manual microbiologia general

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    Dr. Enrique Fernndez FassnachtRector General

    Mtra. Iris Santacruz FabilaSecretaria General

    UNIDAD IZTAPALAPA

    Dr. Javier Velzquez MoctezumaRector

    Dr. scar Jorge Comas RodrguezSecretario

    Dr. Rubn Romn RamosDirector de la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Dra. Edith Ponce AlquiciraJefe del Departamento de Biotecnologa

    Dra. Milagros Huerta CoriaCoordinadora de Extensin Universitaria

    Lic. Adrin Felipe Valencia LlamasJefe de la Seccin de Produccin Editorial

    Primera Impresin 2012

    UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANAUNIDAD IZTAPALAPA

    Av. Michoacn y La PursimaIztapalapa, 09340. Mxico, D. F.

    Impreso y hecho en Mxico/Printed in Mexico

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    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    PresentacinA los alumnos, alumnas y profesores:

    EsteManual de Prcticas del Laboratorio de Microbiologa General est diseado como material didctico de laboratorio paracursar la UEA Microbiologa General, que forma parte de los planes de estudio de las carreras de Ingeniera de los Alimentos eIngeniera Bioqumica Industrial, impartidas en la UAM Iztapalapa.

    Como estudiantes que inician su experiencia en el manejo de microorganismos, se les darn las indicaciones bsicas deltrabajo en este tipo de laboratorios para que comprendan la importancia de realizar un trabajo seguro y eficiente.

    Este manual inicia con un captulo sobre Seguridad en el laboratorio,con los antecedentes y reglas de seguridad ms

    importantes que debern conocer y practicar siempre. Es recomendable resolver el cuestionario de este captulo, as como losde las prcticas incluidas para reflexionar sobre el trabajo realizado, profundizar en los contenidos y mejorar su aprendizaje.

    Las diez prcticas que contiene este manual son de realizacin sencilla y comprobada en numerosos cursos impartidos.Las prcticas propuestas tratan sobre el manejo de bacterias, hongos y algas, porque son los grupos microbianos de mayoraplicacin en biotecnologa y son suficientes para que los alumnos aprendan las bases de trabajo que necesitarn en sus cursosposteriores.

    Cada prctica se estructura en secciones: primero, los Objetivos y la Introduccinpara facilitar la comprensin de losfundamentos de las prcticas. Luego se indican los Materialesque se requieren y los Procedimientos a realizar en forma deinstrucciones numeradas, que se complementan con figuras.

    Al final de cada prctica se proponen cuadros de recopilacin de Resultadosy un espacio para que el alumno redacte unabreve Discusinde sus resultados y su Conclusincon base en los resultados y a los objetivos planteados.

    De igual forma, encontrarn en este manual losAnexos 1y 2, con instrucciones para la preparacin de soluciones y mediosde cultivo que se requieren en las prcticas, as como las Referencias bibliogrficasde apoyo.

    Los invitamos a consultar este manual y sobre todo a realizar los experimentos propuestos con inters y entusiasmo paraadquirir los conocimientos y habilidades de trabajo que se requiere de los profesionales capacitados en estas disciplinas.

    Las autoras

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    5/78 5Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    ndiceSeguridad en el laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

    Prctica 1 Esterilizacin de materiales y medios de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

    Prctica 2 Tcnicas de siembra y aislamiento de bacterias y levaduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

    Prctica 3 Tcnicas de tincin simple, diferencial y selectiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

    Prctica 4 Pruebas de diferenciacin bioqumica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

    Prctica 5 Cultivo y morfologa de hongos filamentosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

    Prctica 6 Cultivo y morfologa de microalgas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

    Prctica 7 Cuantificacin de microorganismos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

    Prctica 8 Efecto de factores ambientales en la curva de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

    Prctica 9 Efecto de la actividad de agua sobre el crecimiento microbiano. . . . . . . . . . . . . . . 55

    Prctica 10 Evaluacin de agentes antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

    Anexo 1. Preparacin de soluciones y colorantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

    Anexo 2. Preparacin de medios de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

    Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

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    7/78 7Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Seguridad en el laboratorioAntecedentes

    Desde hace tiempo la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en particular, la seguridad biolgica

    son importantes cuestiones de inters internacional. En 1983, la OMS public la primera edicin del Manual de bioseguridaden el laboratorio; en la que se alentaba a los pases a aceptar y aplicar conceptos bsicos en materia de seguridad biolgica, ascomo elaborar cdigos nacionales de prcticas para la manipulacin sin riesgo de microorganismos patgenos en los laborato-rios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales.

    La tercera edicin delManual de bioseguridad en el laboratoriode la OMS (2005) proporciona la informacin ms actuali-zada para abordar los aspectos de la seguridad y la proteccin biolgica que se plantean en el nuevo milenio. Asimismo, subrayala importancia de la responsabilidad personal. Adems, hace reflexionar sobre los recientes acontecimientos mundiales quehacen evidente los peligros para la salud pblica derivados de la liberacin o el uso indebido de agentes y toxinas microbianos.

    Como profesionales de estas disciplinas, es importante conocer los principios bsicos de seguridad en el trabajo con micro-organismos, considerando los peligros relativos que implican su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los microor-ganismos para infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado en grupos de riesgo, que se presentan en la Tabla 1.

    Tabla 1. Clasificacin de microorganismos infecciosos por grupos de riesgo.

    Grupo de riesgo 1(riesgo individual y poblacional escaso o nulo)

    Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar en-fermedades en el ser humano o los animales.

    Grupo de riesgo 2(riesgo individual moderado, riesgo poblacionalbajo)

    Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanaso animales pero que tienen pocas probabilidades de entraar unriesgo grave para el personal de laboratorio, la poblacin, animales oel medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocaruna infeccin grave, pero existen medidas preventivas y teraputicas

    eficaces y el riesgo de propagacin es limitado.

    Grupo de riesgo 3(riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)

    Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas oanimales graves, pero que de ordinario no se propagan de un in-dividuo a otro. Existen medidas preventivas y teraputicas eficaces.

    Grupo de riesgo 4(riesgo individual y poblacional elevado)

    Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades graves en elser humano o los animales y que se transmiten con facilidad de unindividuo a otro, directa o indirectamente. Por lo regular no existenmedidas preventivas y teraputicas eficaces

    La OMS y losNational Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos, han propuesto las bases para la jerarquizacin de los

    laboratorios en funcin del grupo de riesgo al que pertenecen los microorganismos que manejan, indicando las condiciones deacceso, tipo de personal, equipo especial y diseo especfico de las instalaciones.

    Normas de seguridad en los laboratorios de docencia

    El Consejo Divisional de CBS aprob un Instructivo delFuncionamiento Interno y Operativo para Regular el Uso de los Serviciose Instalaciones de los Laboratorios de Docencia que fue aprobado por el Consejo Acadmico en la Sesin nmero 314 del 9de noviembre de 2009.

    Un aspecto muy importante que se incluye en este instructivo es el de cumplir en forma estricta las normas de seguridadpara evitar accidentes en el laboratorio, de manera particular en el captulo IV de lasNormas de SeguridadArtculo17 que dice:

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    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    8 Seguridad en el laboratorio

    En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad fsica de las personas involucradas; por ello, no podr

    realizarse ninguna prctica o actividad experimental si el ejecutante no cuenta con los elementos de proteccin indispensa-

    bles para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas aplicables, para lo cual se debern cumplir siempre las

    siguientes reglas.

    1. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable vestir ropa sencilla, queproteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de algodn, zapatos cerrados, con suelas gruesas y sin tacones o platafor-mas, as como traer el pelo recogido.

    2. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o los ojos con las manos.

    3. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabn y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salgan por brevesperiodos.

    4. Al manipular sustancias qumicas corrosivas o peligrosas se utilizarn guantes, lentes protectores y/o mascarillas. No sedeber pipetear oralmente ningn tipo de solucin o cultivo microbiano. Siempre se utilizarn propipetas adecuadas paraeste fin.

    5. No se admitirn visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en eltrabajo.

    6. Evitar la acumulacin de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades de manera ordenada y ensilencio para evitar accidentes.

    7. Localizar extintores, botiqun y salidas de emergencia.

    Sobre los procedimientos

    1. Antes y despus de cada sesin prctica, los alumnos limpiarn las mesas de trabajo con el desinfectante que se le propor-cionar.

    2. Cuando se utilice el mechero, este ser colocado en un lugar alejado del microscopio y otros equipos.

    3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de conservar la calma, inmediatamenteinformar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento:

    a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin.b. Agregar abundante solucin desinfectante sobre las toallas.c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la eliminacin de mate-

    riales contaminados.

    4. Al concluir cada sesin prctica, el estudiante se asegurar de que los materiales de desecho u objetos contaminados seancolocados en recipientes especficos para ello, as como en lugares apropiados. Debern esterilizarse tal y como indique elprofesor.

    Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio

    1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar la ayuda del profesor, delayudante o del tcnico del laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.

    2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado para apagarlo, desconectarlo,guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia.

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    9/78 9Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas, autoclave, potenci-metros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.

    4. Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estn bien cerradas. Dejar limpias y secas las mesas detrabajo.

    Materiales indispensables en cada sesin de laboratorio

    1. El Manual de laboratorio.

    2. 2 cubre bocas y 1 par de guantes de ltex .

    3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar (masking-tape), marcador indeleble o etiquetas pequeas,jabn para manos.

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    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Seguridad en el laboratorio

    Cuestionario1. Qu es la bioseguridad, de cuntos niveles consta y qu caractersticas posee cada uno de estos niveles?

    2. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiologa y un laboratorio convencional.

    3. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo lquido bacteriano se derrama sobre una superficie.

    4. Cules son los riesgos y problemticas en el grupo que se tendrn al no seguir las indicaciones recomendadas?

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    11/7811Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 1Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

    Objetivos

    Que el alumno conozca los principios generales de la preparacin y tcnicas de esterilizacin de diversos materiales y mediosde cultivo de uso comn en Microbiologa. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminacinmicrobiana en el laboratorio.

    Introduccin

    La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquierforma viviente. Una esterilizacin deficiente o manipulacin incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contami-naciones, resultados errneos o prdida del material biolgico. Por ello, se requieren buenas prcticas de laboratorio para suadecuado manejo.

    La esterilizacin por calor seco o hmedo son los mtodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Micro-biologa. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de unmechero o en horno a 150-180C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican en la esterilizacin de asas de inoculacin y paratodo tipo de material de vidrio y quirrgico.

    Los procesos con calor hmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y protenas; se aplican para esterilizar mediosde cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.

    El equipo de uso comn es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presin (15 lb/in2); con esta presin el material alcanzauna temperatura de 121 C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurar la inactivacin de endosporas, que son las estruc-turas bacterianas ms resistentes al calor.

    Como en los estudios de microbiologa se requiere la esterilizacin de espacios, superficies y materiales de naturaleza di-versa (plstico, vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes mtodos que se aplicarn deacuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la Tabla 2.

    Tabla 2. Mtodos de esterilizacin.

    Mtodos fsicos

    calor

    hmedo vapor a presin (autoclave)

    seco

    aire caliente (horno)

    flameado

    incineracin

    filtracindiscos de membranas o filtros absolutos

    flujo laminar

    radiaciones

    no ionizantes rayos ultravioletarayos infrarrojos

    ionizantes

    rayos X

    rayos (cobalto-60)

    radiacin electrnica de alta energa

    Mtodos qumicos

    gases xido de etileno

    lquidosformaldehdo

    -propiolactona

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    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    12 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con rosca

    4 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin rosca15 cajas Petri de vidrio

    10 pipetas serolgicas de 1.0 mL

    5 pipetas serolgicas de 10 mL

    2 pipetas Pasteur

    4 matraces Erlenmeyer de 500 mL

    1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL

    1 matraz volumtrico de 100 mL

    3 vasos de precipitados de 100 mL

    1 probeta de 250 mL

    2 parrillas de calentamiento con agitacin

    2 agitadores magnticos

    1 gradilla

    3 propipetasmecnicas (1.0, 5.0, 10 mL)

    3 esptulas

    2 mecheros Fisher

    1 piceta con agua destilada

    1 piceta con alcohol al 70%

    1 potencimetro

    Papel manila o estraza para envolverAlgodn y gasa

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas1 horno (temperatura>150C)

    1 incubadora

    1 refrigerador

    2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    Medios y Reactivos

    caldo nutritivo (CN)

    agar bacteriolgico

    agar papa dextrosa (PDA)

    agar eosina azul de metileno (EMB)

    Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7

    HCl

    NaOH

    Procedimientos

    El profesor har la demostracin para: envolver las cajas Petri y pipetas con papel estraza, as como elaborar tapones y capucho-nes para tubos y matraces.

    Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo

    1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua corriente.

    2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel deenvolver.

    3. Preparar 200 mL de CN en un matraz Erlenmeyer de 500 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 con un potencimetro, agregando conuna pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCl 0.1M o solucin de NaOH 0.1M en caso de que el pH sea ms alcalino ocido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapn de rosca que se cerrarn sin llegar al tope.

    4. Preparar agar nutritivo (AN) agregando 2.7 g a los 180 mL del CN restante (15 g/L).

    Prctica 1

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    13/7813Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    5. Calentar el medio en una parrilla con agitacin constante hasta ebullicin (cuidar que no se proyecte) y vaciar 5 mL demedio en cuatro tubos con tapn de rosca. Enjuagar de inmediato la pipeta para evitar que se solidifique el agar.

    6. Preparar 200 mL de medio de cultivo PDA en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, ajustar el pH del medio a 5.6. Colocar unagitador magntico y calentar hasta ebullicin, cuidando que no se proyecte o derrame. Vaciar 5 mL de medio en cuatro

    tubos sin rosca que se taparn con tapn de algodn y gasa.

    7. Preparar 200 mL de medio de cultivo EMB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Colocar un agitador magntico y calentarhasta ebullicin. NOTA: Cuidar que no se derrame!

    Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

    1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarn en un horno a 150C durante 2 horas. Despus de sacarlas,dejar enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea asptica (cerca del mechero).

    2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:

    a. Revisar que el agua en la autoclave est limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario

    cambiar o aadir agua destilada.b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento mximo. Con el uso de guantes de asbesto, acomodar los

    medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperar a que salga el vapor por el orificio

    de purga, despus cerrarlo con la vlvula.d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 lbs /in2de presin y mantener estas condiciones durante

    15 minutos. Revisar continuamente el manmetro y regular el control de temperatura a valor medio o mnimo.e. Apagar la autoclave y dejar que la presin baje al valor de cero. Quitar la vlvula y con la ayuda de guantes de asbesto,

    abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

    Vertido de los medios en cajas Petri y solidificacin.

    1. Cerrar los tubos con tapn de rosca, los que contienen agar se colocarn en una superficie inclinada para que el mediosolidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

    2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50C, que coincide con la posibilidadde sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.

    3. Limpiar la mesa con solucin de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos a una distancia de 50 cm. Verterentre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres cajas Petri en esta zona asptica. Dejar que los medios solidifiquen.

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    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 1

    Prueba de esterilidad de materiales

    1. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zonas no aspticas (patio, aulas,comedor) y etiquetarlas.

    2. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zona aspticas (cerca delmechero) y etiquetarlas.

    3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30C durante 24-48 horas. Las cajas Petri se colocarn conla tapa hacia abajo.

    4. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparicin de turbidez, nata superficialy/o depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido, as como la formacin de colonias microbianas en lasuperficie de los medios slidos.

    Resultados

    A. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++)crecimiento abundante.

    B. Describir la morfologa de las colonias en el Cuadro 1.

    C. Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilizacin y manejo de los materiales.

    Cuadro 1. Descripcin del crecimiento de colonias en cajas Petri y apariencia de tubos con medios de cultivo.

    Medio de cultivo En rea no asptica En rea asptica

    Agar nutritivo

    caja

    tubo

    Papa dextrosa agar

    caja

    tubo

    EMB agar caja

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    15/7815Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario1. Qu caractersticas de un material o sustancia se requieren conocer para elegir el mtodo adecuado de esterilizacin?

    2. Qu diferencias observ en los resultados obtenidos en tubos y en cajas de Petri? Explique.

    3. Describa el tipo de contaminantes microbianos que se encuentran con mayor frecuencia en las cajas de Petri. Cmo expli-can estos resultados?

    4. Cules son las tres principales recomendaciones de uso correcto de la autoclave?

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    17/7817Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 2Tcnicas de siembra y aislamiento de bacterias y levaduras

    Objetivos

    Que el alumno aplique diferentes tcnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias y levaduras en medios slidos.Comprobar la utilidad que tienen los medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos.

    Introduccin

    El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de tcnicas de siembra o inoculacin y de ais-lamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversosestudios morfolgicos, de identificacin, bioqumicos, de patogenicidad y ecolgicos, entre otros.

    Existen diferentes tcnicas de siembra: por suspensin de la muestra en medios lquidos; extensin de diluciones de uncultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estra en caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada;

    por piquete o picadura en tubos con medios slidos o semislidos. Con la aplicacin de cada tcnica se obtiene informacin deimportancia para el estudio bsico o aplicado de los microorganismos de inters.

    En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de comunidades degran complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio ms importantes en microbiologa es aislarlos. El aislamiento debacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la tcnica de estra cruzada para producircolonias aisladas en cultivos slidos y as, obtener un cultivo puro o axnico, tambin conocido como cepa, que contiene un solotipo de microorganismo con la misma composicin gentica.

