manual microbiologia aplicada

8/21/2019 Manual Microbiologia Aplicada

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MANUAL DE MICROBIOLOGA APLICADA A

LAS INDUSTRIAS FARMACUTICA,

COSMTICA Y DE PRODUCTOS MDICOS

Hctor Cerra

Mara Cristina Fernndez

Celina Horak

Mnica Lagomarsino

Graciela Torno

Esteban Zarankin


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MANUAL DE MICROBIOLOGA APLICADA A

LAS INDUSTRIAS FARMACUTICA,COSMTICA Y DE PRODUCTOS MDICOS

Editores:

Hctor Cerra


Celina Horak

Mnica Lagomarsino

Graciela TornoEsteban Zarankin

Divisin de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos

Subcomisin de Buenas Prcticas

ISBN 978-987-26716-3-1


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos II

La recompensa del trabajo bien hecho es la oportunidad de

hacer ms trabajo bien hecho.

Jonas Edward Salk


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos III

BIOGRAFAS DE LOS AUTORES

Nstor Oscar Aversa: Bioqumico egresado de la Universidad de Buenos Aires. Ingeniero Certificado enCalidad (American Society for Quality - ASQ), Miembro Senior de la ASQ, Diplomatura en Gestin de la Calidad(IEEC). Actual Director de Espiral de Calidad, Consultora y Capacitacin en Calidad. Previamente y durante

casi 35 aos ininterrumpidos ha desempeado funciones Gerenciales de Calidad en Alcon Laboratorios,Farmasa Farmacutica Argentina, Astra S.A.P.F. y Q., G&M S.A. y Gador S.A. Ha realizado auditoras enUruguay, Chile, Colombia, Paraguay y Mxico. Fue conferenciante en Congresos ASQ (USA) y AOAC (Brasil) yha dictado cursos en Argentina, Uruguay, Paraguay sobre variados temas como Aseguramiento de la Calidad enLaboratorios Analticos y Microbiolgicos, Planeamiento Estratgico de la Calidad, Costos de Calidad, Reclamos,Sistema CAPA, Control Estadstico de Procesos, Diseo de Productos, Anlisis de Riesgo, Agua de UsoFarmacutico y Formacin de auditores, entre otros temas.

Nora Estela Carbone: Es Farmacutica graduada en 1989 y Bioqumica graduada en 1990, ambas en laFacultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Es especialista en Esterilizacin,ttulo recibido tambin en la UBA en 1997.Es Jefe de Esterilizacin de la Fundacin Favoloro - Hospital universitario desde marzo del 2010.

Es docente de la materia Prctica Hospitalaria I de la Carrera de Medicina de la Universidad Favaloro. Es docente invitada de la materia Esterilizacin I de la Carrera de Especializacin en Esterilizacin de laUniversidad Nacional de Crdoba.Es Miembro de la Subcomisin de Productos Mdicos de la Farmacopea Argentina.

Susana Carnevali: Bioqumica (UBA). Especialista en Calidad Industrial (Univ. Nacional San Martn). Diplomadaen Constructivismo y Educacin (FLACSO Argentina y Univ. Autnoma de Madrid). Profesora de MicrobiologaGeneral y Alimentaria y de Bromatologa y Tecnologa de los Alimentos en el IUCS, Fundacin Barcel.Investigadora categorizada de la misma institucin. Asesora metodolgica en la elaboracin del Trabajo Final deInvestigacin de la Carrera de Nutricin. Evaluadora Coordinadora y Evaluadora Tcnica en Microbiologa yEnsayos Biolgicos para Laboratorios de Ensayo. Inspectora de Buenas Prcticas de Laboratorio (OECD) yMiembro del Comit de Ensayos Qumicos, Biolgicos y de Buenas Prcticas de Laboratorio del Organismo

Argentino de Acreditacin. Autora de captulos de libros y de artculos cientficos publicados en Revistasnacionales e internacionales sobre calidad, educacin e inocuidad de los alimentos. Disertante en Jornadas yCongresos Cientficos. Mencin honorfica en el VI Congreso Iberolab, 2011. 2do. Premio en el rea EducacinInicial. Concurso Docentes que cuentan Educambio 2007. Miembro de diversas asociaciones profesionales.

Hctor Cerra: Licenciado en Tecnologa Industrial de los Alimentos, egresado de la Facultad de CienciasAgrarias de la Universidad Argentina de la Empresa (UADE). Comenz su actividad profesional en 1984 en elInstituto Nacional de Medicamentos realizando una beca en el Departamento de Biologa. Se ha desempeadocomo Ayudante de primera y Jefe de Trabajos Prcticos en las ctedras de Microbiologa de la Facultad deCiencias Agrarias de la UADE. A partir de 1986 y hasta el presente trabaja en Laboratorios Boehringer Ingelheimdonde se desempea como Supervisor de Microbiologa.Desde 1983 es miembro de la Asociacin Argentina de Microbiologa (AAM) ocupando varios cargos en laDivisin Alimentos, Medicamentos y Cosmticos (DAMyC) y en la Subcomisin de Buenas Prcticas. Esmiembro de la Subcomisin de Microbiologa de la Farmacopea Argentina. Fue miembro del Comit Organizadordel 1 y 2 Congreso Latinoamericano de Microbiologa de Medicamentos (CLAMME).

Carlos Chiesa: Bioqumico UBA. Consultor independiente especializado en Planeamiento y Desarrollo deprogramas de Calidad orientados a alcanzar los requerimientos de las normas de Buenas Prcticas deManufactura (GMP) nacionales e internacionales aplicadas a empresas de la industria farmacutica, cosmtica,farmoqumica, alimenticia y veterinaria.Previo a su actividad independiente, desempe funciones gerenciales en Gador SA (Divisin Farmoqumica),Grupo Sintyal, American Cyanamid (Lederle), Laboratorios Glaxo (Argentina e Inglaterra), entre otrasimportantes empresas. Recibi entrenamiento en Sistemas de Calidad (GMP) en Inglaterra (Glaxo CasaMatriz) durante un ao. Atendi inspecciones de la FDA en Argentina con resultados muy satisfactorios.En el mbito acadmico se desempe como docente en: Facultad de Farmacia y Bioqumica UBA (Ex Jefe deTrabajos Prcticos).


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos IV

Mino Covo:Es ex Presidente de Filtrar Ingeniera SA, de Microfilter SA, de Mino Covo SA (convertida a PallTechnologies SA), ex Presidente de Captulo Argentino de Filtration Society, y ex representante de The BakerCompany, Cambridge Filter Corporation, Finn Aqua, Pall Corporation, PMS, ATI, Donaldson, etcCursos realizados en Harvard University Air Cleaning Laboratory, en Eagleson Institute Maine (USA), ISPE(USA), PDA (USA), etc. Dict cursos desde 1974 para la Sociedad Argentina de Farmacia y Bioqumica(SAFyBI), ISPE, Universidad de Buenos Aires, Universidad de Sao Paulo, Comisin Nacional de EnergaAtmica (CNEA) Santiago de Chile, Instituto Nacional de los Medicamentos (INAME), ANMAT, etc. Publicvarios libritos como El Filtrado Industrial del Aire, Filtragem de Ar (Brasil), Filtracin de aire para la industriafarmacutica, Filtracin de fluidos, Apuntes sobre filtracin de fluidos, y numerosos artculos en revistastcnicas.Es socio vitalicio de ASHRAE American Society of Air Conditioning Engineers.

Miguel DAquino: Profesor Emrito de la Facultad de Farmacia y Bioqumica (FFyB) de Universidad de BuenosAires (UBA). Se gradu como Dr en Bioqumica y Farmacia en la UBA. Fue Profesor Adjunto y Asociado deMicrobiologa; Prof. de Higiene y Sanidad; Prof. de Mtodos Microbiolgicos aplicados al Control de Calidad, yProf. de Microbiologa de Alimentos I, en la carrera Ingeniera de alimentos UBA Lujn. Fue director delDepartamento de Sanidad y Consejero Titular de la FFyB; Director del rea de Carreras de Especializaciones

(Escuela de Graduados de FFyB, UBA); Director de Carrera de Especializacin PRODUCCIN DECOSMTICOS y de numerosos cursos de postgrado; y Director de numerosos subsidios de investigacin deUBA y CONICET. Fue adems Director de 11 Tesis de doctorados finalizadas y 1 en fase de finalizacin. Publiclos libros: Desinfeccin EUDEBA 1995 Co-autor R. Rezk; Saneamiento-Higiene y Sanidad. Ed. Macchi, 1999y El saneamiento al alcance de todos (2004 indito); as como captulos en otros libros. Public ms de 120trabajos en revistas nacionales y extranjeras. Patent Superficies Antimicrobianas. Acta N P-070101064 del16/3/2007.

Jos Julio Degrossi: Farmacutico (UBA 1994). Especialista en industrias bioqumico farmacuticas conorientacin garanta y desarrollo de calidad (UBA 2000). Doctor de la Universidad de Buenos Aires, reaMicrobiologa (2010).Docente auxiliar de la Facultad de Farmacia y Bioqumica - UBA desde el 1994. Participa en el dictado de la

materia Higiene y Sanidad y de cursos y materias de postgrado (Mtodos microbiolgicos aplicados al control decalidad, Microbiologa sanitaria, entre otros). Desde el programa de transferencia tecnolgica de la Facultad deFarmacia y Bioqumica, UBA realiza anlisis microbiolgicos y ensayos de eficacia de desinfeccin paraterceros.Posee ms de 60 presentaciones en reuniones cientficas y 23 artculos publicados en revistas nacionales einternacionales. Participa del Grupo de Trabajo en Burkholderia cepaciadependiente de la Asociacin Argentinade Microbiologa y del International Burkholderia cepaciaWorking Group.

Claudio Denoya, Ph.D.: He is a Senior Director of Research and Development, Biopharma Group, Life SciencesDivision, Pall Corporation. Responsibilities include New Technologies, Rapid Microbiology, ProcessDevelopment, Validation, Guidelines, and Technical Customer Support. Dr. Denoyas previous position was as aResearch Fellow and Group Leader of the Microbiological Technology Assessment group at Pfizer Global R&D.

He is also an Adjunct Professor at the Department of Molecular and Cell Biology, Univ. of Connecticut. Prior toPfizer, he worked in Bacillus subtilismolecular genetics at the Public Health Research Institute, and before that,he worked in animal viruses and vaccine production, and he formed and led a genetic engineering group at thebiotech company BioSidus, Argentina. He has authored over 80 patents, book chapters, and journal articles and200+ technical presentations. Dr. Denoya holds a Ph.D. in Biochemistry and Molecular Genetics of AnimalViruses, a M.S. in Biochemistry and Microbiology, and a B.S. in Clinical Biochemistry from the University ofBuenos Aires.

