UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁUNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁUNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁUNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA CURSO DE MEDICINACURSO DE MEDICINACURSO DE MEDICINACURSO DE MEDICINA

(BP332 – Microbiologia Médica Aplicada)

MANUAL MANUAL MANUAL MANUAL TEÓRICOTEÓRICOTEÓRICOTEÓRICO----PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS BÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICABÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICABÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICABÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICA

2ª EDIÇÃO

REALIZAÇÃREALIZAÇÃREALIZAÇÃREALIZAÇÃOOOO

ProfessoraProfessoraProfessoraProfessora:::: Drª Cristina Leise Bastos Monteiro (Coordenadora)

ProfessoraProfessoraProfessoraProfessora:::: Drª Laura Lúcia Cogo

ProfessoraProfessoraProfessoraProfessora:::: Drª Izabel Galarda

AcadêmicoAcadêmicoAcadêmicoAcadêmico:::: Fernando Carlos Bortolozzi Filho

CURITIBA 2009

2

SUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIO

A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE

BACTERIOLOGIA E MICOLOGIA............................................................................... 3

INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 5

CAPÍTULO 1: CONTROLE DE MICRORGANISMOS .............................................. 13

CAPÍTULO 2: TIPOS MORFOLÓGICOS DE BACTÉRIAS E

GRUPAMENTOS BACTERIANOS............................................................................ 29

CAPÍTULO 3: MORFOLOGIA COLONIAL................................................................ 35

CAPÍTULO 4: VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE BACTÉRIAS

NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVÉS DE CULTIVO.............................................. 37

CAPÍTULO 5: PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS ................................................ 39

CAPÍTULO 6: MEIOS DE CULTURA........................................................................ 52

CAPÍTULO 7: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS........................................... 55

CAPÍTULO 8: PROVAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIAIS ......................................... 58

CAPÍTULO 9: MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO HUMANO...................... 69

CAPÍTULO 10: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ATRAVÉS DO

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE AGENTES ETIOLÓGICOS .................... 79

- PORÇÕES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS.......................................................... 79

- OROFARINGE ........................................................................................................ 88

- TRATO GÊNITO URINÁRIO................................................................................. 106

- INTESTINAIS ........................................................................................................ 113

- FEBRE TIFÓIDE E PARATIFÓIDE ....................................................................... 126

- TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS .............................................. 131

CAPÍTULO 11: DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS........................... 136

CAPÍTULO 12: MICOBACTERIOSES .................................................................... 152

CAPÍTULO 13: LEPTOSPIROSE ........................................................................... 170

CAPÍTULO 14: OS FUNGOS E AS MICOSES....................................................... 178

CAPÍTULO 15: HERPES-VÍRUS ............................................................................ 199

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 204

3

A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE

BACTERIOLOGIABACTERIOLOGIABACTERIOLOGIABACTERIOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA

“A segurança de todos depende dos cuidados individuais dos alunos e dos

professores.”

Seguem-se as orientações para os alunos executarem as tarefas dentro dos

parâmetros de biosegurança médica:

1. É obrigatório o uso de avental (ou jaleco, guarda-pó, etc.) fechado na frente e de

mangas compridas, para proteger a roupa e a pele dos braços.

2. É expressamente proibido comer, beber ou fumar dentro do laboratório.

3. Não usar anéis e pulseiras.

4. Prender o cabelo comprido.

5. Lavar as mãos antes e depois dos procedimentos. Após a lavagem das mãos

utilizar álcool 70% para otimizar a desinfecção.

6. Evitar o contato da pele e mucosas com materiais clínicos tais como sangue, pus,

escarro, fezes, urina, outras secreções e exsudatos. Tratar sempre todas as amostras

como potencialmente infectantes, sendo que os maiores perigos estão relacionados

com o vírus da hepatite B, HIV, bacilos da tuberculose e salmonelas.

Observação: cada mL de sangue pode conter 100 milhões de vírus de hepatite B e

uma só partícula provoca a hepatite. Caso ocorram respingos pelo material

contaminado sobre a pele, fazer imediatamente a antissepsia do local. O avental

respingado deve ser colocado em cartucho plástico para não contaminar outros

objetos.

7. Não trabalhar nas proximidades de cadernos, mochilas e livros. As mochilas devem

ser colocadas no fundo dos laboratórios no início das aulas práticas.

8. Só utilizar pipeta quando esta tiver mecha de algodão no bocal. A mecha tem dois

objetivos: proteger o operador do risco de contaminação com material patológico ou

culturas de microrganismos e preservar o material manipulado da contaminação pela

saliva do operador (aerossóis).

9. Jamais colocar o tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a mesa. Durante os

procedimentos o tampão deve ser segurado com o dedo mínimo.

4

10. Jamais colocar a pipeta usada sobre a bancada ou mesa de trabalho. Ela deve ser

colocada em recipientes que contêm desinfetantes (Lisoform, hipoclorito de sódio a

2%, etc.), bem como algodão para vidro (para não quebrar a ponta da pipeta)

disponível em cada mesa.

11. Evitar a formação de aerossóis, que são micropartículas que contém uma quantidade

extremamente pequena de líquido (água, saliva, etc.) e algumas partículas infectantes

(vírus, esporos bacterianos, etc.). Estes aerossóis podem cair sobre a mesa

contaminando-a, ou ainda ficarem suspensos no ar e serem inalados, promovendo um

possível ciclo de infecção. Tais partículas podem se formar em procedimentos como

flambagem da alça metálica, flambagem de pinças, abertura brusca de tubos ou

frascos com tampa de pressão, agitação de tubos com as mãos, centrifugação de

tubos abertos, manipulação incorreta de seringas, homogeneizadores, etc.

12. Ao término do trabalho:

a) Desinfetar a bancada com um desinfetante disponível (hipoclorito, álcool 70%,

clorexedine, álcool iodado, etc.).

b) Lavar as mãos e antebraços com água e sabonete líquido. Em seguida utilizar, de

preferência, solução degermante à base de polivinilpirrolidona-iodo (PVPI) a 10%.

Enxugar com toalha descartável. Em seguida aplicar álcool 70% nas mãos para dar

continuidade à desinfecção.

Observação: em caso de acidente, como de pipetas contaminadas, placas e frascos com

material patológico ou cultura de microrganismos é obrigatório:

a) Derramar sobre o material quebrado um desinfetante (por exemplo álcool 70% ou

clorexedine).

b) Cobrir com toalha de papel.

c) Deixar em contato, no mínimo, por uma hora antes de remover o vidro com uma pinça

e com a mão enluvada absorver o líquido com papel toalha, acondicionar em sacos

apropriados e a seguir autoclavar.

ESTE MANUAL NÃO TEM FINS LUCRATIVOS

USO PARA FINS ACADÊMICOS DENTRO DA UNIVERSIDADE

(Concentrado de obras que não estão disponíveis nas bibliotecas da Universidade, por isso

esse texto é disponibilizado aos alunos).

5

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

Micróbio: termo usado em 1878 por Charles Emmanocl Sedillot (cirurgião francês).

Microbiologia: é a ciência que estuda os microrganismos (seres pequenos, geralmente

microscópicos) e suas atividades. São os protozoários, fungos, algas, vírus e bactérias. Os

microrganismos constituem um grande grupo heterogêneo, apresentando características

variadas, tendo, no entanto, em comum o fato de conservarem ao longo do curso de

evolução biológica, uma estrutura simples e indiferenciada, ou seja, possuem estrutura

primitiva não apresentando tecidos ou órgãos especializados.

O estudo dos microrganismos compreende o conhecimento de suas formas,

estruturas, reprodução, metabolismo e identificação. Trata ainda da sua distribuição na

natureza e as relações entre si e com os demais seres vivos. Estudam-se também as

transformações físicas e químicas exercidas nos seus habitats, das quais resultam efeitos

prejudiciais ou proveitosos para outros seres vivos.

Em última análise os fenômenos chamados doenças infecciosas, do ponto de vista

biológico, são simplesmente interações destrutivas entre vegetais e animais.