    Cuando la tcnica por estra se aplica para aislar un microorganismo de inters a partir de mezclas donde se encuentra enpequeas cantidades, generalmente se obtendrn las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o deenriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz

    o temperatura que incrementarn la poblacin del microorganismo de inters y se facilitar su aislamiento.

    Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible distinguir entreespecies bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la apariencia del pH delmedio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterizacin e identifica-cin de especies bacterianas.

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    4 cajas Petri con agar nutritivo (AN)

    4 cajas Petri con agar eosina azul de metileno (EMB)4 cajas Petri con agar papa dextrosa (PDA)

    4 tubos con caldo nutritivo (CN)

    4 tubos inclinados con AN

    4 tubos inclinados con PDA

    2 mecheros Fischer

    2 asas de inoculacin

    1 piceta con agua destilada

    1 incubadora a 30C

    1 refrigerador2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    papel estraza, algodn y gasa

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    18/7818

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Procedimientos

    El profesor proporcionar cultivos puros (cepas) de bacterias Gram (+):Bacillus sp., Micrococcus sp., Gram (-):Escherichia coliy un cultivo de la levaduraSaccharomyces cerevisiae,as como una muestra problema (con al menos dos microorganismosdiferentes). Cada equipo de trabajo inocularE. coli,una bacteria Gram +, la levadura y un cultivo problema en una caja de

    cada medio.

    Tcnica de estra cruzada (Figura 1)

    A. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrs en cuatro cuadrantes. Esterilizar el asa con calor en el mechero.

    B. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.

    C. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estras simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar lacaja. Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta.

    D. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fra, tocar la superficie del de estras recin hechas en un punto

    alejado del inicio. Hacer un segundo grupo de estras como en el caso anterior. Realizar el mismo procedimiento en el tercercuadrante y en el ltimo cuadrante, sin flamear el asa de siembra har una estra ms abierta (simple).

    F. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 35C durante 24-48 horas.

    A

    B

    C

    D

    Figura 1.Tcnica de siembra por estra en placas de Petri.

    Siembra en tubos y condiciones de incubacin (Figura 2)

    A. Despus de la incubacin de los cultivos, seleccionar, de las cajas Petri con AN, la colonia ms aislada de cada cepa.

    B. Transferir con el asa, previamente esterilizada y fra, una pequea muestra de la colonia a un tubo de CN.

    C. Transferir de la misma forma una muestra de la misma colonia inoculando por estra los tubos inclinados con AN y PDA.

    D. Incubar los tubos a 35C durante 24-48 hrs. Observar la aparicin de colonias y reportar la forma de crecimiento de losmicroorganismos.

    Prctica 2

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    19/7819Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    A

    BC

    Figura 2.Tcnicas de siembra en tubos de cultivo.

    Resultados

    A. Reportar en el Cuadro 2, sus resultados de siembra de las cepas en cada medio de cultivo.

    B. Describir la morfologa colonial representativa de cada cultivo microbiano de acuerdo con los criterios indicados en los

    cuadros 3 a 6.

    C. Verificar el tipo de microorganismos que corresponden a la muestra problema, en comparacin con los cultivos puros.

    Cuadro 2. Resultados de crecimiento (C) y aislamiento (A) de cepas en medios de cultivo. (-) no hay crecimiento o no se aisl; (+)

    hay crecimiento, s se aisl.

    Medio decultivo

    E. coli Gram (+): S. cerevisiae Cultivo problema

    C A C A C A C A

    AN

    PDA

    EMB

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    20/7820

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 2

    Cuadro 3. Morfologa colonial de cultivos microbianos en AN.

    E. coli Gram (+): S. cerevisiae Cultivo problema

    Forma

    Color

    Tamao (mm)

    Borde

    Elevacin

    Aspecto:Opaco Brillante

    Consistencia:Dura Suave Elstica

    REDONDEADO

    ONDULADO

    LOBULADO

    ESPICULADO

    FILAMENTOSO

    RIZOIDE

    PLANA

    PLANO CONVEXA

    CONVEXA

    ACUMINADA

    UMBONADA

    PAPILALDA

    PUNTIFIORME

    CIRCULAR

    FILAMENTOSA

    IRREGULAR

    RIZOIDE

    FUSIFORME

    Forma Borde Elevacin

    Cuadro 4. Morfologa colonial de cultivos microbianos en EMB agar.

    E. coli Gram (+): S. cerevisiae Cultivo problema

    Forma

    Color

    Tamao (mm)

    Borde

    Elevacin

    Aspecto:Opaco Brillante

    Consistencia:Dura Suave Elstica

    REDONDEADO

    ONDULADO

    LOBULADO

    ESPICULADO

    FILAMENTOSO

    RIZOIDE

    PLANA

    PLANO CONVEXA

    CONVEXA

    ACUMINADA

    UMBONADA

    PAPILALDA

    PUNTIFIORME

    CIRCULAR

    FILAMENTOSA

    IRREGULAR

    RIZOIDE

    FUSIFORME

    Forma Borde Elevacin

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    21/7821Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Cuadro 5. Morfologa colonial de cultivos microbianos en PDA.

    E.coli Gram (+): S. cerevisiae Cultivo problema

    Forma

    Color

    Tamao (mm)

    Borde

    Elevacin

    Aspecto:Opaco Brillante

    Consistencia:Dura Suave Elstica

    Cuadro 6. Descripcin de cultivos en tubos con CN, AN y PDA.E. coli Gram (+): S. cerevisiae

    Cultivo en tubos de CN

    Forma de pelcula: S No

    Opacidad: Ligera(L), Media(M), Nula(N)

    Sedimento: Compacto(C), Grumoso(G),Viscoso (V)

    Cultivo en tubos inclinados

    AN

    Color de la colonia:

    Color del medio:

    PDA

    Color de la colonia:

    Color del medio:

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    22/7822

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 222

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario1. Por qu se considera que un cultivo puro supone condiciones no naturales? Qu reflexiones hara sobre los resultados

    obtenidos en laboratorio con este tipo de cultivo?

    2. Cules son las ventajas y desventajas de la tcnica de estra cruzada? Proponga otras tcnicas de aislamiento en medios

    slidos que se aplican en microbiologa.

    3. Para qu se inocularon tubos con medios lquidos y tubos con medios slidos por estra?

    4. Investigue la composicin qumica de los medios AN, EMB y PDA. Explique qu tipo de medios son con base en composi-cin y uso.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    23/7823Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 3Tcnicas de tincin simple, diferencial y selectiva

    Objetivos

    Que el alumno aprenda las tcnicas de preparacin de frotis, fijacin y tincin ms utilizadas en el estudio microscpico decultivos microbianos. Que obtenga la informacin bsica para hacer la descripcin inicial de los microorganismos.

    Introduccin

    Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias), por los que no se observarncon facilidad en un microscopio ptico de campo claro por la falta de contraste entre las clulas y el medio circundante, por loque es necesario fijarlos y teirlos en un frotis.

    Un frotis se prepara distribuyendo una pequea suspensin de los microorganismos sobre una superficie transparente que,posteriormente, se fija a la superficie con calor o solventes orgnicos; lo que causar la inactivacin o muerte celular y algunas

    modificaciones de sus caractersticas.

    Existen diferentes tipos de tinciones: simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el nmero y tipo de colorantes utilizadosy de los objetivos de estudio. La tincin que hace uso de un solo colorante es la simple.

    Las tinciones diferenciales permiten diferenciar microorganismos con caractersticas superficiales distintas, por lo que re-quieren ms de un colorante. La ms utilizada en bacteriologa es la propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, queclasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas.

    Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas que son tiles para la clasificacin taxonmica de bac-terias. Por ejemplo, la tincin de endosporas permite identificar bacterias de tipoBacillusy Clostridium.

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    1 probeta de 100 mL

    1 vaso de precipitados de 100 mL

    2 mecheros Fisher

    2 asas de inoculacin

    10 portaobjetos

    1 parrilla de calentamiento con agitacin

    1 gradilla

    1 piceta con agua destilada2 microscopios pticos

    1 frasco gotero con aceite de inmersin

    1 piceta con alcohol al 70%

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas

    2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    papel estraza, algodn y gasa

    tira de papel filtro Wathman # 1

    Medios y reactivos

    4 juego de colorantes de Gram

    2 frascos gotero con verde de malaquita 5% en agua

    Etanol absoluto

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    24/7824

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 324

    Procedimientos

    El profesor proporcionar cultivos lquidos y slidos de cada una de las cepas de estudio y un cultivo problema. El equipo detrabajo preparar frotis de los dos tipos de cultivos y har tincin simple de S. cerevisiae; tincin de Gram de Micrococcussp.,

    Escherichia coli., Bacillus sp., as como la tincin selectiva de endosporas en cultivos de Bacillus sp. Tambin aplicarn estas

    tcnicas en el cultivo problema.