Patricia Domnguez: Bioqumica (1982) y Farmacutica (1986) de la Universidad de Buenos Aires (UBA)Especializacin en Industrias-Bioqumico-Farmacuticas especializacin Desarrollo y Garanta de Calidad (UBA1999). Quality Assurance (UB 2002)). DGQ-QM (INTI 2005).Certificate of Specialist Microbiologist inPharmaceutical and Medical Devices of the National Registry of Certified Microbiologists of the American Collegeof Microbiology USA. Concurrente al Servicio de Bacteriologa del Laboratorio de Anlisis Clnicos del HospitalEscuela Jos de San Martn (1983 -1985). Becaria en el Departamento de Microbiologa del Instituto Nacional de


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos V

Bacteriologa y Bromatologa (INFYB hoy INAME 1985-1987). Supervisora Laboratorio de Control de Calidad deOrganon Argentina S.A (1987-1995). Coordinadora de Microbiologa y Documentacin en Bayer S.A (1995-2005). Actualmente y desde 2005, Jefa de Documentacin/ GMP QA y Co-Directora Tcnica en Bayer S.A.Miembro de ASM, ASQ, AAM, SAFYBI.

Maria Cristina Fernandez: Bioqumica y Farmacutica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica (FFyB) de laUniversidad de Buenos Aires (UBA). Fue responsable del Sector Productos no estriles en el Departamento deMicrobiologa e Inmunologa del Instituto Nacional de Medicamentos (1984-2010). Fue Auditora Tcnica en laAdministracin Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnologa Mdica (ANMAT) (2010-2011). Actualmenteforma parte del Departamento de Estudios y Proyectos de la ANMAT. Posee treinta publicaciones y posters enCongresos nacionales e internacionales. Es co-autora de cinco captulos de manuales y libros. Es coordinadorade la subcomisin de Buenas Prcticas de la Asociacin Argentina de Microbiologa. Es docente de la Ctedrade Microbiologa y del curso para graduados Control Microbiolgico aplicado al Control de Calidad de la FFyBde la UBA. Ha participado como disertante y coordinadora de numerosas actividades relacionadas conMicrobiologa de medicamentos, cosmticos y alimentos. Es miembro del Comit de Microbiologa y Presidentede la Seccin Latinoamericana de la AOAC International.

Mirta Franco: Doctora en Farmacia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Ingres en laCtedra de Microbiologa de la Facultad de Farmacia y Bioqumica (FFyB) -UBA- en 1969. Ocup all los cargosde Subsecretaria de Ciencia y Tcnica (1994-1998), Secretaria de Ciencia y Tcnica (1998-2006) y Secretaria dePostgrado (2006-2014). Actualmente es Profesora Titular Regular de Microbiologa, a cargo de la Ctedra deMicrobiologa, Directora de las Carreras de Especializacin en Esterilizacin para Farmacuticos y Directora decursos de postgrado sobre Microbiologa aplicada a la esterilizacin y al anlisis de medicamentos. En laFacultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumnfue Directora de la Carrerade Especializacin en Esterilizacin(2001-2012). Es autora de captulos de libros sobre Nutricin, Crecimiento yMetabolismo Bacterianos y Respuesta inmune a las infecciones bacterianas, Fuentes de contaminacin einfeccin, etc. Es coautora de publicaciones cientficas en revistas nacionales y extranjeras con referato y depresentaciones en Congresos y Reuniones Cientficas, principalmente sobre factores de virulencia bacterianos yprevencin de infecciones. Es Directora de Tesis doctorales en el rea Microbiologa.

Beatriz Nlida Giampaolo: Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires, profesional de INAME desde 1979,actualmente Jefe de Servicio del Servicio de Ensayos de Pureza, del 1990 al 2007 Subrogante del Departamentode Productos Biolgicos. Inspectora INAME, especialista en Productos Biolgicos y experta en EndotoxinasBacterianas, acreditada en PICs y MERCOSUR. Actuacin en la Farmacopea Argentina 7ma ed. comoCoordinadora de la Subcomisin de Productos y Mtodos Biolgicos; actualmente como miembro de laSubcomisin de Biotecnologa. Redaccin de normas de SPGV, dispositivos mdicos y registro de PB. Hacoordinado, dictado y participado en ms de 25 cursos, 5 publicaciones y ms de 35 presentaciones a simposiosy congresos en los temas de su especialidad y BPM en el mbito nacional e internacional. Actuacin en el comitde Expertos de PICs de Sangre y Tejidos (Terapia Celular y de Tejidos) en la Reunin de AutoridadesNacionales Reguladoras de Productos Biolgicos en Latino Amrica y el Caribe en la Reunin de ProductosBiolgicos/ Biotecnolgicos.

Celina Horak: Licenciada en Tecnologa Industrial de los Alimentos (Universidad Argentina de la Empresa) yMagister de la Universidad de Buenos Aires en Biotecnologa. Trabaj en el Instituto Nacional de Medicamentos,de la ANMAT, desde 1992 hasta 1993, desarrollando tareas de Control higinico y de esterilidad de frmacos,productos mdicos y alimentos. Desde Marzo de 1993 a la actualidad, desarrolla sus actividades en la ComisinNacional de Energa Atmica, como Jefe Divisin Aplicaciones Biolgicas. Experta del Organismo Internacionalde Energa Atmica en Sistema de gestin de calidad en Bancos de Tejidos y Esterilizacin por irradiacin. Esdocente invitada de la materia Esterilizacin II de la Carrera de Especializacin en Esterilizacin de laUniversidad Nacional de Crdoba. Docente de la carrera de posgrado Especializacin en Radioqumica yAplicaciones Nucleares (UNSAM-Instituto Beninsom, CNEA). Participacin en el subcomit de IRAM sobreEsterilizacin de Productos para el Cuidado de la Salud. Miembro de la Subcomisin Buenas Prcticas deMicrobiologa de la AAM; secretara de la Asociacin Argentina de Bancos de Tejidos y de la AATA.


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos VI

Sergio Iglesias: Es Licenciado en Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de laUniversidad de Buenos Aires, especializado en Biologa Molecular. Seminario de Licenciatura Produccin deAntgenos Recombinantes de Trypanosoma cruzi y su Potencial en el Diagnstico de la Enfermedad de Chagas(Dir: Alberto Frasch). Instituto de Investigaciones Bioqumicas, Fundacin Campomar. Efectu el curso dePosgrado de Quality Assurance de la Universidad de Belgrano. Fue docente de Qumica Biolgica (FCEN-UBA). Public en revistas nacionales e internacionales. Particip y dict conferencias en congresos comoCLAMME I y II, SAFyBI, y 1er Congreso Cientfico Nacional del Laboratorio de Salud de Guatemala. Dicta cursosen la Asociacin Qumica Argentina y se desempea como 2do. Jefe de Microbiologa en GADOR SA.Anteriormente fue Encargado de Desarrollo Tecnolgico en Biotecnologa en GADOR SA., participando deldesarrollo de un equipo diagnstico con antgenos recombinantes para Chagas.

Luis Jimnez: En la actualidad ocupa la posicin de profesor asistente de Microbiologa en el BergenCommunity College y de profesor adjunto de Biologa en la Universidad Fairleigh Dickinson, ambos ubicados enel norte de Nueva Jersey, Estados Unidos de Amrica. Tambin es consultor de aplicaciones biotecnolgicas alos problemas ambientales, clnicos, e industriales. Tiene 17 aos de experiencia en las industrias biotecnolgicay farmacutica, en las cuales ha participado en el desarrollo de varios productos para aplicaciones clnicas yambientales. La experiencia del Dr. Jimnez en estas reas se refleja en 51 publicaciones, 8 captulos de libros,

1 tomo, 1 patente, y 74 presentaciones. Termin su doctorado en Microbiologa Ambiental de la Universidad dePuerto Rico y realiz su tesis doctoral bajo la supervisin del doctor Terry Hazen en la planta de Savannah Riveren Carolina del Sur, en virtud de una beca predoctoral en Bioingeniera y Microbiologa del Departamento deEnerga de los Estados Unidos y de los Institutos Nacionales de Salud. Realiz estudios post-doctorales enBiotecnologa Ambiental de la Universidad de Tennessee, en Knoxville, bajo la supervisin del Dr. Gary Sayler.

Mnica Lagomarsino: EsLicenciada en Ciencias Qumicas con orientacin Qumica Biolgica y Licenciada enAnlisis Biolgicos (Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA). Comenz su actividad profesional en laindustria farmacutica en el Departamento de Control de Calidad de Farmasa Farmacutica Argentina (SterlingCo., hoy Glaxo SmithKline). Actualmente es Jefa de Microbiologa en GADOR SA. Ha participado en simposios ycursos y ha publicado trabajos en el pas y un captulo del libro "Microbiology and Sterility Assurance inPharmaceuticals and Medical Devices" publicado en India por Horizons. En congresos de SAFyBI ha sido

disertante en reas de Microbiologa y Garanta de Calidad, y coordinadora en el rea de Microbiologa. Fuemiembro del comit organizador y disertante en el 1 y 2 Congreso Latinoamericano de Microbiologa(CLAMME). Es miembro de la American Society for Microbiology (ASM), de la subcomisin de Microbiologa dela Farmacopea Argentina, y de la Subcomisin de Buenas Prcticas de la divisin DAMyC de la AsociacinArgentina deMicrobiologa.Carlos Luis Llorens: Es arquitecto graduado en 1970 en la Facultad de Arquitectura y Urbanismo de laUniversidad de Buenos Aires (UBA). Es socio gerente de Biglieri Llorens / Arquitectos S.R.L., de ampliatrayectoria en el proyecto de obras industriales farmacuticas, farmoqumicas y veterinarias. 74 obras con unasuperficie cubierta de 240.000 m2, entre proyectadas, terminadas o en curso avalan una experiencia de ms de20 aos de su Estudio profesional en el diseo y direccin de este tipo de obras.Ha dictado cursos, charlas, participado en seminarios, exposiciones en Argentina, Chile, Uruguay, Per y

Colombia; ha colaborado en libros y publicado artculos en Pharmaceutical Technology referidas a suespecialidad. Es miembro de Comisin Directiva de ISPE Argentina. Participa activamente en ETIF comoConsultor desde su inicio.

Mara Rosa Marello:Es Licenciada en Ciencias Qumicas de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA,y Licenciada en Tecnologa Industrial de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agrarias, UADE. Ha asistido anumerosos Cursos, Seminarios y Congresos organizados por SAFYBI, AAM, Biopore, BioMerieux. Trabajospresentados: Actualizacin de un mtodo de valoracin de cianocobalamina y compuestos smiles, Congresode Microbiologa, AAM; Efectividad de algunos agentes conservadores en emulsiones SAFYBI;Comportamientomicrobiolgico de algunos sistemas de conservadores en emulsiones, V Congreso Argentinode SAFYBI; Control microbiolgico de reas productivas no estriles- Revista SAFYBI, entre otros. Se hadesempeado como Jefa de Microbiologa en Laboratorios Mead Johnson y Laboratorios Casasco. Actualmentees asesora en empresas de la industria de medicamentos y cosmticos. Es Miembro de la Subcomisin deBioseguridad y Biocustodia, AAM.