A microbiologia pode ser estudada como ciência autônoma, mas também como

instrumento de outras áreas biológicas. Foram os microrganismos que serviram, e servem

cada vez mais, de modelos para as ciências modernas como: bioquímica, genética, biologia

molecular, engenharia genética, etc. Para o estudo destas ciências é preciso estar

familiarizado com os microrganismos. Os microrganismos possuem muitas características

que os tornam seres ideais para a investigação dos fenômenos biológicos. Pode-se cultivá-

los facilmente em tubos (recipientes pequenos) o que requer menor espaço para

manutenção do que plantas e animais. Crescem rapidamente e se reproduzem a um ritmo

extraordinariamente elevado. Algumas espécies bacterianas produzem cerca de 100

gerações num período de 24 horas. A cada 15 minutos surge uma nova geração e de cada

célula resultam 2 células filhas em uma progressão geométrica sendo que no final de 24

horas teremos milhões de descendentes, o que não acontece com animais e plantas.

6

Áreas de aplicação da microbiologia

O microbiólogo, de uma maneira geral, pode se especializar no estudo de certos

microrganismos. Estritamente falando, bacteriologia é o estudo das bactérias (muitas vezes

o termo é usado como sinônimo de microbiologia), micologia estuda os fungos, virologia

estuda os vírus e ficologia estuda as algas.

É freqüente a especialização em algum aspecto da microbiologia: citologia

bacteriana, genética bacteriana, fisiologia dos fungos, etc. Existem numerosas áreas onde a

Microbiologia aplicada tem grande significado. Microbiologia médica: os microrganismos

muito estudados são os que causam doenças em humanos e são chamados de

patogênicos. Este ramo da microbiologia também estuda a prevenção e controle de

doenças, imunização, imunologia e os métodos diagnósticos. O microbiólogo também busca

estudar os microrganismos em ambientes particulares: solo, ar, água, esgotos, etc.

A educação de um microbiólogo abrange um conhecimento geral da maioria das

subdivisões. Entretanto devido ao tremendo acúmulo de informações em cada

especialização, o microbiólogo deve se limitar a um ou poucos ramos selecionados da

microbiologia.

Distribuição na natureza (habitat)

Os microrganismos são encontrados praticamente em todos os ambientes, desde o

solo e as massas de água (mares, rios), ar, até as superfícies internas e externas de

humanos e outros animais, bem como de plantas. Aparecem em maior abundância onde

encontram condições favoráveis, como substâncias nutritivas, umidade e temperatura

adequada ao seu desenvolvimento.

Os microrganismos, que são favorecidos pelas mesmas condições que a população

humana, podem produzir modificações devido ao seu metabolismo, o que os torna

patogênicos para o homem. Felizmente a maioria é inócua e habita a superfície do nosso

corpo, trato digestório, boca, nariz, e outras cavidades naturais. Dispomos de meios para

resistir à invasão daqueles que são potencialmente patogênicos.

7

Posição entre os seres vivos

Após a descoberta dos microrganismos, ficou claro que eles mostravam todas as

combinações possíveis das propriedades dos vegetais e animais, os dois reinos de seres

vivos admitidos na época, aparecendo vários absurdos como por exemplo, os fungos foram

classificados como vegetais porque eram imóveis, quase não apresentando outras

propriedades dos mesmos sendo também que nenhum fungo possui clorofila.

Para evitar a distribuição arbitrária dos grupos intermediários (entre plantas e

animais), o cientista alemão Ernest Haeckel, discípulo de Charles Darwin em 1866, propôs o

estabelecimento de um terceiro reino, para eliminar a confusão existente em relação à

posição dos microrganismos e para lhes proporcionar uma posição no mundo vivente. Este

terceiro reino foi chamado Protista (da palavra grega que significa primitivo ou primeiro).

O Reino Protista compreendeu as algas, protozoários, fungos e bactérias. .Algumas

vezes os seres classificados em protistas eram denominados Protistas superiores e

Protistas inferiores fundamentando-se em sua estrutura celular. Os superiores possuem

célula eucariótica, como os protozoários, fungos e algas, com exceção das algas azul-

esverdeadas. Os protistas inferiores são procarióticos: 'bactérias e algas azul-esverdeadas.

Desde o conceito original deste terceiro reino de seres vivos têm sido desenvolvidos

numerosos critérios para determinar mais adequadamente onde classificar estas microvidas.

Uma abordagem a respeito da classificação microbiana foi oferecida por Stanier e

Van Niel em 1941. Eles propuseram outra designação para outro reino chamado Monera,

que deveria conter algas azul-esverdeadas e as bactérias. As outras algas e protozoários

deveriam permanecer como pertencentes ao reino Protista. Os vírus, no entanto, ainda

permaneciam como um enigma.

Em 1969 foi proposto por Whittaker um outro sistema classificatório de seres vivos,

compatível com os recentes estudos ultraestruturais, bioquímicos, genéticos e os principais

modos de nutrição: fotossíntese, absorção e ingestão. Os cinco reinos de Whittaker são:

Plantae, Fungi, Animmalia, Protista e Monera. Os microrganismos são encontrados em três

dos reinos:

• Monera (bactérias e algas azuis esverdeadas);

• Protistas (outras algas e protozoários);

• Fungi (fungos: leveduras e bolores).

8

Classificação dos microrganismos

A classificação dos seres vivos serve a vários propósitos, entre eles a de estabelecer

critérios necessários para a identificação e acima de tudo, eliminar confusões. A

classificação dos microrganismos apresenta problemas peculiares podendo se basear em

muitas características. De uma maneira geral as classificações podem ser: Naturais ou

Filogenéticas e Artificiais ou Chaves.

Nas Chaves as características descritivas são organizadas de tal forma que um

organismo em estudo será prontamente identificado. Os organismos agrupados numa chave

não precisam necessariamente apresentar relação filogenética; eles são listados juntos

porque apresentam algumas características em comum, facilmente identificáveis. Será

perfeitamente razoável, por exemplo, colocar numa chave um grupo de bactérias

formadoras de pigmento vermelho, tais como Serraria marcescens e as Sulfobactérias

púrpuras. Todavia, este agrupamento será de muita utilidade, pois um pesquisador com a

responsabilidade de identificar uma cultura com pigmento vermelho, imediatamente terá seu

trabalho reduzido a poucos tipos bacterianos.

Na classificação filogenética, agrupa-se tipos aparentados, isto é, aqueles que tem

um ancestral em comum.

Durante os 100 anos da microbiologia como ciência, têm surgido muitas

classificações. Infelizmente não existe um sistema classificatório inteiramente aceitável para

todos os microrganismos, principalmente para as bactérias. Dependendo da autoridade

consultada, são observadas várias inconsistências. De tempos em tempos são propostos

novos sistemas não aceitos em sua totalidade internacionalmente.

Classificação atual dos microrganismos

Uma classificação proposta atualmente poderia ser a seguinte:

1. Monera: células procarióticas.

a) Bactérias

b) Cianobactérias

c) Arqueobactérias

2. Protistas: Deve-se utilizar a terminologia moderna e mais amplamente aceita. O

termo “protista” atualmente é empregado apenas para microrganismos eucarióticos.

9

a) Algas

b) Protozoários

c) Fungos

Elementos diferenciais entre as células

1. NÚCLEO Procarióticos Eucarióticos

Membrana Nuclear Ausente Presente

Cromossomos Um, circular Um ou mais, lineares

Aparelho mitótico Ausente Presentes

Histonas Ausente Presentes

Genes Agrupados Não agrupados

2. NATUREZA E

ESTRUTURA

CITOPLASMÁTICA

Procarióticos Eucarióticos

Correntes

citoplasmáticas Ausentes Presentes

Pinocitose Ausente Presentes

Mesossomos Presentes Ausentes

Ribossomos Dispersos no citoplasma

Dispostos em membranas,

retículos endoplasmáticos

e cloroplastos

Mitocôndrias Ausentes Presentes

Cloroplastos Ausentes Podem estar presentes

Complexo de Golgi Ausentes Presentes

Vacúolos limitados por

membranas Ausentes Presentes

10

3. ESTRUTURAS

CELULARES EXTERNAS Procarióticos Eucarióticos

Membrana plasmática

Possui parte da

maquinaria respiratória e

fotossíntese

Não desenvolve atividade

respiratória ou

fotossíntese.

