g/100 ml de água destilada44,5 g/250 ml de água destiladaousolução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98)

26,8 g/100 ml de água destilada67,0 g/250 ml de água destiladaousolução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98)


6.1. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,1M; pH = 7,0 a 7,2

Solução A Solução B Completar com H2O para

28,5 ml 71,5 ml 1000 ml14,25 ml 35,75 ml 500 ml2,85 ml 7,15 ml 100 ml



28,5 ml 71,5 ml 660 ml14,25 ml 35.75 ml 330 ml04,75 ml 11,91 ml 110 ml



TAMPÃO 4



57,0 ml 143,0 ml 1000 ml28,5 ml 71,5 ml 500 ml14,25 ml 35,75 ml 250 ml5,7 ml 14,3 ml 100 ml

7. TAMPÃO TRIS-HCl pH 7,4 (para digestão com colagenase)

Solução A: TRIS 0,2M2,42 g/100 ml de água destilada

Solução B: HCl 0,1N:0,8 ml/100 ml de água destilada

Para pH 7,4 misturar:25 ml da solução A42 ml da solução B33 ml de água destilada

TRIS = hidroxi methyl-aminomethan (PM = 121,14)

8. TAMPÃO ACETATO 0,2M, pH 5,8 (para Alcian Blue +concentração eletrolítica crítica)

Solução A: ácido acético 0,2M:1,2 ml/100 ml de água destilada

Solução B: acetato de sódio 0,2M1,64 g de acetato de sódio anidro (PM = 82)/100 ml de águaou2,72 g de acetato de sódio trihidratado (PM = 136)/100 mlde água destilada.

Medir o pH da solução B e ir pingar nesta a solução A, atéatingir o pH desejado.



TAMPÃO 5

9. TAMPÃO SORENSEN pH 6,4

Solução A: solução 0,06M de KH2PO4

0,816 g/100 ml de água

Solução B: solução 0,06M de Na2HPO4.12H2O

1,074 g/50 ml de água.

Para 100 ml de tampão, misturar 70 ml da solução A e 30 mlda solução B.



III. MICROSCOPIA DE LUZ



FIXAÇÃO 1

1. TÉCNICAS DE FIXAÇÃO

O volume do fixador deve ser sempre 20 vezes maior do que

aquele da peça a ser fixada.A peça deve ter, pelo menos um dos lados, medindo 3 mm deespessura para que o fixador possa penetrar.

1.1. ACETONA-METANOL

Partes iguais de acetona e metanol.

1.2. BOUIN

Solução saturada aquosa de ácido pícrico......750 ml

Formol 36-40%.................................250 mlÁcido Acético Glacial..........................50 ml

Técnica de fixação:Fixar pedaços de até 0,5 cm de espessura em Bouin durante

24 horas (5 horas no mínimo).Lavar de um dia para o outro, em água corrente, dentro do

próprio frasco onde foi fixado. Para isto, cobrir ofrasco com uma gaze (amarrada ou presa com um elástico naborda do frasco) e colocá-lo sob a água corrente. Cuidadocom a intensidade do jato de água para não danificar omaterial.

Após a lavagem, passar para álcool 70, onde pode ser

deixado por muito tempo, se a peça não for ser emblocada.

Observações:a) Ácido Pícrico Saturado: solução aquosa de ácido pícricocom concentração de 1,4%.b) Formol 36-40% é o formaldeído líquido (como vem).c) Extração do Ácido Pícrico de peças fixadas em Bouin: sea peça fixada pelo Bouin ainda ficar muito amarela, apósser lavada em água corrente a noite inteira, deixá-la por3 horas na solução saturada de carbonato de lítio emálcool 50o. Em seguida, passar para álcool 70o, desidratare emblocar. Da mesma forma, se o corte histológico aindaestiver amarelado depois da hidratação, deixá-la algunsminutos numa solução saturada de carbonato de lítio emálcool 50o.

1.3. CARNOY II (Carnoy dos patologistas)

Etanol absoluto..............60 mlClorofórmio..................30 mlÁcido acético...............10 ml

Técnica de fixação:



FIXAÇÃO 2

Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão.

1.4. ETANOL-ACÉTICO

Álcool 95...............75 mlÁcido acético...........25 ml

Técnica de fixação:Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão.

1.5. SOLUÇÃO SALINA DE FORMOL 10%

Formol 36-40%.....................100 mlNaCl................................9 gÁgua destilada....................900 ml

Técnica de fixação:Fixar por 24 horas.

1.6. SOLUÇÃO NEUTRA FOSFATO TAMPONADA DE FORMOL

Formaldeído 37-40%.........................100 mlÁgua destilada.............................900 mlFosfato de Na monobásico (NaH2PO4.H2O).......4,0 g

Fosfato de Na dibásico anidro (Na 2HPO4)......6,5 g

Técnica de Fixação:Fixar durante 6 a 24 horas, dependendo do tamanho da peça.

1.7. PARAFORMALDEÍDO A 4% EM PBS (pH 7.0)

Tampão fosfato 0,1M...............100 mlNaCl.................................9 gparaformaldeído.....................40 g

Colocar 800 ml de água destilada para aquecer (não deixarferver). Colocar o NaCl e o tampão. Por último, dissolvero paraformaldeído. Completar para 1000 ml com águadestilada.

Técnica de fixação:Fixar o material de 6 a 24 hs.

1.8. METHACARN

Álcool metílico............60 mlClorofórmio................30 ml



FIXAÇÃO 3

Acético acético............10 ml

Técnica de fixação: Fixar por 24 horas.

1.9. GENDRE

Solução saturada de ácido pícrico em álcool 90.......85 mlFormol 40%...........................................10 mlÁcido acético.........................................5 ml

Técnica de fixação:Fixar por 4 horas.

O líquido de Gendre é um fixador para glicogênio

1.10. SOLUÇÃO DE FORMOL COM CÁLCIO

Formol 40%.........................10 mlÁgua destilada.....................90 mlCloreto de cálcio anidro............1 g

Este é um fixador ideal para estudar lípides.

1.11. CLARKE-CARNOY (Carnoy dos citologistas)

Álcool 100....................... 75 ml

Ácido acético.....................25 ml

Fixador ideal para demonstração de proteínas.

1.12. HIDRATO DE CLORAL

25 g de hidrato de cloral100 ml de álcool 50

Fixar por 24 a 48 horas.

Fixador ideal para método de Nonidez para demonstração determinações nervosas.

1.13. FORMOL BROMETADO

140 ml de formol 40%20 g de brometo de amônia1000 ml de água destilada

Fixador ideal para tecido nervoso que será submetido aalgum método de impregnação pela prata.



FIXAÇÃO 4



DESCALC 1

2. TÉCNICAS DE DESCALCIFICAÇÃO

2.1. DESCALCIFICAÇÃO PELO EDTA

Deixar o fragmento em solução de EDTA a 5% em soluçãosalina (5 g de EDTA em 100 ml de solução salina) até que adescalcificação esteja completa. Testar para verificar adescalcificação.Lavar abundantemente em água corrente antes de iniciar-sea desidratação.

EDTA = Ac. Etilediamino Tetracético Sal Bisódico; PM =372,24

2.2. DESCALCIFICAÇÃO PELO ACÍDO FÓRMICO

Solução A: solução de citrato de sódio a 20%Citrato de Sódio 20% ......50 gÁgua destilada.............250 ml

Solução B: solução de ácido fórmico 1:1Ácido fórmico a 50%.........125 mlÁgua destilada..............125 ml

Misturar partes iguais das soluções A e B. Colocar nestamistura o fragmento ósseo já fixado. Renovar a solução acada 48 horas e testar periodicamente para verificar-se adescalcificação.Após a descalcificação lave o tecido em água correntedurante 24 horas, pelo menos (para eliminar totalmente oácido), antes de iniciar-se a desidratação.Usando-se este método, a descalcificação é lenta, porémpreserva melhor as estruturas.

2.3. TESTE PARA VERIFICAR A DESCALCIFICAÇÃO

5 ml da solução descalcificante usada (que esteve emcontato com a peça durante pelo menos seis horas)5 ml de solução de oxalato de amônia a 5%5 ml de hidróxido de amônia



DESCALC 2

Agitar. Esperar 30 minutos. Se ficar turvo é porque adescalcificação da peça não está completa ainda.Caso esteja pronta, lavar a peça abundantemente antes de

iniciar-se da desidratação.

2.4. DESCALCIFICAÇÃO PELO ÁCIDO NÍTRICO

Colocar a peça em solução aquosa de ácido nítrico a 4%.

É um método muito drástico. Deve-se verificar oamolecimento da peça várias vezes.



INCLUSÃO 1

3. INCLUSÃO EM PARAFINA

3.1. TÉCNICA DE INCLUSÃO EM PARAFINADepois de completa a fixação, o material deve ser lavado,se for o caso, e deixado em álcool 70° durante duas horas,no mínimo.Fazer 3 passagens de duas horas cada uma em álcool 96°.Fazer 3 passagens de 2 horas cada uma em álcool 100° (naúltima pode deixar de um dia para outro).Fazer 3 passagens de 30 minutos cada uma em xilol.Dar um primeiro banho de parafina na estufa 60°C duranteuma hora.Dar um segundo banho de parafina na estufa (à vácuo, depreferência) durante uma hora.

Incluir o material.

Observações:a) A parafina usada nos banhos deve ser filtrada antes deser reutilizada.b) Para amolecer peças muito duras usar banhos de benzolem vez de xilol.c) Para diafanizar peças muito grandes ou muito pequenascalcular o tempo de diafanização da seguinte maneira:deixar no primeiro banho de xilol até a peça ficardiafanizada (como que transparente). Os outros dois banhosde xilol que se seguem devem ter a mesma duração desteprimeiro.

d) Para peças muito fibrosas: depois dos banhos de álcool100, dar 2 banhos com acetato amila ou éter. Em seguida,parafina + éter (1:1) a 38°C e depois parafina pura a60°C.

3.2. PREPARAÇÃO DA PARAFINA

3.2.1. PARAFINA PURA

Derreter a parafina Petrobrás na estufa, colocar paraferver, levantar a fervura três vezes, recolocar na estufae pronto.

3.2.2. FÓRMULA DR. CARDOSO DE ALMEIDA

Parafina Petrobrás 145o ....1000 ml ou 780 gEstearina.....................25 ml ou 21 gCera de abelha...............130 ml ou 104 gVaselina líquida...............2 ml

3.2.3. FÓRMULA DO BENIGNO ARROYO (ICB-USP)

parafina pura..............................800 g



INCLUSÃO 2

cera purificada............................150 gácido esteárico (ou estearina)..............50 g



MICROTOM 1

4. MICROTOMIA EM PARAFINA

4.1. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS

Deve-se limpar previamente as lâminas onde serão colocadosos cortes: retirar as lâminas da embalagem e colocá-las emuma solução de Extran a 1% em um recipiente grande. Deixarde um dia para o outro. Enxaguar em água correnteabundantemente até que o detergente tenha sido totalmenteretirado. Colocar em álcool 95°. As lâminas devempermanecer no álcool até o momento de serem utilizadas,quando então devem ser secas com uma fralda.Se as lâminas estiverem fungadas ou muito sujas, deixar demolho em soluçào sulfocrômica ou em álcool-ácido preparado

da seguinte maneira:Álcool 95 ou 100%...........1000 mlÁgua destilada................63 mlHCl..........................120 ml

4.2. OBTENÇÃO DOS CORTES

Aparar lateralmente o bloco (deve-se aparar o máximopossível, pois se ficar excesso de parafina dos lados dapeça emblocada os cortes sairão enrugados).Cortar rotineiramente com 4 a 7 µm.Com uma pinça colocar fragmentos da fita de cortes emBanho-Maria com água destilada a 45° a 50°C. Colocar asuperfície brilhante da fita em contacto com a água efazê-la caminhar sobre a superfície da água antes desoltá-la da pinça.Separar os cortes um a um usando delicadamente a pinça.Deixar os cortes no banho-maria até esticarem e pescá-loscom as próprias lâminas que devem estar perfeitamentelimpas e desengorduradas (ver "Preparação de lâminas").Depois de pescar, colocar as lâminas com os cortes naestufa a 50 a 60° para secar, durante no mínimo duas

horas, sendo que o melhor é deixá-las na estufa de um diapara o outro. Desta maneira, a parafina derrete bem e oscortes grudam satisfatoriamente na lâmina.



PREP-LAM 1

5. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS E COLAGEM DE CORTES

5.1. COMO DESPARAFINAR E HIDRATAR OS CORTES Este procedimento deve ser seguido rotineiramente, a menosque para o tipo de coloração desejada exista determinaçãoespecífica em contrário.

Passar as lâminas por:Xilol 1..........10 min.Xilol 2..........10 min.álcool 100°.......5 min.álcool 95°........5 min.álcool 70°.......10' a 15 min.Lavar em água corrente

Corar.

Observações:a) Diversos fatores (tipo de parafina, a utilização decortes obtidos há muito tempo, a dimensão do corte)influem no tempo durante o qual as lâminas devempermanecer no xilol para a retirada da parafina.Imediatamente após colocar a lâmina no álcool 100°,retirá-la e, olhando a lâmina contra a luz, certificar-sede que toda parafina foi retirada pelo xilol; se isto nãotiver ocorrido, voltar a lâmina para o xilol.

5.2. MONTAGEM DA LÂMINA APÓS COLORAÇÃO

Passar as lâminas por:

Álcool 70°.............5 min.Álcool 95°.............3 min.Álcool absoluto........3 min.Álcool absoluto........3 min.Álcool-xilol (1:1)....10 min.Xilol diafanizante.....5 min.Xilol montagem........30 min. ou maisColocar a lamínula usando o meio de montagem apropriado.



PREP-LAM 2

5.3. MODELO DE ROTULAÇÃO

Após o meio de montagem estar seco, deve-se limpar a

lâmina para retirar o excesso deste que acumulou-se nasbordas da lamínula, limpando com um pano ou lenço de papelcom xilol. Em seguida, as lâminas devem ser identificadaspor etiquetas que contenham as seguintes informações:número do bloco (correspondente ao número registrado nolivro de autópsias), identificação da espécie animal,identificação do órgão e da coloração.

corte

espécie coloraçãolamínula

número do órgãoregistro

5.4. ESMERILHAMENTO DE LÂMINAS (PREPARO DE LÂMINA FOSCA)

Com este procedimento consegue-se que uma das extremidadesda lâmina fique fosca, e assim pode-se escrever sobre elacom um lápis, facilitando sua identificação.

5.4.1. RECEITA DO PROF. JUNQUEIRA

Solução esmerilhadora:

150 g de fluoreto de amônia anidro20 ml de ácido sulfúrico150 ml de ácido fluorídrico100 ml de água destilada

Adicionar o ácido sulfúrico, em gotas, ao fluoreto deamônia agitando com cuidado. Depois adicionar o ácidofluorídrico da mesma maneira e a água por último.

Técnica: Deixar as lâminas durante 1 minuto na soluçãoesmerilhadora, retirar e lavar bem em água corrente.



PREP-LAM 3

Observações:a) É essencial adicionar os reagentes na ordem indicada.b) Não usar fluoreto de amônia hidratado.

c) Tanto para a preparação como para estocar a soluçãousar recipiente de polietileno de parede espessa, pois areação é exotérmica.d) A adição do ácido sulfúrico por gotejamento e sobconstante agitação deve ser feita para evitarempedramento.e) Lembrar e avisar ao técnico que a solução ataca vidroem geral e não apenas as lâminas.f) À medida que a solução for envelhecendo, aumentar otempo para o esmerilhamento, controlando o processoobservando a lâmina contra luz.

5.4.2. RECEITA DA CLEUSA (ICB-USP)

150 g de fluoreto de amônia30 ml de ácido sulfúrico30 ml de ácido fluorídrico75 ml de água destilada10 ml de goma arábica

Dissolver o fluoreto de amônia na água; adicionar o ácidosulfúrico gota a gota; juntar o ácido fluorídrico e a gomaarábica também gota a gota.

5.5. COLAGEM DE CORTES

Os cortes podem ser pescados em lâminas limpas (semnenhuma substância adesiva) quando pretende-se fazercolorações rotineiras e que não agridam muito o material.Caso contrário, deve-se promover a colagem do corte nalâmina, dissolvendo-se a substância colante no banho-mariaou pescando-se os cortes em lâminas previamentepreparadas.

5.5.1. GELATINA (para cortes que vão sofrer digestãoenzimática)

Gelatina em pó..................1 colher caféBicromato de potássio...........1 colher caféÁgua destilada..................200 ml

Ferver, filtrar, colocar no banho-maria e completar comágua destilada. Trocar cada duas ou três semanas.

5.5.2. GELATINA (usada rotineiramente)

0,1 g gelatina



PREP-LAM 4

0,1 g dicromato de potássio1 litro água destilada fervente

5.5.3. GELATINA (A Yara diz que esta não interfere nacoloração e que as outras interferem)

Dissolver na água do banho-maria um quadradinho de 4cm x4cm de gelatina em folha.

5.5.4. ALBUMINA (Luna, 1968)

Clara de ovo...............50 mlGlicerina..................50 ml

Misturar bem. Filtrar em uma gaze. Colocar uma pequenagota em uma das extremidades da lâmina e espalhar de umasó vez com o dedo.Atenção: a albumina cora-se com muitos corantes, interfereno resultado final e a lâmina torna-se fungada com otempo.

5.5.5. SUPER-COLAGEM PARA DIGESTÃO ENZIMÁTICA

Colar os cortes com albumina.Deixar secar e colocar as lâminas apoiadas (com os cortesvirados para baixo) sobre frascos contendo formol dentro

da estufa a 60°C durante 1 hora.Retirar os frascos de formol e deixar as lâminas secandona estufa a 37°C de um dia para outro antes dedesparafinar.Desparafinar.Deixar de um dia para outro secando na estufa.

5.5.6. SUPER-COLAGEM PARA RETICULINA.

Colar os cortes com albumina.Colocar nos vapores de formol a 60°C durante uma hora (verinstruções na receita acima).Passar pela bateria de desparafinização e hidratação:xilol 1, xilol 2 e álcool 100°.Tirar do álcool 100° e colodionar os cortes, mergulhando-os em solução de celoidina 0,5% (ou nitrato de celulose0,1%) em álcool-éter (1:1).Deixar secar coberto, à temperatura ambiente.Passar no álcool 70°, na água e proceder à coloraçãodesejada.



PREP-LAM 5

5.5.7. GELATINA PARA LÂMINAS AO CRIOSTATO (usada paradigestão enzimática e algumas reações imuno-histoquímicas)

Solução A: Dissolver 1 g de gelatina incolor em 80 ml deágua quente.

Solução B: Dissolver 0,1 g de cromo alumen [CrK(SO4)2.12H2O;PM = 499,40] em 20 ml de água.

Misturar as duas soluções, imergir as lâminas e deixá-lasenxugar verticalmente. Guardá-las no congelador dageladeira em caixas fechadas.

5.5.8. SILANE (3-aminopropyltriethoxysilane nº A-3648Sigma)

Usar lâminas perfeitamente limpas e desengorduradas.

Fazer uma solução de silane 2% em acetona pura.Mergulhar a lâmina 2 vezes nesta solução.Mergulhar a lâmina 2 vezes na acetona pura.Mergulhar a lâmina 2 vezes em água.Secar em temperatura ambiente.

5.5.9. SILANE (receita que o Gregorio deu)

Preparar uma solução de 0,5% de silane em acetona pura.

Mergulhar as lâminas nesta solução por 10 a 15 segundos.Deixar secar de um dia para o outro.Lavar em três ou mais banhos de água destilada.Secar na estufa a 60ºC.

5.5.10. COLA TENAZ

Dissolver um pouco (1 a 2 ml) de cola tenaz de rótulo azulem um recipiente com 50 ml de água. Mergulhar as lâminas.Colocá-las para secar na estufa (cerca de 15 minutos).Após a secagem as lâminas devem ficar praticamentetransparentes, senão é porque tem cola em excesso. Pode-secolocar a cola direto no banho-maria onde os cortes sãopescados.



PREP-LAM 6

5.5.11. COLÓDIO

Esta técnica permite a adesão de cortes que foram pescados

em lâminas sem nenhuma substância adesiva, possibilitandoassim submeter lâminas já prontas a processos comohidrólise, acetilação, saponificação, metilação etc., quesão muito agressivos e descolam os cortes.As lâminas devem ser colodionadas no momento adequado paracada tratamento, segundo as indicações específicas.

Preparo do colódio a 1% ou 0,5%Álcool absoluto.....................50 mlÉter etílico........................50 mlCeloidina em pó..............1 g.ou 0,5 g

No decorrer dos diversos procedimentos, o colódio deve ser

removido das lâminas, passando-as por álcool absoluto e,em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partesiguais.

5.5.12. ADESÃO POR CALOR

De modo geral, para todas as colorações sejam elasagressivas ou não (exceto para digestão enzimática, queneccesita de uma substância adesiva), os cortes resistemmuito bem se, após a desparafinização e passagem porálcool 100°, as lâminas forem colocadas para secar naestufa a 55°,por uma ou duas horas. A seguir, voltar aslâminas no álcool 100° e proceder a bateria de hidrataçãonormal.



DIG-ENZ 1

6. TÉCNICAS DE DIGESTÃO ENZIMÁTICA

6.1. DIGESTÃO COM COLAGENASE Fazer uma solução de colagenase 0,1 a 0,4% (1 a 4 mg/ml)em Tampão Tris-HCl 0,05M (pH 7,4) contendo 0,0025M (2,5mM) de NEM e 0,001M (1 mM) de CaCl2.

Para 10 ml de solução:

10 a 40 mg de colagenase3,1 mg de NEM1,1 mg de CaCl2 Dissolver estes ingredientes em 5 ml de tampão e completarcom o mesmo tampão para 10 ml.

Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C durante24 horas ou mais (testar o tempo de incubação para cadamaterial).