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos VII

Jos E. Martnez: Es un consultor y gestor de proyectos para las compaas farmacuticas, de biotecnologa yde dispositivos mdicos. Se especializa en la Transferencia de Tecnologas, Validacin/ Calificacin yMicrobiologa. Posee una licenciatura de cienc ias (BS), Magna Cum Laude, con concentracin en TecnologaMdica y tiene una maestra en ciencias en dos especializaciones, Bioqumica y Microbiologa. Ha publicado 11artculos en revistas profesionales tales como Pharmaceutical Technology y BioProcess International. Escribiun captulo para el libro de texto y consulta titulado "Advance Techniques in Instrument Qualification,Performance Verification and Analytical Method Validation", 2010. Fue co-autor del estndar WK11898 de laASTM Practice for Real-Time Release of Pharmaceutical Water for The Total Organic Carbon Attribute , 2010.Ha sido orador principal de seminarios en Amrica Central y del Sur, Puerto Rico y los E.U.A. Tiene 27 aos deexperiencia en los departamentos de validacin, servicios tcnicos, control de calidad y de microbiologa.

Russ Nyberg: He is the Biological Technical Support for Raven Labs, Instructor for PDA Training InstituteFaculty, and Instructor for ABSA. His present area of expertise is the use of Biological Indicators for sterilizationprocesses in the Pharmaceutical Industry. On behalf of Raven Labs, Russ participates in numerous seminars andpresentations. And he has had numerous articles on Sterilization Technology and Biological Indicators publishedin Infection Control Today, BioMed, Journal of Validation Technology, Managing Infection Control, AWWAJournal, Journal of Validation Technology, Pharmaceutical Technology, ICT, PMF NewsLetter and PDA Journal.

He serves as Committee Member for Biological Indicators, Resistometer, Industrial Steam and ProcessChallenge Device Committees at AAMI (Association for the Advancement of Medical Instrumentation).Professional Organizations: ABSA (American Biological Safety Association), AWWA (American Water WorksAssociation), PDA (Parenteral Drug Association), ASM (American Society of Microbiology), AAMI (Association forthe Advancement of Medical Instrumentation), IFTPS (Institute for Thermal Processing Specialists)

Antonia Petracca:

Lic. en Ciencias Biolgicas (UBA). Actualmente Inspector Fase IIIMERCOSURInspectorPIC/S, en el Instituto Nacional de Medicamentos. Ex-responsable del Sector de Esterilidad del Servicio deBioseguridad del Dto. de Microbiologa e Inmunologa. Ex-docente en la Ctedra de Ecologa General del Depto.de Biologa en la Fac. Ciencias Exactas y Naturales (UBA). Ex-docente del curso de posgrado ControlMicrobiolgico de Medicamentos de la Univ. Catlica de Crdoba. Docente de los Cursos de Capacitacin paraInspectores en la Fase I y Fase II- MERCOSUR y Curso a Distancia de BPFyC. Entrenamiento a inspectores,

becarios, residentes y pasantes del INAME. Disertante en congresos y cursos en la especialidad. Secretaria deActas de Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiologa, organizadas por la AAM y la SUM. Integrante delSub-comit de Agua y SPGV de la Farmacopea Argentina. Miembro titular de la AAM. Ex-Presidente de laAsociacin de Profesionales del INAME. Ex-miembro de la Regulatory Affairs Professionals Society, con sede enRockville-MD-USA y de la Comisin Permanente de la Carrera Profesional- ANMAT. Docente en Escuela deEducacin Tcnica E.T.N 33.

Silvia Elena Rastelli:Lic. en Biologa (orient. Ecologa), Facultad de Ciencias Naturales y Museo (FCN y M) dela Universidad Nacional de La Plata (UNLP). Inscripta en la carrera del doctorado de la Facultad de Cs. Exactasde la UNLP con el tema de tesis: Efecto de biopelculas bacterianas sobre materiales de redes de distribucinde agua potable e interaccin con metales txicos. Beca de inicio: Agencia Nacional de Promocin Cientfica yTecnolgica (2007-2010). Beca Interna Tipo II CONICET (2011-2013). Ha asistido y/o aprobado 3 cursos de

grado (1997-2001) y 14 de posgrado (2005-2011). Ha participado en 26 reuniones cientficas nacionales,regionales e internacionales (1998-2011), en 12 de ellas present trabajos en forma oral o de pster cuyosresmenes o trabajos completos fueron publicados en las actas de dichos congresos o reuniones. Docencia ennivel medio y pre-universitario en el rea de Ciencias Naturales y Biologa (2004-2010), y en nivel universitariocomo Ayudante Diplomado, D.S. en la Ctedra de Botnica Sistemtica II, Plantas vasculares. FCN y M (2007 ala actualidad).

Blanca Margarita Rosales:Dra. en Ciencias Qumicas de la Universidad de Buenos Aires (UBA)(1968). JefaDepartamento de Investigaciones en Corrosin, CITEFA (1972-2002). Investigadora independiente del CONICETen CIDEPINT (2003- 2008). Especialista en: Corrosin Atmosfrica, Corrosin Microbiolgica, Inhibidores deCorrosin, Conservacin de Patrimonio Cultural, Red de Distribucin de Agua Potable de Ciudad de Bs. As.,Corrosin en Industrias (Aeronutica, Automotriz, Ferroviaria, Gas y Petrleo, Hidrulica, Militar, Minera,

Metalrgica, Naval, Peritajes Tcnicos, Qumica, Recubrimientos Orgnicos e Inorgnicos, Siderrgica,Telecomunicaciones) (1976-2010).Proyectos internacionales: 3 sobre Corrosin Atmosfrica: "ISOCORRAG", (ISO, 1988-98) - "MICAT", (CYTED,


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos VIII

1988-95) - "PATINA", (CYTED, 1996-2001). - Aicraft Integral Fuel Tank Corrosion Study, EOARD (EuropeanOffice of Aerospace Research and Development, USA Air Force 2001-2003), Representante Cientfica porArgentina en el Bulletin of the Resarch On MEtal Conservation (BROMEC) y en Centro Internacional de Museos,(2003-2005).

Sergio Adrin Teves: Es Bioqumico, especialista en Produccin de Cosmticos (UBA). Profesor adjunto deMicrobiologa, a cargo de Microbiologa de Alimentos, Director del curso, Control Microbiolgico de Frmacos noEstriles, Cosmticos, Biomdicos y reas relacionadas. Interpretacin segn Farmacopeas (FFyB. UBA). Vice-director y Coordinador de la Carrera de Especializacin en produccin de cosmticos (FFyB. UBA). Autor de 20trabajos en revistas con referato, autor de 5 trabajos en revistas sin referato, Coautor de 3 captulos de libro yautor de ms de 40 trabajos presentados en congresos y reuniones cientficas. Miembro del comit AsesorEspecifico para carreras de Especializacin en el rea de Farmacia (FFyB UBA). Miembro de la subcomisin deMicrobiologa de la Farmacopea Nacional Argentina. Subjefe del laboratorio de Microbiologa de Proanlisis S.A.

Graciela Torno: Licenciada en Ciencias Qumicas con orientacin Qumica Biolgica, egresada de la Facultadde Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Comenz su actividad profesional enla industria farmacutica en el departamento de Control de Calidad de Laboratorios Roche S.A. A partir de 1986

se desempea como responsable del Laboratorio de Microbiologa en Roche S.A. hasta el ao 2005 que pasa atrabajar en Bayer S.A. en la misma posicin. Tarea que desempea hasta la actualidad.Ha participado como Secretaria Tcnica en los Congresos organizados por la Asociacin Argentina deMicrobiologa (AAM), CLAMME I y II. Es miembro de la Subcomisin de Microbiologa de la FarmacopeaArgentina; y de la Subcomisin de Buenas Prcticas de la divisin DAMyC de la Asociacin Argentina deMicrobiologa.

Alejandra Vzquez: Profesional del rea de Calidad con ms de 25 aos de experiencia en Control yAseguramiento de la Calidad y Entrenamiento en Buenas Prcticas de Manufactura en empresasmultinacionales de primera lnea. Certified Quality Engineer en la American Society for Quality. Tiene postgradosen Gerenciamiento de la Calidad en ITBAIPACE y en Direccin empresarial en IAE Universidad Austral.Facilitador para el proceso de Mejora Continua-UTN. Consultor en Calidad en empresas farmacuticas,

cosmticas, alimenticias y de la salud en reas de Calidad. Jurado de la Competencia Nacional de EquiposEstrellas de la Excelencia en 2011/12. IPACEASQ. Auditor del Programa de Auditoras de proveedores de laindustria farmacutica IPAC-. FUNDECE. Miembro de la Subcomisin de Microbiologa de la FarmacopeaArgentina. Miembro de la subcomisin de Buenas Prcticas/ DAMYC en la AAM. Fue responsable Regional deCalidad LATAM (Brasil, Mxico, Chile, Colombia y Argentina) de los Laboratorios de Microbiologa en Wyeth/Pfizer donde trabaj 17 aos. Fue profesional del rea de la calidad en la certificadora internacional SGSdurante 8 aos. Fue becaria en el Departamento de Biologa del INAME.

Esteban Zarankin: Licenciado en Ciencias Biolgicas (CAECE). Especialista en Calidad Industrial (UNSAM).Quality Manager (Deutsche Gesellschaft fr Qualitt e. V.). Se ha desempeado como Ayudante de primera enla ctedra de Introduccin a la Microbiologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de CAECE. Comenz suactividad profesional en la industria cosmtica en el Laboratorio de Microbiologa de Industrias Qumicas

Independencia (IQUISA) donde actualmente se desemepea como Jefe de Calidad. Es miembro de laSubcomisin de Buenas Prcticas de la divisin DAMyC de la Asociacin Argentina de Microbiologa. Fuemiembro del Comit Organizador del 1 y 2 Congreso Latinoamericano de Microbiologa de Medicamentos yCosmticos (CLAMME).

Alba Zaresky: Agradecemos su participacin como revisora del captulo Incertidumbre en la medicin asociadacon resultados microbiolgicos.


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos IX

CONTENIDO DEL MANUAL

Seccin I. Generalidades.Captulo I.1. Crecimiento Microbiano

Mirta Franco2

Captulo I.2. Fuentes de Contaminacin microbiana de productos farmacuticos ycosmticosMara Cristina Fernndez

16

Captulo I.3. Medios de cultivoHctor Cerra

23

Captulo I.4. Equipamiento: Calificacin y ControlGraciela Torno

33

Seccin II. Preservacin, Desinfeccin y Esterilizacin.