Parede celular de

Peptídeoglicano Presente * Ausente

Organelas locomotoras Fibrilas simples Multifibrilas com

microtúbulos

Pseudópodos Ausentes Presente em alguns

* ausente em Mycoplasma sp.

4. RELAÇÃO GUANINA +

CITOSINA Procarióticos Eucarióticos

Mols de Guanina e

Citosina 28 a 73 Cerca de 40

Bactérias

O termo bactéria, derivado do grego "gotinhas" foi introduzido em 1828 pelo alemão C. G.

Ehrenberg como nome genérico de alguns tipos bacterianos característicos.

Bactérias são organismos microscópicos, unicelulares e procarióticos.

Taxonomia bacteriana geral

Desde a primeira tentativa conhecida de classificação das bactérias, realizada por

Müller, em 1773, um grande esforço foi empregado na taxonomia bacteriana, mas até agora

nenhum dos numerosos esquemas propostos recebeu aprovação universal. Há falta de

concordância nas classificações, mas havendo um interesse em evitar confusão

generalizada é preciso aceitar e permitir a evolução de algum plano razoavelmente

exeqüível acompanhando naturalmente o progresso dos novos conhecimentos. Uma das

classificações foi proposta pela Sociedade Americana de Microbiologia através de seu

11

Bergey' s Manual of Detenninative Bacteriology ao longo de muitas edições. A 9.& edição do

manual de Bergey tem como título: "Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology".

O manual de Bergey representa mais de 70 anos de evolução, sendo mais aceito

que qualquer outro sistema. Devido às incertas relações filogenéticas das bactérias, o

manual admite que sua principal aplicação é determinativa, isto é, permitir aos

pesquisadores determinar se ce11o microrganismo corresponde a uma espécie descrita. A

1ª edição data de 1923, já tendo alcançado a 9ª edição. Em cada edição subseqüente, têm

sido feito vários avanços significativos, inclusive o acréscimo de novas espécies e excluindo

outras.

Atualmente um dos esquemas da classificação semi-oficial disponível é o que foi

publicado na 9ª edição do Bergey's manual de 1984. É amplamente utilizada como padrão

de referência na taxonomia bacteriana. Ele reconhece o reino Monera de Whittaker,

chamando-o, no entanto, de Procaryotae, em virtude da natureza procariótica de suas

células.

Novos conhecimentos causarão uma grande diferença nas futuras publicações a

respeito da classificação microbiana. Nos últimos anos o sistema genético das bactérias foi

estudado ao nível molecular a fim de determinar a homologia entre o DNA das células. O

parâmetro empregado com mais freqüência é a porcentagem de moléculas de guanina mais

citosina no conteúdo total de DNA. A composição das bases do DNA é uma característica

constante de uma determinada espécie e é expressa em porcentagem de guanina mais

citosina sobre o total da mols das bases. Se dois organismos têm proporções muito

diferentes de bases, obviamente não são muito relacionados. Centenas de espécies têm

sido caracterizadas desta maneira modernamente.

Em 1980 o Comitê Internacional sobre Sistemática Bacteriológica, publicou uma lista

de aproximadamente 2500 espécies, substituindo uma lista anterior de 30000. Desde 1º de

janeiro de 1980 apenas a nova lista de nomes é considerada válida. A substituição das

denominações abandonadas, o acréscimo de novas ou quaisquer outras alterações, exigem

publicações no International Journal of Systematic Bacteriology.

Bactérias:

Uma chave classificatória para bactérias estabelece 4 grupos bacterianos, em função do

metabolismo de movimentação e das características da parede celular.

12

Vírus: Complexo molecular vivo, possuindo DNA ou RNA.

*Os dados citados foram compilados de textos dados em aula.

13

CAPÍTULO 1CAPÍTULO 1CAPÍTULO 1CAPÍTULO 1:::: CONTROLE DOS MICRORGANISMOS

É indispensável o conhecimento do controle das populações microbianas para todos

os profissionais da saúde. A medicina progredia à medida que surgiam novos

conhecimentos sobre o domínio dos microrganismos, reduzindo infecções e a transmissão

de doenças contagiosas, executando cirurgias assépticas, etc.

Os microbiologistas conseguiram estudar as espécies bacterianas, após as

aplicações artificiais de condições desfavoráveis à sua multiplicação. Através dos processos

de esterilização dos objetos utilizados, meios de cultura estéreis e técnicas de assepsia,

obtiveram populações bacterianas puras e, estas sim, puderam ser estudadas em todos os

detalhes: morfológicos, estruturais, fisiológicos, obter dados sobre seus fatores de virulência

e outros.

O uso de materiais esterilizados é condição indispensável para o desempenho dos

trabalhos microbiológicos.

Antes de iniciar o estudo dos métodos de controle dos germes, é importante

conceituar vários deles, tais como: esterilização, desinfecção (desinfetantes), anti-sepsia

(anti-sépticos), assepsia, saneamento e sanitização.

Esterilização: deve resultar na destruição total de todas as formas de vida presentes

no material submetido ao processo em questão.

Desinfecção: é o processo que remove a maioria dos microrganismos viáveis,

reduzindo a “bioburden” (carga de organismos viáveis). A desinfecção, na maior parte das

vezes, é conseguida pelo uso de substâncias químicas chamadas desinfetantes, destinadas

a destruir os germes potencialmente patogênicos, mas que são ineficientes contra a maioria

dos esporulados. O calor em temperaturas de 60 a 100oC também tem ação desinfetante,

pois não destrói todos os esporos.

Anti-sepsia: é o conjunto de meios usados para evitar a proliferação de germes,

inativando ou destruído-os. O termo anti-sepsia é geralmente usado referindo-se aos tecidos

vivos, como anti-sepsia da pele, anti-sepsia de feridas, etc., reservando-se o termo

desinfecção para objetos inanimados. A anti-sepsia é obtida pela ação de substâncias

químicas chamadas anti-sépticos.

Assepsia: conjunto de procedimentos que impede a penetração de microrganismos

em local que não os contenha.

Saneamento: mantém a microbiota dentro dos valores populacionais previamente

estabelecidos por instituições de saúde.

14

Sanitização: usada em restaurantes e indústrias de alimentos, refere-se à

eliminação dos microrganismos em utensílios e equipamentos para impedir a deterioração

ou transmissão de infecções pelos produtos alimentares.

ESTERILIZAÇÃO

É importante o conhecimento das diferentes técnicas de esterilização, para saber

qual delas aplica-se melhor, para casos específicos, e que cause dano mínimo ao material

envolvido.

Para pessoas da área de saúde, é indispensável também conhecer os efeitos que

alguns agentes esterilizantes (agentes químicos, radiações) exercem sobre o corpo

humano.

Os meios mais utilizados para esterilização são os meios físicos, tais como

temperaturas elevadas e as radiações. Além destes, é possível eliminar a microbiota

presente em um líquido ou gás, por processos mecânicos, como a filtração.

Como agentes químicos podem ser usados muitos compostos.

A escolha dos agentes e dos diferentes métodos, depende do resultado que se

deseja e do material ou local em que o processo vai ser aplicado.

Segue-se o esquema e a descrição de alguns processos.

Esterilização e Desinfecção por Meios Físicos

� Calor

- Calor Seco

• Flambagem

• Forno de Pasteur (estufa)

• Incineração

- Calor Úmido

• Pasteurização

• Tyndallização ou Tindalização

• Água Fervente

• Autoclavação

15

� Filtração

- Velas

• Chamberland – porcelana porosa

• Berkefeld – infusórios

- Discos

• Vidro

• Amianto – Seitz

- Membranas

• Acetato de celulose: Millipore e HEPA

• Nitrato de celulose

- Algodão – para gases (ar)

� Radiações

- Ultravioleta (UV) – NÃO IONIZANTES

- Gama (γ) - IONIZANTES

Esterilização e Desinfecção por Agentes Químicos

� Agentes Químicos:

- Líquidos – álcoois, detergentes, álcalis, glutaraldeído.