Observações:TRIS = hydroxymethil-aminomethan PM 121,14.NEM = N-ethyl- maleidemide PM 125,13. O NEM atua comoinibidor de outras proteases. Pode-se fazer a digestão semo NEM, caso este não esteja disponível.CaCl2 PM= 110,99.

6.2. DIGESTÃO COM ELASTASE

Fazer uma solução de 0,5 mg de elastase por ml de tampãoVeronal-HCl, pH 8,8.

Pingar a solução sobre os cortes e deixar durante 30 a 60minutos, à temperatura ambiente.Lavar em água corrente.Proceder à coloração desejada.

6.3.DIGESTÃO COM PEPSINA

Fazer uma solução de 2 mg de pepsina cristalizada por mlde HCl 0,02N (pH 1,6).Pingar sobre os cortes e proceder à digestão a 37°C,durante 15 a 60 minutos.



DIG-ENZ 2

6.4. DIGESTÃO COM RNASE

Fazer uma solução de 1 mg de RNAse por ml de água. Usar

água deionizada com pH acertado a 6,8. Acertar o pH daágua com solução de fosfato de sódio bibásico oumonobásico (dependendo do pH que está a água).

Colocar 0,5 ml de solução de RNAse sobre o corte. Incubaros cortes na RNAse a 37°C durante 3 horas. Lavar e corarcom Azul de Toluidina ou Galocianina.

6.5. DIGESTÃO COM TRIPSINA

Tampão Fosfato 0,05M (pH 8,9)......1 mlTripsina cristalizada............0,1 mg

Dissolver a tripsina no tampão, pingar sobre os cortes eincubar a 37°C por duas horas.

6.6. DIGESTÃO COM PAPAÍNA

Fazer uma solução de papaína 0,1% (1 mg/ml) em tampãofosfato 0,02M, pH=4,7, contendo 0,005M (5mM) demetabissulfito de sódio (PM=190,10) e 0,0005M (0,5mM) deEDTA (PM=372,24).

Para 10 ml de solução:

10 mg de papaína9,505 mg de bissulfito de sódio1,86 mg de EDTADissolver estes ingredientes em uma quantidade de tampãosuficiente para completar 10 ml.

Desparafinar os cortes e levá-los até água. Pingar asolução sobre os cortes e deixar à temperatura ambientepor 2 horas. Lavar durante alguns minutos na águacorrente. Realizar a coloração desejada.Sobre os cortes-controle pingar só a solução de tampão +bissulfito + EDTA.

Observação:a) Ver Guia de Tabalhos Práticos, no ítem InteraçãoColágeno-Proteoglicanos.



DIG-ENZ 3

6.7. DIGESTÃO COM AMILASE (LISON, 1960)

Fazer uma solução de amilase 0,1 a 0,5% em salina (1 a 5

mg/ml).Desparafinar e hidratar os cortes.Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C por duashoras. Os cortes controles devem ser submetidos à soluçãosalina sem a enzima.Lavar em água destilada.Corar pelo Método do PAS.

Resultado:Locais PAS positivos na lâmina controle que diminuirem ouperderem a positividade na lâmina digerida indicam

presença de glicogênio.

6.8. DIGESTÃO COM AMILASE

Amilase a 2% em solução aquosa de NaCl a 4%. Pingar asolução sobre os cortes e deixar a 37°C durante 30minutos.

6.9. DIGESTÃO COM HIALURONIDASE TESTICULAR

Fazer um solução de hialuronidase testicular 0,1% (1mg/ml) em tampão Sorensen pH 6,4.

Desparafinar e hidratar 2 cortes (A e B).Submeter o corte A à digestão enzimática, enquanto que ocorte B recebe apenas o tampão.Corar os dois cortes pelo Alcian Blue pH 2,5 ou Azul deToluidina.

Resultado: Diminuição ou perda da positividade ao AlcianBlue no corte A indica a presença de ácido hialurônico

e/ou condroitim-4 ou -6 sulfatado.



DIG-ENZ 4

6.10. DIGESTÃO COM NEURAMINIDASE

Fazer uma solução de neuraminidase 500 U/ml em água

destilada. Diluir esta solução em igual volume de tampãoacetato 0,1M pH 5,5 contendo 1% de NaCl e 0,1% de CaCl2.

Desparafinar e hidratar os cortes.Incubar os cortes com a solução enzimática, a 37° C, por16 a 24 horas. Os cortes controles devem ser incubados nomesmo tampão acetato a 0,05M.Lavar com água destilada.Corar com Alcian Blue - PAS.Montar.

Resultado:Locais menos corados pelo Alcian Blue no corte digeridoindicam a presença de ácido siálico (sialomucinas).



COLOR 1

7. COLORAÇÕES (TÉCNICAS DE USO CORRENTE)

7.1. EOSINA (usar com hematoxilina de Harris)

0,25 g de eosina amarela em pó (solúvel em água)100 ml de água destilada

7.2. EOSINA (para usar com Hematoxilina de Ehrlich)

2 g de eosina1 g de bicromato de potássio20 ml de solução aquosa saturada de ác. pícrico

20 ml de álcool absoluto160 ml de água destilada

7.3. HEMATOXILINA DE HARRIS

1 g de hematoxilina cristalizada10 ml de álcool absoluto20 g de alúmen de potássio ou de amônio200 ml de água destilada0,5 g de óxido de mercúrio (vermelho)

8 ml de ácido acético glacial (optativo)

Preparo do corante:Dissolver a hematoxilina no álcool ligeiramente aquecido,dissolver o alúmen em água aquecida. Misturar as soluçõese aquecer até ferver. Tirar do fogo e adicionarimediatamente e aos poucos o óxido de mercúrio (agitandopara não explodir).Resfriar a solução o mais rapidamente possível,mergulhando o frasco num vasilhame (ou na pia) contendoágua fria.Acrescentar o ácido acético e filtrar. Estocar em vidro

escuro. Dura cerca de 3 meses.Deve-se filtrar a solução toda vez que for usar.



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7.4. HEMATOXILINA DE EHRLICH

2 g de hematoxilina

100 ml de álcool absoluto100 ml de glicerina100 ml de água destilada10 ml de ácido acético glacial15 g de alúmen de potássio

A hematoxilina deve ser dissolvida no álcool; o alúmendeve ser dissolvido na água. Misturar as duas soluções eadicionar os outros reativos.Deixar amadurecer no sol por 1 mês.Dura muitos anos.

Observações:a) O amadurecimento pode ser apressado adicionando-seiodato de sódio, na proporção de 50 mg de iodato de sódiopara cada grama de hematoxilina; porém o corante não duramuito tempo.b) Útil para corar tecidos que estiveram expostos asoluções ácidas; assim é recomendada para corar tecidosque sofreram descalcificação ou que ficaram muito tempo nofixador.c) Usar associada à eosina preparada com bicromato depotássio e ácido pícrico.

7.5. HEMATOXILINA DE MAYER

0,2 g de hematoxilina200 ml de água destilada0,4 g de iodato de sódio10 g de alúmen de potássio10 g de hidrato cloral0,2 g de ácido cítrico

Dissolver a hematoxilina, o alúmen e o iodato na águadestilada. Isto pode ser feito a quente ou deixando de umdia para o outro à temperatura ambiente. Após a totaldissolução, adicionar o hidrato cloral e o ácido cítrico.Ferver por 5 minutos, esfriar e filtrar. Pode ser usadaimediatamente.



COLOR 3

Observação:a) Esta hematoxilina, por não precisar de diferenciaçãocom álccol-ácido, é especialmente útil como corante

nuclear nos casos em que é necessário realçar, porcontraste, algum componente citoplasmático que tenha sidodemonstrado por um corante que sofre descoloração com adiferenciação em álcool ácido (comum para outrashematoxilinas).

7.6. HEMATOXILINA-EOSINA

Desparafinar e hidratar os cortes.Corar com hematoxilina, pelo tempo desejado, conforme o

tipo e idade da hematoxilina; de modo geral: corar durante15 a 20 minutos com hematoxilina de Mayer; corar de 2 a 10minutos com a hematoxilina de Harris e corar de 2 a 10minutos com a hematoxilina de Ehrlich.Lavar em água corrente por 10 minutos.Caso necessário, proceder à diferenciação em álcool-ácido:solução alcoólica de HCl a 1% (1 ml de HCl em 99 ml deálcool 70°). Controlar a diferenciação ao microscópio atéchegar à intensidade desejada.Lavar rapidamente em água corrente, após a diferenciação.Corar pela eosina por 2 minutos.Lavar em água corrente (até que a água esteja limpa).Passar pela bateria de desidratação: passar rapidamentepelo álcool 70°, passar pelo álcool 95°, álcool 100°,xilol e montar.

Observações:a) A hematoxilina cora os núcleos primariamente emvermelho e a posterior lavagem em água corrente converte acoloração para o azul (processo de azulecimento dahematoxilina).b) O procedimento de diferenciação da hematoxilina emálcool-ácido raramente é necessário e deve ser feito nos

casos em que ocorre uma supercoloração.c) A eosina sofre diferenciação com o álcool 70°; por issoesta passagem deve ser rápida. Se, por acaso, o corteficar muito descorado ao ser passado pelo álcool 70° ,passá-lo novamente pela água e recolocá-lo na eosina. Àsvezes, é preferível pular a passagem pelo álcool 70°,colocando diretamente em álcool 95°.



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7.7. SHORR - HEMATOXILINA (para esfregaços vaginais)

Pode-se usar o corante comercial ou prepará-lo:

0,5 g de Biebrich scarlat red0,25 g de Orange G0,075 g de fast green FCF0,5 g de ácido fosfotúngstico0,5 g de ácido fosfomolíbdico1 ml de ácido acético glacial100 ml de álcool 50°

Procedimento:Fazer o esfregaço numa lâmina e colocá-la imediatamente noálcool 95° para fixação. Deixar no álcool por 15 minutos

(pode ficar até 72 horas).Lavar rapidamente em álcool 70°.Lavar rapidamente em água corrente.Corar pela hematoxilina por 30 segundos.Lavar em água corrente por 5 minutos.Lavar em álcool 90°.Corar no corante de Shorr por 5 minutos.Lavar em álcool 95°.Desidratar e montar.

Resultado:Reconhecimento das fases do ciclo estral de ratas:No diestro tardio o esfregaço aparece tipicamenteatrófico, consistindo de poucas células epiteliaispequenas, arredondadas e nucleadas, enorme quantidade depolimorfonucleares e muco.No começo do proestro decresce em muito a quantidade depolimorfonucleares e o esfregaço compõe-se principalmentede células epiteliais arredondas ou ovaladas e nucleadas.No fim do proestro predominam as células poligonaisgrandes, achatadas e com núcleo picnótico, sendo que jáexistem células anucleadas.Com a chegada do estro, o esfregaço apresenta-se

basicamente constituído por células cornificadas (célulaspoligonais, grandes, achatadas, anucleadas e acidófilas).No começo do metaestro o esfregaço constitui-se de célulascornificadas, polimorfonucleares e muco. No metaestrotardio a imagem é de muitas células epiteliais ovaladas ouarredondadas e nucleadas, associadas a polimorfonuclearese muco.A fase seguinte é o diestro, onde nota-se que o esfregaçotorna-se cada vez mais atrófico: as poucas célulasepiteliais que aparecem são pequenas, arredondadas,



COLOR 5

nucleadas e sempre acompanhadas de grande quantidade depolimorfonucleares e muco.



IV. MÉTODOS HISTOQUÍMICOS



MINERAIS 1

1. MINERAIS

1.1. VON KOSSA (para cálcio)

Solução corante:solução aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 5%

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Corar na solução de nitrato de prata, sob luz do dia forte(porém não luz solar direta), durante 10 a 60 minutos.Lavar em água destilada por 1 a 2 minutos.Deixar em água destilada, sob luz difusa, por 10 a 60

minutos(esta passagem pode ser omitida).Reduzir a prata, imergindo os cortes em solução dehidroquinona 0,5% ou solução diluída 1:3 de qualquerrevelador fotográfico, durante 2 minutos, agitando sempre.Tratar com solução aquosa de hipossulfito de sódio a 5%durante 2 a 3 minutos, para remover o excesso de prata(controlar ao microscópio).Lavar em água destilada.Contracorar com safranina O a 0,2 a 0,5%, durante 20 a 30segundos.

Montar.

Resultado: regiões contendo carbonato ou fosfato de cálcioaparecem coradas em negro; o método demonstra a presençade cálcio de maneira indireta, uma vez que, de fato, éespecífico para os íons fosfato e carbonato.

Observações:a) se os cortes estiverem descolando da lâminas,colodionar com celoidina a 1%, depois do álcool absolutode montagem, mergulhar no álcool 70° e seguir a montagem.b) a reação consiste em uma dupla troca entre o nitrato deprata e o fosfato ou carbonato de cálcio, levando àformação de carbonato e fosfato de prata insolúveis. Estescompostos são fotossensíveis e escurecem, sobre a ação daluz, formando um precipitado amarelo ou marrom. A passagempela hidroquinona serve para reforçar a cor destesprecipitados, tornando-os negros.c) o material de eleição para esta coloração é joelho derato de 5 dias de idade, pois ainda é pequeno e permitecortes sem descalcificação.



MINERAIS 2

d) se houver grande quantidade de cálcio depositado, émelhor corar pelo nitrato de prata, em bloco, antes dedescalcificar, pois deve-se remover um pouco do cálcio

para poder cortar.

1.2. AZUL DA PRÚSSIA E TURNBULL (para Fe+3 ou Fe+2,respectivamente)

Solução corante:Preparar na hora de usar:

a) para testar a presença Fe+3:solução de ferrocianeto de potássio [K4Fe(CN)6.3H2O] a 1%

em ácido clorídrico 0,5%.b) para testar a presença de Fe+2:solução de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 1% em

ácido clorídrico 0,5%.

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Deixar na solução corante por 60 minutos.Lavar em água corrente.Contracorar os núcleos com corante nuclear vermelho.Lavar em água corrente.

Montar.

Resultado: pigmentos de ferro coram-se em azul brilhante,núcleos em vermelho e citoplasma em rosa claro.

Observação:a) a fixação do material deverá ser feita em formolisotônico (preparado com salina ou PBS) ao pH fisiológico,durante 24 horas. Fixadores ácidos solubilizam os íonsferro e são, portanto, contra-indicados.b) material de eleição: baço e rim de rato ou cobaiainjetados, intraperitonialmente, com sangue, durante 6

dias, na dose diária de 1 ml de sangue para cada 100 g deanimal.



MINERAIS 3

1.3. DETECÇÃO DE TÁLIO

Solução de gás sulfídrico:

7,8 g de Na2S0,56 ml de H2SO4100 ml de água destilada

Solução de sulfeto de amônia:Solução aquosa de sulfeto de amônia [(NH4)S] saturada com

selênio preto (óxido de selênio)

Soluções estoques para revelação:Preparar:solução aquosa de goma arábica a 10% (preparada 7 a 14dias antes e agitada diariamente com um bastão de vidro)solução aquosa de nitrato de prata a 10% (mantida 14 diasno escuro, antes de usar)solução de ácido cítrico a 5%solução de hidroquinona a 2%

Solução reveladora de trabalho (líquido de Timm):100 ml da solução de goma arábica1 ml da solução de nitrato de prata2 ml da solução de ácido cítrico10 ml da solução de hidroquinona

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Tratar pela solução de gás sulfídrico por 15 minutos.Imergir na solução de sulfeto de amônia por 10 minutos.Lavar em água destilada.Passar em H2O2 a 20% até descolorir.

Colocar no líquido de Timm (solução de trabalho), durante20 a 30 minutos, no escuro. Parar a revelação quando oscortes estiverem marrons e não pretos.Lavar em água corrente.

Montar.

Resultado: depósitos de tálio aparecem como grânulosnegros.



MINERAIS 4

Observações:a) Deve-se fazer junto cortes controles, omitindo-se o gássulfídrico, o óxido de selênio ou o procedimento de

revelação.b) A prata e o mercúrio podem interferir na coloração, maspoderão ser identificados no controle sem o óxido deselênio.



RADQUIM 1

2. RADICAIS QUÍMICOS EM PROTEÍNAS

2.1. REAÇÃO PARA CITRULINA (Rogers, 1970)

Preparo da solução corante:1 g de p-dimetil-amino-benzaldeído (reagente de Ehrlich)4 ml de ácido clorídrico concentrado23,38 g de NaClágua destilada suficiente para completar 100 ml

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Colocá-los na solução corante e montar no próprio meio de

reação.Observar seguidamente ao microscópio até o aparecimento deuma coloração amarelada (demora cerca de 15 a 20 minutos).Fotografar, pois a preparação não pode ser montada demaneira permanente.

Resultado:Locais ricos em citrulina, principalmente folículospilosos, coram-se em amarelho palha.

2.2. REAÇÃO PARA CISTEÍNA (SH)

Preparo da solução corante:30 ml de solução aquosa de cloreto férrico (FeCl3.6H2O) a

1%4 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio[K3Fe(CN)6] a 1 %

6 ml de água destilada

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.

Deixá-los imersos na solução corante recém preparada, por10 minutos, à temperatura ambiente.Lavar em solução de ácido ácético a 1%.Lavar em água corrente.Montar.

Resultado: Locais ricos em radicais SH coram-se em azul.

2.3. REAÇÃO PARA CISTINA (SS)Barka e Anderson, 1963



RADQUIM 2

Preparo da solução corante:60 ml de solução aquosa de cloreto férrico [FeCl3.6H2O] a

1%20 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio[K3Fe(CN)6] a 1 %

Preparo da solução de iodoacetamida:2 g de acetamida0,5 d iodo ressublimado100 ml de água destiladaAjustar o pH para 8,5 com NaOH 1N

Preparo do tioglicolato de sódio:

5 ml de ácido tioglicólico50 ml de água destilada50 ml de NaOH 1NAjustar o pH para 8,5 com cerca de 5 ml de NaOH 1N

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Submetê-los à ação da iodoacetamida por 24 a 48 horas a37°C.Lavar em água destilada.Deixar na solução de tioglicolato de sódio por 4 horas.

Lavar em solução de ácido acético 1% por 2 minutos.Colocar na solução corante recém-preparada por 10 minutos,no escuro.Lavar demoradamente em água corrente (cerca de 15minutos).Montar.

Resultado: locais em que houve a redução dos grupos SSaparecem corados em pink, vermelho, lilás e azulado.

2.4. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS BÁSICAS EM GERAL

Solução corante:naphtol yellow S...............1 gácido acético..................1 mlágua destilada...............100 ml



RADQUIM 3

Solução metiladora:HCl 1N...................0,8 mlálcool metílico...........100 ml

Procedimento:Desparafinar, levar até álcool absoluto e colodionar oscortes.Metilar o tecido, à 60°, por cerca de 3 horas.Lavar em álcool e levar até a água.Imergir os cortes na solução corante durante 20 minutos.Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1minuto cada banho.Desidratar diretamente em álcool butílico terciário,

diafanizar e montar.

Resultado: locais ricos em proteínas básicas aparecemcorados de amarelo vivo.

2.5. DETECÇÃO DE HISTIDINA

Solução corante:naphtol yellow S...............1 gácido acético..................1 mlágua destilada...............100 ml

Solução metiladora:HCl 1N....................0,8 mlálcool metílico...........100 ml

Solução acetiladora:Anidro acético.............40 mlPiridina...................60 ml

Procedimento:Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes.

Metilar o material por 3 horas.Lavar em álcool absoluto.Recolodionar.Deixar na solução acetiladora, por 24 horas.Lavar em piridina por 2 minutos.Lavar em álcool absoluto e levar até a água.Corar pela solução corante por 20 minutos.Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1minuto cada banho.Desidratar diretamente em álcool butílico terciário,diafanizar e montar.



RADQUIM 4

Resultado: locais ricos em histidina aparecem corados deamarelo vivo.

2.6. DETECÇÃO DE ARGININA

Solução corante:2 ml de solução aquosa de NaOH a 4%2 gotas de água sanitária, "cândida", solução dehipoclorito de sódio a 5% comercial4 gotas de solução de alfa naphtol a 1% em álcool 70°Misturar nesta ordem e imediatamente antes do uso.

Procedimento:Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes.Secar e mergulhá-los em álcool 70°.Levar até a água.Colocar os cortes na horizontal e cobrí-los com a soluçãocorante.Preparar nova solução corante, desprezar a primeira etornar a cobrir os cortes por 2 minutos.Montar no próprio meio de reação e observar imediatamente.

Resultado: locais ricos em arginina coram-se em vermelhotijolo.

Observação:a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles,bloqueando-se os radicais guanidil, através da acetilação,assim realizada: após a passagem pelo álcool 70°, lavar oscortes em piridina por 2 minutos e colocá-los na soluçãoacetiladora por 24 horas; em seguida, lavar em álcoolabsoluto, recolodionar os cortes e realizar a reação paraarginina.Solução acetiladora:Anidro acético.............16 ml

Piridina...................24 ml



RADQUIM 5

2.7. DETECÇÃO DE TIROSINABensley & Gersh, 1933

Preparo do reativo de Millon:Preparar uma solução aquosa de ácido nítrico a 40%,dissolvendo o ácido gota a gota na água (40 ml de ácido em60 ml de água). Deixar estabilizar por 48 horas. Diluir 40ml desta solução em 360 ml de água, conseguindo-se assim400 ml de uma solução de ácido nítrico a 4%. Deixerepousar por 24 horas. Saturar esta solução com excesso decristais de nitrato de mercúrio. Filtrar e adicionar 1,4 gde nitrito de sódio e 4 ml da solução aquosa de ácidonítrico a 40% (aquela inicial). O reativo de Millon assimpreparado pode ser guardado em geladeira por muito tempo.

Procedimento:Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes.Secar e mergulhá-los em álcool 70°, por 3 minutos.Mergulhar em acetona anidra e deixar secar ao ar.Cobrir com o reagente de Millon.Levar à chama do bico de Bunsen até o aparecimento dacoloração tijolo.Lavar bem em solução de ácido nítrico a 2% a 37°C.