    Preparacin de frotis (Figura 3)

    A. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.

    B. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quemay destruccin de los microorganismos. Si los frotis son de cultivos slidos, se colocar en el centro del portaobjetos una gotade agua destilada.

    C. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapn del tubo, flamear la boca e introducir el asa para tomar lamuestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en rea circular de ms o menos 2 cm de

    dimetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.

    D. En el caso de cultivos lquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza el mismo procedimiento antesdescrito.

    Fijacin del frotis

    E. Los frotis de cultivos slidos se fijarn con calor, pasando el portaobjetos rpidamente 2-3 veces por la flama del mechero.

    F. Los frotis de medios lquidos se fijarn colocando dos gotas de etanol absoluto, que se dejarn secar al aire (precaucin:hacer esto en zona alejada del mechero).

    B

    C

    D

    E

    F

    CULTIVO LQUIDO

    CULTIVO SLIDO

    Figura 3. Preparacin y fijacin de frotis.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    25/7825Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Tincin simple

    1. Cubrir el frotis deS. cerevisiaey de la muestra problemacon 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos.

    2. Eliminar el exceso de colorante con la piceta de agua destilada y dejar secar al aire.

    Tincin de Gram

    1. Cubrir el frotis deMicrococcussp.,E. coli,Bacillus sp. y de la muestra problema con 2 gotas de cristal violeta durante 60segundos. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

    2. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con precaucin el frotis con agua.

    3. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya ms colorante. Lavar de inmediato con agua.

    4. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. Lavar de nuevo con agua, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

    Tincin selectiva de endosporas

    1. Colocar un pequeo trozo de papel filtro sobre un frotis deBacillus sp.

    2. Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparacin.

    3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullicin.

    4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco ms, si es necesario).

    5. Eliminar el colorante con agua destilada y cubrir con safranina durante 30 segundos.

    6. Lavar nuevamente, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

    Observacin al microscopio.

    1. Limpiar con precaucin los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

    2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observacin (iluminacin Khler), siguiendo las indicaciones del profesor.

    3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparacin con el objetivo de 10X, despus pasar al de 40X. Para laobservacin con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin.

    4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones quedaan estos sistemas.

    Resultados

    A. Reportar las observaciones microscpicas en los Cuadros 7- 9.

    B. Comparar sus observaciones con la informacin reportada en la literatura.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    26/7826

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 3

    Cuadro 7. Observaciones microscpicas de cultivos con tincin simple.

    Levadura Problema

    Cultivo lquido

    Aumento total:

    Forma: (esfricas, ovales)

    Agrupacin (solos,par,cadenas,racimos)

    Densidad

    Cultivo slido

    Aumento total:

    Forma: (esfricas, ovales)

    Agrupacin (solos, par, cadenas o racimos)

    Densidad

    Cuadro 8. Observaciones microscpicas de cultivos con tincin de Gram

    Cepa 1 Cepa 2

    Cultivo lquido

    Aumento total:

    Forma: (cocos, bacilos, espirilo)

    Agrupacin (solos, par, cadenas, racimos)

    Cultivo slido

    Aumento total:

    Forma: (cocos, bacilos, espirilo)

    Agrupacin (solos, par, cadenas o racimos)

    Cepa 3 Problema

    Cultivo lquido

    Aumento total:

    Forma: (cocos, bacilos, espirilo)

    Agrupacin (solos, par, cadenas o racimos)

    Cultivo slido

    Aumento total:

    Forma: (cocos, bacilos, espirilo)

    Agrupacin (solos, par, cadenas o racimos)

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    27/7827Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Cuadro 9. Descripcin microscpica de endosporas

    Bacillus sp. Problema

    Descripcin del cultivo: (lquido o slido, edad delcultivo)

    Forma y localizacin de la endospora (central o la-teral)

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    28/7828

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 3

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario

    1. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin y fijacin de frotis?

    2. Cul es la descripcin general de un microorganismo que puede reportar en un estudio microscpico aplicando lastcnicas de la prctica?

    3. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la tincin de Gram?

    4. Si se aplica la tincin de Gram deBacillus sp. conendosporas Cmo se observaran la clula vegetativa y la endos-pora? Por qu?

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    29/7829Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 4Pruebas de diferenciacin bioqumica

    Objetivos

    Que el alumno demuestre los tipos de metabolismo bacteriano utilizando las pruebas bioqumicas. Observar la capacidad deutilizacin de diferentes sustratos y condiciones de oxgeno por las bacterias, de importancia para su caracterizacin bioqumica.

    Introduccin

    El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye procesos de obtencin de energa,tales como, descomposicin de molculas orgnicas en los quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el caso de losfottrofos. Asimismo, se encuentran las de sntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).

    Todas las reacciones metablicas son catalizadas por enzimas que en su mayora son intracelulares aunque hay tambinextracelulares, sobre todo hidrolticas, que son liberadas por la clula para catalizar reacciones fuera de esta.

    Es posible conocer las caractersticas metablicas de los microorganismos por su inoculacin en medios de cultivo con diver-sos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energa, carbono, donadores de electrones, as como de otros nutrientesesenciales necesarios para su crecimiento.

    Existen numerosas pruebas bioqumicas con medios de cultivo adicionados de indicadores de pH para detectar la produc-cin de cido o lcali, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinacinde diferentes actividades metablicas. Las actividades que se evalan con mayor frecuencia son: capacidad para fermentarcarbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), para catabolizar aminocidos y urea, la produccin de enzimas hidrolticas especficasde tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etctera.

    Por la importancia que tienen estas pruebas bioqumicas para la identificacin de especies bacterianas en reas de alimentos,

    clnica y ambiental, se han desarrollado sistemas bioqumicos miniaturizados (Api), Micro ID, Microgen que se realizan en formams rpida y segura pero que mantienen los criterios de evaluacin de las pruebas bioqumicas convencionales.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    30/7830

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 4

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    1 gradilla

    2 parrillas de agitacin2 probetas de 100 mL

    2 matraces Erlenmeyer de 250 mL

    2 agitadores magnticos

    2 mecheros Fisher

    1 asa de siembra

    3 tubos de 16 x 150 mm con tapn de rosca y 7 mL de cada medio).

    caldo glucosa-rojo de fenol

    caldo lactosa-rojo de fenol

    caldo sacarosa-rojo de fenol

    caldo manitol-rojo de fenolmedio SIM (Sulfuro, Indol, Movilidad)

    medio TSI (triple azcar hierro)

    medio de citrato de Simmons

    caldo urea

    leche tornasolada

    agar gelatina nutritiva

    1 caja de Petri con Agar Almidn

    12 tubos (campanas) de Durham

    2 portaobjetos

    2 pipetas Pasteur

    1 piceta con agua destilada

    papel manila o estraza para envolver

    algodn y gasa

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas1 incubadora

    1 refrigerador

    2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    Reactivos

    perxido de hidrgeno al 30%

    cido tricloroactico al 5%

    Procedimientos

    El profesor proporcionar cultivos puros de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens y Klebsiella sp. Cadaequipo trabajar con un cultivo puro y un cultivo problema, que inocularn en diferentes medios de cultivo para evaluar diferentesactividades metablicas. Compartirn sus cuadros de resultados con los otros equipos.

    Nota:Los tubos con medio TSI y medio de citrato de Simmons se dejan solidificar en forma inclinada; los tubos con agargelatina nutritiva y medio SIM en forma recta. Uno de los tubos de cada medio se etiqueta como control y no se inocular perose incubarn de la misma forma que los tubos inoculados.

    Fermentacin de carbohidratos

    1. Inocular cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa, lactosa, sacarosa y manitol.

    2. Incubar los tubos a 35C durante 24 a 48 horas.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    31/7831Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    3. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubacin. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador yproduccin de gas en la campana de Durham (medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol).

    Criterios de evaluacin:

    Produccin de cido

    Prueba positiva (+): color amarillo

    Prueba negativa (-): color rojo

    Produccin de gas

    Prueba positiva (+): Burbujas en campana de Durham

    Prueba negativa (-): Sin burbujas

    Utilizacin de urea, azcares, protenas y produccin de sulfuros

    1. Inocular cada cepa en tubos de caldo urea, leche tornasolada. Los tubos con TSI Agar se inoculan primero por picadura enel fondo del tubo y terminar con estra simple en la superficie.

    2. Incubar los tubos a 35C durante 24 a 48 horas.

    3. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubacin.