- Gasosos – brometo de metila, óxido de etileno, formaldeído.

- Sólidos – pastilhas de formalina.

Esterilização e Desinfecção por Meios Físicos

A ação letal do calor é uma relação tempo-temperatura afetada por numerosos

fatores que devem ser levados em consideração, na seleção da intensidade térmica e na

duração da exposição, para reduzir a população bacteriana ao nível desejado.

16

CALOR SECO

a) Flambagem

É a exposição do objeto à chama de bico de Bunsen ou lamparina. Na técnica

bacteriológica utiliza-se a flambagem para esterilizar a alça de platina pelo

aquecimento até o rubro. As pinças, as pipetas, as bocas dos tubos e balões em que

se faz a semeadura são aquecidos na chama (chamuscadas) sem, no entanto, levá-

las ao rubro.

b) Ar Quente – Forno de Pasteur

O Forno de Pasteur moderno é uma estufa de forma retangular de paredes duplas,

isolada termicamente e aquecida por eletricidade. A temperatura desejada é

regulada e mantida por um termostato. Em seu interior existem prateleiras móveis.

Na porção superior possui orifícios para ventilação e colocação de termômetro

graduado em 200oC.

Observação: o aparelho e seu funcionamento serão mostrados em aula.

A exposição ao ar quente constitui método usado correntemente em bacteriologia,

para a esterilização de materiais secos, tais como: tubos, ampolas, placa, provetas,

objetos metálicos, óleo mineral, vaselina sólida, parafina, talco, areia, etc. A vidraria

seca será esterilizada no forno a 170 – 180oC por uma hora. O papel que protege o

material e os tampões de algodão adquire cor parda, porém não devem escurecer

demais ou tornarem-se quebradiços. Deixar o forno esfriar espontaneamente.

A destruição dos microrganismos ocorre por desidratação e oxidação dos

constituintes celulares.

Limitações: não se pode esterilizar a seco a vidraria fina como balões volumétricos e

pipetas graduadas de precisão, líquidos diversos, meios de cultura, borracha, etc.

c) Incineração

O método de incineração, do ponto de vista microbiológico, consiste em destruir os

microrganismos junto com os materiais orgânicos onde eles se localizam. São

materiais removidos dos curativos, peças anatômicas, animais de experiência

infectados e mortos, etc., (há os incineradores usados na queima de lixo não

hospitalar). Os incineradores que possuem uma só câmara de combustão são

ineficazes e inadequados. Isto porque os materiais não são destruídos por completo,

contaminando a atmosfera por microrganismos e substâncias tóxicas. O incinerador

17

deve ter, além da câmara de combustão principal, uma câmara de combustão

secundária. Ideal é quando a 1a câmara está a 800oC e a segunda aquecida no

mínimo a 1000oC.

A incineração tem-se tornado um problema social e político em muitas comunidades,

principalmente européias. Isto porque, a queima em altas temperaturas de matéria

orgânica e plástico, gera substâncias altamente tóxicas, tais como as dioxinas.

“Incineradores, na verdade, são indústrias de “ultragifte” – ultravenenos – expressão

cunhada pela comunidade científica para designar dioxinas e furanos.”

Observação: o criminoso Agente Laranja usado na Guerra do Vietnã era rico em

dioxinas (Fonte: Proteção no 11 – vol. 03).

CALOR ÚMIDO

a) Pasteurização

Ato de pasteurizar. Processo pelo qual um determinado material (o leite, por

exemplo), é aquecido a uma temperatura não elevada (62,8oC por 30 minutos ou

71,7oC por 15 minutos) e a seguir submetido a resfriamento brusco (em torno de

4oC), obtendo-se assim a morte dos germes patogênicos, no caso do leite:

Salmonella, brucelas, estreptococos, bacilos da tuberculose, mas não a eliminação

total dos germes contaminantes (bactérias esporuladas). É um processo de

desinfecção.

b) Tyndallização ou Tindalização

É uma esterilização fracionada.

Tyndall, o idealizador do processo, verificou que o aquecimento descontínuo, ou

seja, aquecimento a 100oC, durante 1 hora, em 3 dias consecutivos, intercalados por

períodos de incubação em temperatura ambiente, conseguia esterilizar a solução em

estudo.

Os esporos resistentes germinam durante o tempo de incubação e são destruídos

nas subseqüentes exposições ao calor.

A temperatura de tindalização varia de acordo com o material a esterilizar. Alguns

meios de cultura bacteriológicos, soluções de carboidratos, soluções de vitaminas ou

enzimas, etc., serão aquecidas à temperatura que não altere as suas propriedades.

18

c) Água em Ebulição

Os materiais ou objetos contaminados não podem ser esterilizados com segurança

pela simples exposição à água em ebulição. Embora as células vegetativas das

bactérias possam ser destruídas em poucos minutos, alguns esporos resistirão

durante muitas horas. A imersão em água fervente quando usada para esterilização

de instrumentos cirúrgicos, seringas de injeção, etc., oferece o risco de

contaminação por esporulados. Só deve ser usada em circunstâncias emergenciais.

Pela fervura do material mergulhado em água ou exposto ao vapor em autoclave

com válvula aberta (vapor fluente) só se consegue uma desinfecção e não

esterilização.

d) Autoclave (temperatura superior a 100oC)

É um método em que se utiliza vapor d’água sob alta pressão, de tal modo que é o

meio mais prático, rápido e barato de esterilização. O aparelho que utiliza-se nesse

procedimento chama-se autoclave. Há vários modelos: horizontais, verticais,

aquecidas a gás ou eletricidade, ou ainda, alimentadas por vapor gerado em

caldeiras separadas.

Autoclave de Chamberland: caldeira de paredes resistentes, tampa com borracha

apertada por parafusos. Orifícios para o manômetro, válvula de segurança e torneira.

Autoclave usa vapor d’água sob pressão regulada. É uma câmara de vapor saturado

equipada com dispositivos que permitem a manutenção do vapor em determinada

temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo, dependendo da natureza

do material a esterilizar, do tipo do continente e de seus volumes. Por exemplo: tubos

de ensaio com meios líquidos podem ser esterilizados em 10 a 15 minutos a 121oC.

Os mesmos líquidos em balões de 10 litros requerem 1 hora ou mais sob a mesma

temperatura e pressão. Materiais utilizados em Biologia Molecular necessitam de 40

minutos de autoclavação (para agir no DNA).

Modo de proceder: o material a esterilizar é embrulhado em papel ou sacos plásticos

(como os de microondas) formando pacotes. Os pacotes são colocados dentro de

uma cesta metálica, esta repousa sobre um suporte, evitando o contato com água do

fundo da autoclave. Iniciar o aquecimento com torneira aberta. Quando a água

começar a ferver, há emissão de um jato intermitente de vapor e ar. Quando todo o

ar for expulso, começa a sair um jato contínuo de vapor, neste momento fecha-se a

19

torneira. Com a continuação do aquecimento, haverá aumento de pressão acusado

pelo manômetro. Ao ser atingida a temperatura desejada, 120oC por exemplo,

marca-se o tempo. Após esse período desliga-se a corrente elétrica. Para abrir a

autoclave, espera-se até que o manômetro abaixe para zero. Só então se abre a

torneira. O material sai da autoclave impregnado de umidade. Deve-se colocá-lo na

estufa ± 60oC para a secagem. Há autoclaves mais modernas em que o material já

sai seco, como a que existe no departamento de Bioquímica da UFPR.

Observação: a autoclave e seu funcionamento serão mostrados em seminários,

acompanhando os processos de preparação de material para a esterilização.

Desvantagens e Limitações: alguns materiais não miscíveis na água, como gorduras,

óleos, vaselina líquida e sólida e parafina, que consequentemente não podem ser

autoclavados. Tais materiais não são atingidos pelo vapor, e os microrganismos

poderão sobreviver. Algumas substâncias são alteradas (metais que oxidam) ou

destruídas. O talco e a areia umedecidos são difíceis de secar.