Resultado: locais ricos em tirosina aparecem em vermelhotijolo.

Observação:a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles,através do bloqueio dos radicais p-hidroxi-fenil, porprocesso de iodação, da seguinte maneira (Landing & Hall,1956):Após colodionar os cortes, colocá-los diretamente nasolução de iodação por 24 horas; em seguida, lavar em águacorrente, voltar ao álcool absoluto, recolodionar oscortes e realizar o método para tirosina, a partir daetapa da acetona.

Solução de iodação:Iodo.........................3 gIodeto de potássio...........6 gÁgua destilada............100 ml



RADQUIM 6

2.8. DETECÇÃO DE TRIPTOFANO

Soluções corantes:

Solução de p-dimetiaminobenzaldeído (DMAB) a 5% em HClconcentrado

Solução de nitrito de sódio a 1% em HCl concentrado. Oscristais de NaNO2 são postos no HCl imediatamente antes de

se usar a solução. Mergulhar as lâminas enquanto estáhavendo formação de gás.

Procedimento:Desparafinar e levar as lâminas até álcool absoluto.Recobrir o corte com celoidina, imergindo-o em solução

0,25% de celoidina em álcool absoluto e éter em partesiguais durante 1 minuto.Retirar o corte da celoidina e colocar diretamente nasolução de DMAB por 1 minuto.Colocar diretamente na solução de NaNO2 por 1 minuto.

Lavar em água corrente por 30 segundos.Passar em solução de álcool ácido (HCl concentrado a 1% emálcool 70°).Montar.

Resultados:

Locais contendo triptofano aparecem corados em azul.Grânulos de zimogênio das células principais do estômago:moderadamente corados.granulações eosinofílicas: fortemente coradas.queratina: não se cora.grânulos de zimogênio do pâncreas: muito corados.células alfa da ilhota pancreática: azul claro.células beta da ilhota pancreática: não se coram.célula de Paneth: fortemente corada.células absortivas do intestino: azul acinzentado claro.fibras elásticas das artérias: não se coram.

Observações:a) o ácido clorídrico puro é extremamente corrosivo efumegante; trabalhe com luvas e na capela.b) para demonstrar células de Paneth no intestino useanimais que foram mantidos em jejum por um noite.



RADQUIM 7

c) pode-se bloquear a reação, utilizando-se o ácidoperfórmico, da seguinte maneira:Após colodionar, mergulhar os cortes em solução de formol

a 10% em álcool 70° e em seguida, colocá-los na solução deácido perfórmico por 2 minutos; lavar em álcool absoluto,recolodionar os cortes e aplicar a técnica paratriptofano.Preparo da solução de ácido fórmico:Ácido fórmico a 98%......................40 mlÁcido sulfúrico a 65%...................0,5 mlÁgua oxigenada 100 vol....................4 mlPreparar 3 horas antes de usar e agitar por diversas vezespara remover o gás formado.

2.9. DETECÇÃO DE GRUPOS NH 2

(Yasuma & Ichikawa, 1953)

Solução corante:solução aloxana a 1% em álcool absoluto

Reativo de Schiff: ver método de PAS, em Histoquímica depolissacarídeos

Solução de água sulfurosa:

10 ml de metabissulfito de sódio10 ml de HCl 1N180 ml de água destilada

Procedimento:Desparafinar os cortes e levá-los até o álcool absoluto.Mergulhar as lâminas em solução de aloxana por 24 horas.Lavar em álcool absoluto e levar até a água.Colocar no reativo de Schiff por 30 minutos.Passar por três banhos de água sulfurosa de 2 minutoscada.Lavar em água corrente por 15 minutos.Montar.

Resultado: locais ricos em radicais livres NH 2 coram-se emvermelho.



RADQUIM 8

Observação:a) pode-se bloquear a reação, através do método de Barka &Anderson (1963), utilizando-se o seguinte procedimento:

Desparafinar e hidratar os cortes, colocá-los na soluçãobloqueadora por 24 horas; lavar em água e realizar ométodo da aloxana.Preparo da solução bloqueadora: misturar, na hora de usar,partes iguais de solução aquosa de ácido acético a 12,5% esolução de nitrito de sódio a 15% (ambas geladas).



LIPID 1

3. LÍPIDEOS

3.1. SUDAN BLACK B

Preparo da solução corante:Preparar uma solução saturada de Sudan black em álcool 70°e filtrar.

Procedimento:Usar cortes de material fresco ou fixado em formol.Cortar em congelação.Imergir os cortes por 10 minutos na solução corantefiltrada.

Lavar em álcool 70° para retirar o excesso de corante ouaté que os cortes controles estejam descorados.Lavar em água corrente.Pode-se contracorar fracamente com hematoxilina.Montar em glicerina.

Resultado: lipideos coram-se em negro.

Observações:a) a adição de cálcio ao formol fixador contribui para aretenção dos lípides ao tecido.b) Sabe-se que os cristais de colesterol não se coramnormalmente com o Sudan black; além disso, osfosfolipídeos se dissolvem no álcool (que é o solvente docorante). Estes dois problemas podem ser contornadosusando-se uma solução de brometo da seguinte forma:Obtidos os cortes, deixá-los em uma solução aquosa debrometo a 2,5%, por 1 hora e, em seguida, lavar em umasolução aquosa de 0,5% de metabissulfito de sódio pararetirar o excesso de brometo; lavar em água corrente eimergir na solução corante.



POLISS 1

4. POLISSACARÍDEOS

4.1. AZUL DE TOLUIDINA

Solução corante:Azul de Toluidina 0,5% em água destilada

Procedimento:Corar as lâminas durante 1 a 2 horas.Lavar em água destilada.Montar.

Resultado:

Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA epolissacarídeos ácidos, com diferentes intensidades decor, conforme a quantidade de grupamentos ácidos.

4.2. ALCIAN BLUE, pH 2,5Mowry, R.W.; Ann. N.Y. Acad. Sci, 106 (2): 402-423, 1963.

Solução corante: Alcian Blue 8GX 1% em solução aquosa deácido acético a 3%

Preparo da solução corante:97 ml de água destilada3 ml de ácido acético glacial1 g de Alcian Blue 8GX

Medir o pH da solução e, se necessário, acertá-lo com HCl1N ou NaOH 1N.

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Passá-los em solução aquosa de ácido acético 3% durante 3minutos.

Corar pela solução corante, por 2 horas.Enxugar o excesso de corante.Lavar em ácido acético 3%, durante 3 minutos.Lavar em água corrente.Montar.



POLISS 2

Resultado:Coram-se, em azul turquesa, carboidratos complexos ricosem grupos carboxilas, ácido hialurônico, carboibratos

fracamente sulfatados, carboidratos ricos em ácidosiálico. Os carboidratos fortemente sulfatados coram-sefracamente ou não se coram.

4.3. ALCIAN BLUE pH 0,5 e 1,0

Solução corante: solução de Alcian Blue 1% em HCl 0,2 N.

Preparo da solução:1 g de Alcian Blue 8GX

100 ml de HCl 0,2N (para pH 0,5) ou100 ml de HCl 0,1N (para pH 1,0).

Para 100 ml de HCl 0,2N: 1,65 ml de HCl em 98,3 ml de H2O.

Para 100 ml de HCl 0,1N: 0,83 ml de HCl em 99,17 ml deH2O.

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Passar no HCl 0,2N ou 0,1N, por 3 minutos.Corar na solução corante por 30 minutos.

Passar em HCl 0,2N ou 0,1N.Lavar rapidamente em água destilada.Desidratar e montar.

Resultado:Locais ricos em polissacarídeos sulfatados coram-se emazul, portanto não cora ácido hialurônico (não-sulfatado).

4.4. METILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + ALCIAN BLUE, pH 2,5

O processo de metilação em alta temperatura promove obloqueio da basofilia dos polissacarídeos sulfatados ecarboxilados; a saponificação posterior restaura abasofilia somente dos polissacarídeos carboxilados.

Solução para metilação:99,2 ml de álcool metílico (metanol)0,8 ml de HCl



POLISS 3

Solução para saponificação:Solução de BaOH a 4% em álcool 80°

ou

1 g de hidróxido de potássio70 ml de álcool absoluto30 ml de água destilada

Procedimento:Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcoolabsoluto.Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar,passar 5 minutos no álcool 70° e levar até álcoolabsoluto.Colocar os cortes A e B na solução metiladora pré aquecida

por 2 a 5 horas a 60°C. O corte C deve permanecer em águadestilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura.Lavar em água corrente e colocar todos os cortes em álcool70°.Tratar o corte A com uma das soluções saponificadoras, poruma hora à temperatura ambiente. Os cortes B e C devempermanecer em álcool 70°.Lavar em água corrente por 5 minutos.Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as porálcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes iguais.Lavar em água, ou em solução de ácido acético a 3%, caso amanutenção do pH seja importante.Corar todos os cortes com Alcian Blue, pH 2,5, por 5 a 30minutos.Lavar em água corrente.Montar.

Resultado:Corte C (Alcian): coram-se os polissacarídeos carboxiladose sulfatados;Corte B (metilação + Alcian): bloqueia a coloração dospolissacarídeos carboxilados e sulfatados;

Corte A (metilação + saponificação + Alcian): coram-sesomente os polissacarídeos carboxilados.



POLISS 4

Interpretação:Caso o corte A fique tão corado quanto o corte C: indica apresença de polissacarídeos carboxilados somente.

Caso o corte A fique menos corado que o corte C: indica apresença de polissacarídeos carboxilados e sulfatados.Caso o corte A não se core pelo Alcian: indica a presençade polissacarídeos sulfatos somente.

Observações:a) Sempre que realizar este método colocar para correrjunto três lâminas de um material já previamente testadocom bons resultados.b) O colódio deve ser bem removido, pois ele se cora com oAlcian Blue, interferindo com o resultado.

4.5. MÉTODO DA HIDRÓLISE ÁCIDA + ALCIAN BLUE (Quintarelli)

Solução para hidrólise:acetato de sódio a 0,02M: 0,164 g em 100 ml de água

0,273 g , se for trihidratado.ácido clorídrico a 0,02N: 0,164 ml em 100 ml águaMisturar as duas soluções em partes iguais.Medir o pH e acertar para 2,5.

Procedimento:Desparafinar e levar até álcool absoluto dois cortes (A eB).Colodionar os cortes.Deixar secar, passar no álcool e água destilada.Colocar o corte A na solução de hidrólise, durante 2 horasa 60°C. Acompanhar o procedimento com o corte B, cobertocom água destilada.Descolodionar os cortes com mistura de álcool-éter (partesiguais).Corar pelo Alcian Blue pH 2,5, durante 30 minutos.Lavar em água corrente.

Montar.

Resultados:Estruturas Alcian Blue positivas na lâmina B, quediminuírem ou perderem positividade na lâmina A, indicam apresença de ácido siálico.Pode-se aumentar o tempo ou a temperatura de hidrólisepara obtenção de melhores resultados.

4.6. ALCIAN BLUE + PAS



POLISS 5

Desparafinar e hidratar os cortes.Colocá-los por 30 minutos em solução de Alcian Blue, pH

2,5.Lavar em solução de ácido acético a 3%.Passar em água destilada.Deixar por 10 minutos em ácido periódico a 1%.Lavar rapidamente em água destilada.Deixar por 1 hora no Reativo de Schiff (ver preparo doreativo de Schiff no ítem PAS, em Histoquímica dePolissacarídeos).Lavar em água corrente por 10 minutos.Montar.

Resultado:Glicogênio e polissacarídeos neutros em vermelho.Polissacarídeos ácidos em azul.A cor violeta representa associação de ambos.

4.7. ALCIAN BLUE + CONCENTRAÇÃO ELETROLÍTICA CRÍTICA

Solução corante:0,05 g de Alcian Blue100 ml de tampão acetato 0,2M, pH 5.8Adicionar MgCl

2.6H

2O (PM = 203,30) nas diversas

molaridades requeridas 0,3M, 0,65M, 0,9M e 1M.

Procedimento:Desparafinar e hidratar as lâminas.Corar pelas soluções de Alcian Blue com as diferentesconcentrações de MgCl2, por 18 horas, à temperatura

ambiente.Lavar em água corrente.Montar.



POLISS 6

Resultado:A presença de uma concentração eletrolítica maior nasolução corante proporciona uma coloração seletiva dos

polissacarídeos de acordo com o grau crescente desulfatação.Com MgCl2 0,3M: coram-se todos os polissacarídeos

carboxilados e sulfatados.Com MgCl2 0,65M: coram-se todos os polissacarídeos

sulfatados.Com MgCl2 0,9M: coram-se heparina, heparam sulfato e

queratam sulfato.Com MgCl2 1M: cora-se somente queratam sulfato.

4.8. REAÇÃO FERRO-COLOIDAL (Mowrey)

Preparo da solução estoque de ferro-coloidal:Preparar 5 ml de solução de cloreto férrico a 29% (1,45 gde cloreto férrico em 5 ml de água).Ferver 250 ml de água destilada.Com a água fervendo, adicionar 4,4 ml da solução decloreto férrico. Deixar ferver. Quando a solução ficarvermelho escuro suspender a fervura e deixar esfriar.Dializar a solução contra água destilada gelada 18-24horas duas vezes.Guardar a solução estoque na geladeira. Dura muitos meses.Na hora de usar, diluir esta solução estoque na seguinteproporção:12 ml de ácido acético18 ml de água destilada10 ml solução estoque de ferro-coloidal

Preparo da solução de ferrocianeto clorídrica:Preparar 15 ml de solução de ferrocianeto de potássio a2%: 0,3 g de ferrocianeto de potássio em 15 ml de água.Preparar 30 ml de ácido clorídrico 1%: 0,3 ml de HCl em 30

ml de água.Misturar as duas soluções na hora de usar.

Procedimento para reação:Desparafinar e hidratar o corte.Lavar rapidamente em ácido acético 10%.Colocar na solução de ferro coloidal recém-preparada,durante 2 horas.Lavar em 3 banhos de ácido acético 10%, 3 minutos cada.



POLISS 7

Colocar os cortes expostos ao ferro e os cortes controles(que ficaram na água) durante 20 minutos na solução deferrocianeto-clorídrica.

Lavar em água corrente 5 minutos.Montar.

Resultado:Cora polissacarídeos ácidos em azul

Observação:a) O ferro coloidal é adsorvido pelos polissacarídeos e évisualizado com a subseqüente conversão para ferrocianeto-férrico (azul da Prússia).

4.9. REAÇÃO DO FERRO COLOIDAL (Muller, 1966)

Preparo da solução estoque de hidróxido de ferro coloidal:solução aquosa de cloreto férrico a 32%............12 mlágua destilada....................................750 mlLevar a água à ebulição e, quando ferver, ajuntar asolução de cloreto férrico. Dura um mês, no máximo.Solução de trabalho (preparar na hora de usar):solução de hidróxido de ferro coloidal..........100 mlácido acético....................................10 ml

Preparo da solução de ferrocianeto de potássio:Ferrocianeto de potássio..............1 gHCl concentrado......................1 mlÁgua destilada......................99 ml

Procedimento:Desparafinar os cortes e levá-los até a água.Tratar com a solução de trabalho de hidróxido de ferrocoloidal, durante 10 minutos.Lavar 5 vezes em água destilada.Tratar pela solução ferrocianeto clorídrica recém

preparada, por 10 minutos.Lavar em água destilada.Montar.

Resultado:Coram-se os polissacarídeos ácidos em azul.

4.10. PAS (ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF)

Solução de ácido periódico a 1%:



POLISS 8

Esta solução pode ser preparada de duas maneiras:periodato de sódio ou potássio ............1 gácido sulfúrico 1N.......................100 ml

ou, a mais usada:ácido periódico............................1 gágua destilada...........................100 ml

PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF:Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963

Água destilada........................192 mlÁcido clorídrico concentrado............8 mlFucsina Básica (Color Index 42510)....0,5 g

Sulfito de sódio (Na2SO3)...............5 g ouMetabissulfito de sódio (Na2S2O5).....3,8 g

Carvão ativado........................0,5 g

Dissolver a fucsina na água adicionada de ácidoclorídrico.Junte o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco.Agitar por 20 a 30 minutos até que a mistura estejalímpida e de cor marrom avermelhado. Adicione o carvãoativado para descolorir. Agitar por 2 minutos efiltrar. O filtrado deverá ser incolor. O reativo

somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 horas apóssua preparação. Guardar na geladeira.

Observações sobre o Reativo de Schiff:a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido;se não, rejeitá-lo.b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo estepode descolorir totalmente ou ficar com coloraçãoamarelo palha; em qualquer dos casos está bom para serutilizado.c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas domesmo em alguns mililitros de formol a 10%. Se asolução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode serusado.



POLISS 9

Procedimento para a realização do método PAS:Desparafinar e hidratar os cortes.Colocar no ácido periódico, durante 10 a 15 minutos, na

geladeira.Lavar em várias trocas de água destilada ou lavar 5minutos na água corrente e, em seguida, passar pela águadestilada.Colocar no reativo de Schiff durante 1 hora, no escuro, nageladeira ou durante 15 minutos, no escuro, à temperaturaambiente.Lavar em água corrente por 5 a 10 minutos.Montar.

Resultado:

Locais ricos em glicogênio ou polissacarídeos neutros,contendo grupos 1,-2 glicol, coram-se em vermelho. Osproteoglicanos não se coram.

Observações:a) Ao retirar-se do Reativo de Schiff pode-se passar pelasseguintes soluções:bissulfito de sódio 2% durante 2 minutosouvários banhos de HCl 3N durante 2 minutosou3 banhos de água sulfurosa de 2 minutos cadaPreparo da água sulforosa:Metabissulfito de sódio a 10% ...............10 mlHCl 1N.......................................10 mlÁgua destilada...............................180 mlDe modo geral, estes banhos são desnecessários.b) Para material incluído em historesina o ácido periódicodeve ser a 0,4% e os cortes devem ficar no Reativo deSchiff por 30 minutos.

4.11. ACETILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + PAS

Solução acetiladora:Anidrido acético..................32,5 mlPiridina..........................50,0 ml

Solução saponificadora:Solução de BaOH a 4% em álcool 80°



POLISS 10

Procedimento:Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcoolabsoluto.

Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar,passar 5 minutos no álcool 70° e levar até álcoolabsoluto.Passar os corte A e B na piridina por 2 minutos.Colocar os cortes A e B na solução acetiladora recém-preparada, durante 24 horas à temperatura ambiente. Ocorte C deve permanecer em água destilada pelo mesmo tempoe na mesma temperatura.Lavar em álcool absoluto.Recolodionar os cortes.Passar no álcool 70° por 5 minutos.

Passar no álcool 80°.Colocar o corte A na solução saponificadora, por 4 a 5minutos, a temperatura ambiente. Os cortes B e C devempermanecer no álcool 80°.Lavar em água destilada.Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as porálcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes iguais.Lavar em água.Realizar o método de PAS.

Resultado:Corte C (PAS): coram-se o glicogênio e os polissacarídeosneutros.Corte B (acetilação + PAS): bloqueia a coloração dospolissacarídeos neutros.Corte A (acetilação + saponificação + PAS):polissacarídeos neutros bloqueados pela acetilação voltama se corar.

4.12. P.A.S. + BOROHIDRIDO

Solução de borohidrido de sódio:Borohidrido de sódio (NaBH4 ; P.M = 37,83)........0,1 gNa2HPO4 (anidro)..................................1,0 gÁgua destilada...................................100 mlDissolver o fosfato de sódio na água e então acrescentar oborohidrido. Preparar solução nova cada vez que for usar.O pH deve ser 9,4.



POLISS 11

Procedimento:Desparafinar três lâminas (A, B e C) e levar até a água.Tratar a lâmina A e B com ácido periódico a 1%, por 30

minutos. A lâmina C deve permanecer no ácido periódico por24 horas.Lavar bem as lâminas em água destilada.Tratar a lâmina B com a solução de borohidrido, por 30minutos, enquanto a lâmina A espera em solução aquosa deNa2HPO4 .sem o borohidrido.Lavar as lâminas em água corrente.Tratar as lâminas com Reativo de Schiff, por 15 minutos.Lavar em água corrente.Montar.

Resultado:Lâmina A: somente os polissacarídeos neutros e oglicogênio aparecem corados em magenta (P.A.S. normal).Lâmina B: bloqueio total da coloração dos polissacarídeosneutros e do glicogênio.Lâmina C: coram-se, em magenta, tanto os polissacarídeosneutros quanto os ácidos (glicosaminoglicanas).

Observação:a) Com o tempo maior de exposição ao ácido periódico (24horas) os grupamentos 1,2 glicol das glicosaminoglicastambém dão origem a aldeídos e reagem com o Reagente deSchiff.b) o borohidrido serve para bloquear a positividade doP.A.S.c) Aconselha-se usar cortes colhidos em lâminas com algumtipo de adesivo e/ou colodionar os cortes.d) O tempo durante o qual as lâminas A e B permanecem noprimeiro ácido é 30 minutos, ao invés dos 10 a 15 minutosdo P.A.S. de rotina. Assim, as glicoproteínas neutras e oglicogênio produzam o máximo de grupamentos aldeídos nesteestágio, para que sejam efetivamente bloqueados peloborohidrido.



ACNUCL 1

5. ÁCIDOS NUCLÉICOS

5.1. COLORAÇÃO DE ACRIDINE ORANGE (Ganter e Jolles)

Solução estoque de Acridine Orange:Acridine Orange....................1 gH2O destilada...................1000 ml

Solução de Trabalho:Solução Estoque de Acridine Orange.........10 mlPBS (pH 6,0 a 6,5).........................90 ml

Corar 15 minutos na solução de trabalho de acridine

orange.Lavar em PBS.Cobrir a lâmina com glicerina e observar no microscópio defluorescência.