Captulo II.1. Desinfectantes y Desinfeccin de superficies y equiposMiguel DAquino y Sergio A. Teves

40

Captulo II.2. EsterilizacinCelina Horak y Nora Carbone

53

II.2.A. Esterilizacin por Calor hmedoFederico Kurt Lungwitz y Nora Carbone

59

II.2.B. Esterilizacin con Radiaciones ionizantesCelina Horak

81

II.2.C. Esterilizacin por xido de etileno

Nora Carbone

97

II.2.D. Filtracin esterilizante de fluidosMino Covo

112

Captulo II.3. Indicadores biolgicos de esterilizacinRuss Nyberg

130

Captulo II.4. Control de la Validacin de un Proceso de SaneamientoJos E. Martnez

141

Captulo II.5. Conservadores en productos farmacuticos y cosmticosMiguel DAquino y Sergio A.Teves 152


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos X

Seccin III. Instalaciones y su influencia en la calidad microbiolgica de losproductos.

Captulo III.1. Diseo del Laboratorio de MicrobiologaCarlos Luis Llorens

166

Captulo III.2. Filtros HEPA, flujo laminar y cabinas de bioseguridadMino Covo

178

Captulo III.3. Aguas para Aplicaciones FarmacuticasCarlos Chiesa

210

Captulo III.4. BiopelculasBlanca M. Rosales y Silvia E. Rastelli

226

Captulo III.5. Simulacin del proceso de llenado asptico o Media fillNstor Oscar Aversa 238

Seccin IV. Mtodos de control.

Captulo IV.1. Ensayo de EsterilidadAntonia Petracca y Alejandra Vzquez

249

Captulo IV.2. Endotoxinas bacterianasBeatriz Giampaolo y Nlida Mondelo

276

Captulo IV.3. Control microbiolgico de Medicamentos no obligatoriamenteestrilesMara Cristina Fernndez

305

Captulo IV.4. Verificacin de la Aptitud de mtodos microbiolgicosSergio Iglesias

325

Captulo IV.5. Valoraciones de Antibiticos por mtodos microbiolgicosMirta Franco

343

Captulo IV.6. Valoracin microbiolgica de VitaminasGraciela Torno

364

Captulo IV.7. Control microbiolgico de CosmticosEsteban Zarankin

372

Captulo IV.8. Control microbiolgico de AguasSergio Iglesias y Mnica Lagomarsino

379

Captulo IV.9. El complejo Burkholderia cepaciaJos Degrossi 388


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos XI

Captulo IV.10. Monitoreo ambientalAlejandra Vzquez y Claudio Denoya

401

Captulo IV.11. Mtodos rpidos para el anlisis microbiolgico de productosfarmacuticos

Luis Jimnez

428

Seccin V. Aseguramiento de la calidad y Seguridad en el laboratorio deMicrobiologa

Captulo V.1. Investigacin de las Desviaciones de los ResultadosMicrobiolgicosMnica Lagomarsino

449

Captulo V.2. Evaluacin del Riesgo de Contaminacin MicrobiolgicaMnica Lagomarsino 461

Captulo V.3. Documentacin y RegistroPatricia Domnguez

470

Captulo V.4. Incertidumbre de medicin asociada a los resultados de ensayosmicrobiolgicosSusana Carnevali

476

Captulo V.5. Capacitacin y Entrenamiento

Patricia Domnguez495

Captulo V.6. Auditora del Laboratorio de MicrobiologaNstor Oscar Aversa

502

Captulo V.7. Bioseguridad en el Laboratorio de MicrobiologaMara Rosa Marello

514


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos XII

PREFACIO

El Manual de Microbiologa aplicada a las industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos , es unlibro actualizado, nico por estar en espaol, y que cubre una gran variedad de temas que son de consultapermanente por los microbilogos y otras reas relacionadas con la calidad. Adems ha sido pensado para que

pueda formar parte de la bibliografa en las materias afines de carreras universitarias y terciarias.Este libro ha nacido como una inquietud de los miembros de la Subcomisin de Buenas Prcticas, dependientede la Divisin de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos (DAMyC), perteneciente a la Asociacin Argentina deMicrobiologa (AAM), debido a la cantidad de consultas que con frecuencia recibimos, por la falta de textos queabarquen todos los temas aqu tratados, pero sobre todo por la ausencia total de bibliografa en nuestra lengua.

Es un texto sin precedentes para profesionales, estudiantes y docentes de la Microbiologa aplicada a lasindustrias farmacutica, cosmtica, de productos mdicos y otras relacionadas, en la que no slo se tratan temastericos, prcticos y adems relacionados con las buenas prcticas, sino que adems incluye nuevastecnologas, algunas ya en uso incipiente, y otras que estn en desarrollo, pero que pueden ser aplicadas en elfuturo.

El manual est separado en cinco secciones, que incluyen captulos de tpicos especficos, cada uno de los

cuales ha sido redactado por personas calificadas y reconocidas en el tema. Cada autor ha tenido libertad parareflejar su propia experiencia y su propio estilo, pero manteniendo un nivel adecuado, tanto para que sea til yprctico como libro de consulta, como para que contenga toda la informacin terica necesaria para el lector.

La Seccin Idel manual es una introduccin que incluye Generalidades o tpicos apropiados y necesarios de laMicrobiologa, que son bsicos para la comprensin posterior de algunos temas tratados ms adelante.

La Seccin II, trata extensamente de temas bsicos tambin relacionados con prcticamente todos los mbitosde la Microbiologa como es la destruccin microbiana en todas sus formas. En este captulo hemos tenido laayuda de expertos extranjeros, como los Dres. Jos E. Martnez, Luis Jimnez y Russ Nyberg, quegenerosamente han contribuido con su conocimiento, y a quienes agradecemos la confianza.

En la Seccin IIIse agrupan los captulos relacionados con las instalaciones, desde su diseo, hasta la calidad

de los servicios, como el aire y al agua, temas tan importantes e influyentes en la calidad microbiolgica de losproductos farmacuticos y cosmticos, as como lo son en otras industrias y laboratorios, que de una u otramanera estn dedicados a la salud o a la elaboracin de productos para consumo humano. Tambin en estaseccin se incluy el tema de la simulacin del llenado asptico (Media Fill), aplicado exclusivamente a lavalidacin del llenado de productos estriles, tan dependiente de la calidad del aire, entre otros.

Los captulos de la Seccin IV tratan de los mtodos microbiolgicos y sus validaciones. En esta seccin seincluyen dos captulos con la descripcin de nuevas tecnologas, para los que se invit a participar a dosexpertos en estos temas radicados en el exterior, los Dres. Claudio Denoya y Luis Jimnez, a quienesagradecemos su generoso aporte.

Y por ltimo, en la Seccin V, los captulos tratan de los aspectos relacionados al aseguramiento o garanta dela calidad, y a temas de seguridad relacionados al laboratorio de Microbiologa.

Los editores de este libro, miembros de la Subcomisin de Buenas Prcticas de la AAM, agradecemos a todoslos autores que con tanto profesionalismo y generosidad nos han brindado sus conocimientos y experiencia.

Hctor Cerra


Celina Horak

Mnica Lagomarsino

Graciela Torno

Esteban Zaranquin


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Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos 1

ISBN 978-987-26716-3-1

Seccin I. Generalidades.pgina

Captulo I.1. Crecimiento Microbiano 2Mirta Franco

Captulo I.2. Fuentes de Contaminacin microbiana de productos 16farmacuticos y cosmticos


Captulo I.3. Medios de cultivo 23Hctor Cerra

Captulo I.4. Equipamiento: Calificacin y Control 33Graciela Torno


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Captulo I.1.

Crecimiento Microbiano

Mirta Franco

Introduccin

Visualizacin del crecimiento

Medicin del crecimiento

1. Recuento de microorganismos viables

- Recuento en placa

-

Nmero ms probable

2.

Determinacin de microorganismos totales-

Recuento directo

- Medicin de la masa celular

- Determinacin de peso de la fraccin celular

-

Determinacin de la Absorbancia

Curva de crecimiento

Factores que modifican el crecimiento microbiano

Cultivo continuo

Cultivo sincronizado

Bibliografa

Introduccin

El crecimiento microbiano puede definirse como el aumento de los constituyentes celulares. En losmicroorganismos que se multiplican por fisin binaria o gemacin, el crecimiento produce un aumento delnmero de clulas. En los microorganismos cenocticos, el crecimiento produce aumento del tamao pero no delnmero de clulas.

En bacterias, la sntesis regulada de todos los constituyentes de una clula bacteriana produce primero unaumento de su masa y luego, cuando sta ha sido duplicada, la divisin de la bacteria por el mecanismo de

fisin binaria. De esta manera se originan dos bacterias hijas de las que puede decirse que, en trminosgenerales, son iguales entre s e iguales a la bacteria parental que les dio origen. A continuacin cada una de lasbacterias hijas repetir el ciclo de la bacteria parental y se originarn 4 bacterias, aumentando el nmero deellas, es decir de la poblacin bacteriana, en progresin geomtrica (Figura 1).

Visualizacin del crecimiento

En medios lquidos el aumento del nmero de bacterias se visualiza como turbidez y/o formacin de sedimento opelcula en los cultivos. En cambio, en medios agarizados el aumento del nmero de bacterias produce coloniasmacroscpicamente visibles, algunas de cuyas caractersticas (tamao, forma, color, etc.) pueden contribuir a laidentificacin del microorganismo.

Medicin del crecimientoPara medir el crecimiento se pueden emplear tcnicas que estimen el nmero de bacterias, ya sea totales o


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viables, o la masa celular. A continuacin se describen algunos de los mtodos ms usados.

De acuerdo a la tcnica empleada para el recuento, su resultado expresar el nmero de microorganismostotales (viables ms no viables) o solamente viables presentes en una muestra, siendo stos ltimos los queposeen la capacidad de crecer y multiplicarse.

Figura 1: Fisin binaria en bacterias

Recuento de microorganismos viables

Recuento en placa

El recuento de microorganismos viables en placa se basa en la formacin de una colonia a partir de cadaclula viable, utilizando como soporte, medios agarizados en placas de Petri. No puede asegurarseindubitablemente que toda colonia derive de un solo microorganismo, por eso la forma correcta de expresarlos resultados es como unidades formadoras de colonias (UFC).

El recuento se puede realizar por plaqueo en medios agarizados o por retencin en una membranafiltrante. Las tcnicas de recuento de viables en placas son sensibles, relativamente sencillas y se usanampliamente para el recuento de bacterias y otros microorganismos en muestras de alimentos,medicamentos, agua, etc.