Vantagens:

1. Aquecimento rápido.

2. Grande poder de penetração em material denso.

3. Maior condutibilidade.

4. Não deixa resíduos tóxicos.

5. Mais econômico.

6. Termocoagulação das proteínas, catalisada pela água. O calor úmido desnatura

proteínas, quebrando ligações químicas envolvidas na manutenção da

conformação espacial das proteínas, causando sua coagulação.

Grau de Umidade (%) Temperatura de Coagulação da Ovoalbumina

50

25

18

06

00

56

80

90

145

170

20

Eficiência Comparativa do Calor Seco e do Calor Úmido como Esterilizantes

� O calor úmido tem um poder de penetração superior.

� A penetração do calor seco é menor, sendo necessário, portanto, esterilizar o

equipamento e utensílios a temperaturas mais elevadas e por períodos mais longos.

� Esta diferença de poder de penetração do calor em estado seco ou úmido é

exemplificada pela verificação de que, em um fardo de flanela exposto ao calor seco a

150oC durante 4 horas, a temperatura atingida no centro sobre apenas a 83oC, ao passo

que, à temperatura de 120oC em autoclave durante 1 hora e meia, a temperatura central

chega a 117oC.

Fardo de Flanela Temperatura Central

Calor Seco – 150oC – 4 horas 83oC

Calor Úmido – 120oC – 1 hora e meia 117oC

Microrganismo Calor Úmido 120oC Calor Seco 120oC

Clostridium botulinum 20 minutos 120 minutos

Bacillus anthracis 15 minutos 120 minutos (150oC)

Calor Úmido (tempo em minutos para várias temperaturas)

Microrganismos 100oC 105oC 115oC 120oC

Bacillus subtilis

Clostridium botulinum

Bactérias do solo

Anaeróbios – putrefação

Bactérias termófilas

300

530

780

420

400

40

20

30

06

11

Testes para Controle de Eficiência da Autoclave

Em geral, é necessário fazer o controle de esterilidade enquanto a autoclave está em

operação, em vez de tentar reconhecer falhas, através do isolamento de microrganismos no

material processado.

21

Embora a temperatura e a pressão sejam indicadas pelo termo-manômetro, todos os

laboratórios microbiológicos fazem testes confirmatórios de esterilidade do material

processado.

Para tanto se pode recorrer a métodos físicos e biológicos.

Nos métodos físicos usa-se:

1. Indicadores que têm por base a reação de um composto químico quando

expostos a um parâmetro necessário à esterilização. Geralmente vêm em forma

de fitas ou selos que mudam de cor na temperatura estabelecida.

2. Substâncias químicas em pó (acondicionadas em ampolas de vidro) cujo ponto

de fusão é conhecido. Após a autoclavação, observar a substância que deve

aparecer fundida.

Observação: para cada método de esterilização existem indicadores químicos

específicos.

No método biológico usam-se esporos bacterianos altamente resistentes como os do

Bacillus stearothermophillus. Os esporos podem vir acondicionados em frascos com meio de

cultura ou impregnados em tiras de papel de filtro seco, numa concentração de 106 esporos

em ambos os casos. Os esporos do Bacillus stearothermophillus morrem quando

submetidos a 121oC por 15 minutos.

Colocar os esporos na autoclave em pontos críticos, centro e fundo da cesta, pontos

em que a temperatura desejada é obtida com maior dificuldade.

Após a autoclavação, incubar a 55 a 57oC os esporos em caldo (ou no caso de usar

as tiras, transferi-las para um caldo) durante 24 a 48 horas. Caso haja turvação, indica que o

bacilo proliferou e que a autoclavação foi insatisfatória.

Os bioindicadores existem no comércio sob o nome de Esporofars®, Steritest® e

outros.

FILTRAÇÃO

A filtração é o método de escolha para esterilizar soluções contendo substâncias

termossensíveis como o soro sanguíneo, plasma, solução de vitaminas, solução de

enzimas, solução de alguns carboidratos, fluidos para inoculação, colírios, etc.

Líquidos injetáveis são primeiramente filtrados e depois autoclavados para evitar

pirogênios. Estes são componentes termoestáveis da degradação das bactérias.

22

As técnicas de filtração são também usadas para recuperar pequenas quantidades

de bactérias presentes em grandes volumes de líquido, como, por exemplo, água. Nestes

casos, após a filtração, a membrana é colocada em meio de cultura adequado, as bactérias

vão proliferar dando colônias que podem ser quantificadas, estudadas e identificadas.

A filtração pode ser aplicada na descontaminação de gases como o ar. O exemplo

disto é dado pelo uso de tampões de algodão que obturam a boca de tubos, balões vazios

ou contendo meio de cultura. O algodão é suficientemente poroso para permitir a entrada de

ar e impedir a entrada de germes. Outro exemplo é a filtração do ar nas câmaras assépticas,

salas de cirurgia, etc.

Numerosos são os dispositivos e materiais usados na técnica da filtração, como por

exemplo:

a) VELAS - Chamberland: porcelana.

- Berkefeld: terra infusórios.

b) DISCOS - Vidro.

- Amianto.

c) MEMBRANAS - Acetato de celulose, também chamados de filtros

moleculares. Exemplo: Millipore. Atualmente são as mais usadas nas técnicas de

filtração. Elas apresentam a vantagem de poder ser autoclavadas. Há as

descartáveis. Podem filtrar diversos líquidos: água, álcool, éter, toluol, xilol, metano,

etano, acetileno, parafina, naftalina, terpeno, etc., sem sofrer degradação.

Tamanho dos poros: 0,05 a 10 µm (micrômetros).

Cada cm2 contém milhões de poros, 80% da membrana é espaço aberto e 20% de

material sólido, com isto o fluxo é em torno de 40 vezes mais rápido que pelos

demais filtros.

Ultrafiltração

Elford – colódio – membrana Gradocol (de nitrato de celulose).

Poros: 10 a 10.000 ηm (para determinar o tamanho do vírus).

23

Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) de Acetato de Celulose

Utilizados para produção de fluxo de ar estéril em câmaras bacteriológicas

assépticas, salas de cirurgia, etc. Há produção de fluxo de ar não turbulento ou laminar.

Eficiência = 99,97%

RADIAÇÕES NÃO IONIZANTES (U.V.)

As radiações na forma de luz ultravioleta têm sua atividade melhor na faixa de 250-

260 ηm, comprimento de onda de absorção máxima pelas bases púricas e pirimídicas do

DNA, formando dímeros, inibindo a replicação do DNA.

É comum seu emprego para esterilização do ar em hospitais e também em

laboratórios de microbiologia, nas câmaras assépticas, onde as condições de assepsia

devem se manter rigorosamente controladas. Emprega-se esse tipo de radiação para

reduzir a população microbiana da superfície dos equipamentos ou do ar.

O seu poder de penetração é mínimo. Uma camada fina de vidro ou água pode

impedir a ação da luz U.V. O uso de raios U.V., em medicina, é limitado por danificar a

córnea e a pele.

Raios Gama e Raios X

Os raios gama são atualmente muito usados para esterilizar grandes quantidades de

itens de pequeno porte tais como agulhas, seringas, equipamentos endovenosos, cateteres

e luvas.

O material é esterilizado já acondicionado na sua embalagem final. O processo é

100% eficiente e ininterrupto. Não é uma técnica aplicável para uso descontínuo, pois não é

possível ligar ou desligar.

Os raios gama e os raios X criam radicais livres ativos (OH- e H+) pela hidrólise da

água. Estes radicais altamente reativos quebram as ligações covalentes do DNA, alterando

as estruturas do DNA e das proteínas.

Vantagens - esterilização fria (indústria alimentícia e farmacêutica);

- alto poder de penetração.

Desvantagens - alto custo;

- operadores altamente especializados;

24

- acarreta sérios danos à saúde, tais como:

a) alterações celulares (neoplasias malignas, como a

leucemia);

b) lesões de gônadas (alterações cromossômicas).

ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS

A esterilização por produtos químicos é indicada apenas para os materiais que não

podem ser submetidos ao calor.

A escolha de um agente químico dependerá da finalidade do uso. Não existe uma

substância ideal capaz de agir em todos os casos. Alguns são muito ativos, mas tóxicos

para os tecidos vivos, portanto usados apenas em objetos inanimados. Outros apresentam

instabilidade quando em solução. Alguns são rapidamente inativados em contato com

matéria orgânica.

A maioria dos agentes químicos age como desinfetante ou anti-séptico, somente

alguns são capazes de esterilizar, embora se saiba que os produtos químicos podem agir

como bacteriostáticos ou esterilizantes dependendo da concentração e do tempo de ação.

Ácido fênico em solução de 0,2% age como bacteriostático e a 5% é esterilizante.

Alguns produtos químicos são mais utilizados que outros devido a vários fatores:

facilidade de obtenção, menor custo, maior estabilidade quando em solução e seu poder

germicida.

Assim temos:

Produto Químico

• Deve ter

- Atividade antimicrobiana de largo espectro.

- Estabilidade e homogeneidade quando em solução.

- Inocuidade para o homem.

- Boa solubilidade.

• Deve não ser

- Corrosivo.

- Irritante.

• Deve

- Não deixar resíduos.

25

- Não alterar materiais como borracha, plástico, etc.

Na aplicação de qualquer agente químico é necessário observar-se as seguintes

variáveis:

a) Concentração;

b) Tempo;

c) Temperatura;

d) pH;

e) Limpeza.

AGENTES QUÍMICOS

Agentes químicos são comumente empregados para a esterilização ou desinfecção

de equipamentos:

• Líquidos: ácidos e álcalis fortes, glutaraldeído, compostos fenólicos, álcoois e

compostos quaternários de amônio.

• Gasosos: ozônio, brometo de metila, β-propionalactona, óxido de etileno, óxido

de propileno e formaldeído.

• Sólidos: pastilhas de formalina.

Óxido de Etileno

É um gás incolor, não corrosivo e que se liquefaz a 10,9oC, sendo o líquido bastante

solúvel em gás e solventes orgânicos.

Concentrações acima de 100 mg/litro são tóxicas ao ser humano, causando

irritações dos olhos e pulmões, náuseas, edema pulmonar e danos à pele.

O gás é altamente inflamável e explosivo, não se podendo trabalhar em

temperaturas elevadas, no máximo 60oC.

Aplicações industriais são baseadas no uso de misturas contendo 10% de óxido de

etileno e 90% de CO2 ou 50% de óxido de etileno e 50% de formato de metila.

O gás tem elevado poder de penetração em material orgânico, incluindo plásticos,

borrachas, madeira, papel, tecidos (lã), couro, produtos desidratados, equipamentos de

26

anestesia e seringas sem danificá-los, o que recomenda muito o seu emprego. Pode ainda

ser utilizado em metais, vidros e materiais elétricos.

O uso de óxido de etileno requer equipamentos adequados de alto custo. O aparelho

esterilizador a ETO é formado de um conjunto de três unidades:

- Uma autoclave (câmara grande) tendo o gás ETO e vapor d’água.

- Um painel de controle onde está conectado o cilindro de mistura de gases.

- Uma câmara secadora onde o material, após a esterilização, é obrigatoriamente

submetido à aeração, que consiste na circulação de ar filtrado. O ar passando

pelos materiais faz a remoção dos resíduos de gás retido nos mesmo.

Tendo condições adequadas de temperatura, pressão de vapor d’água, tempo e

concentração do gás, o ETO é muito eficiente.

Condições:

• Temperatura entre 49 e 60oC;

• Tempo de exposição de 2 a 12 horas;

• Concentração do gás 450 mg/L;

• Umidade de 20 a 40%.

Óxido de Etileno

Vantagens Desvantagens

a) Bactericida, viricida, esporicida;

b) Temperatura baixa 47-60oC;

c) Grande variedade de materiais;

d) Equipamento anestesia, seringa.

a) Alto custo;

b) Tóxico;

c) Inflamável.

O óxido de etileno atua como alquilante, inativando as enzimas e outras proteínas

que têm átomos de H lábeis, como em grupos sulfidrila. O anel da molécula do óxido de

etileno se rompe para formar –CH2 –CH2O que se insere entre átomos de enxofre e

hidrogênio do grupo sulfidrila:

H2C H2C + R.SH R.SCH2.CH2.OH

O (enzima ativa) (enzima inativa)

27

Formaldeído

O formaldeído, de estrutura simples (HCOH), é estável em altas concentrações e

temperaturas elevadas, mas é extremamente tóxico, seus vapores são irritantes às

mucosas. Em temperatura ambiente o formaldeído polimeriza-se, formando uma substância

sólida, incolor – paraformaldeído – que libera formaldeído pelo aquecimento.

Formalina é a solução aquosa de formaldeído (37 a 40%), forma em que é

comercializado.

O formaldeído é utilizado na forma gasosa para esterilizar áreas fechadas, como

quartos de doentes contagiosos, após a desocupação. A umidade e temperatura têm grande

influência sobre sua ação antimicrobiana, temperatura ideal de 22oC e umidade de 60 a

80%.

Tem a desvantagem do baixo poder de penetração.

A sua ação é com os grupos amino, hidroxila, carboxila e sulfidrila, introduzindo um

radical (CH2), alterando a estrutura das proteínas e ácidos nucléicos.

Glutaraldeído

Age de modo semelhante ao formaldeído, mas é menos tóxico e dez vezes mais

eficiente. Age lenta mas efetivamente. Usado na desinfecção de endoscópios e

equipamentos de terapia respiratória.

Outras substâncias de interesse na prática médica

���� Álcoois: os mais usados são o álcool etílico e o isopropílico. O álcool etílico é muito

usado na degermação da pele e desinfecção de superfícies, algumas vezes em combinação

com iodo. Requer presença de água (álcool a 70%) para sua atividade máxima. O álcool

desestrutura os lipídios da membrana celular e desnatura as proteínas bacterianas.

���� Ácidos e Álcalis: a variação acentuada de pH pode resultar em cessação do

metabolismo e morte do microrganismo. A ação dos ácidos depende do seu grau de

ionização: da concentração hidrogeniônica no caso dos ácidos minerais ou da natureza de

suas moléculas no caso dos ácidos orgânicos. A ação dos álcalis depende do seu grau de

28

dissociação, da concentração de íons hidroxila e do íon metálico do álcali. O hidróxido de

cálcio é um deles. É de alto poder desinfetante, usado em quartos de doentes, excretas,

vagões, etc.

���� Oxidantes: inativam as células oxidando os grupos sulfidrila livres. São: peróxido de

hidrogênio, iodo, cloro e compostos que liberam lentamente o cloro (cal clorada).

O iodo é anti-séptico muito utilizado nas práticas médicas. É de efeito imediato. É

encontrado em duas formas: Tintura de Iodo e iodóforos. Os iodóforos são complexos de

iodo com detergentes ou outras moléculas carreadoras. Os iodóforos liberam iodo

lentamente, não irritam a pele, não tem odor irritante e não tingem os tecidos. O iodo reage

especificamente com resíduos de tirosina das proteínas e inativa as enzimas que contém

pontes de dissulfeto.

���� Detergentes: são agentes surfactantes ativos e podem ser aniônicos ou catiônicos.

a) Detergentes aniônicos têm hidrocarboneto de cadeia longa de carga elétrica

negativa, por exemplo: os sabões e produtos sintéticos semelhantes aos sabões. Os

produtos sintéticos são mais solúveis e mais baratos que os sabões convencionais.

b) Detergentes catiônicos de carga elétrica positiva. Os mais usados são os

detergentes de compostos quaternários de amônio. Estes compostos têm amplo

espectro bactericida e bacteriostático mesmo em altas diluições contra bactérias

Gram positivas e Gram negativas.