Observações:a) A fixação do material deve ser feita em Carnoy ouetanol acético; para esfregaços ou culturas de células afixação deve ser feita em acetona metanol.b) O preparado descora e muda de cor depois de um tempo.c) Alguns autores recomendam, após lavar no PBS, passar em

uma solução de cloreto de cálcio 0,1M, por 1 a 2 minutose, em seguida, lavar em PBS por 10 segundos, antes demontar.

Resultado: coram-se as estruturas ricas em ácidosnucléicos.

5.2. AZUL DE TOLUIDINA ÁCIDO

Solução corante:Azul de Toluidina 0,5% em água; pH 3,5 (acertar com HCl0,1N)

Procedimento:Corar as lâminas durante 1 a 24 horas a 60°C (com ocorante pré-aquecido a esta temperatura).Lavar em água destilada.Imergir em molibdato de sódio ou potássio 1%, por 30segundos, para evitar descoloração posterior.Montar.



ACNUCL 2

Resultado:Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA epolissacarídeos ácidos.

5.3. MÉTODO DE FEULGEN PARA DNA

Solução de ácido clorídrico 1N: 8,5 ml de HCl em 91,5 mlde água destilada.

Solução aquosa de metabissulfito de sódio ou de potássio a0,5%.

Reativo de Schiff.

PREPARO DO REATIVO DE SCHIFFAm N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963.

Água destilada.........................192 mlÁcido clorídrico concentrado.............8 mlSulfito de sódio (Na2SO3)................5 g ou

Metabissulfito de sódio (Na2S2O5)......3,8 g

Fucsina Básica (Color Index 42510).....0,5 gCarvão ativado.........................0,5 g

Dissolver a fucsina na água adicionada de ácidoclorídrico. Juntar o sulfito ou o metabissulfito.Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos até que amistura esteja límpida e de cor marrom avermelhado.Adicionar o carvão ativado para descolorir. Agitar por2 minutos e filtrar. O filtrado deverá ser incolor. Oreativo somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6horas após sua preparação. Guardar na geladeira.

Observações sobre o Reativo de Schiff:a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido;

se não, rejeitá-lo.b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo estepode descolorir totalmente ou ficar com coloraçãoamarelo palha; nos dois casos está bom para ser usado.c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas domesmo em alguns mililitros de formol a 10%; se asolução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode serusado.



ACNUCL 3

Procedimento para realização do método de Feulgen:Desparafinar e hidratar os cortes.Hidrolisar os cortes, a 60°C, durante 5 a 20 minutos, no

ácido clorídrico 1N pré-aquecido a esta temperatura.Interromper a hidrólise através de uma lavagem em águadestilada.Transferir para o Reativo de Schiff, durante 45 minutos.Lavar os cortes em três banhos de metabissulfito de sódioou potássio durante 2 minutos cada.Lavar em água corrente.Montar.

Resultado:O DNA nuclear cora-se em vermelho escuro.

Os núcleos de microorganismos, como plasmódios,sarcosporídeos, toxoplasma, histoplasma, etc., coram-se emvermelho pálido devido ao seu baixo teor de DNA.

Observações sobre o método de Feulgen:a) O metabissulfito utilizado deve ser ativo. Conhece-sepelo seu forte cheiro característico.b) O tempo de hidrólise com ácido clorídrico varia com otipo de fixador que foi usado e com o tempo de fixação. Nocaso do formol, o tempo de hidrólise é ao redor de 8minutos; para o Bouin, deve ser um pouco menor; para oHelly, deve ser ao redor de 5 minutos. Para obter bonsresultados convém testar vários tempos de hidrólise, entre5 a 15 minutos para cada bloco utilizado.c) O método de Feulgen baseia-se no fato de que o HClquebra a ligação purina-desoxiribose formando grupamentosaldeídicos, que podem ser visualizados pelo Reativo deSchiff pela formação de um novo composto de adiçãoinsolúvel e de cor vermelho forte. O processo de hidrólisenão afeta o RNA, de modo que o método é específico paraDNA.d) Se quiser, antes de montar, contracorar em solução0,01% Fast Green - FCF em álcool 95° durante alguns

segundos.e) Se a lâmina estiver colodionada, deve-se retirar ocolódio antes de tratar pelo Reativo de Schiff.



ACNUCL 4

5.4. GALOCIANINA

Solução corante:

10 g de alúmen de cromo0,3 g de galocianina200 ml de água destilada

Dissolver o álumen em 200 ml de água e acrescentar agalocianina. Misturar por agitação e levar lentamente àfervura. Ferver por 10 a 20 minutos. Esfriar lentamente.Filtrar e completar para 200 ml com água destilada. Asolução deve ter pH 1,8.

Procedimento:

Desparafinar e hidratar os cortes.Corar na solução corante por 24 a 48 horas.Lavar em água destilada.Montar.

Resultado:Ácidos nucléicos corados em azul profundo.

5.5. LÍTIO-CARMIN (de Örth)

Preparo da solução corante:Preparar 100 ml de solução saturada de carbonato de lítio(aproximadamente 1,25 g em 100 ml).Dissolver 2,5 a 5,0 g de carmin (C.C.) em 100 ml dasolução de carbonato de lítio e levar à ebulição. Ferverdurante 10 a 15 minutos. Quando esfriar, adicionar 1 g detimol e filtrar.

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Corar na solução corante por 2 a 5 minutos.Transferir diretamente para o álcool-ácido.

Proceder a um ou mais banhos em álcool-ácido para fixar ocorante no núcleo e para diferenciação; controlar adiferenciação ao microscópio.Lavar em água corrente.Desidratar em álcool 95° e 100°.Montar.

Resultado:núcleos em vermelho; citoplasma rosa claro ou descorado.



GRANUL 1

6. GRÂNULOS CITOPLASMÁTICOS

6.1. SIRIUS RED ALCALINO - HEMATOXILINA

Solução corante:Sírius Red F3B .........................0,5 gálcool absoluto.........................50 mlSolução aquosa de NaOH a 1%..............1 mlSolução aquosa de NaCl a 20%.............4 mlÁgua destilada..........................45 ml

Dissolver o Sírius na água destilada; acrescentar o álcoole, em seguida, o NaOH. Agitar várias vezes até dissolver

bem. Deixar repousar por duas horas; gotejar lentamente,agitando bem, o NaCl até obter um ligeiro precipitado;deixar repousar de um dia para o outro e filtrar; asolução se conserva, na geladeira, por um ou dois meses.

Procedimento:Desparafinar e levar até a água.Corar pela hematoxilina por 2 a 3 minutos.Lavar em água corrente por 5 minutos.Passar pelo álcool 70°.Corar no Sírius alcalino por 1 hora.Lavar em água corrente por 10 minutos.Montar.

Resultado:Coram-se em vermelho os eosinófilos e amilóide.

Observações:a) Após o acréscimo do NaOH, o pH da solução ficará emtorno de 12 e permanecerá assim até o final. A receitaoriginal manda acertar o pH para 10,5, o que pode serfeito acrescentando-se gotas de HCl 1N nesta etapa.Para evitar-se o acréscimo de HCl, pode-se omitir o NaOH,

pois, em qualquer das três circunstâncias, ou seja, comNaOH (pH 12), com NaOH e HCl (pH 10,5) ou sem nenhum dosdois (pH 11), o corante funciona perfeitamente.



GRANUL 2

6.2. LEISHMAN (para esfregaços de sangue)

Solução corante estoque:

0,2 g de Leishman100 ml de álcool metílico p.a.O corante leva um mês para amadurecer e dura anos.

Solução corante de trabalho:Na hora de usar, diluir o corante na proporção de 1 ml decorante para 3 ml de água tamponada.

Procedimento:Fixar o esfregaço em metanol, por 2 a 3 minutos.Colocar sobre o esfregaço a solução corante de trabalho e

deixar de 3 a 5 minutos.Lavar em água tamponada.Secar ao vento.Examinar ao microscópio com óleo de imersão.

Resultado:grânulos dos eosinófilos: rosa alaranjado.grânulos dos neutrófilos: púrpura a violeta.grânulos dos basófilos: violeta escuro.núcleo dos monócitos: violeta claro.citoplasma dos monócitos: cinza claro.grânulos centrais das plaquetas: violeta.grânulos periféricos das plaquetas: azul claro.eritrócitos: coloração variando de rosa amarelado a cinza,dependendo do pH.

Observação:a) a água tamponada deve ser feita adicionando-se 1 ml detampão fosfato 0,1M (pH 6,5) para cada 30 a 40 ml de águadestilada.b) aconselha-se, após a coloração, proceder a umadiferenciação com água destilada (que é ligeiramenteácida) ou com ácido acético muito diluído (0,05%) para

retirar o excesso de azul, tornar as hemácias bem rosadase realçar os grânulos dos eosinófilos.



FIBRMATR 1

7. FIBRAS DA MATRIZ EXTRACELULAR

7.1. ALDEÍDO-FUCSINA (Gomori)

Solução corante:Fucsina básica...........0,5 gÁlcool 70°...............100 mlDissolver a fucsina, se necessário com ligeiroaquecimento. Deixar esfriar. Filtrar.Adicionar:Ácido clorídrico concentrado ...1 mlParaldeído......................1 ml

Deixar a solução amadurecer à temperatura ambiente (48 hs)ou a 50°C (menos tempo), em recipiente fechado. A soluçãopassa de vermelho para roxo, quando estará em condições deser usada.Quando guardada a 4°C pode ser usada por várias semanas. Àtemperatura ambiente dura até 4 dias.

Solução Oxidante: Ácido per-acético a 40% encontradacomercialmente ou preparada da seguinte maneira:ácido acético........................9,5 mlácido sulfúrico.....................0,25 mlperóxido de hidrogênio a 30%........30,0 ml

A solução deve amadurecer por 1 a 3 dias e ser estocada emgeladeira (4°C). Colocar 4 mg de fosfato dissódico após os3 dias para estabilizar a solução.

Procedimento para coloração:

Desparafinar e hidratar os cortes.Oxidar os cortes com a solução de ácido per-acético a 40%por 30 minutos.Lavar em água corrente por 2 minutos.

Corar com aldeído-fucsina por 10 a 20 minutos.Diferenciar os cortes: 4 trocas em álcool 95° por 2minutos e uma troca em álcool 70° por 4 minutos; controlarao microscópio.Desidratar, diafanizar e montar.



FIBRMATR 2

Resultado:Sistema elástico em púrpura.Omitindo-se a oxidação dos cortes, coram-se apenas as

fibras elásticas e elaunínicas.Outras estruturas que também se coram: algumasglicosaminoglicanas (como por exemplo, aquelas presentesna matriz cartilaginosa e nos grânulos dos mastócitos),queratina, grânulos de zimogênio, células beta do pâncrease hipófise.

Observações:a) Recomenda-se fixar o material em fixadores aldeídicoscomo o formol ou o Bouin que praticamente não dãocoloração de fundo. Fixadores com sais de mercúrio (como

Helly ou Zenker) dão coloração de fundo lilás pálido.b) O aldeído-fucsina é um corante transitório.A fucsina básica (vermelha) com paraldeído, sob condiçõesácido-alcóolica, forma gradualmente um corante violetadenominado aldeído-fucsina (à temperatura ambiente).O corante forma-se lentamente, e após um período de 2semanas ocorrem posteriores modificações, quando assubstâncias formadas não são mais úteis como corante. Parapreservar por mais tempo o corante costuma-se mantê-lo a4°C. Alguns autores acham que mesmo nesse caso o corantenão é muito confiável.c) Em vez de usar o ácido per-acético é preferívelproceder a oxidação com solução 10% de OXONA, por 30minutos (ver Técnica da Resorcina-Fucsina de Weigert)ouoxidar com solução de monoperssulfato de potássio, por 2 a3 minutos; usar solução recém preparada, de acordo com aseguinte instrução:10 ml de permanganato de potássio a 2,5%: 0,25 g/10 ml deágua destilada10 ml de ácido sulfúrico a 5%: 0,52 ml/10 ml de água80 ml de água destiladad) Recomenda-se que o paraldeído usado na preparação do

corante seja novo (não mais de 3 ou 4 meses).



FIBRMATR 3

7.2. CRESIL - VIOLETA (fibras oxitalânicas)Garotek & Jewemoka, 1964 (Cotta-Pereira)

Solução corante: solução aquosa de cresil-violeta a 0,01%

Solução oxidante: solução aquosa de Oxona a 10% (vertécnica da Resorcina Fucsina de Weigert)

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Oxidá-los pela Oxona, por 40 minutos.Lavar 5 minutos em água corrente.Corar 15 minutos na solução de cresil-violeta.Montar.

Resultado:Coram-se as fibras oxitalânicas.

7.3. IMPREGNAÇÃO ARGÊNTICA (Gomori)

Soluções necessárias:

Solução de prata amoniacal:

Preparar 20 ml de solução aquosa de nitrato de prata a10%.Preparar 3,0 ml de sol. aquosa de hidróxido de potássio10%.Preparar 50 ml de sol. aquosa de hidróxido de amônia a28%.

Misturar 10 ml da solução de nitrato de prata em 2,5 ml dasolução de hidróxido de potássio.Adicionar, gota a gota, a solução de hidróxido de amônia,agitando energicamente o frasco somente até o ponto em queo precipitado se dissolva.

Em seguida, adicionar, gota a gota, a solução de nitratode prata, até que se forme um pouco de precipitado, o qualse dissolve facilmente com a agitação. Completar para odobro de volume com água destilada e estocar em vidroescuro. Filtrar antes de usar.Imediatamente antes de usar, diluir 1:8 em água destilada.

Solução de Permanganato de Potássio a 0,5%

Solução de Metabissulfito de Potássio a 2%



FIBRMATR 4

Solução de Sulfato Férrico - Amoniacal a 2%

Solução de Formalina a 20%

Formaldeído (37-40%)......20 mlÁgua destilada............80 ml

Solução de Cloreto de Ouro a 0,2%

Solução de Cloreto de ouro a 1%.......10 mlÁgua destilada........................40 mlPara fazer a solução de Cloreto de ouro 1% quebre a ampolade cloreto de ouro (15 gramas) em um béquer com 100 ml deágua destilada.

Solução de Tiossulfato de Sódio a 2%

Procedimento:Desparafinar e hidratar as lâminasLavar em água destilada.Atenção: daqui para frente, pingar as soluções sobre oscortes.Oxidar em permanganato de potássio, por 1 minuto.Lavar em água corrente por dois minutos.Diferenciar com solução de metabissulfito, por 1 minuto.Lavar em água corrente por 2 minutos.Passar na solução de sulfato férrico-amoniacal, por 1minuto.Lavar em água corrente, por 2 minutos.Lavar em duas passagens de água destilada, 30 segundoscada.Impregnar na solução de prata amoniacal, durante 10segundos a 1 minuto.Mergulhar em água destilada por 20 segundos.Reduzir na solução de formalina, por 3 minutos, agitandosuavemente durante o primeiro minuto.

Lavar em água corrente por 3 minutos.Passar em água destilada (2 a 3 banhos).Fazer a viragem em cloreto de ouro, por 10 minutos (atéficar cinza).Mergulhar em água destilada.Reduzir na solução de metabissulfito de potássio, por 1minuto.Fixar na solução de tiossulfato de sódio, por 1 minuto.Lavar em água corrente, por 2 minutos.Montar.



FIBRMATR 5

Resultado- fibras reticulares em negro, fibras colágenasem castanho e coloração de fundo em cinza.

Observações:a) Este método é bastante complexo e deve ser seguido nosmínimos detalhes.b) Os frascos contendo as soluções devem ser perfeitamentelimpos.c) Todos os reagentes devem ser da maior pureza possível eacuradamente medidos e pesados.d) Qualquer excesso de hidróxido de amônia na solução deprata amoniacal provoca perda da sensibilidade do método,resultando em preparados fracamente ou não corados.e) Devido ao fato dos reagentes empregados serem de

natureza bastante alcalina, os cortes tendem a se soltaremda lâmina. Assim sendo, deve-se proceder à colagem doscortes, tomando-se cuidado para não colocar colantes emexcesso, pois resultam em formação de precipitados emlugares inadequados.f) Os reagentes devem ser sempre dissolvidos em águadestilada ou deionizada, para evitar precipitação de saisde prata insolúveis.g) A solução de tiossulfato de sódio serve para remover oexcesso de prata que fica no tecido sob a forma não-precipitada.h) A impregnação pela prata deve ser, ao final, convertidaem impregnação pelo ouro para resultar em um preparadopermanente e produzir uma coloração negra de altadensidade.i) Se for utilizar soluções preparadas há mais de um mês eestocadas na geladeira, antes de corar o materialdesejado, core um material já testado com bons resultados,pois alguma das soluções pode não estar funcionando mais.

7.4. ORCINOL - NEOFUCSINA (método usado por Cotta-Pereira para fibras elásticas)

Fullmer & Lillie, 1956, 1958.

Preparo da solução de orcinol-neofucsina:

Colocar em ebulição 200 ml de água destilada.Adicionar 2 g de neofucsina (cuidado).Adicionar 4 g de orcinol (cuidado).Deixar em ebulição por 5 minutos.Adicionar 25 ml de solução aquosa de cloreto férrico a30%.Deixar em ebulição por mais 5 minutos.



FIBRMATR 6

Deixar esfriar e filtrar.Descartar o filtrado e dissolver o depósito retido nopapel de filtro em 100 ml de etanol 95°.

Estocar na geladeira, por até 3 meses.

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Corar em solução de orcinol-neofucsina, por 15 minutos, a37°C (com o corante pré-aquecido a esta temperatura).Passar em três trocas de álcool 70°, por 5 minutos em cadatroca.Desidratar, diafanizar e montar.

7.5. ORCEINA

Solução corante:1 g de orceína100 ml de álcool 70°0,6 ml de HCl concentrado

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Corar com a solução de orceína durante 30 a 60 minutos.Enxaguar em água destilada.Secar a água em excesso.Passar no álcool 95° para tirar o excesso de corante.Deixar no álcool absoluto durante 5 a 30 minutos até que ocorte esteja castanho claro. Verificar ao microscópio seas fibras elásticas estão bem pretas.Descorar o fundo colocando os cortes no álcool ácido: 1 mlde HCl em 99 ml de álcool 70°; este procedimento deve serfeito, controlando ao microscópio, até que o fundo fiquebem incolor. A descoloração é obtida entre 2 a 10 minutos.Lavar em água corrente durante 5 minutos.Montar.

Resultado:fibras elásticas coradas em castanho-preto.



FIBRMATR 7

7.6. PICROSSÍRIUS - HEMATOXILINA

Sírius Red..............................0,2 g

Solução saturada de ácido pícrico.......100 ml

Misturar e colocar um pouco de ácido pícrico (em pó) paraque apareça um precipitado no fundo do frasco.

Procedimento:Desparafinar e levar as lâminas até água.Corar durante 1 hora no Picrossírius à temperaturaambiente.Lavar em água corrente por 5 minutos.Corar pela Hematoxilina de Harris por 6 minutos (ou menos,

se a hematoxilina for nova).Lavar por 10 minutos em água corrente.Montar.

Observações:a) Trocar o corante uma vez por mês se este for muitoutilizado.b) A solução deverá estar sempre saturada.c) Especificação do Sirius Red: F 3 B 200 (Mobay ChemicalCo., Union, NJ).d) Para experimentos quantitativos deve-se omitir acontracoloração pela hematoxilina.e) Ler sobre o método do Picrossírius associado à digestãopela papaína em DIGESTÃO ENZIMÁTICA.

7.7. RESORCINA-FUCSINA DE WEIGERT COM E SEM OXIDAÇÃO

Solução corante: Resorcina-FucsinaSolução oxidante: Oxona 10% em água destilada

Preparo da Solução corante:Água destilada ..............200 ml

Fucsina básica ................2 gResorcina .....................4 gCloreto férrico a 30%..........50 mlÁlcool 95.....................200 mlHCl concentrado ................2 ml

Adicionar a fucsina e a resorcina na água destilada.Colocar esta solução em ebulição. Adicionar o cloretoférrico. Continuar em ebulição por 4 minutos. Esperaresfriar e filtrar. Descartar o filtrado e deixar secar odepósito retido no papel de filtro. Dissolver este



FIBRMATR 8

depósito em 200 ml de etanol 95° aquecido. Deixar esfriare adicionar o HCl.Guardar a solução na geladeira. Dura um ano ou mais.

A) Procedimento para os cortes que não serão oxidados:

Desparafinar e hidratar até álcool 95°.Corar pela Resorcina-fucsina, por 1 hora, à temperaturaambiente. A Resorcina-fucsina deve estar à temperaturaambiente antes de colocar os cortes para corar.Lavar na água corrente durante 5 minutos.Colocar em duas trocas de álcool 70°durante 10 minutos nototal. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciação.Desidratar, diafanizar e montar.

Se necessário, depois do álcool 70°,remover a coloração defundo passando em uma solução de álcool-ácido a 1% (1 mlde HCl concentrado em 99 ml de álcool 70). Controlar ao aomicroscópio tendo o cuidado de preservar a coloração dasfibras mais finas; após a diferenciação em álcool-ácidolavar em água corrente.

B) Procedimento para cortes que serão oxidados:

Desparafinar e hidratar até água.Pingar sobre os cortes a solução aquosa de OXONA 10% edeixar oxidando durante 40 minutos (ver observação b.).Lavar em água corrente por 5 minutos.Passar pelo álcool 70°.Passar pelo álcool 95°.Corar pela Resorcina-fucsina durante 1 hora, à temperaturaambiente.Lavar na água corrente durante 5 minutos.Colocar em duas trocas de álcool 70°durante 10 minutos nototal. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciação.Desidratar, diafanizar e montar.Se necessário, depois do álcool 70°,remover a coloração de

fundo passando em uma solução de álcool-ácido a 1% (1 mlde HCl concentrado em 99 ml de álcool 70°). Controlar aoao microscópio tendo o cuidado de preservar a coloraçãodas fibras mais finas; após a diferenciação em álcool-ácido lavar em água corrente.