La forma corriente de realizar un recuento de unidades formadoras de colonias es la siguiente: realizardiluciones seriadas 1/10 de una suspensin bacteriana o de una muestra en ensayo y sembrar volmenesmedidos de varias de ellas, de modo de obtener colonias separadas. Esto se logra cuando el nmero decolonias por placa de Petri es entre 30 y 300, dependiendo del tamao de las colonias originadas. En


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general, por encima de ese lmite hay superposicin de colonias y por debajo de l la significacinestadstica es muy pobre.

Las siembras se pueden hacer:

a) por diseminacin: sobre la superficie del medio ya gelificado y secado, contenido en la placa, devolmenes de 0,10,2 ml de las diluciones correspondientes, o

b) en profundidad: incorporando el inculo en un volumen de medio fundido, mantenido a temperaturascompatibles con la viabilidad microbiana (aproximadamente 45C), que luego se vuelca en una placade Petri y se deja gelificar. Los volmenes inoculados pueden ser de hasta el 10% del volumen delmedio.

Luego de la incubacin en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la concentracin deUFCs presentes en una suspensin se calcula multiplicando el nmero de colonias por placa, promedio devarias placas, por la inversa de la dilucin de la suspensin, y dividiendo por el volumen sembrado:

Figura 2:Recuento en placa por diseminacin en superficie

En la Figura 2 se esquematiza el procedimiento para contar las UFC/ml en una suspensin bacteriana,utilizando la tcnica de siembra por diseminacin en superficie. Si, por ejemplo, un volumen de 0,1 ml de ladilucin 1 x 10-4de un cultivo origina un promedio de 120 colonias por placa, el nmero de UFC por mililitrode cultivo ser de 1,2 x 107 (120 UFC / 10-4 x 0,1 ml).

Cuando el nmero de microorganismos viables presentes en una muestra es bajo, se puede recurrir a lafiltracin de la misma a travs de filtros de membrana que retienen bacterias. Luego de filtrar la suspensinque contiene las bacterias a cuantificar, la membrana se coloca sobre la superficie de un medio agarizado osobre una fina almohadilla de papel absorbente (pad) embebido con medio lquido, se incuba encondiciones adecuadas y se cuentan las colonias, que representan el nmero de UFC presentes en elvolumen de muestra filtrado.

Incubar

tiempo + temperatura

3 placas/

dilucin

10-2 10-3 10-4 10

-5

N colonias / placa

UFC / ml =dilucin x 0,1 ml

0,1 ml


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Tanto para la tcnica de plaqueodirecto como para la de filtracin se pueden utilizar medios especiales,selectivos y/o diferenciales, que permiten el recuento de bacterias especficas.

Nmero ms probable

La concentracin de microorganismos viables puede ser estimada por el mtodo del nmero ms probable

(NMP). Este mtodo infiere matemticamente el recuento de viables a partir de la fraccin de cultivos entubos que no muestran crecimiento.

Consiste en realizar varias diluciones de la muestra, inocular varias rplicas de las mismas en tubosconteniendo un medio de cultivo apropiado y registrar el nmero de tubos con crecimiento en cada dilucin.

Es un mtodo estadsticamente ineficiente, por lo que es necesario sembrar varios tubos con cada dilucin.Sin embargo, resulta til para el recuento de microorganismos en suspensiones con baja concentracin oque producen algn producto detectable en el medio, que permita diferenciarlo de otros microorganismospresentes en la muestra., por ejemplo para el recuento de coliformes en aguas. En la Figura 3se muestraun ejemplo utilizando una tabla con tres niveles de diluciones y 5 tubos por dilucin

Figura 3.Recuento de viables por el mtodo del NMP

Determinacin de microorganismos totales

Se emplean mtodos que determinan directamente el nmero de bacterias suspendidas en un mediolquido o el peso correspondiente a la fraccin celular. Tambin se pueden utilizar mtodos indirectos, entre

ellos el ms utilizado es la determinacin de la absorbancia de las suspensiones celulares, que, dentro decierto margen y en condiciones estandarizadas, es proporcional a la masa celular.


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Recuento directo

El recuento en cmara por microscopa ptica es un mtodo til para determinar el nmero de bacteriastotales en una suspensin, cuando su concentracin no es demasiado baja. Brinda tambin informacinsobre el tamao y la morfologa de los microorganismos.

Las suspensiones se colocan en cmaras de recuento de volumen conocido. En el caso del recuento de

bacterias estas cmaras poseen un espesor sensiblemente menor que los hemocitmetros, debido almenor tamao de las bacterias. Las cmaras de recuento de Petroff-Hausser tienen un espesor de 0,02mm, que las hace particularmente aptas para el recuento de bacterias. La superficie de la cmara es de 1mm2y est dividida en 25 cuadrados. Luego, el nmero de bacterias por mm3se calcula multiplicando elnmero de bacterias en un cuadrado por el nmero de cuadrados (25) y por la inversa del espesor (1 / 0.02= 50). Esta tcnica requiere un alto nivel de control de calidad operativa y aun as tiene un amplio margende variacin.

Los protozoos, algas y levaduras, que son de mayor tamao que las bacterias, pueden contarse concontadores electrnicos (Coulter). Este mtodo consiste en hacer pasar una suspensin demicroorganismos a travs de un pequeo orificio. A travs del mismo fluye una corriente elctrica y loselectrodos situados a ambos lados miden su resistencia elctrica. Cada vez que una clula microbiana

atraviesa el orificio, aumenta la resistencia elctrica y se cuenta la clula.

Medicin de la masa celular

El aumento del nmero de microorganismos va acompaado de un aumento continuo de la masa celular enel cultivo que, por supuesto, refleja el total de las clulas (viables ms no viables). La masa celular en uncultivo microbiano puede medirse directamente determinando el peso de la fraccin celular oindirectamente midiendo la absorbancia de las suspensiones microbianas.

Determinacin del peso de la fraccin celular

Se puede determinar el peso seco o hmedo de la fraccin celular de una alcuota de una suspensin.

Como el contenido de humedad de la fraccin hmeda puede ser variable, resulta ms reproducible ladeterminacin del peso seco. Para ello las alcuotas a analizar se colocan en pesafiltros previamentetarados, se evapora a sequedad en estufas y se determina su nuevo peso. La diferencia con la taracorresponde al peso celular en la alcuota. En ciertos casos es necesario lavar la fraccin celular de lasalcuotas por sucesivas centrifugaciones y resuspensiones en soluciones acuosas adecuadas. Esta tcnicatiene la desventaja de que es poco sensible, se requiere grandes cantidades de microorganismos ysuficiente cantidad de muestras para cumplir exigencias estadsticas de reproductibilidad, que latransforman en una tcnica larga y engorrosa. Se la usa principalmente para medir la masa de cultivos dehongos filamentosos.

Manteniendo el mismo principio de la obtencin de clulas por centrifugacin de un volumen determinadode la suspensin bacteriana, se puede estimar la masa celular midiendo, en el sedimento final, el contenidode diferentes elementos (nitrgeno, carbono) y/o molculas como cidos nucleicos, protenas, etc.

Determinacin de la absorbancia

Una tcnica ms rpida, ms sensible y de uso corriente se basa en medir espectrofotomtricamente ladispersin de la luzproducida por las bacterias presentes en una suspensin. A medida que aumenta laconcentracin de bacterias el cultivo se vuelve ms turbio (aumenta la absorbancia) y la luz transmitida esmenor. Debido a que las clulas de una especie bacteriana tienen tamaos relativamente constantes, ladispersin de la luz puede considerarse proporcional a la concentracin de bacterias en la suspensin. Larelacin lineal entre absorbancia y concentracin celular slo se cumple en un rango determinado deconcentraciones y, adems, la absorbancia de una suspensin bacteriana no depende slo de la masacelular sino tambin de otros factores, como por ejemplo la forma de las bacterias. Por ello es aconsejablerealizar una curva de calibracin para cada sistema, de modo de establecer la relacin entre la densidadptica (DO) y el parmetro estimado, efectuando distintas diluciones de una suspensin concentrada ymidiendo sus respectivas absorbancias.


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Viables

fase de muerte

Log

Totales

fas

Log

Esta tcnica es de gran aplicacin en los ensayos microbiolgicos de factores de crecimiento y antibiticosen medios lquidos. Tambin se aplica esta tcnica para estandarizar suspensiones inculo, aunque en laprctica diaria de laboratorio se utilizan comparadores de turbidez (escala de Mc Farland) con los cuales seefectan clculos de concentracin de bacterias.

Curva de crecimiento

De acuerdo a lo dicho anteriormente, cuando una clula bacteriana se encuentra en un medio ambiente en elque puede sintetizar en forma regulada todos sus constituyentes, se observa primero un crecimiento individual,es decir un aumento de su masa y de su volumen, y luego un crecimiento de la poblacin debido a sucesivasdivisiones celulares. La masa aumenta continuamente, mientras que el nmero de bacterias se duplica aintervalos de tiempo regulares.

Cuando un nmero N0de bacterias, cuyos ciclos celulares no estn sincronizados, se inoculan en un medio decultivo lquido que les provee todos los nutrientes necesarios y se incuba en condiciones adecuadas a susrequerimientos, se produce el aumento de la poblacin bacteriana. En la Figura 4 se muestran los grficos dellogaritmo del nmero de bacterias viables y totales presentes en un cultivo cerrado versus el tiempo deincubacin. En las curvas de crecimiento se observan las siguientes fases: adaptacin, crecimiento exponencial,

estacionaria mxima y muerte (slo en la curva de viables).

Figura 4.Curvas de crecimiento de bacterias viables y de bacterias totales

Fase de adaptacin o fase lag o fase de retardo

Durante esta etapa el metabolismo de las bacterias inoculadas se adapta a las nuevas condiciones de cultivo. Sibien las bacterias son activas metablicamente, no se observa aumento del nmero. Su duracin es variable,puede ser muy corta o estar ausente cuando las bacterias estn capacitadas para utilizar inmediatamente losnutrientes (por ejemplo cuando provienen de un cultivo en fase exponencial en el mismo medio de cultivo) orelativamente larga cuando: a) estn injuriadas, b) son viejas y, por lo tanto, deficientes en ATP, cofactoresesenciales y ribosomas, y c) la composicin del medio es diferente a la de aquel del que provienen y hacenecesaria la induccin de algunas enzimas para poder utilizar algn nutriente esencial.

Tambin influyen sobre su duracin algunos factores fsicos que modifican la velocidad de reaccionesenzimticas, como la temperatura, pH y la fase gaseosa.


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Fase de crecimiento exponencial o logartmico

Durante esta etapa cada bacteria es capaz de duplicar su masa y dividirse a intervalos regulares, dando lugar alcrecimiento exponencial de la poblacin. Aunque la divisin celular ocurre a intervalos regulares, la falta desincronizacin entre los ciclos individuales de cada clula hace que tanto el aumento de la masa como el delnmero de bacterias se observen como una funcin continua. La fase de crecimiento exponencial representa la

etapa en la que la velocidad de crecimiento es constante y mxima para esas condiciones de cultivo. Lavelocidad de crecimiento puede ser modificada cambiando la composicin del medio de cultivo y/o lascondiciones de incubacin.