    Criterios de evaluacin:

    Caldo urea

    Prueba positiva (+): rojo cereza

    Prueba negativa (-): rosa

    TSI

    -Para la produccin de H2SPrueba positiva (+): ennegrecimiento del medio

    Prueba negativa (-): no hay ennegrecimiento

    -Fermentacin de azcares:

    Sin fermentacin de azcares: Medio alcalino, color rojo en pico de flauta sin cambio en profundidad

    -Fermentacin de los azcares: Medio cido, color amarillo en pico de flauta y profundidad

    Fermentacin de glucosa: Alcalino/cido, color rojo en pico de flauta y amarillo en profundidad

    Produccin de gas

    Prueba positiva (+): Separacin ruptura del agarPrueba negativa (-): Sin cambio

    Leche tornasolada

    -Cambio de color:

    Fermentacin de la lactosa: cido color rosa

    Formacin de CO2e H

    2: gas

    Liberacin de amonaco: alcalino color azul prpura

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    32/7832

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 4

    Reduccin del tornasol: Incoloro (blanco)

    Formacin de coagulo

    Peptonizacin (digestin): licuefaccin

    Produccin de sulfuros, indol y movilidad

    1. Inocular por picadura hasta el fondo del tubo cada uno de los tubos con agar SIM.

    2. Incubar los tubos a 35C durante 24 a 48 horas.

    3. Realizar observaciones a las 24 horas.

    Criterios de evaluacin:

    Produccin de H2S

    Prueba positiva (+): ennegrecimiento del medio

    Prueba negativa (-): no hay ennegrecimiento

    Movilidad

    Prueba positiva: hay una turbidez difusa del medio, Prueba negativa: slo hay crecimiento a lo largo de la picadura.

    Produccin de indol

    Prueba positiva: aparicin de color rojo cuando se agrega el reactivo de Kovacs, Prueba negativa: no hay aparicin de color.

    Asimilacin de citrato como fuente de carbono

    1. Inocular primero por picadura en el fondo del tubo y terminar con estra simple en la superficie.

    2. Incubar los tubos a 35C durante 24 a 48 horas.

    3. Realizar observaciones a las 24 y 48 horas.

    Criterios de evaluacin:

    Prueba positiva (+) viraje del medio a azul

    Prueba negativa (-) sin cambio

    Actividades hidrolticas

    1. Inocular cada cepa por picadura (con el asa recta) en los tubos con gelatina nutritiva y por estra simple en la mitad de una

    caja de Petri con agar almidn.

    2. Incubar los tubos y la caja a 35C durante 24 a 48 horas.

    3. En los tubos de agar gelatina, observar si hubo licuefaccin del medio y despus agregar cuidadosamente 1-2 gotas desolucin de cido tricloroactico al 5%, observar la aparicin de zonas claras o turbidez en el medio.

    4. Observar la actividad de amilasas en la caja de agar almidn por el crecimiento de colonias y aparicin de zonas clarasalrededor de la misma. Para mejor observacin, agregar unas gotas de lugol y localizar zonas claras cerca de las colonias yel color azul en la parte no inoculada del medio como indicativo de prueba (+).

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    33/7833Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Actividad de catalasa

    1. Preparar en una gota de agua sobre un portaobjetos una suspensin de una colonia obtenida en medio de agar almidn.

    2. Agregar unas gotas de perxido de hidrgeno al 30%. Observar la formacin de burbujas que indican una prueba de cata-

    lasa (+).

    Resultados

    A. Reportar los resultados en el Cuadro 10 con la notacin siguiente:

    Crecimiento: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), crecimiento medio (++), crecimiento abundante (+++).

    Actividad metablica: Positiva (+), Negativa (-)

    B. Investigar los resultados bibliogrficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la prctica.

    C. Con base en sus resultados y la informacin bibliogrfica, identifique la especie bacteriana que corresponde a su cultivo

    problema.Cuadro 10. Resultados de pruebas de diferenciacin bioqumica

    Medio de cultivo Cepa Cultivo problema

    Caldo rojo de fenol: Glu Lac Sac Man Glu Lac Sac Man

    Crecimiento

    cido (amarillo)

    Alcalino (rojo)

    Gas

    Leche Tornasolada:

    cido (rojo a rosa)lcali (azul a prpura)

    Sin cambio (azul)

    Reduccin (blanco)

    Peptonizacin (licuefaccin)

    Coagulacin (cuajada)

    Gas (burbujas)

    Caldo Urea

    Crecimiento

    Sin cambio (rosa)Hidrlisis de urea (rojo cereza)

    Medio TSI

    Crecimiento

    Produccin de H2S

    Produccin de gas

    Fermentacin de Glu

    Sin fermentacin de azcar

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    34/7834

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 4

    Cuadro 10 (Cont.) Resultados de pruebas de diferenciacin bioqumica

    Medio SIM:

    Produccin de H2S

    Produccin de indol

    Movilidad:

    Crecimiento: superficial, en la parte media,en el fondo

    Crecimiento en la picadura

    Gelatina nutritivaActividad proteoltica

    Licuefaccin del medio

    Formacin de turbidez al agregar TCA al 5%

    Hidrlisis de gelatina

    Crecimiento: superficial, en la parte media,

    en el fondo

    Crecimiento en la picadura

    Movilidad

    Agar almidn (actividad amiloltica)

    Color del medio con el lugol

    Descripcin de colonias

    Medio de Citrato de Simmons

    Cambio de color

    Utilizacin de citrato

    Prueba de catalasa

    Burbujeo

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    35/7835Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario1. Describa las actividades enzimticas que se evalan en cada uno de los medios de cultivo utilizados en la prctica, indicando

    la reaccin bioqumica general.

    2. Por qu se recomienda evaluar las pruebas bioqumicas primero a las 24 horas y despus de 48 horas?

    3. Qu pruebas bioqumicas le permitieron comprobar la capacidad de oxidacin completa de la glucosa? Porque?

    4. Por qu se busca la precipitacin de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la superficie?

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    36/78

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    37/7837Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 5Cultivo y morfologa de hongos filamentosos

    Objetivos

    Que el alumno adquiera los conocimientos bsicos para la manipulacin de hongos filamentosos y tcnicas de cultivo. Quedescriba las caractersticas morfolgicas macroscpicas y microscpicas e identifique algunas especies de hongos.

    Introduccin

    Los hongos son organismos eucariotas, de mayor tamao y complejidad que las bacterias. Se distinguen de otros eucariontes,como los animales, por ser inmviles y, de las algas y plantas, por carecer de pigmentos fotosintticos. Son de nutricin heter-trofa; es decir, dependen de nutrientes orgnicos disueltos por sistemas enzimticos especficos, que son absorbidos a travs de supared celular y membrana plasmtica.

    En este grupo de organismos se encuentran formas unicelulares (levaduras) o pluricelulares (filamentosos). Las levaduras

    son clulas de forma esfrica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; con frecuencia se encuentran formando unacubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen en forma asexual por gemacin, un proceso por elcual brota una protuberancia o yema de la clula madre que, posteriormente se separa como clula individual.

    Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa caracterstica denominada hifa. El conjunto de hifas ra-mificadas constituye el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de loshongos que pertenecen al grupoZygomycota, las hifas no presentan estos septos y se conocen como hifas cenocticas.

    El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual por fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccinde esporas en conidiforos y esporangiforos, formados en hifas areas, llamadas reproductivas.

    La presencia de estructuras de reproduccin sexual, es el principal criterio de clasificacin que permite ubicar a los hongos en

    tres divisiones ophyla:Zygomycota,AscomycotayBasidiomycota. Otros criterios importantes para la clasificacin de los hongosson las caractersticas de las hifas y las estructuras de produccin de esporas asexuales.

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    4 cajas Petri con 25 mL de PDA

    4 tubos inclinados con 7 mL de PDA

    1 matraz Erlenmeyer de 500 mL

    1 probeta de 100 mL

    2 mecheros Fisher10 portaobjetos

    1 pinza de diseccin

    1 asa de siembra

    tiras de cinta adhesiva transparente de 1 pulgada de ancho

    1 tijeras

    2 microscopios pticos

    1 frasco gotero con aceite de inmersin

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas

    2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    1 piceta con alcohol etlico al 70%1 incubadora a 30 C

    1 frasco gotero con azul de lactofenol

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    38/7838

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 5

    Procedimientos

    El profesor proporcionar a los alumnos cultivos de:Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Rhizopus oligosporus, Fusarium sp.

    Cada equipo de trabajo, inocular tres cepas en cajas de Petri con PDA y har la descripcin macroscpica y microscpica de

    cada especie. Compartirn sus cuadros de resultados con los otros equipos.

    Preparacin de materiales e inoculacin

    1. Lavar y preparar todo el material para esterilizar.

    2. Preparar medio PDA, esterilizar a 15 lb/pulg2 a 121C durante 15 min, enfriar el medio hasta aproximadamente 45C yvaciarlo en las cajas Petri.

    Siembra de hongos filamentosos

    1. Para sembrar los hongos filamentosos, se separa una parte de micelio de los hongos proporcionados por el profesor con

    asa de siembra, previamente esterilizada en la flama del mechero.2. Se coloca el micelio en el centro de una caja de Petri con medio por inoculacin por piquete.