Resultado: nos cortes que não foram submetidos à oxidaçãocoram-se fibras elásticas e elaunínicas; nos cortessubmetidos à oxidação coram-se fibras elásticas,elaunínicas e oxitalânicas.



FIBRMATR 9

Observação:a) Se o cloreto férrico contiver impurezas, a coloraçãonão sairá bem; até mesmo o cloreto férrico novo pode ter

sais ferrosos e pode ser substituído por nitrato férricoque é considerado livre de sais ferrosos.b) Referência da OXONA: composto monopersulfato, Du Pont,Wilmington, Delaware, E.U.A.).

7.8. HEMATOXILINA FÉRRICA DE VERHOEFF

Preparo da solução corante:Hematoxilina..................................1 gÁlcool 100°..................................20 mlSolução aquosa de cloreto férrico a 10%.......8 ml

Solução de Lugol..............................8 ml

Preparo da solução de Lugol:Iodo...........................2 gIodeto de potássio.............4 gCompletar para 100 ml com água destilada.

Preparo do Bouin:Solução saturada aquosa de ácido pícrico........750 mlFormol 36-40%...................................250 mlÁcido acético glacial............................50 ml

Preparo da solução diferenciadora:cloreto férrico...............1 gágua destilada...............50 ml

Dissolver a hematoxilina no álcool. Adicionar a solução decloreto férrico. Misturar e adicionar o lugol.

Procedimento:Desparafinar os cortes e levar até à agua.Colocar na solução de Bouin por 30 minutos.Lavar em água corrente.

Colocar na solução corante por 20 a 30 minutos.Lavar em água corrente.Diferenciar por poucos segundos na solução de cloretoférrico, controlando ao microscópio até que estejamcoradas somente as fibras elásticas; se diferenciardemais, voltar para a solução corante.Lavar em água corrente.Lavar em álcool 95° por 2 a 5 minutos para removerqualquer coloração devida apenas ao iodo.Lavar em água corrente.Desidratar rapidamente através do gradiente alcoólico.



FIBRMATR 10

Diafanizar e montar.

Observações:

a) Prepare todas as soluções na hora do uso e só core emsolução corante recém preparada.b) Se o cloreto férrico contiver impurezas, a coloraçãonão sairá bem; até mesmo o cloreto férrico novo pode tersais ferrosos e pode ser substituído por nitrato férrico,que é considerado livre destes sais.c) O Bouin atua como mordente, aumentando o contraste dasfibras elásticas após a diferenciação.

7.9. TRICRÔMICO DE MALLORY

Soluções corantes:Solução A:0,5 g de fucsina ácida100 ml de água destiladaSolução B:0,5 g de azul de anilina2,0 g de orange G1,0 g de ácido fosfotúngstico

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Corar pela solução A durante 2 minutos.Passar diretamente para a solução B, corando durante 5 a10 minutos.Lavar em água corrente até tirar o excesso de corante.Passar pelo álcool 80° por alguns segundos.Desidratar e montar.

Resultado:Tecido conjuntivo cora-se em azul e tecido muscular emvermelho.

7.10. AZAN (modificado por Heidenhaim)

Soluções corantes:Solução A (solução de azocarmin):0,25 a 1,0 g de azocarmin B100 ml de água destilada1 ml ácido acético glacialSe for usado o Azocarmin G, saturar 100 ml de águadestilada, por aquecimento, com 0,1 g do corante; esfriare acidificar com 1 ml de ácido acético glacial.



FIBRMATR 11

Solução B (azul de anilina-orange G):Preparo da solução estoque:

0,5 g de azul de anilina solúvel em água2,0 g de orange G8,0 ml de ácido acético glacial100 ml de água destiladaDissolver o orange G na água destilada; acrescentarlentamente e misturando sempre, o ácido acético; adicionaro azul de anilina e filtrar.Preparo da solução de trabalho:33 a 50 ml da solução B estoque misturados à águadestilada que seja suficiente para 100 ml.

Procedimento:Desparafinar e hidratar os cortes.Corar na solução A, na estufa 50 a 55°, por 30 a 60minutos e, em seguida, continuar corando pela solução, àtemperatura ambiente, por 1 a 2 horas.Lavar em água destilada.Mergulhar em solução de ácido acético a 1% em álcool 95°.Colocar em solução aquosa de ácido fosfotúngstico a 5%,durante 30 minutos a 3 horas (mordente).Lavar em água destilada durante 3 minutos.Corar na solução B de trabalho, durante 1 a 3 horas.Lavar em água destilada.Dar dois banhos de álcool 95°, dois banhos de álcool 100°e dois banhos de xilol.Montar.



FIBRMATR 12

Resultado:vermelho: núcleo, osteócitos, eritrócitos, neuroglia,depósitos de imunocomplexos na membrana basal de alças

capilares glomerulares.vermelho alaranjado: músculo.azul: membrana basal, fibras colágenas, fibrasreticulares, fibrina, muco, saliva.

Observação:a) a solução A e a solução estoque B devem ser guardadasem geladeira; a solução de trabalho B deve ser descartada.



HISTORES 1

V. HISTORESINA



HISTORES 2

ÍNDICE

1. FIXAÇÃO

2. DESIDRATAÇÃO

3. INCLUSÃO

4. MICROTOMIA

5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES

6. COLORAÇÃO

7. USO DO KNIFE-MAKER DO ADOLPHO LUTZ



HISTORES 3

1. FIXAÇÃO Uma das dimensões do material a ser fixado deverá medir no

máximo 1 a 2 mm para que o fixador penetre bem. A fixação

deverá ser feita em solução de paraformaldeído a 4% em PBS

neutro ou solução de glutaraldeído a 2% isotônica e

neutra. O tempo de fixação deverá ser de 6 a 12 horas

(ideal é 8 horas).

2. DESIDRATAÇÃO

Álcool 70°, por uma noite (no mínimo por 2 horas);

Deixar em acetona pura, por 2 a 3 dias, trocando-a

diariamente.

A desidratação poderá ser feita também da seguinte maneira:

Desidratar em álcool 70°, por uma noite;

2 banhos em álcool 95°, de 30 minutos cada

4 banhos em álcool absoluto (total de 2 a 3 horas)

Órgãos que contenham ar, como o pulmão, devem ser

colocados no vácuo por aproximadamente 30 minutos, durante

a passagem no álcool 70°.

3. INCLUSÃO

O material pode ser incluído em cápsulas de gelatina

(formato de cápsulas de remédio) ou em forminhas

retangulares de plástico, que se prestam mais pelo próprio

formato e por permitirem mudar o plano de corte.



HISTORES 4

3.1. PREPARAÇÃO DA RESINA

Durante o processo de inclusão são utilizadas duas

soluções (A e B) preparadas a partir do kit para

Historesina adquirido comercialmente:

PREPARO DA SOLUÇÃO A:

Solução de peróxido de benzoila a 1% em Tecnovit 1 ou

Historesin (hidroxietil metacrilato), preparada da

seguinte maneira:

0,15 g de peróxido de benzoila

15 ml de Tecnovit 1

Agitar suavemente por 10 a 15 minutos.

Usa-se a solução A para a pré-inclusão.

Esta solução é estável à temperatura ambiente por 4

semanas.

Esta quantidade é suficiente para a inclusão de 10 blocos

em cápsulas de gelatina.

Pode-se guardar na geladeira por até uma semana.

PREPARO DA SOLUÇÃO B:

5 ml da solução A

0,33 ml do polimerizador (Tecnovit 2).

Misturar cerca de 5 minutos.

Esta solução é usada para a inclusão propriamente dita e

deve ser feita no momento de usar e colocada no gelo; caso



HISTORES 5

contrário, polimeriza em cerca de 10 minutos. Pode ficar

no gelo até por 1 hora sem polimerizar-se.Se a resina for velha, pode-se agregar mais polimerizador,

até 0,46 ml em 5 ml da solução A.

Necessita-se cerca de para 0,5 ml por cápsula de gelatina.

3.2.PROCEDIMENTO PARA INCLUSÃO:

Colocar o material numa mistura 1:1 de solução A e acetona

(ou álcool absoluto, caso a desidratação tenha sido feito

nele), por 12 horas, girando.

Colocar em resina pura, a 24 horas, girando.

Encher as cápsulas de gelatina ou as forminhas de plástico

com a solução B recém-preparada; se usar forminhas de

plástico, untá-las com silicone antes de colocar a resina,

para evitar que se ressequem e assim, duram mais.

Colocar o material com a superfície de corte próxima ao

local que vai ser cortado; se a inclusão é em cápsula de

gelatina, deve-se colocar a superfície de corte para o

fundo da cápsula; se é forminha de plástico, deve-se

colocar a superfície de corte para baixo.

Se o material se deslocar ou estiver em posição

inadequada, pode-se posicioná-lo dentro da cápsula na

posição desejada, com a ajuda de um alfinete ou palito de

dente.

Encher totalmente a cápsula com a resina ou a forminha de

plástico (até ficar abaulado) e colocar um pedaço de

plástico transparente na superfície; este procedimento



HISTORES 6

serve para que a polimerização ocorra de maneira homogênea

em todo bloco, pois se a superfície ficar em contacto como ar demora mais a se polimerizar.

Deixar polimerizar na estufa a 37 a 45° (a estufa de

Junqueira é a 40°), por 24 horas, no mínimo. Após as

primeiras 6 a 8 horas, retirar o plástico da superfície

para que a polimerização se complete.

Depois de polimerizar, retirar a cápsula de gelatina em

que o bloco está envolto, mergulhando-a em água morna,

quase quente; esfregar o bloco com os dedos até que este

não esteja mais escorregadio; secar com papel absorvente.

Em seguida, colocar na estufa para secar; é interessante

colocar sílica na estufa, para absorver a umidade. Se a

inclusão for feita com forminhas de plástico, soltar os

blocos como se retira o gelo da forma.

4. MICROTOMIA EM HISTORESINA

Como regra geral, deve-se cortar um mesmo material em

várias espessuras (1 µm, 2 ou 3 µm e 5 µm) e pescá-los na

mesma lâmina.

O método para a microtomia varia de acordo com a inclusão

do material que pode ter sido feita em cápsulas de

gelatina (formato de cápsulas de remédio) ou em forminhas

retangulares plásticas.

No caso de inclusão em cápsulas, a microtomia pode ser

feita tanto no piramitomo do Laboratório de Microscopia

Eletrônica, quanto no micrótomo do Laboratório de



HISTORES 7

Microscopia Óptica (LEIKA). Se for cortar no piramitomo as

facas de vidro devem ser aquelas feitas no Knife-maker da Microscopia eletrônica (são mais finas); se for cortar no

micrótomo deve-se usar facas de vidro mais grossas, feitas

no Knife-maker da Microscopia Óptica.

No caso de inclusão em forminhas plásticas, a microtomia

deve ser feita sempre no micrótomo Leica ou no micrótomo

de parafina, para o qual foi feito um adaptador para facas

de vidro. As facas devem ser aquelas grossas, feitas no

Knife-maker da Microscopia Óptica. Caso necessário, saiba

que existe um Knife-maker Dupond do Laboratório de

Microscopia Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, que

também faz facas grossas.

Os blocos provenientes de inclusão em forminhas de

plástico devem ser colados em cubinhos de madeira (2x2x2

cm), através de araldite.

4.1. Microtomia para blocos feitos em cápsulas

A microtomia deve ser feita no piramitomo ou no micrótomo

Leica, de acordo com as instruções de uso destes

aparelhos.

4.2. Microtomia para blocos incluídos em forminhas

plásticas

As facas de vidro utilizadas no micrótomo de parafina

devem ser feitas no knife-maker Leica da Microscopia

Óptica ou no Dupond do Laboratório de Microscopia



HISTORES 8

Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, pois são mais

resistentes, por serem feitas em vidro mais grosso queaquelas feitas no knife-maker LKB da microscopia

eletrônica. Porém, em último caso, pode-se usar as facas

de vidro feitas neste, adaptadas ao micrótomo de parafina.

4.2.1. Microtomia no micrótomo de parafina:

Acopla-se o adaptador para facas de vidro ao micrótomo,

deixando-o bem firme na posição desejada, apertando-se o

parafuso A com a chave em forma de L.

Desaparafusa-se o botão B, que solta o carro C. Neste, há

uma fenda na ponta onde coloca-se a faca de vidro. Traz-se

o carro C totalmente para a direita para facilitar a

colocação da faca. Prende-se novamente o carro C,

aparafusando o botão B de forma que o carro C fique

imóvel.

Desaparafusa-se o botão D que dá uma mobilidade

independente à fenda. Coloca-se a faca de forma que o lado

que não é de corte fique rente ao lado inferior da fenda,

e o lado maior fique sobre a base larga da fenda. Aperta-

se bem o botão D, e assim, a faca e a fenda estão fixas.

Solta-se novamente o botão B, leva-se o carro C para a

esquerda de forma a acertar a posição da faca na frente do

bloco. Acerta-se o ângulo desejado observando a escala de

papel E no corpo do adaptador; o ângulo melhor é 7°.

Aperta-se novamente o botão D, determinando-se a micragem

desejada e pode-se iniciar a microtomia.



HISTORES 9

4.2.2. Microtomia no micrótomo Leica:

Ligar o estabilizador de voltagem.Ligar o aparelho.

Apertar o botão TRIM e ajustar a micragem desejada para

trimar o bloco.

Colocar o bloco no suporte.

Ajustar a sua posição com a ajuda dos botões laterais após

destravá-los, girando a trava em forma de L que fica em

cima à esquerda.

Colocar a faca e travá-la com a avalanca da direita no

próprio suporte de faca.

Verificar se o carrinho da faca está travado (botão na

frente do aparelho).

Regular a micragem desejada para o corte (botão preto à

direita do aparelho em cima).

Programar o curso do canhão (1, 2 ou 3).

Proceder à trimagem.

Desligar o botão TRIM e começar a cortar com a micragem

estabelecida.

OBS: Tanto para começar ou parar de trimar ou cortar deve-

se apertar o botão RUN/STOP.

CUIDADO: o aparelho possui um sistema automática de trava

(botào vermelho à esquerda) que serve para parar todas as

suas funções em caso de emergência. Para que isto ocorra

deve-se apenas empurrá-lo para dentro. Nada mais vai

funcionar até que este botão seja novamente puxado para

frente com um leve giro para à direita.



HISTORES 10



HISTORES 11

5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES

Tanto para materiais incluídos em cápsulas quanto paraaqueles incluídos em formas plásticas, os cortes obtidos

devem ser esticados em água limpa à temperatura ambiente.

Para cortes difíceis de esticar, molhar a ponta de um

pincel em clorofórmio puro e encostá-lo bem perto do corte

na água.

Pesca-se em lâminas limpas. Não é necessário nada para

grudar os cortes nas lâminas. Se quando o corte está

flutuando perceber que há bolhas de ar embaixo, prender a

ponta do corte (segurando com uma pinça pela resina) e,

passar um estilete debaixo do corte para que as bolhas

saiam; fazer isto com o corte flutuando sobre a água o

tempo todo.

As lâminas podem ser secas em estufa à temperatura de

cerca de 37°C, caso não haja especificação em contrário.

6. COLORAÇÃO

6.1. AZUL DE TOLUIDINA - FUCSINA BÁSICA

Solução corante de Azul de toluidina 0,1% em solução

aquosa

Preparo da solução:

0,3 g de Toluidina



HISTORES 12


Filtrar no dia seguinte. Deixar o frasco imóvel, à

temperatura ambiente.

Pode-se usar o azul de toluidina usado para corar os

cortes grossos da microscopia eletrônica, porém o

Junqueira não recomenda.

Solução corante de fucsina básica: solução aquosa de

fucsina básica (pararosaniline ou fucsina diamante) a 0,1

ou 0,2%.

Preparo da solução:

0,1 ou 0,2 g de fucsina básica (pararosaniline da Sigma ou

fucsina diamante)


Filtrar.


Colocar a solução de azul de toluidina sobre as lâminas

utilizando-se uma pipeta Pasteur comum e deixar corando

por 1 a 4 minutos (conforme o material: por exemplo,

órgãos como o baço, o fígado e pâncres, devem corar por

cerca de 1,5 minutos, enquanto que órgãos cujas células

tem pouco RNA devem ficar corando por mais tempo). O

frasco com o corante, depois de filtrado, deve ser mantido



HISTORES 13

imóvel (nunca tirá-lo do lugar, nem levantá-lo, nem

sacudí-lo). Além disso, deve-se tomar o cuidado de retirara solução sempre do meio do frasco: não enfiar a pipeta

até o fundo do frasco e nem retirar o corante da

superfície.

Lavar jogando água destilada sobre os cortes com uma

pisseta.

Colocar uma gota de água destilada e deixar sobre o corte

por 30 segundos. Escorrer.

Cobrir os cortes com a solução de fucsina, por 6 a 30

segundos. A fucsina diferencia ligeiramente o azul de

toluidina; assim sendo deve-se colocar a fucsina sobre o

corte e ficar observando; quando começar a sair uma nuvem

azulada retirar imediatamente a fucsina.

Lavar jogando água destilada sobre os cortes com uma

pisseta.

Colocar uma gota de água destilada e deixar sobre o corte

por 30 segundos. Escorrer. A fucsina deve ser bem lavada

para não formar uma semi-lua de corante em volta do corte.

Depois de lavar, cobrir os cortes com uma solução aquosa

de molibdato de sódio a 0,1%, por 30 segundos; escorrer

bem, agitando bem ao ar, para que não fique depósito.

Secar, com um papel de filtro, ao redor do corte.

Colocar na estufa a 37°,para secar.

Montar.

Resultado:



HISTORES 14

Coram-se em azul as substâncias ácidas, como ácidos

nucléicos e alguns grânulos de secreção; coram-se emfucsia as mitocôndrias e outros grânulos de secreção.



HISTORES 15

Observação:

a) Pode-se corar somente com o azul de toluidina, pulando-se a coloração pela fucsina. Se não for corar pela fucsina

deve-se deixar no azul de toluidina por somente 1 a 2

minutos, para não corar demasiadamente.

b) É importante passar pelo molibdato; caso contrário, o

azul de toluidina descora com o tempo.

7. USO DO KNIFE-MAKER LEICA

Este Knife maker deve ser usado para fazer facas de vidro

grossas para microtomia de blocos de historesina que foram

incluídos tanto em forminhas retangulares plásticas como

em cápsulas de gelatina e que serão cortados no micrótomo

Leica ou no micrótomo de parafina antigo usado com

adaptador.

Manipular os vidros pegando sempre nas superfícies, nunca

dos lados.

Lavar as barras de vidro com detergente fraco em água em

água fria e secar com lenço de papel.

Cortar as barras em retângulos sucessivamente menores

(sempre nas metades) até obter quadrados. Para isto

colocar o botão 1 na posição "barras". Levantar a alavanca

3; colocar a barra de forma a encostá-la no pino à

esquerda e encaixá-la no suporte preto; observe que o

risco do fabricante deve ficar para baixo. Abaixar a



HISTORES 16

alavanca 3 com um pouco de pressão; puxar o riscador 2 e

girar a alavanca 4, segurando-a com um pouco depressão atéque o vidro se quebre. Como o vidro vai ficando cada vez

menor e deve ser cortado sempre na metade usar os outros

dois pinos guias para apoiar o vidro.

Os quadrados devem agora ser cortados em triângulos, que

serão as facas propriamente ditas. Para isto, deve-se

mudar o botão 1 para a posição "losango com uma barra

atravessando-o de um lado para o outro totalmente";

levanta-se a alavanca 3; coloca-se o quadrado de vidro com

a parte mais perfeita voltada para o aparelho e não para o

operador; coloca-se a pinça 6 sob o quadrado de vidro e

abaixa-se a alavanca 3; traz-se com cuidado o botão 6 para

a frente até encostar no vidro. Ajuste-se a alavanquinha 5

de modo a somente prender o vidro, sem apertá-lo (este

procedimento tem por função segurar as facas para que no

final elas não caiam e quebrem). Abaixe a alavanca 3 com

leve pressão dos dedos de cima para baixo na parte

superior (branca); risca-se o vidro, trazendo-se o

riscador 2 para frente; coloca-se devagar a alavanca 4

para a direita até que faca começe a quebrar; a partir

daí, esperar até que a faca se quebre sozinha.

8. USO DO KNIFE-MAKER DUPOND DO ADOLPHO LUTZ

Este knife-maker está no Laboratório de Microscopia

Eletrônica do Instituto Adolpho Lutz e deve ser usado para



HISTORES 17

fazer facas de vidro para microtomia de blocos de

historesina que foram incluídos em forminhas retangularesde plástico.

Manipular os vidros pegando sempre nas superfícies, nunca

dos lados.

Lavar com detergente fraco em água fria e secar os

retângulos de vidro (10x5 cm).

Cortar os retângulos de vidro em quadrados grandes de 5x5

cm.

Cortar os quadrados grandes em retângulos de 2,5 x 5 cm e

estes, por sua vez, em quadrados de 2,5 x 2,5 cm.

PROCEDIMENTO PARA CORTAR OS VIDROS:

Passar pincel a superfície do aparelho para eliminar

esquírolas de vidro.

Centrar o retângulo grande no aparelho com a parte riscada

pelo fabricante para baixo. Abaixar a alavanca (1),

rodando a manivela no sentido do relógio até encostar as

borrachas laterais no vidro. Nesta altura a manivela

endurece. A partir daí girar a manivela mais uma volta e

meia, para prender bem o vidro.

Trazer o controle (2) para fora.

Puxar o riscador de vidro (3) para fora, apertar o botão

desse riscador e impulsionar de maneira contínua e

ininterrupta o riscador para dentro. Esta etapa é crítica;

se o botão for apertado demais o risco será fundo e



HISTORES 18

irregular e não se obtém facas boa; se apertar pouco, o

vidro não risca. A intensidade do aperto do botão depende,pois, da experiência. Colocar a tampa de plástico (medida

de segurança).