Os detergentes agem sobre os lipídeos da membrana celular alterando sua função ou

desintegrando-a. também desnaturam as proteínas. Os compostos quaternários de amônio

são muito solúveis em água, são pouco tóxicos e não corrosivos, como o cloreto de

benzalcônio, muito utilizado na anti-sepsia da pele.

���� Metais Pesados: os mais usados são mercúrio e prata. Ambos possuem boa atividade

antimicrobiana. O mercúrio quando combinado a outras substâncias, apresenta-se menos

tóxico ao organismo humano que o próprio metal. Por exemplo: mercúrio cromo, Mertiolato.

A prata combinada com proteínas é antisséptico de mucosas do nariz e garganta: Argirol,

Protargol. Estes metais agem inativando as enzimas bacterianas através do grupo sulfidrila.

29

CAPÍTULO 2CAPÍTULO 2CAPÍTULO 2CAPÍTULO 2: : : : TIPOS MORFOLÓGICOS DE BACTÉRIAS E

GRUPAMENTOS BACTERIANOS

Objetivos

a. Observar e comparar a morfologia das diversas bactérias em lâminas focalizadas.

b. Identificar nas preparações microscópicas focalizadas a forma da célula e o grupamento.

c. Verificar se nos grupamentos há ou não arranjos sempre com o mesmo número de

células.

d. Observar estruturas bacterianas no interior das células (esporos, granulações).

Tipos Morfológicos

Embora existam milhares de espécies bacterianas, as suas células podem agrupar-

se em três tipos morfológicos fundamentais:

a) Arredondada;

b) Alongada;

c) Ondulada.

COCOS

Forma arredondada (perfeitamente esféricas, elípticas, em chama de vela e

riniformes. * VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRÁTICAS

Esférico: Completamente arredondado.

Exemplo: Staphylococcus aureus.

Coco-oval (alongado)

Exemplo: Streptococcus pyogenes.

30

Pneumococo (em forma de gota, chama de

vela)

Exemplo: Streptococcus pneumoniae.

Fonte:

Fernando Bortolozzi

Gonococo e Meningococo: Forma

riniforme (em forma de feijão ou rim)

Exemplos: Neisseria gonorrhoeae (G)

Neisseria meningitidis (M).

BACILOS

Forma alongada ou cilíndrica. Bastonetes. (variações: quanto ao comprimento,

espessura e forma das extremidades).

Obs: Os bacilos eram também denominados bastonetes até alguns anos atrás. No entanto,

a denominação “bastonete” é de uso mais aconselhável para os neutrófilos imaturos que

saem da medula óssea mielóide e vão para a corrente sanguínea suprir necessidades

fisiológicas durante uma infecção (desvio à esquerda, como será visto nas aulas de

Patologia Médica Molecular – BP334). Portanto para bactérias alongadas, prefere-se o

termo BACILO.

VARIAÇÕES BACILARES:

� Finos e curtos: têm extremidades arredondadas.

Exemplo: Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Mycobacterium.

� Finos e longos (forma filamentosa). Parece um fio de cabelo.

Exemplo: Leptotrix buccalis, Lactobacillus sp.

� Curtos, espessos e extremidades rombadas.

Exemplo: Bacillus.

� Finas longas e extremidades agudas.

31

Exemplo: Fusobacterium nucleatum.

� Curta e arredondada (cocobacilo).

Exemplo: Brucella, Haemophilus sp.

* VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRÁTICAS

Nos bacilos, sempre o comprimento predomina sobre a espessura no mínimo uma

vez e meia, ao contrário dos cocos, nos quais essas dimensões permanecem quase iguais.

FORMAS ONDULADAS

Forma ondulada, espiralada ou helicoidal.

Compreende:

a) Espirilos

b) Espiroquetas

c) Vibriões

a) Espirilo: possui corpo rígido, movendo-se à custa de flagelos.

Exemplo: Spirillum

b) Espiroqueta: corpo flexível e móvel com o auxílio de filamentos axiais presentes sob a

camada externa.

Exemplo: Treponema pallidum

32

c) Vibrião: em forma de vírgula, apenas um seguimento de espiral.

Exemplo: Vibrio cholerae Imagens: Tortora, 2005

Outros: Entre espirilos e espiroquetas aparecem diferenças notáveis de comprimento,

espessura, número e amplitude de espiras.

� Algumas possuem pequeno número de espiras, abertas e irregulares.

Exemplo: Borrelia.

� Outras têm espiras numerosas, regulares e apertadas à semelhança de dentes de serra.

Treponema pallidum

Leptospira interrogans

33

GRUPAMENTOS BACTERIANOS

Ao lado da forma da célula, é importante o conhecimento das diferentes disposições

que as bactérias apresentam, chamadas de grupamentos, pelos quais pode-se diferenciar

gêneros bacterianos.

Estas associações são explicadas por peculiaridades dos processos de

multiplicação.

Podem ocorrer os seguintes arranjos:

Imagens: Fernando Bortolozzi e Tortora, 2005 h

NOMENCLATURA DO GRUPAMENTO

FORMATO EXEMPLOS

Diplococos (dois a dois)

1

2

1. Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitis

(GONOCOCO e MENINGOCOCO) 2. Streptococcus pneumoniae

(PNEUMOCOCO)

Estreptococos (cadeias)

Streptococcus pyogenes

Estafilococos (irregular ou cacho de uva)

Staphylococcus aureus

Tétrades (cocos de 4 em 4 elementos, simetricamente)

Micrococcus

Sarcina (8 elementos, formando cubos simetricamente)

Sarcina (não visível no plano do MO)

Quanto às células alongadas, os grupamentos não apresentam tanta importância:

1. Diplobacilos (dois a dois):

2. Estreptobacilos (em cadeia): Imagens: Tortora, 2005

(Geralmente esporulam)

34

3. Alguns bacilos podem agrupar-se em paliçada, quando o movimento pós-

divisional é de deslizamento:

Mycobacterium tuberculosis (PALIÇADA)

4. Globias: bacililos agrupados em formas concêntricas que se assemelham a um

globo.

Mycobacterium leprae (GLOBIA)

Imagens: Fernando Bortolozzi

5. Um outro movimento pós-divisional é em dobra, onde as células formam ângulo à

semelhança de letras e o conjunto lembra letras chinesas:

Corynebacterium diphteriae

6. As formas onduladas apresentam-se individuais, não formando grupamentos.

Observação: em uma preparação microscópica, observar a morfologia celular e o

grupamento predominante.

Formas de Involução e Pleomórficas

Pleomórficas: são bactérias sem parede e justamente por isso não têm forma definida

ORIGINALMENTE (não se enquadram em cocos, bacilos, espirilos etc., uma vez que nunca

tiveram forma definida). Independe das condições do meio. Exemplos: Haemophilus,

Mycoplasma, Proteus, Chlamydia e o bacilo diftérico.

Involutivas: Bactérias em degeneração, aberrantes ou intumescidas. Quando em meio

inadequado (pH, O2, toxinas, composição do meio, produtos tóxicos vindos do próprio

metabolismo bacteriano, etc.), esses microrganismos perdem sua forma original. Um dia

foram cocos, bacilos, etc. As células deste tipo mostram aspectos de intumescimento,

aberrantes e em degeneração, como por exemplo, a Yersinia pestis.

35

CAPÍTULO 3CAPÍTULO 3CAPÍTULO 3CAPÍTULO 3: : : : MORFOLOGIA COLONIAL

Objetivos

1. Identificar as principais características culturais de bactérias;

2. Avaliar a importância destes dados na sistemática bacteriana, facilitando a

caracterização e a identificação das bactérias.

Introdução

Fornecendo as mesmas condições de cultivo relacionadas à composição do meio de

cultura, atmosfera, temperatura, pH, etc, as bactérias apresentam uma notável constância

de caracteres.

Pode-se considerar as seguintes características coloniais pela variação de: tamanho,

cor, forma, tipos de bordas, elevação, superfície, consistência, transparência, brilho,

cromogênese (pigmento solúvel ou não).

Definição

Colônia é o crescimento dos microrganismos em meio sólido. Em condições ideais, a

colônia representa a descendência de uma única célula.