El perodo de tiempo entre dos divisiones sucesivas se denomina tiempo de generacin (g) y es una estimacinde la velocidad de crecimiento. Cuando g = 30 minutos, la poblacin se duplica cada 30 minutos, es decir 2veces por hora. Cuando g es menor, por ejemplo 20 minutos, se producen 3 divisiones por hora, es decir lavelocidad de crecimiento es mayor. Luego, la relacin entre g y velocidad de crecimiento es inversa, a mayor gmenor velocidad de crecimiento y viceversa.

La expresin matemtica del crecimiento exponencial es:

n

t NN 20

donde: Nt= nmero de bacterias al tiempo tN0= nmero inicial de bacterias (tiempo 0)n = nmero de generaciones

2log

loglog 0NNn t

La velocidad de crecimiento se puede expresar tambin como la constante de velocidad de crecimiento (k), querepresenta el nmero de generaciones por unidad de tiempo.

k = n / t cuando n = 1, t = g, Luego k = 1 / g

Fase estacionaria mxima

El crecimiento bacteriano en un cultivo cerrado, en el que no hay aporte de nuevos nutrientes ni remocin de losproductos del metabolismo, es autolimitado. Luego de varias generaciones, diversos factores, entre ellos ladisminucin o agotamiento de los nutrientes disponibles, la acumulacin de productos metablicos txicos y ladisminucin del espacio vital, hacen que la multiplicacin bacteriana cese o que su velocidad de crecimientodisminuya a niveles que se equilibran con la velocidad de muerte.

La concentracin de clulas en esta fase se denomina cosecha mxima, y depende del tipo de microorganismo,de la composicin del medio y de las condiciones de incubacin.

Fase de muerte

Desde un punto de vista biolgico la muerte celular representa la prdida de su capacidad de multiplicacin,aunque no significa necesariamente prdida absoluta e inmediata de todas las funciones celulares. El nicocriterio vlido de muerte bacteriana es la prdida irreversible de la capacidad de reproducirse en cualquier medioadecuado para ello. Queda as definido un concepto fundamental, la viabilidad, que permite diferenciar en unapoblacin dos clases de bacterias:

a)

las bacterias viables (o vivas) que son aqullas que conservan su capacidad reproductora, y

b) las bacterias no viables (o muertas) que son las que han perdido esa capacidad.

Por lo tanto, la observacin de la fase de muerte slo es posible cuando se analiza la evolucin del nmero de

bacterias viables presentes en la poblacin.La muerte bacteriana responde a una cintica exponencial, es decir que en perodos de tiempo iguales se


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mueren porcentajes constantes de la poblacin.

En algunos casos la muerte bacteriana va acompaada de lisis celular, observndose no slo disminucin delnmero de bacterias viables sino tambin de la masa celular.

La muerte de las bacterias puede provocarse por el uso de agentes antimicrobianos con actividad bactericida.Este tema se desarrolla en la Seccin II del presente manual.

Factores que modifican el crecimiento bacteriano

De acuerdo a lo que hemos visto, la multiplicacin bacteriana requiere el aporte de sustancias qumicas(nutrientes) y condiciones fsicas y qumicas adecuadas. El conocimiento de los factores que modifican elcrecimiento bacteriano nos permitir:

1)

Establecer condiciones de laboratorio en las cuales una o ms especies bacterianas puedan desarrollarsatisfactoriamente, de modo de poder evidenciar y cuantificar su presencia en cualquier muestra.

2)

Controlar la proliferacin bacteriana impidiendo o desfavoreciendo su multiplicacin.

Del mismo modo las propiedades fsicas y qumicas de productos tales como alimentos, medicamentos, etc.,orientan sobre la calidad de los microorganismos eventualmente presentes.

Veremos a continuacin cules son los principales factores que inciden sobre el crecimiento bacteriano.

Figura 5.Elementos fundamentales de un cultivo en medio lquido

Nutrientes y factores de crecimientoEntre los principales factores que influyen sobre la velocidad de crecimiento debe considerarse la calidad ycantidad de los nutrientes disueltos en el medio de cultivo.

Cualitativamente estos nutrientes deben proveer todos los elementos qumicos que necesitan las bacterias(carbono, nitrgeno, oxgeno, hidrgeno, azufre, iones inorgnicos, etc.) para biosintetizar sus componentes, yla energa necesaria para llevar a cabo sus funciones. De acuerdo a las capacidades metablicas de lasbacterias, diferentes formas qumicas de un mismo elemento pueden determinar velocidades de crecimientodiferentes.

Por otra parte, la concentracin de cada uno de esos compuestos qumicos influye sobre la velocidad decrecimiento. En general puede definirse una concentracin ptima para cada nutriente, que es aqulla queproduce la mayor velocidad de crecimiento en determinadas condiciones. Concentraciones inferiores a la ptima

se denominan concentraciones limitantes. En el rango de las concentraciones limitantes, un aumento de laconcentracin del nutriente se traduce en un aumento de la velocidad de crecimiento. Por encima de laconcentracin ptima pueden darse dos efectos; que el aumento de la concentracin del nutriente no modifique

Nutrientes

Fase gaseosa

Aerbica

Anaerbica

Fase lquida

pH

Presin osmtica
http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=a69w4RLJJtguXM&tbnid=PQIUyQMWaIFDXM:&ved=0CAUQjRw&url=http://pages.usherbrooke.ca/biomedias/equipements_lab.htm&ei=3kumUaf4HYL88gSL2YHIAg&bvm=bv.47008514,d.dmQ&psig=AFQjCNF0PkhoyAWZKjoTCpkjE7H0zN6VAQ&ust=1369939176998064http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=a69w4RLJJtguXM&tbnid=PQIUyQMWaIFDXM:&ved=0CAUQjRw&url=http://pages.usherbrooke.ca/biomedias/equipements_lab.htm&ei=3kumUaf4HYL88gSL2YHIAg&bvm=bv.47008514,d.dmQ&psig=AFQjCNF0PkhoyAWZKjoTCpkjE7H0zN6VAQ&ust=1369939176998064http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=a69w4RLJJtguXM&tbnid=PQIUyQMWaIFDXM:&ved=0CAUQjRw&url=http://pages.usherbrooke.ca/biomedias/equipements_lab.htm&ei=3kumUaf4HYL88gSL2YHIAg&bvm=bv.47008514,d.dmQ&psig=AFQjCNF0PkhoyAWZKjoTCpkjE7H0zN6VAQ&ust=1369939176998064


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la velocidad de crecimiento, o que la disminuya por efectos txicos derivados de altas concentraciones delmismo. Al igual que lo que ocurre con la velocidad de crecimiento, cuando el crecimiento bacteriano es limitadopor la baja concentracin de un nutriente requerido, el crecimiento neto final o cosecha mxima tambinaumenta con la cantidad inicial del nutriente limitante.

Adems de los nutrientes, muchas bacterias requieren factores orgnicos de crecimiento, es decir sustancias

que no pueden sintetizar a partir de los nutrientes generales y que cubren requerimientos especficos. Ejemplosde factores de crecimiento son los aminocidos, las vitaminas y los derivados de purinas y pirimidinas. En estoscasos no existe la posibilidad de que un compuesto pueda ser reemplazado por otro, salvo que se trate de unprecursor del mismo. No obstante, el efecto de la variacin de la concentracin del factor de crecimiento sobre lavelocidad de crecimiento y la cosecha mxima es anlogo al descripto para los nutrientes, aunque con unadiferencia sustancial en lo que se refiere a los rangos de concentraciones, que en el caso de los primeros es delorden de nano o picogramos, muy inferior al de los de los nutrientes. Este es el fundamento de los ensayosmicrobiolgicos de vitaminas y otros factores de crecimiento.

Ensayos microbiolgicos de factores de crecimiento:

En el punto anterior nos referimos a un aumento de la velocidad de crecimiento debido a un aumento de la

concentracin de un factor de crecimiento, en el rango de concentraciones limitantes. Esta observacin permitidisear ensayos sensibles y especficos que permiten cuantificar sustancias hidrosolubles que actan comofactores de crecimiento de diferentes bacterias. Estos ensayos se basan en determinar, a un tiempo dado, elcrecimiento de una bacteria de ensayo frente a distintas concentraciones de una preparacin de referencia de lasustancia a ensayar y comparar este crecimiento con el que produce una preparacin de la misma sustanciacuya actividad se quiere conocer (Figura 6). Debido a su sensibilidad y especificidad, los bioensayos permitendeterminar sustancias activas que se encuentran en concentraciones muy bajas, an en mezclas complejas.Estas propiedades los hacen particularmente tiles no slo para el control de calidad de productos que contienenuna sustancia activa sino tambin para estudios clnicos y de biodisponibilidad.

Figura 6.Fundamento de los ensayos microbiolgicos

Por ejemplo, si deseamos determinar la concentracin de vitamina B12en una solucin polivitamnica, debemosdisponer de una suspensin de bacterias auxtrofas para vitamina B12, (es decir que no la sinteticen), de unmedio de cultivo basal (que no contenga vitamina B12)y de un patrn de vitamina B12de concentracin conocida(preparacin de referencia). Se prepara una serie de medios de cultivos que contienen diferentes

concentraciones de vitamina B12, agregando diferentes diluciones de la preparacin de referencia al medio decultivo basal. Se siembran esos medios, previamente esterilizados, con la suspensin de la bacteria auxtrofa. Aun tiempo dado, se detiene el crecimiento, se mide la absorbancia de los cultivos y se construye una curva de

Ensayos Microbiolgicos

Muestra Preparacin de referencia

Sistema Biolgico

(cultivo de microorganismos)

Efecto Efecto

POTENCIA RELATIVA CUANTIFICABLE


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absorbancia versus la concentracin de vitamina B12 originalmente presente en los medios. Paralelamente serealiza el mismo procedimiento reemplazando la preparacin de referencia por la muestra a analizar. De estamanera se obtienen dos curvas que, si satisfacen los requisitos de regresin, linealidad y similitud, permitencalcular la concentracin de vitamina B12 en la muestra. Para ms detalles ver el captulo Valoracinmicrobiolgica de antibiticos y Factores de Crecimiento en el presente manual.

La composicin de los medios de cultivo determina adems otras propiedades de los mismos, como ser pH,presin osmtica, actividad de agua, potencial de xido-reduccin, etc., a los que debe sumarse la influencia delambiente externo, que incluye la atmsfera gaseosa y la temperatura de incubacin.