Rodar o apertador de vidro (4) sempre em sentido horário,

gradualmente, por etapas até quebrar o vidro. Este

processo deverá ser lento. Após cortar o retângulo, virar

a manivela (1) em sentido anti-horário, e retirar o vidro.

Nunca girar o apertador de vidro (4) em sentido anti-

horário (ele volta à posição inicial sozinho).

Seguir sempre o mesmo procedimento de cortar o vidro até

obter quadrados de 2,5 x 2,5 cm.

OBTENÇÃO DAS FACAS DEFINITIVAS:

Colocar os quadrados de 2,5 x 2,5 com o canto mais regular

e mais perpendicular olhando para o aparelho. A borda

irregular do vidro deve ser colocada para cima, isto é, ao

contrário do que foi feito até agora.

Centrar o quadrado na sua posição correta empurrando para

a frente o centrador preto. Com o centrador preto

pressionando a faca, prender o quadrado, girando a

manivela (1) como descrito anteriormente.

Apertar o controle (2) para dentro do aparelho, trazer o

riscador (3) para fora, apertar o botão e riscar o vidro,

colocar a tampa de plástico e girar o apertador (4)

lentamente até quebrar o vidro.



PROCE-ME 1

VI. PROCESSAMENTO DE MATERIAL

PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA

DE TRANSMISSÃO



PROCE-ME 2

ÍNDICE

1. FIXAÇÃO

1.1. Glutaraldeído

1.2. Tetróxido de Ósmio

1.3. Acetato de Uranila

1.4. Rotina de Fixação

2. DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO

2.1. Em araldite 6005

2.2. Em Resapol

2.3. Em Medcast

2.4. Em Araldite CY-205

3. MICROTOMIA

3.1. Uso do piramitomo para desbastar o bloco

3.2. Uso do ultramicrótomo para desbastar o bloco

3.3. Obtenção dos cortes finos

3.4. Coloração dos cortes finos

3.5. Obtenção de cortes ultra-finos

3.6. Coloração de cortes ultra-finos4. CARBONIZAÇÃO

5. PREPARAÇÃO DE TELAS

5.1. Lavagem de telas

5.2. Cobertura da tela com parlódio

6. MÉTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS

BACTERIANOS EM PREPARADO TOTAL



PROCE-ME 3

1. FIXAÇÃO:

Os fixadores usados rotineiramente são: glutaraldeído,

ósmio e uranila. O glutaraldeído fixa as proteínas, o

tetróxido de ósmio fixa principalmente lipídeos, enquanto

que o acetato de uranila reduz a extração de ácidos

nucléicos, fosfolipídeos, proteínas.

1.1. GLUTARALDEÍDO 2,0 % EM TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO E POTÁSSIO 0,15M, pH 7,2

1.1.1. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO

Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09):


Solução B:solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98)


ousolução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98)

26,8 g/100 ml de água destilada67,0 g/250 ml de água destiladaousolução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98)


Guardar as soluções A e B no congelador.



PROCE-ME 4

Na hora de usar, descongelar as soluções estoques e

misturá-las de acordo com a tabela abaixo para fazer

solução tampão sódio-potássio 0,15M; pH = 7,0 a 7,2


28,5 ml 71,5 ml 660 ml

14,25 ml 35.75 ml 330 ml

04,75 ml 11,91 ml 110 ml

Medir o pH do tampão e corrigí-lo, se necessário.

Congelar de novo as soluções estoques.

1.1.2. PREPARO DO GLUTARALDEÍDO:

Existem várias embalagens de glutaraldeído: frascos

grandes de 250 ml e ampolas de 10, 25 e 70 ml com

glutaraldeído. Nestas embalagens o glutaraldeído pode

estar em diferentes porcentagens: 10, 25, 50 ou 70%.

No caso de ampolas, deve-se lavá-las bem com EXTRAN e

enxaguar abundantemente; deixar secar.

Colocar luvas e quebrar a ampola envolvendo-a em uma gaze

limpa, para não deixar a gordura da mão no vidro. Evitar

qualquer contato manual. Deve ser feito em capela, pois é

tóxico.

No caso de frascos com grande quantidade de líquido, deve-

se retirar a quantidade de glutaraldeído desejada com um

pipeta muito bem lavada (com Extran ou solução

sulfocrômica), muito bem enxaguada e seca.



PROCE-ME 5

1.1.3. PREPARO DO GLUTARALDEÍDO A 2%:

Colocar o tampão fosfato 0,15M, pH 7,0 a 7,2, em uma

proveta e por cima despejar o glutaraldeído com um pipeta

muito limpa, misturar e dividir em vidrinhos.

Se a ampola de GA for a 70%, misture 10 ml GA em 340 ml de

tampão;


tampão;


tampão.

Estocar em vários vidrinhos de tamanhos diversos (10 ml,

20 ml, 40 ml) e deixar rotulado (nome, data, pessoa que

fez a solução), no congelador.

Observação: se não for diluir todo o glutaraldeído que

tinha na ampola, deve-se vedar o frasco muito bem e

colocar no congelador, rotulado. Porém, uma vez aberta a

ampola, sempre é melhor diluir todo o seu conteúdo eestocar o glutaraldeído já a 2%.



PROCE-ME 6

1.1.4. FIXAÇÃO DE FRAGMENTOS DE TECIDO POR GLUTARALDEÍDO

Descongelar os vidrinhos de glutaraldeído,

imediatamente antes da cirurgia, aquecendo-os apenas com o

calor da mão. Colocar os fragmentos em vidrinhos contendo

glutaraldeído a 2% em tampão fosfato 0,15M, pH 7,2, e

deixar por 2 horas, à temperatura ambiente.

Se o material for usado para o estudo das fibras do

sistema elástico deve-se dissolver 0,1% de ácido tânico na

solução fixadora de glutaraldeído 2%, na hora de usar,

para aumentar o contraste. Em todo caso, deve-se sempre

fixar fragmentos com e sem ácido tânico.

O fragmento a ser fixado deve ter um dos lados com 1

mm de espessura, para permitir a penetração do fixador.

Aconselha-se a cortar o material na forma de um palito de

cerca de 3 a 5 mm de comprimento, 1 mm de lagura e 1 mm de

espessura.

Após as duas horas, cada minuto a mais que o materialficar no fixador, só contribui para piorar sua qualidade;

assim sendo é essencial que ele seja submetido à rotina de

fixação (lavagem, tratamento pelo tetróxido de ósmio,

seguido de lavagem e colocação no acetato de uranila: ver

ROTINA DE FIXAÇÃO).

Se por acaso, o material for entregue ao Laboratório

no final da tarde e na impossibilidade de alguém ficar por

cerca de 1 hora a mais para seguir a rotina até o acetato

de uranila, então deve-se esperar completar as duas horas

de fixação, lavar em solução de lavagem por um minuto e

deixar em solução de lavagem por, no máximo, 40 horas,

tendo-se o cuidado de retomar o quanto antes a rotina de

fixação.



PROCE-ME 7

1.1.5. FIXAÇAO DE CULTURA DE CÉLULAS

Tratar cada garrafa ou tubo de cultura com 2,0 ml de EDTA0,02% em PBS, por tempo suficiente para descolar a

monocamada.

Colher a suspensão de células num tubo de ensaio, tipo

"Ependorff" ou similar, centrifugar a baixa rotação para

formar um "pellet". A centrifugação deve ser feita por 4

minutos a ½ ponto da centrífuga CELM, cerca de 200 a 500

giros por minuto.

Escoar o sobrenadante.

Ressuspender, adicionando glutaraldeído 2% em tampão

fosfato; com delicadeza, deve-se descolar o "pellet" das

paredes do tubo; deixar no fixador por 5 minutos.

Centrifugar novamente e seguir as demais etapas da rotina

de fixação.

1.1.7. APROVEITAMENTO PARA ME DE PEÇAS INCLUÍDAS EM

PARAFINA

Desbastar o bloco, retirando o máximo de parafina.

Escolher a região que vai ser incluída para microscopia

eletrônica.

Com um bisturi, separar a região escolhida do resto do

bloco.

Deixar overnight no xilol para dissolver a parafina.

No dia seguinte, recortar para o tamanho adequado para

Microscopia eletrônica e hidratá-lo, segundo a bateria a

seguir:

1 banho de álcool 100° por 15 minutos.



Ápos a hidratação, lavar em solução de lavagem.

Colocar no glutaraldeído a 2% em tampão fosfato.

Seguir a rotina de fixação, desidratação e inclusão.



PROCE-ME 8

1.2. TETRÓXIDO DE ÓSMIO

Fazer uma solução-mãe de tetróxido de ósmio a 4% (1,0 g de

ósmio para 25 ml de água deionizada). Para isto:

Lavar bem a ampola de tetróxido de ósmio, com Extran,

lavar em água corrente por 3 minutos (ou deixar de molho

por 4 horas em solução sulfocrômica e lavar por 1 hora em

água corrente). Passar por água deionizada e deixar secar.

Colocar 10 ml de água deionizada no frasco onde será feita

a solução-mãe, colocar a ampola dentro e quebrá-la com

auxílio de bastão de vidro. Acrescentar 15 ml de água

deionizada. Não filtrar (deixar a ampola quebrada dentro

do frasco).

Colocar na geladeira e só usar no dia seguinte, quando

deverá estar totalmente dissolvido.

A solução de tetróxido de ósmio deve ser guardada nageladeira na seguinte embalagem:

Dentro de um vidro coberto com papel alumínio, com tampa

fechada com fita crepe e coberta com papel alumínio;

colocar este vidro dentro de uma embalagem hermética.

Rotular (nome, quantidade, data e quem fez a solução).

Sempre que usar, marcar quem usou, quantidade e data.

Solução de trabalho de tetróxido de ósmio:

Na hora de usar, preparar solução de tetróxido de ósmio a

1%, diluindo a solução-mãe 1:3 em solução de lavagem.

PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM:

NaCl.....................6,0 g

Sacarose................73,0 g



PROCE-ME 9

Água destilada......... completar para 1 litro

GUARDAR NA GELADEIRA

Verificar se não tem fungo antes de usar a solução de

lavagem.

1.3. ACETATO DE URANILA PARA FIXAÇÃO

Fazer uma solução mãe de acetato de uranila a 3% (3 g de

acetato de uranila em 100 ml de água deionizada). Não

filtrar.

Estocar sempre em vidro com tampa de rosca; não usar tampa

de vidro para evitar contaminação.

Guardar na geladeira envolvido por papel alumínio e

rotulado.

Solução de trabalho de acetato de uranila para fixação:

Na hora de usar, diluir a solução-mãe para 1%, misturando

2 ml solução de lavagem e 1 ml de uranila a 3%.

1.4. ROTINA DE FIXAÇÃO

Fazer toda a manipulação dentro da capela

1) Deixar o material na solução fixadora de glutaraldeído

2% em tampão fosfato sódio-potássio 0,15M, pH 7,2, à

temperatura ambiente por 2 horas; jogar o fixador em um

vidro de descarte de glutaraldeído.

2) Lavar 3 vezes em solução de lavagem: tempo total de 1

minuto; jogar a solução de lavagem usada no vidro de

descarte de glutaraldeído.



PROCE-ME 10

3) Para cada vidro com material colocar 2 ml de solução de

tetróxido de ósmio a 1% e deixar 1 hora na geladeira.

Jogar o descarte em um vidro de ósmio usado.

4) Lavar três vezes em solução de lavagem, 1 minuto cada

lavagem, colocando o descarte num vidro de ósmio usado.

5) Para cada vidro com material colocar 2 ml de solução de

acetato de uranila a 1% e deixar "overnight" na

geladeira.

6) Lavar três vezes em solução lavagem.

2. DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO

Este processo deve ser feito em um único dia, não podendo

ser interrompido em nenhuma etapa.

A inclusão pode ser feita em diversos tipos e marcas de

resina e o procedimento para a desidratação varia de

acordo com a resina.As resinas ficam estocadas na geladeira juntamente com o

óxido de propileno e devem ser retiradas da geladeira duas

horas antes do uso.

Enquanto o material está na estufa em resina pura, colocar

resina nas forminhas próprias para inclusão, de maneira a

encher totalmente a barquinha.

Neste momento, coloque também um pedacinho de papel

vegetal (ou manteiga) com o número do registro do

material; escrever com tinta nanquim ou à lápis.

Deixar à temperatura ambiente.

Retire os frascos da estufa e, com o auxílio de um palito

de dente, retire o material e coloque-o nas forminhas na

posição adequada (de acordo com a orientação desejada).



PROCE-ME 11

Após a polimerização (ver o tempo para cada tipo de

resina), retirar os blocos da forminha como se fossem

cubos de gelo; se estiverem grudados, deixe de um dia para

outro à temperatura ambiente. Se os blocos estiverem

grudando sempre, passe um pouco de silicone na forminha

antes de colocar a resina.

Arquive os blocos que não serão cortados imediatamente.



PROCE-ME 12

2.1. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO COM ARALDITE

6005

2.1.1. Desidratação

1 banho de acetona 30°, por 10 minutos



2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada

2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada

2.1.2. Preparação do Araldite 6005

Quando o material estiver no primeiro banho de óxido de

propileno, prepare a resina.

Esta receita dá para a inclusão completa de 4 frascos

contendo material a ser processado.

10 g de Araldite 6005

9,0 g de DDSA (plastificador)

0,46 ml de BDMA (endurecedor)

2.1.3. Infiltração do Araldite 6005

Preparar uma solução de resina diluída em óxido de

propileno, na proporção de 1:2, em quantidade suficiente

para colocar-se 2 ml desta solução em cada frasco contendo

material.

Colocar esta solução nos frascos contendo material e

deixar durante 30 minutos no girador.

Após este tempo, retire a solução 1:2 e coloque 2 ml de

solução de resina diluída em óxido de propileno, na

proporção de 1:1, em cada frasco. Deixar no girador por 2

horas.

Após as duas horas, retirar a solução de resina diluída em

óxido de propileno e colocar cerca de 2 ml de resina pura,



PROCE-ME 13

em cada frasco de material. Deixar 40 minutos na estufa

58°C.

Incluir o material(Ver Ítem Desidratação e Inclusão).

Manter na estufa 58/60°, por 72 horas, antes de cortar.

2.2. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM RESAPOL






2.2.2. Preparação do Resapol

Fazer uma solução que contenha 80% de Resapol 8001 (duro)

e 20% de Resapol T208 (mole). Adicionar peróxido de

benzoila anidro, na proporção de 0,5 g para cada 100 ml deresina.

Fazer uma quantidade de Resapol que seja suficiente para

colocar em cada frasco 5,5 ml de solução até a fase

overnight e 0,4 ml de resina pura por bloco.

2.2.3. Infiltração e Inclusão em Resapol

Colocar nos frascos com o material as seguintes soluções,

nesta ordem:

Solução de Resina Resapol + acetona (1:3), por 30 minutos



Resina Resapol pura, na estufa a 55°, por 12 horas.

Incluir o material (Ver Ítem Desidratação e Inclusão)



PROCE-ME 14

Deixar 3 a 4 dias na estufa 60° para endurecer, antes de

cortar.



PROCE-ME 15

2.3. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM MEDCAST






2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada

2.3.2. Preparação do Medcast

Misturar nesta ordem:

Medcast (resina)..........11,9 g (equivalente a 9,8 ml)

DDSA (plastificador).......2,3 g (equivalente a 2,4 ml)

NMA (endurecedor).........10,1 g (equivalente a 0,3 ml)

DMP-30 (acelerador)........0,4 g (equivalente a 0,4 ml)

2.3.3. Infiltração e Inclusão em Medcast

Colocar nos frascos contendo material uma mistura de óxidode propileno e resina Medcast, na proporção de 1:1.

Deixar por 1 hora, no girador.

Em seguida, dar 2 banhos de resina Medcast pura, com a

duração de 30 minutos cada, no vácuo.

Incluir o material (Ver ítem Desidratação e Inclusão)

Deixar 3 a 4 dias na estufa a 60°, antes de cortar.

2.4. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM ARALDITE CY-

205

2.4.1. Desidratação:





PROCE-ME 16



2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada.

2.4.2. Preparação do Araldite CY-205:

Araldite CY-205...........10 g

DDSA........................8 g

DMP30......................0,6 ml

Dibutil fitalato.........0,035 ml

Misture na seqüência acima e coloque para homogeinizar na

batedeira em rotação lenta (em torno de 30 ac.volts),para

que não se formem bolhas.

Esta receita é suficiente para a inclusão de seis

vidrinhos contendo material.

2.4.3. Infiltração e inclusão em Araldite CY-205:

Colocar o material em uma mistura (1:1) de resina e óxido

de propileno e deixar no girador por 2 a 3 horas àtemperatura ambiente.

A sguir, retirar a mistura anterior dos vidrinhos, colocar

resina pura e colocar na estufa a 37º, por 1 hora.

Retirar da estufa e incluir o material nas barquinhas (ver

ítem Desidratação e Inclusão).

Deixar na estufa a 60º, por 72 horas.

3. MICROTOMIA

3.1. FAZER FACAS DE VIDRO NO KNIFE-MAKER LKB

3.1.1. Corte do retângulo maior:



PROCE-ME 17

Lavar os vidros com detergente neutro (nunca segurá-lo

pelas laterais) e secar com lenço de papel.

O ângulo do Knife-maker deve estar entre 90 e 100° para

que sejam obtidas facas de 50 graus, que são as que se

usam normalmente para microtomia.

Colocar o vidro inteiro no Knife Maker com o lado

serrilhado do fabricante para cima, o vidro deve estar

rente a chapa bege de plástico (A), que determina o

ângulo, e a extremidade direita da faca deve estar na

mesma direção do pontinho (B) no próprio Knife Maker à

direita do suporte do vidro (C). Nesta fase o botão

seletor (1) acima do riscador deve estar nos risquinhos.

Baixar a braçadeira de pressão (2) através da alavanca (3)

fazendo uma leve pressão segurando-a para não dar tranco

sobre o vidro.

Puxar o riscador (4), e girar o botão preto (5) para fazer

pressão até que se possa observar uma "barriguinha" no

interior do vidro; esperar; cortar e separar o retângulo

em dois menores.

3.1.2. Obtenção dos losangos

Colocar um dos retângulos menores de vidro rente a chapa

(A); conforme descrito anteriormente, sendo que a

extremidade esquerda do vidro deve estar encostada no

primeiro pininho de metal à esquerda do riscador (4) e

seguir normalmente como descrito anteriormente até que os

losangos estejam prontos.

3.1.3. Obtenção das facas

Os losangos obtidos devem ser colocados no Knife Maker:



PROCE-ME 18

a) com o lado serrilhado do fabricante para baixo, e os 2

pontos observados no vidro do lado que foi cortado devem

estar para cima, para esquerda e para frente.

b) o botão seletor (1) acima do riscador, deve estar no

25.

c) a escala atrás do vidro deve estar sempre no 2.

d) Encaixe do losango:

prender o botão (6) que está na lateral do aparelho

baixar a braçadeira de pressão (2)

puxar o riscador (4)

girar o botãozinho de escala (35,45,55) (6) até final.

fazer pressão com botão preto (5) até que se possa

observar a formação de "barriguinha" no vidro, o barulho

que indica que o vidro quebrou deve ser seco e oco.

3.2. DESBASTAR O BLOCO

Primeiramente deve-se desbastar o excesso de resina do

bloco.

Para isto pode-se usar o piramitomo ou então, prender o

bloco no ultramicrótomo e apará-lo com uma gilete.

3.2.1. USO DO PIRAMITOMO PARA DESBASTAR O BLOCO

Regras Gerais:

- Travar (LOCKED) 41, cada vez que for mexer nos

parafusos.

- Quando começar a aparecer vermelho na janela (33),

travar e com o 40 voltar tudo até o branco total.

- Após trimar cada face, recuar o braço pora-bloco; para

isto, zerar a escala de espussura, travar o braço e voltar

com o 40.



PROCE-ME 19

Procedimento:

No caso do material ser pequeno, e portanto estar sobrando

muita resina ao seu redor, antes de colocar no piramitomo,

dar uma debastada com a serra ou lima retirando a resina

ao redor do material e também da superfície.

Colocar o bloco no suporte do piramitomo (20) e prender

bem, apertando os três parafusos.

Colocar o suporte na peça 22 do piramitomo.

Colocar a faca de vidro (17) na peça 14 e olhando na lupa,

acertar o fio da faca no eixo X.

Aproximar a faca soltando alavanca 13, e empurrando todo o

suporte (12) colocar a escala em 90° do lado esquerdo do

aparelho. Dessa maneira expõe-se o material a ser cortado.

Colocar o 29 na posição indicada pelo diagrama mexendo o

último parafuso (30).

Começar a cortar com a manivela 42, acertando a micragem

desejada no pino da direita (39).

Aproximar e cortar até chegar na peça.Afastar a faca.

Acertar o cabeçote com desenho da base menor na marca da

esquerda.

Para fazer as bases e os lados colocar sempre o suporte no

60° do lado esquerdo do aparelho.

Faca a 60°.

Aproximar e cortar até que entre base maior e menor tenha

0,3 mm no aumento I (escala na objetiva da esquerda).

Acertar cabeçote com desenho de um dos lados de pirâmide

na marca da esquerda.

Faca a 60°.

Aproximar e cortar até chegar bem perto da peça.

Afastar a faca.



PROCE-ME 20

Mudar cabeçote para a posição com o desenho do outro lado

da pirâmide na marca da esquerda.

Ver esquema no interior da tampa do aparelho (38).

Aproximar e cortar até chegar bem perto da peça e medir na

escala, deixando entre um lado e outro 0,6 mm tomando por

referência a base maior (aumento 1 X).

Afastar faca, retirar faca, retirar bloco, escovar

aparelho, desligar luz e cobrir o aparelho com o plástico.

3.2.2. USO DO ULTRAMICRÓTOMO PARA DESBASTAR O BLOCO

Acoplar o bloco no suporte apropriado para blocos do

ultramicrótomo e, olhando na lupa, aparar a superfície e

as laterais com uma gilete.