    3. Se incuban las cajas de Petri en forma invertida, envueltas en papel o en una bolsa de plstico, a 28-30 C durante 3-5 das.

    Descripcin macroscpica

    Observar las siguientes caractersticas de los hongos filamentosos:

    a) Forma, tamao y tipo de colonia

    b) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio

    c) Color del micelio y color de las esporas

    d) Cambios en el medio de cultivo

    Descripcin microscpica en montaje con cinta adhesiva

    1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio.

    2. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente; con pinzas de diseccin doblar la cinta en U con el adhesivo haciaafuera.

    3. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la periferia de la colonia.

    4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando la formacin de burbujas para noalterar las estructuras. La cinta funciona como cubreobjetos, no es necesario colocar uno.

    5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X. Localizar y ob-servar hifas, estructuras especializadas como esporangiforos, esporangios, conidiforos, conidias y rizoides; determinar silas hifas presentan divisiones (septos).

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    39/7839Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Resultados

    A. Reportar en el Cuadro 11 las observaciones macroscpicas y microscpicas de las cepas, indicando el nombre de cada una.

    B. Comparar las observaciones realizadas con la bibliografa.

    C. Investigar en la literatura cmo se clasifican los hongos estudiados en la prctica.

    Cuadro 11. Descripcin morfolgica de hongos en medio PDA

    CaractersticaCepa

    1 2 3

    Descripcin macroscpica(colonias)

    Color

    Tamao

    Aspecto

    Textura

    Descripcin microscpica

    aumento total de:

    Septos (si/no)

    Estructura de reproduccin.

    Tipo de esporas

    Clasificacin (phyla)

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    40/7840

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 5

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario

    1. Qu diferencias hay entre los procedimientos de observacin e identificacin de bacterias, levaduras y hongos fila-mentosos?

    2. Cules son los principales criterios de identificacin de los hongos?

    3. Describa los tipos de esporas sexuales y asexuales que caracterizan a los diferentesphylade hongos.

    4. Describa de manera breve tres problemticas causadas al hombre por hongos y tres ejemplos de sus aplicacionesindustriales.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    41/7841Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 6Cultivo y morfologa de microalgas

    Objetivo

    Que el alumno describa las caractersticas morfolgicas de las microalgas y conozca la diversidad de especies en muestras natu-rales. Que evale el crecimiento de microalgas en cultivos.

    Introduccin

    Las microalgas son organismos eucariotas, acuticos, fotosintticos, que se encuentran en casi todos los ambientes iluminadosy representan uno de los sistemas ms eficientes para la bioconversin de energa solar en molculas complejas y productoresde oxgeno.

    Existen gneros representativos de agua dulce, salobre y marina, as como de aguas residuales y de embalses. Hoy en da,existen ms de 3000 especies de microalgas, las cuales han sido objeto de estudios taxonmicos y algunos enfocados a aspectos

    fisiolgicos y bioqumicos.

    El crecimiento de las microalgas en los sistemas acuticos se relaciona con la disposicin de nutrientes minerales, comonitratos y fosfatos, por lo que su crecimiento puede ser indicador de la calidad del agua. De esta manera, ms de 1 x 103clulas/mL de microalgas indican una cantidad excesiva de nutrientes.

    El inters de estudio de estos microorganismos se ha dirigido al cultivo para la produccin de compuestos biolgicamenteactivos, como es el caso de las toxinas, antibiticos, antifngicos, aminocidos, lpidos, hidrocarburos, biocombustibles, pig-mentos, vitaminas y polisacridos, los cuales tienen aplicacin en la industria de cosmticos, diettica, farmacutica, agricultura,acuicultura y avicultura.

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    2 matraces Erlenmeyer de 250 mL

    1 matraz Erlenmeyer de 500 mL

    1 matraz Erlenmeyer de 125 mL

    2 pipetas serolgicas de 1mL

    2 pipetas Pasteur

    1 asa de siembra

    2 mecheros Fischer

    1 piceta con agua destilada

    2 microscopios pticos2 esptulas

    1 parrilla con calentamiento y agitacin

    1 agitador magntico

    Gasa, algodn y papel para envolver

    1 espectrofotmetro

    2 celdas para espectrofotmetro

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas

    2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    1 piceta con alcohol etlico al 70%

    incubadora a 30 C con foco de iluminacin

    1 agitador orbital de matracesReactivos

    NaNO3

    MgSO4.7H

    2O

    KH2PO

    4

    K2HPO

    4

    CaCl2.2H

    2O

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    42/7842

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 6

    Procedimientos

    El profesor proporcionar una muestra de un cultivo puro de Chlorella. El profesor solicitar a cada equipo de trabajo, colectaren un frasco limpio y seco una muestra de agua de embalse de: canales de Xochimilco, Cuemanco, Lago de Chapultepec o deAragn. Se inocularn las muestras de agua en medios de cultivo mineral. Compartirn sus cuadros de resultados con los otros

    equipos.

    Preparacin de materiales e inoculacin

    1. Cada equipo preparar 350 ml de medio mineral, vaciarn 150 ml de medio en 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL; a unode los matraces le agregarn 0.4 g NaNO3. Los 50 mL restantes se colocan en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Esterilizarlos medios a 15 lb/pulg2 a121C durante 15 min.

    2. En condiciones aspticas, uno de los equipos inocular sus 2 matraces Erlenemeyer de 250 mL con 15 mL del cultivo deChorella. Los otros equipos inocularn de la misma forma una muestra de embalse.

    3. Homogeneizar el cultivo agitando suavemente y tomar en condiciones aspticas, 2 ml de muestra de cada uno de los

    matraces (tiempo 0).

    4. Leer la densidad ptica a 660 nm calibrando el espectrofotmetro con medio de cultivo estril del matraz Erlenmeyer de 125mL.

    5. Hacer preparaciones en fresco de las muestras de estudio y observar en el microscopio a 40X la morfologa de las microal-gas.

    6. Incubar los matraces a 25-28 C, en agitador orbital a 100 rpm, con iluminacin natural o artificial durante una semana. Leerla densidad ptica a 660 nm y observar la morfologa de las microalgas en preparaciones en fresco.

    Resultados

    A. Anotar los resultados de densidad ptica de los cultivos de microalgas, identificando el origen de las muestras en el cuadro12.

    B. Describir la morfologa de las microalgas en el cuadro 13.

    C. Analizar y discutir los resultados obtenidos comparando con los que se reportan en la bibliografa

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    43/7843Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Cuadro 12. Resultados de densidad ptica de cultivos de microalgas con respecto al tiempo

    Tiempo (das) Muestra de:

    Matraz 1 Matraz 2 (NO3-

    )0

    8

    Cuadro 13. Descripcin microscpica de cultivos de microalgas con respecto al tiempo

    das Aumento: Muestra de:

    T: 0 Caracterstica

    Tamao y morfologa

    Color

    Estructuras especiales (movilidad,ornamentacin, agrupacin)

    Clulas en duplicacin

    Clasificacin(phyla)

    T: 7

    Aumento Matraz 1 Matraz 2

    Tamao

    Color

    Estructuras especiales

    Clulas en duplicacin

    Clasificacin (phyla)

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    44/78

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 644

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario1. Cul fue el efecto del nitrato en el crecimiento de microalgas de su muestra de estudio?

    2. Cmo influy el tiempo de incubacin en los tipos de microalgas observadas en su muestra de estudio?

    3. Investigue las aplicaciones industriales de microalgas en reas de: alimentacin, tratamiento de aguas, acuacultura, cosm-ticos, etctera.

    4. Podra recomendar esta metodologa para conocer el efecto de factores ambientales en el crecimiento de las microalgas?Explique.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    45/7845Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 7Cuantificacin de microorganismos

    Objetivo

    Que el alumno aprenda la tcnica de dilucin y cuenta en placa para cuantificar microorganismos viables y que compare susresultados de la cuenta viable con los de cuenta directa en el microscopio.

    Introduccin

    El crecimiento microbiano se define como el aumento del nmero de microorganismos o de biomasa en un periodo de tiempodeterminado. Existen diferentes mtodos para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.

    La forma de cuantificar clulas viables ms utilizada en microbiologa es la de recuento en placa con medios de cultivoespecficos para la poblacin de inters. Consiste en inocular un volumen determinado de cultivo o muestra sobre un mediode cultivo slido adecuado para el crecimiento de colonias el crecimiento de colonias. Cada una de estas deriva de una clula

    aislada; es decir, una unidad formadora de colonia (UFC).

    Hay dos variaciones en la forma de realizar esta tcnica: la siembra en superficie o vertido en placa. En ambos casos, a lamuestra a cuantificar se le aplica el mtodo de diluciones sucesivas y cada dilucin se deposita en cajas de Petri estriles.