Concentracin de oxgeno molecular

De acuerdo a su requerimiento de oxgeno molecular, las bacterias se clasifican en aerobias y anaerobias. Lasbacterias aerobias requieren O2 para crecer; las anaerobias facultativas no requieren O2, pero cuando estpresente lo utilizan; las anaerobias aerotolerantes no requieren ni utilizan O2, y las anaerobias estrictas no slono requieren O2 sino que les resulta altamente txico, induciendo alteraciones metablicas y la muertebacteriana. Ver Figura 7.

Figura 7.Clasificacin de los microorganismos por su requerimiento y tolerancia al O2.

El crecimiento de las bacterias aerobias y de las anaerobias facultativas en presencia de O 2 depende de laconcentracin de oxgeno en solucin. Dado que el oxgeno es relativamente insoluble (


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catalizador que va incorporado a la vasija.

En medios lquidos, las bacterias anaerobias pueden ser protegidas de los efectos txicos del oxgeno mediantela incorporacin al medio de un fuerte agente reductor. La inclusin de ascorbato, tioglicolato sdico, cistena otrazas de sulfito sdico en el medio de cultivo, permite manejar anaerobios que no requieren condicionesrigurosas de exclusin del O2. El medio puede liberarse del oxgeno disuelto por ebullicin y luego protegerse

cubriendo su superficie con una capa de aceite mineral. A tales medios se les suele incorporar una pequeacantidad de agar para aumentar su viscosidad y disminuir la disolucin del O2del aire.

La manera ms til para medir el grado de anaerobiosis de un medio de cultivo es el potencial de oxidacin-reduccin o potencial redox (Eh). En medios corrientes, la mayora de las bacterias anaerobias son inhibidas avalores de Eh mayores que100 mV, y algunas no inician su crecimiento con potenciales superiores a330 mV.

Actividad de agua y presin osmtica

Los microorganismos necesitan disponer de agua en el medio para poder crecer. La cantidad de agua disponibleen un medio o actividad de agua (aw) depende del efecto osmtico, es decir de su interaccin con las molculasde solutos, y de la posibilidad de adsorcin sobre superficies de slidos. La actividad de agua de un medio esigual a la relacin entre la presin de vapor de la solucin y la del agua pura:

agua

solucin

wP

Pa

Puede calcularse a partir de la humedad relativa en una cmara sellada en la que se ha alcanzado el equilibrioentre el medio de cultivo y el aire (por ejemplo, si la humedad es del 95%, la actividad de agua del medio es0,95).

La actividad de agua est inversamente relacionada a la presin osmtica (): a mayor presin osmtica, menoraw.

waVRT ln

donde R es la constante gaseosa,T es la temperatura absolutaV es el volumen de 1 mol de agua

La mayora de las bacterias tienen valores ptimos de a w superiores a 0.98. Las variaciones en la awpuedenafectar la velocidad de crecimiento, la composicin celular y las actividades metablicas de las bacterias; por ellola desecacin o el agregado de grandes cantidades de sales o azcares son mtodos muy efectivos parapreservar los alimentos de la contaminacin microbiana. Es bien conocido que los jarabes y las jaleas son poco

susceptibles a la contaminacin bacteriana.Los microorganismos denominados osmotolerantesque pueden retener agua y mantener una alta concentracininterna de solutos, son capaces de crecer en un amplio rango de actividad de agua o presin osmtica. Porejemplo, Staphylococcus aureuspuede cultivarse en medios que contienen concentraciones de cloruro de sodiode hasta 3 moles por litro; y algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae,en soluciones de azcares deaw= 0.6. Algunas bacterias halfilas crecen mejor en altas concentraciones de clorurode sodio y aw0.80.

pH

Aunque algunas bacterias pueden crecer a pH 1.0 y otras a pH 11.0, la mayora de las especies bacterianascrecen en un rango estrecho de pH. Cada especie crece en un rango definido de pH y posee un pH ptimo decrecimiento: las acidfilas entre 0 y 5.5, las neutrfilas entre 5.5 y 8.0 y las alcalfilas entre 8.5 y 11.5. Engeneral, una disminucin del pH produce una disminucin de la velocidad de crecimiento. Este fenmeno esutilizado desde hace muchsimo tiempo para aumentar la vida til de alimentos lcteos (leches acidificadas,


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yogur, etc.).

Los cambios de pH del medio pueden modificar la ionizacin de los nutrientes y reducir su asimilacin por losmicroorganismos. A pesar de las amplias variaciones de pH del medio, el pH interno de la mayora de lasbacterias se mantiene prximo a la neutralidad. Se han propuesto diferentes mecanismos para explicarlo:impermeabilidad de la membrana a protones, intercambio de iones sodio o potasio por protones, etc. Sin

embargo, variaciones drsticas de pH pueden inhibir la actividad de enzimas y protenas transportadoras demembrana, y si el pH interno de las clulas disminuye mucho, las bacterias mueren.

Muy frecuentemente, los microorganismos provocan el cambo del pH de su propio hbitat pues producen yliberan metabolitos cidos o bsicos. Por ejemplo, es bien conocido que la fermentacin de hidratos de carbonoproduce cidos orgnicos y que la degradacin de aminocidos genera amonio. El pH de los cultivos se controlausualmente incorporando al medio soluciones buffers (por ejemplo, mezclas de fosfatos monocido y dicido),aunque su potencial regulador es limitado. Para un control ms eficiente se debe recurrir a la adicin automticade cidos o bases.

Algunos medios de cultivo tienen incorporados indicadores de pH, cuyo viraje indica determinada actividadmetablica. Se usan para identificar microorganismos

Temperatura

Adems de la composicin de los medios de cultivo un factor muy importante que afecta la velocidad decrecimiento es la temperatura de incubacin. Del mismo modo que para los nutrientes, puede definirse unatemperatura ptima como la que posibilita la mayor velocidad de crecimiento. Por debajo de la temperaturaptima puede definirse un rango ms o menos extendido de temperaturas en las que las bacterias crecenaunque con velocidades cada vez menores a medida que nos alejamos de la temperatura ptima. ste es elfundamento del alargamiento de la vida til de un producto conservado a temperaturas de refrigeracin. Porencima de la temperatura ptima la velocidad de crecimiento tambin disminuye pero el rango de temperaturascompatibles con el crecimiento es muy estrecho, pues el aumento de la temperatura produce desnaturalizacinde las protenas. Por esta razn, la temperatura mxima est mucho ms cerca de la ptima de lo que lo est latemperatura mnima (Figura 8). Si bien en su conjunto los microorganismos son capaces de multiplicarse en un

amplio rango de temperaturas, no todas las especies tienen la misma temperatura ptima ni el mismo rango detemperaturas compatibles con el crecimiento. Existen especies capaces de desarrollar a temperaturas superioresa 40C (termfilas), otras que lo hacen entre 20C y 40C (mesfilas) y otras a temperaturas inferiores a 20C,incluso a temperaturas de refrigeracin (psicrfilas) (Figura 8).

Las bacterias termfilas tienen algunas aplicaciones interesantes. Por ejemplo, las endosporas de Geobacillusstearothermophilusse utilizan como indicadores biolgicos de los procesos de esterilizacin por vapor saturadoa presin superior a la normal. Thermus aquaticus y Thermococcus litoralis producen las polimerasas Taq yVent, respectivamente, ambas de uso muy extendido en la tcnica de la reaccin de la polimerasa en cadena(PCR).

Es evidente que el calor ejerce una accin deletrea en la mayora de los microorganismos. Temperaturaselevadas son el agente esterilizante de eleccin cuando los materiales son resistentes a ellas, como se ver en

el captulo Esterilizacin del presente manual. Por otra parte, el fro se usa para la conservacin demicroorganismos viables.

Otros factores fsicos que pueden afectar el crecimiento son la presin hidrosttica y las radiaciones,principalmente ionizantes y ultravioleta. En cuanto a la presin, slo es importante en bacterias capaces decrecer en las profundidades de ocanos. Las radiaciones ionizantes son dainas para las bacterias, ya que enbajos niveles producen mutaciones, que pueden ser letales, pero en altas dosis son directamente letales; a talpunto que se utilizan como agentes esterilizantes.

Las consideraciones anteriores tambin permiten comprender por qu los tejidos del organismo humano resultanparticularmente aptos para la sobrevivencia y multiplicacin de muchas especies microbianas, principalmente lasquimiohetertrofas mesfilas con rango de pH ptimo cercano a la neutralidad. Como es sabido, en la mayorade las enfermedades de origen microbiano se requiere una concentracin umbral de una especie microbianapara producir una enfermedad, concentracin que depender de su mecanismo de patogenia, de su virulencia yde las condiciones inmunolgicas del husped. Estas consideraciones justifican, de alguna manera, losrequisitos de esterilidad, biocarga mxima y ausencia de determinadas especies en productos no estriles.


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Figura 8.Clasificacin de los microorganismos de acuerdo a sus temperaturas cardinales

Figura 9.Esquema de quimiostato Fig. 10. Crecimiento de cultivos sincronizados


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Cultivo continuo

Cuando las bacterias se cultivan en un ambiente cuya composicin se mantiene constante porque se le agregancontinuamente nutrientes y se eliminan productos de desecho, la poblacin bacteriana se mantiene en fase decrecimiento exponencial y la concentracin de masa es constante. Estas condiciones se alcanzan en ellaboratorio a travs de un sistema de cultivo continuo, siendo los ms usados: 1) quimiostatos y 2) turbidostatos.

1) En un quimiostato se eliminan alcuotas de cultivo que son reemplazadas con la misma velocidad pormedio de cultivo fresco que posee un nutriente (por ejemplo, un aminocido) en concentracin limitante(Figura 9). La velocidad de crecimiento est determinada por la velocidad de incorporacin del nutrientelimitante y la concentracin celular por la concentracin de dicho nutriente.

2) Un turbidostato tiene una fotoclula que mide la turbidez del cultivo, regulando la velocidad de flujodel medio para mantener una turbidez predeterminada.

Los sistemas de cultivos continuos son muy tiles para realizar estudios en condiciones que simulan laspresentes en ambientes naturales.

Cultivo sincronizado

Hemos dicho que si bien las bacterias se dividen a intervalos de tiempo regulares, la velocidad de crecimiento deun cultivo en la fase exponencial aparece corrientemente como una funcin continua. Esto se debe a que todaslas bacterias no se dividen simultneamente. Se pueden obtener cultivos sincronizados, en los que las bacteriasse dividen al mismo tiempo (Figura 10), modificando propiedades fsicas del ambiente o la composicin qumicadel medio de cultivo. Por ejemplo, si la temperatura o la concentracin de un nutriente esencial son muyinferiores a los valores ptimos, la actividad metablica ser muy baja y las clulas no se dividirn. Cuando seaumente rpidamente la temperatura de incubacin o la concentracin del nutriente esencial, las bacterias sedividirn sincronizadamente. Tambin se pueden sincronizar cultivos seleccionando clulas por tamao o poredad. Lamentablemente, el estado de sincronizacin dura muy pocas generaciones, pues los ciclos celularesindividuales no tienen la misma duracin.