3.3. OBTENÇÃO DE CORTES SEMI-FINOS

São cortes de cerca de 1 a 2 µm, também chamados de cortes

grossos, e podem ser obtidos tanto no ultramicrótomo como

no piramitomo.

3.3.1. NO PIRAMITOMO

Coloca-se o bloco de maneira apropriada para cortar-se a

superfície, calibrar para cortes de 2 µm e cortar.

Colocar o corte na superfície de água destilada em uma

cuba; o corte vai esticar. Juntar cerca de 4 a 5 cortes e

colhê-los mergulhando uma lâmina sob os cortes; arrumá-los

com o auxílio de um pincel fino. Secar rapidamente a

lâmina em chapa aquecida ou na estufa. Está pronta para a

coloração.



PROCE-ME 21

3.3.2. NO ULTRAMICRÓTOMO

Acopla-se o bloco no suporte do ultramicrótomo e procede-

se à microtomia, obtendo-se cortes esverdeados (cerca de 2

µm). Os cortes cairão automaticamente na água da barquinha

acoplada à própria faca de vidro utilizada no

ultramicrótomo.

Com auxílio de uma alça de platina ou de um pelo duro

(cílio ou cabelo de japonês) na ponta de um palito, colher

os cortes em uma lâmina. Secar e corar.

4. COLORAÇÃO DE CORTES SEMI-FINOS

Solução corante: Azul de Toluidina a 0,25% em solução

aquosa de borato de sódio a 1%

Preparo da Solução:

1 g de Toluidina

4 g de Borato de Sódio

4 ml de álcool absoluto


Dissolver 1 g de Azul de toluidina em 4 ml de álcool

absoluto.

Dissolver 4 g de borato de sódio em 400 ml de água

destilada.

Misturar as 2 soluções e filtrar.



PROCE-ME 22


À FRIO: Colocar 1 gota sobre os cortes (que deverão estar

sobre uma lâmina de vidro) e deixar corar por cerca de 1

minuto. Lavar em água destilada. Secar no papel de filtro.

À QUENTE: Colocar 1 gota sobre os cortes, aquecer na chapa

rapidamente até formar um halo metalizado. Lavar em água

destilada. Secar no papel de filtro.

Se quiser, pode montar a lâmina com lamínula e resina de

montagem.

5. OBTENÇÃO DE CORTES ULTRAFINOS (ULTRAMICROTOMIA)

Aparar o bloco de modo a conter o local desejado na

superfície de corte.

Colocar o bloco no porta-espécime e fixá-lo no braço do

ultramicrótomo.

Colocar a faca (de vidro ou de diamante) no suporte.

Verificar o grau de inclinação na escala ao lado do

suporte da faca: para facas de vidro deve marcar dois

traços a partir do zero e para facas de diamante deve-se

seguir as instruções do fabricante da faca que estão na

sua embalagem.

Colocar água destilada na barquinha da faca, acertando a

quantidade de água até obter uma superfície espelhada em

função do ângulo de iluminação. Procure obter o máximo de

superfície espelhada



PROCE-ME 23

Para aproximar a faca em relação ao bloco, procure o

reflexo na superfície do bloco; para isto movimente obloco e desloque a fonte de luz.

Aproximar a faca lentamente em relação ao bloco,

utilizando sempre a lupa, até o reflexo na superfície do

bloco desaparecer.

Procurar de novo a maior superfície espelhada possível na

água e cortar.

Desprezar os primeiros cortes. Os cortes deverão sair em

tiras, de cor prateada.

Pescar mais ou menos 4 a 5 cortes com o auxílio de uma

pinça em uma tela de cobre, coberta pelo Parlódio (Ver

PREPARO DAS TELAS).

A faca de diamante só deve ser usada para quem já tem

prática em usar faca de vidro.

6. COLORAÇÃO DOS CORTES ULTRAFINOS

6.1 PRERARO DA SOLUÇÃO DE URANILA

Uranila................0,4g

Etanol 70%.............20 ml

Estocar em geladeira.

6.2. PREPARO DA SOLUÇÃO DE REYNOLDS



PROCE-ME 24

Coloque num béquer limpo 500 ml de água destilada e deixe

ferver até chegar a 250 ml; deixe esfriar um pouco atéficar morna.

Num balão volumétrico contendo 1,76 g de citrato de sódio

e 1,33 g de nitrato de chumbo, colocar 30 ml de água morna

e agitar na mão por 30 minutos. Esta solução deverá ficar

leitosa. Colocar 8 ml de NAOH 1,0N (preparada no momento

do uso) e a solução ficará transparente. Completar com

água até 50 ml. Agitar sem fazer bolhas e medir o pH, que

deve ser cerca de 12 ou 13. Guardar à temperatura

ambiente; quando começar a ficar turvo jogar fora e fazer

outro; antes de desprezar, precipitar o chumbo com algumas

gotas de ácido acético glacial.



PROCE-ME 25

6.3. PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO

Atenção: os cortes devem estar secos e tomar cuidado paranão respirar sobre as telas.

1) Corar com uranila 2% em etanol 70%.

Colocar numa placa de Petri parafinada uma gota da solução

de uranila para cada tela e enfiar a telinha na gota de

maneira que fique coberta. Deixar 30 minutos no escuro.

2) Pegar a tela com uma pinça e sobre um béquer ir

pingando água destilada com uma pinseta, por cerca de 40

segundos. Isto deve ser feito pingando-se a água sobre a

pinça de maneira que ela escorra da pinça para a tela.

3) Deixar secar cerca de 5 minutos numa placa de Petri

forrada com papel de filtro e tampada.

4) Corar com citrato de chumbo (solução de Reynolds).

Para isto, proceder como com a solução de uranila,

deixando a tela mergulhada em uma gota de Reynolds por 15

minutos.

A placa de Petri onde faz-se a coloração pelo chumbo deve

conter umas 20 pastilhas de NaOH para absorver o CO2.

5) Como no caso da uranila, lavar as telas sobre um bequer

durante cerca de 40 segundos.

Ao final, colocar o bequer na pia e deixar escorrer

bastante água.

6) Deixar as telas secarem em placa de Petri tampada por

30 minutos e carbonizá-las.



PROCE-ME 26

4. CARBONIZAÇÃO

4.1. Uso do carbonizador (ou evaporador)

1) Apontar os carbonos e alinhar os suportes. Verificar a

mola que pressiona os eletrodos para que as pontas dos

carbonos estejam em contato.

2) Ligar a chave geral na parede

3) Ligar a água

4) Colocar a válvula 2 vias para cima

5) Ligar o marcador de tempo (Voltar o botão até zerar o

timer)

6) Ligar a bomba mecânica (na segunda chave da esquerda

para a direita). Esperar 3 minutos.

7) Voltar com a válvula 2 vias para a posição preliminar.

Esperar 5 minutos.

8) Colocar a válvula 2 vias em vácuo bomba

9) Ligar a bomba difusora e esperar 2 a 3 minutos

10) Abrir válvula alto vácuo

11) Ligar o vacuômetro de vácuo preliminar e esperar

chegar no final da escala (seta verde)

12) Ligar o vacuômetro de alto vácuo e esperar marcar

entre 10-4 e 10-5 na escala de cima (seta verde). Até aqui

gasta-se cerca de 45 minutos.

13) Desligar os dois vacuômetros

14) Colocar o seletor em 2

15) Ligar a voltagem (Volt)



PROCE-ME 27

16) Girar lentamente o variador de voltagem até o nº 32 e

esperar até a marca do carbono ficar semelhante à dasombra.

17) Desligar o variador de voltagem (girando rapidamente)

18) Desligar a voltagem

19) Voltar o seletor para o 0

20) Fechar a válvula de alto vácuo

21) Desligar a bomba difusora e esperar 25 minutos

22) Colocar a válvula 2 vias em preliminar

23) Desligar a bomba mecânica

24) Apertar o botão de entrada de ar (rapidamente no

início e mais lentamente depois) até parar o barulho de

entrada de ar.

25) Tirar a campânula, com cuidado para não batê-la nos

suportes do carbono.

26) Desligar o marcador de tempo

27) Desligar a chave geral

28) Esperar 20 minutos e fechar a torneira da água.



PROCE-ME 28

5. PREPARAÇÃO DAS TELAS:

5.1. LAVAGEM DE TELAS

As telas utilizadas em microscopia eletrônica podem ser

novas ou reaproveitadas e devem ser processadas da

seguinte maneira:

Tela nova:

Passar pela acetona 5 minutos e secar em papel de filtro

em placa de Petri. Deixar na estufa 1O minutos.

Tela reaproveitada:

Ferver as telas a serem reaproveidas em Extran 2%.

Colocar no Ultrasom, durante 5 minutos.

Lavar bem em água corrente.

Colocar em amoníaco 10% no ultrasom, durante 3 minutos.

Lavar uma vez em água corrente e duas vezes em água

destilada.

Passar em acetona pura, por uma vez.

Secar em papel filtro na placa de Petri a 60° C, por 10

minutos.

5.2. COBERTURA DAS TELAS COM PARLÓDIO

Não colocar os dedos no Parlódio para não engordurá-lo;

pegar com luvas ou pinças.



PROCE-ME 29

Num frasco de vidro com tampa colocar:

Parlódio................................... 1 gAcetato de amila anidro (geladeira)........ 5O ml

Atenção: quebrar as tiras deparlódio sem contacto manual.

Deixar de um dia para o outro para dissolver. Separar em

frasquinhos de 5ml e deixar a temperatura ambiente.

ATENÇÃO: o PARLÓDIO não pode ser jogado na pia.

No dia de cobrir as telas com a película, se for fazê-lo

na sala do microscópio eletrônico, desligar o ar

condicionado da sala (não esquecer de desligar o ME e

deixar o deumidificador ligado). A umidade relativa do ar

deverá estar em torno de 50%.

Na capela da sala do ME, colocar dentro de uma bandeja de

plástico um pirex com água até a boca (até transbordar).

Com uma fonte de luz ver se a água está suja e limpá-la

passando um papel de limpeza de lentes (lens clean paper)

sobre sua superfície.

Com uma pipeta Pasteur de ponta boa colocar uma gota de

parlódio na água (desprezando as primeiras gotas na

bandeja). Na superfície da água vai se formar uma película

de parlódio.

Observe que a tela tem duas faces: uma brilhante e uma

fôsca. Entortar a tela ligeiramente, com auxílio de uma

pinça, de modo a fazer uma concavidade do lado brilhante.

Colocar cerca de dez telas com o lado fosco em contato com

a película. Cobrí-las com um pedaço de Parafilm e com uma

pinça mergulhar as bordas do Parafilm de modo que o



PROCE-ME 30

parlódio recubra todo o perímetro do Parafilm. Puxar na

direção da pessoa, de uma só vez, tirar sem água e semencostar no pirex. Evitar contaminar a água com os dedos.

Em uma placa de Petri com papel de filtro, colocar o

Parafilm para baixo, as telas para cima. Deixar secar até

o dia seguinte, à temperatura ambiente, coberto com tampa.

Verificar se a película está boa, olhando as telas no ME.

Se quiser película mais grossa, colocar 2 gotas de

PARLÓDIO na água do pirex, em vez de uma só.

6. MÉTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS

BACTERIANOS EM PREPARADOS TOTAIS

6.1. SUPORTE:

- Montar uma câmara úmida, contendo um suporte de papel

parafilm ou parafina.

- Utilizar telas de cobre de "300 mesh" previamente

recobertas com película de formvar-carbono. Recomenda-se

empregar Bacitracina (0,01ug/ml em água destilada) como

agente umectante.

- Empregar pinças e vidraria de boa qualidade, limpas,

pipetas descatáveis e tubos Ependorff estéreis.



PROCE-ME 31

6.2. SUSPENSÕES:

6.2.1. Bacteriana

- Partir de uma suspensão de bactérias padronizadas por

método imunológico (por exemplo Imuno DotBlot).

Para o H. influenzae, utilizou-se uma densidade óptica

(DO) = 0,25 p/ 540nm, após a diluição em PBS 0,1M, pH 7,2.

6.2.2. Antissoro

- Determina-se anteriormente a concentração ótima para se

obter melhor título, por método imunológico (Imunno

DotBlot), para que todos os sítios antigênicos estejam

saturados pelo soro policlonal. Empregou-se a diluição

1:100 do anti-25kD (sub-unidade proteica de fímbria

bacteriana) em PBS 0,1M, pH 7,2.

6.2.3. Proteina A-Au (Sigma):

Empregou-se a diluição 1:50 do complexo numa solução

contendo BSA 1,0% em PBS 0,1M de pH 7,2 (nesta diluição o

Au está em excesso e é capaz de saturar, todos os sítios

Fc das Imunoglobulinas).

6.2.4. Solução para contrastação

Solução de sílico-tungstato de sódio (SST) a 1,0% em água

de pH 6,4 até 7,2.



PROCE-ME 32

6.3. PROCEDIMENTO

1) Colocar uma gota (40ul) da suspensão bacteriana no

suporte e sobre ela uma tela (filme voltado para a

suspensão) durante 30 minutos à temperatura ambiente

(aproximadamente 25oC); retirar o excesso com papel de

filtro;

2) Em seguida, colocar a grade sobre uma gota (10ul) do

antissoro específico diluido, durante 60 minutos à

temperatura ambiente (aproximadamente 25oC); retirar o

excesso com papel filtro;

3) Colocar imediatamente a grade sobre uma gota (10ul) da

suspensão de Proteínas A-Au diluida 1:50, durante 20

minutos à temperatura ambiente (aproximadamente 25oC).

4) Lavar a preparação com PBS 0,1M de pH 7,2 durante 1

minuto, empregando-se um jato suave de pipeta Pasteur e

logo em seguida com um jato suave de água bidestilada ou

deionizada durante 1 minuto.

5) Contrastar pelo sílico-tungstato de sódio 1,0% de pH

7,2.

Obs: A contrastação é opcional uma vez que esta promove a

remoção das partículas de ouro.

6) Recobrir com carvão e observar ao M.E.



GUIA-TP 0

X. GUIA DE TRABALHOS PRÁTICOS



GUIA-TP 1

ATIVAÇÃO ESPERMÁTICA, REAÇÃO DO ACROSOMA EFECUNDAÇÃO IN VITRO.

a) Obtenção e manuseio de gametas in vitro

Superovulação

Injetam-se fêmeas adultas de hamster com 25 u.i. de PMSG

(Pregnant mare's Serum Gonadotropin) no dia de post-

estro (Orsini, 1961) e com 25 u.i. de HCG (Human

Chorionic Gonadotrophin) na tarde do 3º dia após a

descarga de post-estro. As fêmeas são sacrificadas por

deslocamento cervical entre 12 e 16 horas após a injeção

de HCG.

Procede-se a uma laparotomia através da linha medio-

ventral, rejeitando as alças intestinais para um lado e

expondo-se a via genital feminina. Uma vez isolados, os

ovidutos são postos em uma placa de cultura de tecidocontendo BMOC - 2 ou BWW (meios de cultura). Com um par

de pinças de relojoeiro rompe-se a ampola do oviduto

para que saiam os ovócitos com células do cúmulo. Também

pode-se lavar o oviduto com o mesmo meio usando uma

seringa com agulha Nº 30 e de ponta romba.

Se os óvulos são recém ovulados, coloca-se a agulha na

extremidade uterina do oviduto, porém se são passadas 24

horas ou mais após a ovulação faz-se a lavagem desde a

fímbria.

b) Remoção das células foliculares

Prepara-se uma solução de hialuronidase a 0,01% em BMOC-

2 na qual se colocam as massas do cúmulo. Ao cabo de



GUIA-TP 2

poucos minutos pode-se observar ao microscópio de

contraste de fase que os ovócitos se desnudam das

células foliculares.

Os ovócitos devem ser manipulados com pipetas de vidro

de 5 cm de comprimento e cujo diâmetro distal não

ultrapasse 0,2 a 0,3 mm. Pode-se usar a pipeta acionada

mediante uma chupeta (fig. 2) ou com a boca.

Com ajuda da pipeta com pouco fluído, os ovócitos ou

ovos fecundados são colocados em uma lâmina com dois

fios de parafina-vaselina paralelos.

Coloca-se a lamínula sobre os fios de parafina, tendo

cuidado para que a gota não se desloque para um dos

extremos. Comprimem-se suavemente os fios de parafina-

vaselina, obtendo-se entre lâmina e lamínula uma câmara

de altura adequada para a observação (recomenda-se uma

altura de 20 a 40 um).

c) Obtenção dos espermatozóides

Machos adultos de fertilidade comprovada são

sacrificados por deslocação cervical. Com uma incisão

médio-ventral expôem-se os testículos e respectivos

epidídimos. Com um par de tesouras corta-se a porção

mais caudal do epidídimo, evitando contaminá-lo com

sangue e logo coloca-se em uma placa de Petri contendo o

meio de cultura cobrindo-se com azeite mineral. Em

seguida, juntam-se 0,2 a 0,3 ml de meio de cultura para

permitir a dispersão dos espermatozóides. Após 5 a 10

min retiram-se os epidídimos ficando só a suspensão de

espermatozóides. Calcula-se a concentração com um

hemocitômetro e ajusta-se para que na solução de

incubação fique 106 espermatozóides/100 microlitro de

meio.

d) Capacitação dos espermatozóides



GUIA-TP 3

Incubam-se 104 espermatozóides/1 ml de soro sanguíneo

(ver mais adiante) a 370C por 3 ou 4 horas em uma placade cultura. Cobrir com azeite mineral. Ao cabo desse

tempo pode-se examinar os espermatozóides com o

microscópio de contraste de fases para avaliar a

ativação e reação do acrosoma (ver Barros, 1974).

e) Inseminação artificial

Fêmeas induzidas a ovular ou superovular são

anestesiadas com Avertina, Nembutal ou éter e, através

de uma incisão médio-ventral, injetam-se nos cornos

uterinos 0,2 ml de uma suspensão de espermatozóides (2

epidídimos para 4 cornos uterinos). Em seguida liga-se o

corno uterino cranialmente da entrada da agulha. Sutura-

se o animal e, aos diferentes tempos desejados, obtém-se

os ovos fecundados. Para uma maior segurança (não muita)

convém inseminar umas 12 horas após a injeção de HCG.

f) Preparação do soro sanguíneo 70oC

Deixa-se coagular sangue humano obtido sem

anticoagulante e depois o submete a centrifugação para a

obtenção do soro. Aquece-se em banho-maria a 70oC por 1

hora o soro obtido com a centrifugação. Passa-se este

soro coagulado por homogenizador e centrifuga-se

novamente a 15 000 rpm (± 27 000 g) durante 30 minutos.

Obtém-se um sobrenadante fluído que, depois de ser

esterilizado por filtração, pode ser envasado em

alíquotas de 1cc a -40oC. Uma vez descongelado, o soro

só deve ser usado uma única vez.

g) Fecundação "in vitro"



GUIA-TP 4

Espermatozóides capacitados (ver ítem d) são utilizados

para inseminar ovócitos "in vitro". O tempo de incubação

durante o qual ficarão ambos os gametas depende doestágio da fecundação que se deseja,. Ao término da

incubação observa-se com o microscópio de contraste de

fase.

REFERÊNCIAS

ORSINI, M.W. (1961) The external vaginal phenomena

characterizing the stages of the oestrous cycle,

pregnancy, pseudopregnancy, lactation and the anestrous

hamster Mesocricetus auratus, Waterhouse. Proc. Anim.

Car. Panel 11: 193.

BARROS, C. (1974) - Capacitation of mammalian spermatozoa.

En Physiology and Genetics of Reproduction, part B,

capítulo 27 (E.M. Coutinho & F. Fuchs, eds). Plenum

Publ. Corp., New York.



GUIA-TP 5

TRANSFERÊNCIAS EMBRIONÁRIAS EM COELHOS

1- COLETA DE OVOS

a) Superovulação: As coelhas doadoras superovulam quando

procede-se à injeção de gonadotrofinas combinadas da

seguinte maneira:

Primeiramente faz-se uma injeção intramuscular ou sub-

cutânea de 150 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum

Gonadotrophin). Após 66 a 72 horas procede-se à

inseminação artificial (ou pareamento natural com dois

machos férteis) e aplica-se uma injeção endovenosa de 50

UI de HCG.

Um outro procedimento que também provoca a

superovulação é a aplicação de duas injeções diárias

intramuscular ou sub-cutânea, durante 3 dias, de 0,5mg

de FSH (Hormônio Folículo Estimulante). No 4º dia

proceder à inseminação artificial (ou pareamento

natural) e aplicar uma injeção endovenosa de no mínimo1,5mg de LH por quilo de peso do animal. Consegue-se

assim cerca de 40 a 60 ovulações.

A sobre-estimulação reduz a porcentagem de recuperação

embrionária pois os estrógenos endógenos influem sobre o

transporte através do trato genital feminino. Além

disto, alguns ovos permanecem nos folículos. A

superovulação também pode ser induzida em fêmeas

imaturas, por exemplo nos coelhos brancos neo-holandeses

as 12 semanas de idade e nas fêmeas holandesas listradas

as 16 semanas de idade.



GUIA-TP 6

Os animais doadores são sacrificados por deslocamento

cervical ou por comoção cerebral, golpeando a nuca com

um pau ou com a mão. Os ovos podem ser recuperados(colhidos) entre 40 e 50 horas "post-coitum" (após

pareamento); extraem-se os ovidutos que são colocados em

placas de Petri esterilizadas e a seguir lavados com uma

solução fisiológica estéril e soro homólogo. Também

podem ser colhidos ovos de coelhos anestesiados,

insertando uma cânula no orifício infundibular do

oviduto e injetando-se líquido pelo vértice do corno

uterino: os embriões devem ser contados e examinados

(para poder-se distinguir anomalias grosseiras) com a

ajuda do microscópio estereoscópico binocular. Os

blastocistos uterinos também podem ser recolhidos in

vivo.

b) Manipulação dos ovos: Tipos distintos de soluções têm

sido utilizadas para manipular ovos incluindo a solução

de Krebs e a soluçõo de Ringer-Dale tamponada com

fosfato contendo glicose. As pipetas de vidro e todomaterial utilizado para manipular ovos devem estar

esterilizados e mantidos entre 30 e 37oC, seja em uma

platina térmica ou em uma incubadora. Os ovos devem ser

manipulados em uma placa de cultura parcialmente fechada

e isenta de luz ultravioleta; deve-se também evitar, na

medida do possível, exposiçõo ao sol ou luz elétrica.