    Es recomendable homogenizar las diluciones y hacer la adecuada inoculacin de las muestras para evitar resultados err-neos. Si no se separan bien las clulas, se obtendrn valores bajos y los valores sern elevados si la toma de muestra se hace delfondo del tubo donde se concentran los microorganismos por gravedad.

    El recuento directo consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de bacterias.En portaobjetos especiales denominados cmaras de Petroff-Hausser o de Neubauer.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    46/7846

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 7

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    10 cajas de Petri con PDA

    15 pipetas de 1 mL2 pipetas de 10 mL

    10 tubos con 9 mL de solucin salina isotnica (SSI)

    1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de SSI

    1 matraz aforado de 100 mL

    1 pipetero metlico

    2 vasos de precipitados de 50 mL

    1 parrilla con agitacin

    1 potencimetro

    1 agitador de tubos tipo Vrtex

    1 cmara de Neubauer2 microscopios pticos

    2 pipetas Pasteur

    2 mecheros Fisher

    2 propipetas de 5 y 10 mL

    1 varilla de vidrio doblada en L

    1 gradilla

    1 piceta con agua destilada

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula

    2 balanzas analticas2 pares de guantes de asbesto

    escobillones, fibra, detergente y toallas de papel

    1 piceta con alcohol etlico al 70%

    1 frasco gotero con azul de metilo

    1 equipo cuenta colonias

    Procedimientos

    El profesor proporcionar un cultivo lquido de Saccharomyces cerevisiae; todos los equipos de trabajo determinarn las UFCpor diluciones decimales y siembra en placas con medio de cultivo. Se compararn estos resultados con los de cuenta directaen cmara. Al final, compartirn sus cuadros de resultados, calcularn la desviacin estndar de los resultados y compararan losresultados del grupo.

    Tcnica de dilucin y siembra en placa (Figura 4)

    1. En condiciones aspticas, pipetear 1 mL del cultivo del microorganismo o de la muestra problema y depositarla en el matrazErlenmeyer con 99 mL de SSI. Esta corresponder a la dilucin 10-2. Hacer diluciones decimales del cultivo hasta 10-7.

    2. Para la inoculacin por la tcnica de superficie, se deposita 0.1 mL de cada una de las diluciones 10-3-10-7. Distribuir cuidado-samente el inculo en toda la superficie de la caja con una varilla de vidrio doblada en L que previamente se sumergi en

    alcohol, se pas en la flama del mechero y se dej enfriar.

    3. Dejar absorber el lquido durante 5-10 minutos. En caso de utilizar la tcnica de vertido se deposita 1.0 mL de la dilucin enla caja de Petri a la cual se le aaden ca.20 mL de medio fundido (48-50C).

    4. Incubar las cajas en forma invertida a 30C durante 72 horas y realizar la cuenta de colonias.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    47/7847Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    1mL1mL

    1mL

    1mL1mL 1mL

    9 mL9 mL9 mL 9 mL 9 mL99 mL

    0.1 mL 0.1 mL0.1 mL 0.1 mL0.1 mL

    10-3 10-4 10-5 10-6 10-7Dilucin10-2

    CultivoMicrobiano

    Figura 4. Tcnica de dilucin y cuenta en placa.

    Tcnica de cuenta directa en cmara de Neubauer (Figura 5)

    1. Se coloca 1 mL de cultivo microbiano original en un tubo de ensaye y se agrega 1 gota de azul de metileno. Mezclar y dejaren reposo durante 5-10 minutos.

    2. Lavar cuidadosamente la cmara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave.Colocar el cubreobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecia una zona cuadricula-da en forma de cruz.

    3. Homogeneizar la muestra en vrtex, tomar de inmediato una alcuota con pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gotaentre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara, evitando el exceso, dejando que la muestra se distribuya porcapilaridad.

    4. Reposar durante 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco dbil (10X) la zonade cuenta que se muestra en la Figura 5. El cuadro central mide 1.0 mm por lado y al observar en objetivo seco fuerte (40X)se encuentra dividido en 5X5 cuadros pequeos de 0.2 mm por lado.

    5. Observar que las clulas que se tien de azul son las no viables y las que no se tien son las viables. La cuantificacin declulas se hace generalmente en el cuadro central a 40X, contando en diagonal las clulas de 9 cuadros (que a su vez estndivididos en 16 cuadros ms pequeos). Al dividir el nmero de clulas entre 9, se obtiene el # clulas/cuadro de 0.2 mmde lado.

    6. Se multiplica el # clulas/cuadro (de 0.2 mm) X 25 para obtener el # total de clulas/0.1 mm3 (1 mm x 1 mm de cada ladodel cuadrante central x 0.1 mm de profundidad de la cmara), que se multiplicar por 104para obtener el # clulas/mL.

    Hacer esta cuenta por duplicado.

    7. En el caso de que el cultivo est muy concentrado, se recomienda hacer diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc. segn sea necesario)para facilitar el conteo.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    48/7848

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 7

    a) Cuadro central (10 x) b) Cuadro central (40 x)0.2 mm

    1 mm

    1mm

    Figura 5. Cuenta en Cmara de Neubauer

    Resultados

    A. Para calcular las UFC, clulas viables y no viables por mL de muestra original, se aplicar lo siguiente:

    En cajas de Petri:

    - Nmero de colonias promedio X (FD)= UFC/ mL, El factor de dilucin (FD) se calcula tomando en cuenta la dilucin que se seleccion como vlida para la cuenta

    (que tenga entre 30-300 colonias) y el volumen de muestra inoculado en cada caja. FD = 1

    Dilucin x Vol. inoculado En la cmara de Neubauer:- Nmero de clulas promedio/cuadro central X (Fd)= # clulas/ mL

    El factor de dilucin (Fd) se aplicar solamente en casos de cultivos con alta densidad de clulas, en las que se hicie-ron diluciones de la muestra original para hacer una cuenta confiable.

    B. Reportar los resultados de cuantificacin en los cuadros 14 y 15.

    C. Recopilar los resultados de los otros equipos y calcular la desviacin estndar y coeficiente de variacin de todos los datos.

    Cuadro 14. Cuenta viable de Saccharomyces cerevisiae en placa.

    No. de colonias en caja No. de colonias promedio D.S. Fd UFC/mL

    Caja 1

    Caja 2

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    49/7849Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Cuadro 15. Cuenta de Saccharomyces cerevisiae en cmara de Neubauer .

    Tcnica No. de clulas por cuadro de 0.1 mm3 No. de clulas promedio D.S. Factor de dilucin (Fd) No. clulas/mL

    Cuenta viable

    1

    2

    Cuenta no viable1

    2

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    50/7850

    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 7

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario1. Comparando el mtodo de dilucin en placa con el mtodo de cuenta directa en cmara de Neubauer para la cuantificacin

    de microorganismos Qu ventajas y desventajas tiene cada uno?

    2. Explique cules la importancia de realizar anlisis estadsticos de los resultados en este tipo de mtodos de cuantificacin demicroorganismos.

    3. Explique la importancia de considerar el factor de dilucin en el clculo de UFC/mL.

    4. Investigue algunas aplicaciones de estas metodologas en reas de alimentos y microbiologa industrial.

  • 5/26/2018 Manual Microbiologia General

    51/7851Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    Prctica 8Efecto de factores ambientales en la curva de crecimiento

    Objetivos

    Que el estudiante identifique las fases de una curva de crecimiento bacteriano en cultivo por lote. Que el alumno calcule y com-pare los parmetros cinticos y t

    den curvas de crecimiento obtenidas en diferentes condiciones ambientales.

    Introduccin

    Cuando se inoculan clulas bacterianas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado, despus de cierto tiempo experi-mentarn un aumento del tamao y posterior divisin celular, por lo que se incrementar el nmero de clulas microbianas. Eltiempo que requiere una clula para que a partir de esta se formen dos se llama tiempo de duplicacin (t

    d).

    As, las clulas cultivadas van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez, sintetizandosus componentes celulares y dividindose a una tasa de crecimiento especfico () hasta alcanzar un incremento mximo de

    biomasa celular denominado crecimiento total (Xt).

    Si se grfica el nmero de clulas o la cantidad de biomasa con respecto al tiempo, se obtendr una curva de crecimientocaracterstica con cuatro fases.

    El nmero de clulas y el tiempo de duracin de cada fase depender de la especie de microorganismo, la preparacin yestado fisiolgico del inculo, la composicin qumica del medio de cultivo y las condiciones ambientales de incubacin (T, pH,NaCl, O

    2).