Los cultivos sincronizados permiten estudiar etapas particulares del ciclo celular, que por razones tcnicas no es

posible realizar.

Bibliografa recomendada

Franco, M. Crecimiento bacteriano. En Programa de Educacin y Actualizacin Farmacutica (PROEF). PrimerCicloMdulo 3. 1999. Cap. 2, pp. 33-51- Editorial Mdica Panamericana. ISSn: 1514-1551.

Franco Mirta (2006) Nutricin y Crecimiento bacteriano. En Microbiologa Biomdica, 2 ed. J.A.Basualdo, C.E.Coto y R.A. de Torres (eds.), pp 83-99. Editorial Atlante SRL. Argentina. ISBN: 950-9539-47-3.

Gerhardt, Murray, Costilow, Nester, Wood, Krieg and Phillips. Manual of Methods for General Bacteriology, 1981.Cap. 10-11, pp. 65-207. American Society for Microbiology.

Hugo & Russells. Pharmaceutical Microbiology. 7th ed. 2004. Cap. 3, pp. 32-38. Edited by Stephen P. Denyer,Norman A. Hodges & Sean P. Gorman. Blakwell Science. ISBN 13: 978-0-632-06467-0.

Prescott Harley- Klein. Microbiologa, 5 ed. 2004. Cap. 6, pp. 118-142. Mc Graw Hill Interamericana deEspaa S.A.U. ISBN 84-486-0525-X

Tortora Funke Case. Introduccin a la Microbiologa. 9 edicin, 2007. Cap. 6, pgs. 159-183. EditorialMdica Panamericana. ISBN 978-950-06-0740-7


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Captulo I.2.

Fuentes de contaminacin microbiana de productosfarmacuticos y cosmticos


Introduccin

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Salmonella sp

Clostridium spp

Hongos filamentosos y levaduras

Candida albicans

Introduccin

La contaminacin microbiana de los productos farmacuticos y cosmticos ha sido extensamente estudiadatanto a nivel nacional como internacional. Los productos para administracin parenteral y de uso ocular debenser estriles. Existen otras formas farmacuticas no obligatoriamente estriles que se usan por va oral, tpica,nasal, vaginal, etc, fabricadas con ingredientes que pueden ser substratos adecuados para los microorganismos.Las preparaciones farmacuticas y los cosmticos pueden contaminarse con hongos filamentosos, levaduras ybacterias. Las materias primas naturales, el equipamiento, el agua, los operadores, el aire, y el material deempaque pueden ser fuentes de contaminacin de los productos farmacuticos y cosmticos (1).

La U.S. Food and Drug Administration (FDA) reconoce tres categoras de microorganismos: patgenos,oportunistas y objetables:

Patgenosson aquellos microorganismos o toxinas responsables de enfermar o infectar al hombre (Salmonellasp, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Clostridium spp, etc).

Se consideran oportunistas a aquellos microorganismos que producen enfermedad en pacientesinmunocomprometidos.

Y son objetables aquellos microorganismos que pueden inactivar drogas activas y/o deteriorar el productoprovocando una posible falta de eficacia de los productos farmacuticos y seguridad en cosmticos.

Un medicamento o un cosmtico se consideran contaminados si contiene microorganismos patognicos,oportunistas, objetables o metabolitos microbianos txicos, o si presentan deterioro fsico o qumico. Losmicroorganismos con requerimientos nutricionales simples tienden a estar presentes en alto nmero, mayor de106ufc/g o ml, a pesar de que el producto no muestre signos visibles de contaminacin.

La dosis infectiva de los microorganismos no slo vara entre las especies sino tambin entre los individuos. Lossntomas y consecuencias de las infecciones por medicamentos o cosmticos contaminados son diversos. Lasreacciones clnicas, varan desde una infeccin local de heridas, infecciones gastrointestinales por productosorales contaminadas en el caso de productos no estriles, a infecciones sistmicas serias por productos


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inyectables contaminados.

Slo unas pocas materias primas empleadas para la fabricacin de productos farmacuticos son estriles.Controles ambientales, del agua, de las materias primas, de limpieza de equipos y reas, buenas prcticas dehigiene del personal son vitales para minimizar el tipo y nmero de microorganismos presentes.

En la Figura 1 podemos ver cuales son las fuentes ms comunes de contaminacin de medicamentos ycosmticos.

Figura 1. Fuentes de contaminacin ms frecuentes de productos de uso y consumo humano

Muchos microorganismos pueden llegar a producir toxinas constituyendo un riesgo sanitario especialmente enformas farmacuticas orales (Bacillus cereus, Staphylococcus aureusy hongos filamentosos) o pueden provocarel deterioro de un producto cosmtico o de un medicamento como consecuencia de su crecimiento alterando suscaractersticas organolpticas. Otros microorganismos patgenos pueden producir distintas enfermedades en los

usuarios dependiendo del grado de contaminacin y de la susceptibilidad del consumidor. En general los gruposetarios ms sensibles son los lactantes, nios y ancianos.

A continuacin describiremos los microorganismos contaminantes ms comnmente investigados enmedicamentos y cosmticos:

Pseudomonas aeruginosa

Es un bacilo Gram negativo no fermentador de la glucosa, y es uno de los ms importantes patgenos dentro delos gneros Pseudomonasy Burkholderiacon respecto al nmero y tipo de infecciones que causa y su relacincon la alta morbilidad y mortalidad relacionada (2).

Este microorganismo combina perfectamente su adaptabilidad a diferentes ambientes con una gran variedad de

factores de virulencia. El espectro de enfermedades causadas por este agente vara desde una infeccinsuperficial de piel hasta una sepsis.

La patogenicidad de Pseudomonas aeruginosase explica por su gran variedad de factores de virulencia. Un pilipolar media la adherencia de este microorganismo a las clulas epiteliales. Una vez adherida la bacteria produceproteasas, hemolisinas, exotoxinas y endotoxinas que producen dao tisular. El papel de una elastasa, una delas proteasas producida por P. aeruginosa, ha sido documentada en su patognesis de queratitis, infecciones deheridas y enfermedades crnicas de pulmn en pacientes con fibrosis qustica (3).

El rol de la presencia de una exotoxina A en la patognesis de las infecciones por P. aeruginosaes desconocido,pero esta toxina podra estar asociada con la diseminacin de este microorganismo y su toxicidad sistmica (2).

Los individuos inmunocomprometidos son las comunidades ms afectadas por infecciones por P. aeruginosay

las causas estn frecuentemente asociadas con contaminacin de agua y de soluciones acuosas. La infeccinsuperficial ms asociada con este microorganismo es la foliculitis e infecciones del canal auditivo.


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La infeccin de P. aeruginosaen ojos est frecuentemente asociada al uso de lentes de contacto y de solucionesde lavado de lentes de contacto contaminadas con este microorganismo. Esta infeccin puede llegar a producirlceras de crnea que pueden progresar a una prdida de la funcin ocular si no es adecuadamente tratada (4).

La infeccin ms severa causada por este microorganismo es la endocarditis por administracin endovenosa demedicamentos, cuando, al ser inyectados, son disueltos o suspendidos en vehculos acuosos que, si estn

contaminados con P. aeruginosa pueden llegar a producir bacteriemia que puede evolucionar a unaendocarditis(2).

De ah la importancia de investigar la presencia de P. aeruginosa en productos farmacuticos que van a seradministrados por va inhalatoria y ocular como as tambin en vehculos acuosos.

Los cosmticos tambin pueden ser vehculo de este microorganismo en especial los lquidos y cremas.

Pseudomonas aeruginosa y otras bacterias Gram negativas pueden colonizar los sistemas de purificacin deagua por la formacin de biofilms. Estas estructuras una vez formadas son muy difciles de remover con el usode agentes sanitizantes.

Los Biofilms (o biopelculas) son masas de microorganismos vivos o muertos que se acumulan dentro de losreservorios de agua, caeras u otras superficies inertes como acero inoxidable de equipos y mesadas. Otros

organismos o materiales pueden ser atrapados en las lminas del biofilm, incluyendo nematodes, algas,bacterias, hongos y depsitos minerales. La densidad bacteriana en el biofilmpuede estar en el orden de 105a108ufc/cm2.

Durante los ltimos aos se realizaron estudios genticos que ayudaron a comenzar a entender el complejoproceso de desarrollo de la formacin de un biofilm. Ver captulo de Biopelculasen el presente manual.

Staphylococcus aureus

El genero Staphylococcusest ampliamente distribuido en la naturaleza, se lo encuentra en la piel y mucosas dehumanos y de otros primates. Es frecuentemente encontrado en la boca, sangre, glndulas mamarias, intestino,tracto genitourinario y vas areas respiratorias de sus huspedes. Staphylococcus aureusse trata de un coco

Gram positivo perteneciente a la familia Micrococcaceae.Est bien documentado que S. aureuses un patgeno oportunista humano y es una de las mayores causas deinfecciones agudas y piognicas; si no es tratada, puede extenderse al tejido circundante o por va de unabacteriemia a otros rganos. Muchas de las infecciones causadas por S. aureusenvuelven la piel con episodiosde celulitis, imptigo, e infecciones post operatorias en diversos sitios. Otras infecciones mayores en las que estimplicado este microorganismo son: bacteriemia, neumona, osteomielitis, endocarditis aguda, meningitis,abscesos en msculo, entre otros.

La presencia del genero Staphylococcus y particularmente S. aureus en una materia prima o productofarmacutico o cosmtico, indica que la fuente de contaminacin puede ser humana, o sea los operadores. Estosmicroorganismos pueden ser transportados por el polvo, piel, ropa y microgotas de humedad que se generan almoverse, hablar y stornudar (5).

Escherichia coli

El tracto gastrointestinal de los animales contiene siempre microorganismos. Se pueden encontrarmicroorganismos patgenos reconocidos como Salmonella y Shigella, y otros microorganismos nativos comoStaphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, enterococos, lactobacilos, diversos miembros de la familiaEnterobacteriaceae, clostridios y una gran variedad de protozoos.

Los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son bacilos Gram negativos anaerobios facultativos quefermentan la glucosa. Las enterobacterias estn ampliamente distribuidas en plantas, suelos y en el intestino dehumanos y animales. Estn asociados con muchos tipos de infecciones como abscesos, neumona, meningitis,septicemia e infecciones intestinales, urinarias y heridas.

Escherichia colies parte de la flora normal fecal de humanos y animales inferiores, Sin embargo algunas cepaspueden producir infecciones del tracto urinario, de heridas y entricas, ocasionalmente pueden producir


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manual microbiologia aplicada

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