Para exposições prolongadas, recomenda-se a luz

vermelha, pois as menores exposições à luz ultravioleta

podem inibir a segmentação.

c) Seleção dos ovos: As anormalidades estruturais dos ovos

podem resultar de fatores citológicos, genéticos, do

meio circundante ou patológicos; os três primeiros são

aparentemente os responsáveis pela variação no êxito do

armazenamento dos ovos. As anormalidades dos ovos



GUIA-TP 7

incluem: aberrações de tamanho, forma e grau de

granulação ou pigmentação citoplasmática.

2- ARMAZENAMENTO DOS OVOS

a) Meios de armazenamento: A maior parte dos meios de

armazenamento são compostos de solução salina, soro,

proteínas e antibióticos. Por curtos períodos, a solução

fisiológica (0,9% NaCl aquoso) mantém a tonicidade do

ovo; porém não sendo tampão e não contendo os íons

orgânicos não apresenta uma ótima pressão coloido-

osmótica. As soluções fisiológicas se utilizam como:

1. líquidos para lavar o tracto genital, que mantenham a

tonicidade do vitelo;

2. tampão que mantém limite de pH fisiológico (entre 7,2

e 7,6);

3. meios iônicos aquosos imprescindíveis para o metabo-

lismo celular. Os meios de armazenamento rotineiros

contém entre 25 e 50% do soro de coelho. Soro deoutras espécies também têm sido utilizados: os de

cavalo, cachorro, cobaia, rato e porco são adequados

para ovos de coelhos, enquanto que o soro do homem,

ovelha, vaca, cabra e aves contém um fator ovicida. O

soro congelado, o soro reconstituído depois de

liofilizado, liquor de blastocistos e a solução de

gema de ovo citratada, podem substituir o soro

fresco. O sangue do coelho se obtém por punção

cardíaca ou da veia marginal da orelha. Assim obtido,

permite-se coagular à temperatura ambiente (durante

30 minutos) antes de ser centrifugado por 20 a 3000

rotações por minuto. O soro é decantado,

centrifugado, filtrado através de um filtro milipore

de 0,45 u e, em seguida, a este volume de soro

adiciona-se igual volume de solução salina

fisiológica estéril.



GUIA-TP 8

Tudo isto se mantém entre 3 e 4oC. Recomenda-se a

adição de 7% de gelatina ao meio de armazenamento:

prepara-se um meio de gelatina a 14% dissolvendo 14 gde gelatina em 100 ml de solução fisiológica e

autoclavando-o imediatamente para evitar crescimento

bacteriano; a este meio logo se junta solução de

soro: salina na concentração de 1:1 (quer dizer

volume a volume). Depois de armazenar em gelatina a

7% a porcentagem de implantações dos ovos de coelho

ainda se mantém em 53% até 7 dias, porém

transcorridos 14 dias vai declinando gradualmente até

3%.

A sobrevida dos embriões não é afetada pelo

armazenamento a baixas temperaturas quando a solução

contém 7,5 mg de estreptomicina, 4 mg de

cloromicetina, 6,5 mg de paranomicina e 23,9 mg de

penicilina por mililitro de meio líquido. Porém,

concentrações mais altas de antibióticos são tóxicas

para os ovos.

b) Recipientes para o armazenamento: Os ovos são

armazenados em tubos de vidro de 4 ml de capacidade com

um diâmetro interno de 8 mm. A gelatina, a solução

salina fisiológica e o soro são medidos e transferidos

aos tubos com seringas estéreis. Mistura-se

cuidadosamente usando uma pipeta de vidro com chupeta de

borracha. Tem-se que ter o cuidado de evitar que se

formem bolhas de ar. Se os tubos são cheios

completamente até a boca, a evaporação e condensação do

meio não vai acontecer durante o armazenamento. Em um

destes tubos podem armazenar-se entre 10 e 100 ovos.

Também usam-se ampolas de vidro seladas que contenham

0,3 ml de meio e entre 10 e 15 ovos.

c) Temperatura e duração do armazenamento: A temperatura

ótima para o armazenamento é 10oC. O choque "a frigori"



GUIA-TP 9

reduz a viabilidade embrionária e isto pode ser evitado

por aclimatação, ou seja, um esfriamento lento. A

velocidade do esfriamento de 0,01oC por minuto pode serobtida colocando-se os tubos de armazenamento (que

contém ovos) dentro de um banho de 20oC, que é colocado

em um esfriador que o mantenha a 10oC constante.

Os ovos de coelho são armazenados sem que percam sua

vitalidade por períodos maiores que qualquer outro ovo

de mamífero. Está claro que os ovos de coelho diferem

daqueles da maior parte das outras espécies no fato de

que durante seu transporte ao longo do oviduto são

recobertos por uma camada de mucina. Ainda que não haja

nenhuma evidência que demonstre isto, pode ser que esta

camada de mucina proteja os ovos de coelho durante sua

manipulação e armazenamento in vitro. Depois de 5 dias

de armazenamento aparece um acentuado declínio na

porcentagem de sobrevida dos ovos de coelho, porém é

possível armazenar-se ovos com este método e com grande

êxito até 14 dias.

3- TÉCNICA DE TRANSFERÊNCIA

Os ovos têm que ser examinados microscópicamente antes

de serem transferidos a uma receptora apropriada, sã, e

de fertilidade conhecida. O estadio do ciclo reprodutivo

do animal receptor deve corresponder ao estadio do

desenvolvimento do ovo. Por exemplo, se na transferência

o ovo tem dois dias de idade, o receptor terá que ser

injetado intravenosamente com 20 U.I de hormônio

gonadotrófico coriônico (HCG) dois dias antes da

transferência.

O receptor deve ser anestesiado e os ovos transferidos

ao oviduto por meio de uma laparotomia medial ou por

duas incisões nos flancos. As incisões nos flancos são

as mais recomendadas porque é mais fácil encontrar-se o

oviduto e o animal sofre menos trauma. O tecido adiposo



GUIA-TP 10

que rodeia a ampola é levado para fora da cavidade

corporal o que expõe o ovário e o infundíbulo.

Transfere-se entre 3 e 6 ovos à ampola utilizando umapipeta pasteur cujos bordos tenham sido arredondados

pelo fogo e que mantenham um diâmetro de 2 mm na ponta.

O volume do fluido que acompanha o ovo terá que ser o

mínimo possível. É conveniente evitar a deposição de

grandes bolhas de ar no oviduto, apesar de que pequenas

bolhas possam ser utilizadas para marcar a posição do

ovo na pipeta. Para transferência ao útero usa-se uma

pipeta cujos bordos não tenham sido arredondados pelo

fogo. Assim pode-se picar a parede do útero para a

deposição do ovo em seu lúmen. Para transferir

blastocistos grandes utiliza-se uma pipeta maior (de 3

mm de diâmetro na ponta) e torna-se necessária uma

pequena incisão da parede uterina para passar essa

pipeta tão grossa; a incisão deve ser fechada com catgut

após a transferência. Os animais receptores são

laparotomizados 8 dias "post-coitum" para contagem do nº

de implantações e, em seguida, sacrifica-se na data quetenha sido planejada pelo experimentador, antes do

nascimento, para contar-se o nº de fetos viáveis. Nas

fêmeas prenhas em que se desejam, ou que se necessitam

as crias, pode-se permitir a parição. Para laparotomias

e cirurgia menores é imprescindível conhecer algumas

técnicas de anestesias e manter a esterilidade

cirúrgica.

ANESTESIA

Os estudos sobre coelhos freqüentemente requerem

procedimentos cirúrgicos para os quais necessitamos de

uma anestesia adequada. O pentobarbital sódico é

injetado via intravenosa à razão de 30 mg por Kg/peso.

Pode ser utilizado apenas o pentobarbital ou sua

associação com éter. Um simples catéter pode ser



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utilizado para injeção intravenosa (quer dizer um tubo

de polietileno de 30 cm de comprimento unido a uma

agulha em uma ponta e na outra extremidade uma seringa).O barbiturato e/ou o éter podem produzir colapso

respiratório e/ou convulsões que provocam fraturas nas

vértebras ou nos membros. Conseqüentemente tanto a

propiopromazina como o diazepam em combinação com o

paraldeido são recomendáveis para anestesia geral. Pode-

se usar um tranqüilizante e o nembutal. Paraldeído 1 mg

por Kg/peso pode ser injetado intramuscularmente ou

intraperitonealmente. O lugar preferido para a injeção é

a região cranial da coxa.

Utilizam-se o reflexo conjuntival e o reflexo do

beliscão para ver a profundidade da anestesia. Quando a

conjuntiva do canto medial do olho é tocada com o dedo o

movimento das pálpebras indica que o animal ainda não

alcançou o plano cirúrgico de anestesia. Se as almofadas

plantares dos pés e das mãos forem beliscadas com as

unhas, um movimento de flexão dos membros indica que o

coelho não está convenientemente anestesiado. Hávariações individuais quanto as raças que sào

responsáveis pelas acentuadas diferenças no que diz

respeito aos anestésicos.

LAPAROTOMIAS

Os receptores são anestesiados e laparotonizados através

de uma incisão medial. Cortam-se os músculos sub-

peritoniais ao mesmo tempo expondo os órgãos viscerais,

os ovários e os ovidutos se localizam afastando os

órgãos para fora da cavidade.

Deve-se manipular o mesosalpinx e não tocar no oviduto.

Para fechar a cavidade abdominal deve-se reunir os

bordos peritoneais e os músculos abdominais e suturar



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com catgut cromado (00). Os bordos da pele devem ser

reunidos com clips metálicos.

4- TRANSFERÊNCIA DE OVOS A OUTRAS ESPÉCIES

O ovo de uma espécie pode temporariamente estar

armazenado no oviduto ou útero de outras espécies e logo

transferido a um receptor apropriado. Porém os ovos de

furão dividem-se e desenvolvem-se apenas no oviduto de

coelho e os ovos de coelho não sobrevivem nem no oviduto

nem no útero de furão. Os ovos ovinos de dois

blastômeros vivem pelo menos cinco dias e se desenvolvem

até o estadio de blastocisto no tracto genital do

coelho. Esses ovos sobrevivem melhor no coelho do que

quando armazenados durante três dias in vitro a 7oC.

Esse "incubador" pelo que tem sido demonstrado é útil

para transportar ovos ovinos de um continente a outro.

5- CULTIVO DO EMBRIÃO

Existem vários métodos para cultivo de ovos "in vitro"

que facilitam o desenvolvimento do ovo antes da

implantação; estes métodos têm sido especialmente

utilizados para estudar o efeito dos hormônios e dos

compostos que produzem antifertilidade sobre o ovo.

Utilizam-se micropipetas acopladas a seringas para

transplantar ovos à câmara anterior do olho. Os ovos

intra-oculares mostram desenvolvimento normal até o

estágio de mórula, porém, se cultivados em uma câmara

rodeados por filtros de milipore, ou em placas de Petri

cobertos por azeite mineral, se desenvolvem até o

estágio de blastocisto.

BIBLIOGRAFIA



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Hafez, E.S.E (ed). Reproduction and breeding techniques

for laboratory animals. Philadelphia, Lea & Febiger,1970.



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OBTENÇÃO DA CAMADA MUSCULAR INTERNA DEINTESTINO DELGADO DE CACHORRO

I. MATERIAL NECESSÁRIO:

01 cachorro vivo anestesiado.

2 ampolas (0,5 mg cada) de atropina

Recipiente com 300 ml de água destilada a 37ºC

Recipiente com 300 ml de salina a 37ºC mais 0,5 mg de

atropina.

Éter etílico

Gelo

1 seringa de 1 ml com agulha

1 seringa de 5 ml com agulha

1 seringa de vidro de 10 ml com agulha

Material cirúrgico (bisturi, tesoura, pinças dente de

rato, pinças anatômicas)

II. PROCEDIMENTO:

Aplicar 1 ml de atropina no animal. Se for por via

intramuscular deve ser aplicado 15 minutos antes do animal

ser sacrificado. Se for por via intravenosa deve ser

aplicado 5 minutos antes do sacrifício.

Para sacrificar o animal deve ser aplicado

aproximadamente 10 ml de éter em seu pulmão. Caso o animal

não morra deve-se aplicar um pouco mais de éter por via

intravenosa em sua língua.

Assim que o animal tenha morrido, passa-se álcool 70%

em seu abdomem evidenciando a linha mediana do corpo na

altura do umbigo.

O animal deve ser aberto nessa região com um corte de

aproximadamente 15 cm de comprimento, até alcançar a

cavidade abdominal. Nesta encontra-se primeiramente o



GUIA-TP 15

epiplon que deve ser afastado ou retirado; a seguir

encontra-se o intestino delgado de aspecto liso e claro.

Com o auxílio de uma tesoura, retirar um pedaço deaproximadamente 30 cm de intestino delgado e recortá-lo em

pedaços de aproximadamente 5 cm de comprimento. Esses

fragmentos devem ser imediatamente lavados em água a 37ºC.

Após a retirada do conteúdo intestinal, o material

deve ser transferido para um recipiente com salina e

atropina. Observando o relaxamento total do intestino este

deve ser virado com o auxílio de uma pinça dente de rato

de tal modo que tenhamos a luz do intestino (mucosa)

voltada para o lado externo. Depois deste procedimento

todos os fragmentos devem ser mantidos sob baixa

temperatura (gelo).

A seguir, deve-se retirar a mucosa juntamente com a

submucosa. Para isto, deve-se fazer, com uma lâmina de

aço, um corte firme e pequeno no sentido longitudinal de

tal maneira alcançar a submucosa (de aspecto branco e

rígido; abaixo dela encontra-se a camada muscular interna

que apresenta estriações no sentido transversal em formade anéis).

Assim que tenha alcançado a submucosa este corte deve

ser prolongado no sentido longitudinal com o auxílio de

duas pinças dente de rato que irão ampliando a separação

da submucosa produzida pelo corte até obtermos o corte

completo no sentido longitudinal.

A camada interna deve então ser desprendida da sub-

mucosa com o auxílio de uma pinça anatômica.

Em seguida, deve-se "revirar" o intestino, com auxílio

de uma pinça dente de rato, de tal modo que tenhamos a

serosa do intestino novamente voltada para fora. Então

junto a porção onde estava inserido o mesentério deve-se

fazer um pequeno corte no sentido longitudinal (com

cuidado para cortar somente a camada muscular externa, que

apresenta estriações no sentido longitudinal, enquanto a



GUIA-TP 16

camada interna apresenta estriações no sentido

transversal.

Após esse pequeno corte a camada externa deve ser"rasgada" com auxílio de duas pinças e ser desprendida da

camada interna com auxílio de uma pinça anatômica.

A camada interna é obtida em forma de anéis. O

importante é não deixar nenhum resíduo da camada externa e

da submucosa, podendo-se, para isto, até perder um pouco

da camada interna.



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PROCESSAMENTO DE ENCÉFALO DE RATOS:CONGELAÇÃO E PARAFINA

I. SOLUÇÕES

1. Solução Salina Tamponada

- 9 g de cloreto de sódio- 100 ml de Tampão Fosfato 0,1 MDissolver e filtrar.

2. Tampão fosfato 0,2M (ph 7,4)

A: Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O)12,5 g para 2 litros de H2O

B: Fosfato de sódio Dibásico (Na2HPO4.7H2O)83 g para 2 litros de H2O

Misturar os dois e filtrar.

3. Corante de Nissl

Tampão I:H2O destilada - 994 mlÁc. acético glacial - 6 ml

Tampão II:Acetato de sódio - 13,6 gH2O destilada - 1000 ml (completar para)

Solução de Cresil Violeta:...100 ml de H 2O destilada

1 g de cresil violeta

Aquecer sem deixar ferver.

Corante de Nissl:Tampão I.....................230 mlTampão II.....................20 mlSolução de Cresil Violeta.....12,5 ml



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4. Subbing Solution

250 ml de H2O

0,16 g de Sulfato de Potássio e Cromo1,25 g de gelatina

Misturar à temperatura de 70°C e depois filtrar a solução.

5. Solução de Montagem

200 ml de H2O aquecida0,5 g de gelatina50 ml de álcool absoluto50 ml de Tampão Fosfato 0,1M

200 ml de Tampão Fosfato 0,2M

Dissolver a gelatina em 200 ml de água aquecida a 70°C,acrescentando 200 ml de Tampão Fosfato 0,2M, 50 ml deTampão Fosfato 0,1M e 50 ml de álcool absoluto. Filtrar.

6. Solução de Sacarose a 30%

30 g de Sacarose100 ml de Tampão Fosfato 0,1M

Misturar os dois e filtrar. Autoclavar.

II. MÉTODOS

1. Obtenção do encéfalo

Perfundir o animal com Solução Salina e posteriormente comFormol a 10% em H2O destilada. A perfusão é feita pelaaorta, fechando-se a veia cava. Com isso economizam-se assoluções de perfusão e tempo, já que, dessa maneira,perfunde-se somente a parte de cima do animal. Gasta-senisso, aproximadamente 200 ml de cada uma das duas

soluções. Essa perfusão é melhor executada com a ajuda deuma bomba peristáltica.

Após isso feito, retirar o cérebro e mantê-lo por 4horas em Formol a 10%. Colocá-lo na solução de sacarose,na geladeira, até o momento de ser cortado (no máximo ummês, porque funga).



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2. Cortes por congelamento

Preparação das lâminas

- Lavar as lâminas com sabão de côco- Enxaguar com H2O corrente e depois com H2O destilada- Deixar em álcool após a lavagem- Enxaguar em H2O destilada e secar com um pano limpo- Passar as lâminas na “Subbing Solution”- Deixar secar por 24 horas

Cortes no micrótomo de congelação

O cérebro retirado da solução de sacarose é aparado na

região posterior, de modo a que tenha uma base reta parapoder ser fixado (com a solução fixadora Tissue Tek ou coma própria sacarose congelada) no suporte do micrótomo decongelação. Cobre-se o material com gelo seco trituradopor, aproximadamente, 3 minutos. Esse processo decongelação deve ser repetido sempre que necessário. Tira-se o gelo da parte superior do cérebro e inicia-se a

microtomia (cortes de 3µm). Os cortes obtidos sãocolocados, com a ajuda de um pincel fino, na solução demontagem. Novamente, com a ajuda do pincel, “pescam-se” oscortes nas lâminas previamente preparadas. Deixam-se aslâminas secando em estufa a 37°C por 24 horas. Corar comCresil Violeta:

Coloração dos cortes por congelamento:

Passar os cortes por:

- Água destilada - 3 a 5′ - Corante de Nissl - 5′ - Água destilada - lavar o excesso de corante- Álcool 75° - 3′ - Ácido Acético + Álcool 95° (1:10) - diferenciar atéquanto

se queira

- Álcool 95° - 3 a 5′ - Álcool Butílico + Álcool Absoluto (1:1) - 3′ - Álcool Absoluto - 3 a 5′

- Xilol - 5′ - Montar as lâminas



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3.Inclusão em parafina

Fixação:

- Formol a 10% - 24 h

Desidratação

- H2O corrente - 3 h- Álcool 70° - 3 h- Álcool 95° - 12 h- Álcool Absoluto - 12 h- Álcool Absoluto - 12 h- Álcool Absoluto + clorofórmio (1:1) - 2 h

- Benzol (2 h)- Benzol (2 h)- Benzol (1 h)

Inclusão

- Parafina 58-60°C (1,5 h)- Parafina 58-60°C (1,5 h)- Parafina 58-60°C (1,5 h)- Incluir- Cortar

Coloração de cortes em parafina

- Desparafinar e levar até a água- 20′ no corante de Nissl- Deixar escorrer (± 2′)- Lavar 3 vezes em água- ± 10′ fora- 3 vezes no álcool 70° (diferencia muito o corante. Deve-se

passar rapidamente)- 3 vezes no álcool 96°- 3 vezes no álcool absoluto

- ± 10′ fora- ± 10′ xilol

- ± 10′ xilol- ± 10′ xilol- Montar



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INTERAÇÃO COLÁGENO-PROTEOGLIGANAS

1. Com cortes de parafina

Usar 14 lâminas: 7 controles e 7 digeridas pela papaína.

Proceder à digestão pela papaína.Corar as lâminas pelo Picrossírius durante uma hora.Lavar em água corrente.Lavar duas vezes com água destilada.Deixar as lâminas secarem bem, cobertas, na estufa.Raspar os cortes com uma gilete transferindo-os parapequenos tubos de ensaio.

Retirar o corante dos cortes colocando NaOH 0,1N no tubode ensaio. A quantidade de NaOH depende do tamanho doscortes, porém deve-se colocar a mesma quantidade para oscortes controles e os digeridos.Esperar alguns minutos para que o corante reaja com oNaOH.Ler a absorbância em espectofotômetro em comprimento deonda de 540 nm.Se possível, ler alguns cortes controles e algunsdigeridos com a papaína em citofotômetro ou em umanalisador de imagens digital.

Para calcular a interação colágeno-proteoglicanas:

Absorbância digerido = 100% (máxima captação doPicrossírius pelo colágeno, sem bloqueio pelasproteoglicanas).Absorbância do controle = X (captação do Picrossíriuspossível, com bloqueio do colágeno pelas proteoglicanas)100 - X = % de captação do Picrossírius que foi impedidapelas proteoglicanas, portanto este é um índice dainteração do colágeno com as proteoglicanas.

manual tecnicas - usp

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