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    1 matraz Erlenmeyer de 250 mL

    2 matraces Erlenmeyer de 125 mL

    10 tubos de ensaye

    10 pipetas de 5 mL estriles

    10 pipetas de 1 mL estriles

    2 pipetas Pasteur

    1 probeta de 100 mL

    1 gradilla

    1 piceta con agua destilada

    2 esptulas

    2 propipetas de 1.0 y 5.0 mL

    1 potencimetro

    1 parrilla de calentamiento con agitacin

    2 mecheros Fisher

    2 autoclaves (con base, canastilla y vlvula)

    1 espectrofotmetro y 8 celdas

    2 agitadores orbitales de matraces

    2 incubadoras

    Medios de cultivo y reactivos

    caldo nutritivo (CN)

    extracto de levadura

    amortiguadores de referencia pH 4 y pH 7

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    Universidad Autnoma Metropolitana /Unidad Iztapalapa/Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

    Prctica 1Prctica 8

    Procedimientos

    El profesor preparar un cultivo deEscherichia colien un matraz Erlenmeyer con CN con 0.1 % de extracto de levadura y pH =6.5; 12 horas antes de iniciar la prctica. Este cultivo (matraz A) se utilizar como inculo.

    El crecimiento se cuantificar, midiendo la turbidez del cultivo durante 4 horas de incubacin. Cada equipo trabajar diferentescondiciones de pH y temperatura.

    Preparacin de material y medios de cultivo

    a. Cada equipo preparar 120 mL de CN con 0.1% de extracto de levadura en un matraz de 250 mL. Ajustar al pH del medioa pH = 5.0 o pH = 7.0. segn corresponde.

    b. Colocar en 2 tubos de ensaye 10 mL del mismo medio que prepararon antes.

    c. Esterilizar en autoclave (15 lb/in2por 15 min) las pipetas, medios de cultivo y tubos de ensaye vacos.

    Inoculacin de matraces y tratamiento de muestras (Figura 6)

    a. En condiciones aspticas, inocular 10 mL del cultivo deE. coli (del matraz A) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100mL de caldo nutritivo (matraz B).

    b. Homogeneizar el cultivo agitando suavemente y tomar de inmediato, con pipeta estril, 3 mL que se pasan a un tubo deensaye estril. Esta muestra corresponde al tiempo cero (t=0).

    c. Colocar el matraz B en un agitador orbital a una velocidad de 100 rpm, incubando a la temperatura correspondiente. De lamisma forma, se tomarn muestras de 3 mL cada 30 min hasta completar 4 horas de incubacin.

    d. Leer la densidad ptica (D.O.) de cada muestra en un espectrofotmetro a 560 nm, previamente calibrado con medio decultivo estril. Cuando las muestras reporten una D.O. igual o mayor a 0.8, se prepararn diluciones con caldo de cultivoestril. (Fd)

    .

    (b) t = b

    Matraz A Matraz B

    (a) (c) (d)

    Figura 6. Esquema de procedimientos de la curva de crecimiento microbiano.

    Resultados

    A. Registrar los datos de D.O. del cultivo de E. coli para cada condicin de pH y temperatura con respecto al tiempo en elCuadro 16.

    B. Elaborar una grfica de D.O. vs tiempo para cada condicin de pH y temperatura e identificar las fases de crecimiento y laduracin (t) de cada una.

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    53/7853Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

    Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General

    C. Elaborar una grfica de ln D.O. vs tiempo para cada condicin de pH y temperatura e identificar la fase de crecimientoexponencial.

    D. Determinar la tasa especfica de crecimiento () con los datos de la fase exponencial y calcular el tiempo de duplicacin deE. coli en cada condicin de pH y temperatura.

    E. Discutir cmo influyeron las condiciones estudiadas en la duracin de las fases de crecimiento, en el tdy en lade creci-

    miento.

    Cuadro 16. Resultados de crecimiento deE. colicultivada en diferentes condiciones de pH y temperatura.

    Equipo/Condicin Tiempo (h) D.O. FdParmetros

    cinticosEquipo/Condicin DO Fd

    Parmetroscinticos

    1

    pH 5, 25C

    0.5

    1

    =

    2

    pH 5, 37C

    1

    =

    1.0

    1.5

    2.0

    Td= T

    d=

    2.5

    3.0

    3.5

    4.0

    3

    pH 7, 25C

    0.5

    4

    pH 7, 37C

    1.0

    1.5 3=

    3=

    2.0

    2.5

    3.0 Td= T

    d=

    3.5

    4.0

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    Prctica 8

    Discusin de resultados

    Conclusin

    Cuestionario1. Explique los eventos que ocurren a nivel celular en cada una de las fases del crecimiento bacteriano.

    2. Qu hara para disminuir o eliminar la fase de adaptacin en la curva de crecimiento?

    3. Cules fueron las condiciones ptimas de crecimiento deE. coli?Cmo relaciona estos resultados con los reportados en la

    bibliografa?

    4. Cul es la importancia y aplicacin de los estudios de cintica del crecimiento microbiano?

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    55/7855Mara de los ngeles AquiahuatlTania VolkeLilia A. PradoKeiko ShiraiFlorina RamrezMargarita Salazar

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    Prctica 9Efecto de la actividad de agua sobre el crecimiento microbiano

    Objetivos

    Que el alumno observe y comprenda el efecto de la adicin de altas concentraciones de solutos en el crecimiento de bacterias yhongos. Que el alumno establezca la relacin entre la concentracin de solutos, la actividad de agua y el crecimiento microbiano.

    Introduccin

    Cualquier solucin est formada por un soluto y por el solvente en el cual este se disuelve. La concentracin del soluto se re-laciona con un fenmeno conocido como presin osmtica; que es la fuerza con la que el solvente se mueve de una solucinde baja concentracin de soluto a una mayor concentracin a travs de una membrana semipermeable, por lo que tambin sedefine como la presin que se debe aplicar a una solucin para detener el flujo neto de solvente.

    El aumento en la concentracin de solutos en la fase acuosa de un alimento, por ejemplo, mediante su deshidratacin o

    por la adicin de nuevos solutos, tambin provoca una disminucin en la actividad de agua (aw). Cuando se disuelve un solutoen agua pura, la cantidad de agua disponible o agua libre se reduce, conduciendo a una disminucin en el valor de a

    w. La a

    wse

    define como la relacin entre la presin de vapor de una solucin o un material (P) y la presin de vapor del agua pura (P0) a la

    misma temperatura, a travs de la siguiente ecuacin:

    Donden1yn

    2son el nmero de moles de soluto y solvente respectivamente.

    Como una alta concentracin de solutos reduce la aw, al establecerse estas condiciones se limitar el crecimiento de muchas

    bacterias por el efecto osmtico en sus membranas.

    Este efecto se utiliza de manera amplia para la conservacin de alimentos, debido a que la mayora de los microorganismosno toleran estas acondiciones adversas, sin embargo, existen algunos que toleran o incluso requieren para su desarrollo bajosvalores de a

    w(xerfilos), con altas concentraciones de azcares (osmfilos) o de sales (halfilos), por tener mecanismos de

    adaptacin especficos por cada tipo de microorganismo.

    Los microorganismos tolerantes a estas condiciones se encuentran principalmente en: mermeladas, carnes y frutos secos;tambin habitarn en lagos salados, en desiertos y salinas condiciones donde la mayora de los microorganismos se deshidra-taran rpidamente.

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    Prctica 9

    Materiales

    Por equipo Por grupo

    1 caja de Petri con AN1 caja de Petri con AN + 5% de NaCl1 caja de Petri con AN + 10% de NaCl1 caja de Petri con AN + 10% de sacarosa1 caja de Petri con AN + 20% de sacarosa1 matraz Erlenmeyer de 500 mL2 esptulas1 probeta de 250 mL1 parrilla de calentamiento con agitacin1 agitador magntico2 mecheros Fisher1 asa de inoculacin1 piceta con agua destilada

    1 piceta con alcohol al 70%

    2 autoclaves con base, canastilla y vlvula2 balanzas analticas1 incubadora a 30C1 refrigerador2 pares de guantes de asbestoescobillones, fibra, detergente y toallas de papelpapel estraza, algodn y gasa

    Medios y reactivos

    agar nutritivo (AN)sacarosaNaCl

    Procedimientos

    El profesor proporcionar cultivos de:Bacillus subtilis, Staphylococcus sp. Saccharomyces rouxii y Aspergillus niger. Los equiposde trabajo inocularn las cuatro cepas en diferentes medios y se observar la respuesta. Compartirn sus cuadros de resultadosde crecimiento con el grupo para calcular la desviacin estndar y el coeficiente de variacin de los resultados.

    Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo

    1. Cada equipo preparar 200 mL de cada uno de los siguientes medios: AN con NaCl 0, 5 y 10% (p/v) o AN con sacarosa 0,10

    y 20% (p/v).2. Esterilizar los medios preparados en autoclave a 15 lb/in2durante 15 min.

    3. En condiciones aspticas, vaciar en cada caja de Petri entre 20 y 25 mL de cada medio. Dejar que los medios enfren