Características das Colônias

• Tamanho: puntiformes (menores que 0.5mm) até alguns centímetros de

diâmetro.

• Cor: amarela ouro, amarela citrina, amarela clara, vermelha, rosada, branca,

castanha, alaranjada, etc., com pigmento difusível ou não.

• Forma:

Circular Irregular Rizóide ou arborescente

36

• Bordas:

Lisa Denteadas

Lobadas Onduladas

• Elevação:

Convexa alta Convexa baixa

Acuminada Espraiada

Centro-saliente Umbilicada

Centro-deprimida Papiliforme

• Superfície:

Lisa, rugosa, pregueada, raiada

Com círculos concêntricos

• Consistência:

Cremosa, viscosa, granulosa, seca

• Transparência:

Opaca, translúcida, transparente

• Brilho:

Fosca, brilhante

37

CAPÍTULO 4CAPÍTULO 4CAPÍTULO 4CAPÍTULO 4: : : : VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE

BACTÉRIAS NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVÉS DE

CULTIVO

Observação

A partir deste capítulo as aulas práticas serão participativas ou demonstrativas

dependendo da disponibilidade de material para sua execução (meios de cultura, material

patológico, soros aglutinantes, placas, pipetas, etc.)

Objetivos

1) Avaliar o ambiente quanto a presença e número de bactérias viáveis não

exigentes, aeróbias e mesófilas, para justificar a necessidade de assepsia nos

trabalhos bacteriológicos.

2) Prevenção de contaminação em salas de curativos, cirurgias, etc..

3) Estudar as diferentes características coloniais.

Contagem

Meio de cultivo: ágar simples (ASI) distribuído em placas de Petri de 10 cm de

diâmetro.

Técnica

1. Expor à contaminação, pelo ar, as placas abertas em diversos locais da sala de

aula por 30 minutos (por exemplo);

2. Fechar e incubar a 36oC durante 48h;

3. Contar as colônias desenvolvidas;

4. Calcular a quantidade de bactérias por m2 de acordo com os seguintes dados:

38

a. Área da placa de 10 cm de diâmetro = 0,007854 m2.

b. Tempo de exposição: 30 minutos.

Exemplo: 10 UFC →→→→ 0,007854 m2

x →→→→ 1 m2

x = 1.273 UFC/m2

em uma hora: 1.273 →→→→ 0,5 hora

x →→→→ 1 hora

x = 2.546 UFC/m2/h

UFC = Unidades Formadoras de Colônia

39

CAPÍTULO 5CAPÍTULO 5CAPÍTULO 5CAPÍTULO 5: : : : PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS

Objetivos

Familiarizar o aluno com as técnicas de preparações microscópicas, visando a

observação dos microrganismos. Pelas características vistas, iniciar a identificação das

bactérias.

Introdução

Existem muitos tipos de preparações microscópicas, variando com a necessidade de

obter dados como: mobilidade, estruturas celulares, propriedades tintoriais, etc,...

A bacterioscopia pode ser feita com o objetivo de observar bactérias:

1. Vivas: pelos exames a fresco.

2. Mortas: em preparações coradas.

Preparações a Fresco

• Campo Claro

- Entre lâmina e lamínula.

- Gota pendente.

• Campo Escuro

- Entre lâmina e lamínula.

Servem para observar a mobilidade e/ou presença de bactérias.

Preparações Coradas

• Coloração Negativa – usando contraste.

• Coloração Simples – um corante.

• Coloração Composta ou Diferencial – dois ou mais corantes

A coloração negativa e a coloração simples são usadas para observar a presença de

bactérias e sua morfologia.

A coloração composta é usada para evidenciar estruturas celulares e as

propriedades tintoriais.

40

Preparações a Fresco

Nas preparações a fresco os materiais líquidos como urina, exsudatos, LCR, meios

de cultivo líquidos, podem ser examinados tais como se apresentam ou centrifugados e

examinando-se o sedimento.

Quando se tem material espesso (patológico ou de cultivo), deve-se diluí-lo em soro

fisiológico estéril.

Pode-se examinar as bactérias ao natural, com pouca luminosidade, mas como as

suas células têm um índice de refração próximo ao da água, algumas vezes torna-se difícil

observá-las. Nesses casos recorre-se aos corantes vitais, atóxicos (para não prejudicar a

mobilidade). Os mais usados são: azul de metileno, vermelho neutro, azul de Nilo, entre

outros, em solução aquosa a 1%.

Técnica de preparação

entre lâmina e lamínula

1) Sobre uma lâmina colocar uma ou duas gotas do

líquido a examinar;

2) Cobrir com lamínula.

Observar ao microscópio com quantidade reduzida de

luz e objetiva de pequeno aumento (10x) para uma visão

panorâmica. Em seguida passar para 40x aumentando

convenientemente a intensidade da luz.

Observação: para evitar a dessecação do material, pode-se

cercar as gotas com Vaspar (mistura de vaselina e parafina).

A lamínula colocada ficará aderida ao Vaspar, fechando a

preparação. Na falta de Vaspar pode-se utilizar vaselina

sólida ou lanolina.

Técnica de preparação em

gota pendente

Usa-se para esta técnica a lâmina escavada de Koch (lâmina

com ± 3 mm de espessura com concavidade central).

1. Untar as bordas da concavidade com Vaspar.

2. Sobre uma lamínula colocar uma pequena quantidade do

líquido a ser examinado.

3. Inverter a lâmina escavada sobre a lamínula e pressioná-la

levemente para aderir ao Vaspar.

4. Voltar rapidamente a lâmina à sua posição normal.

41

VISTA DE CIMA CORTE TRANSVERSAL (APÓS A MONTAGEM)

Lâmina Vaspar Lâmina Lamínula Vaspar Gota Pendente

escavação (concavidade)

Preparação a fresco em campo escuro

Serve para a mesma finalidade que as técnicas precedentes, mas especialmente

usada para observar bactérias muito delgadas, que são invisíveis em campo claro. Utilizada

para observar a presença de espiroquetas em materiais como serosidade de cancro sifilítico

(Treponema pallidum) ou urina suspeita de conter Leptospira (urina recém emitida e

centrifugada, utilizar o sedimento).

O campo escuro ao microscópio é obtido usando-se um condensador especial (como

o cardióide) que impede a penetração de raios diretos de luz sobre o material examinado.

As bactérias são iluminadas lateralmente, contrastando com o fundo escuro.

A técnica de montagem da preparação é a mesma que entre lâmina e lamínula.

Preparações Microscópicas Coradas

São as mais usadas em bacteriologia, onde as bactérias estão mortas e

artificialmente coradas. Este tipo de preparação, que compreende a coloração de Gram, é

muito importante na identificação presuntiva de microrganismos. A morfologia da célula, sua

disposição e propriedades tintoriais são freqüentemente suficientes para definir o gênero.

Etapas das preparações coradas:

1) Esfregaço

2) Fixação (a quente ou a frio)

3) Coloração

42

1. Esfregaço: consiste em depositar o material a examinar no centro de uma lâmina

e espalhá-lo numa espessura apropriada. Deixar secar espontaneamente ou

numa estufa a 37oC. Se o material a examinar pela bacterioscopia for muito

espesso (patológico ou cultivo), deve ser diluído em salina ou água estéril. Se for

material líquido e pobre em microrganismos, deve ser centrifugado (urina, por

exemplo); derrama-se o sobrenadante e examina-se o sedimento.

2. Fixação: tem por objetivo fixar o material à lâmina para que não se desprenda

durante os procedimentos ulteriores. A fixação pode ser feita a quente ou a frio.

Em ambos os casos há coagulação de célula bacteriana que a faz aderir à

lâmina.

A Quente

• Pode ser feita “serrando” com a lâmina a chama da lâmpada

ou bico de Bunsen, duas a três vezes, com a face que contém

o material voltada para cima, para não ter contato direto com a

chama.

• Derrama-se álcool sobre a preparação e inflama-se.

Observação: a exposição excessiva ao calor deforma a morfologia da bactéria e

com aquecimento insuficiente haverá desprendimento do material.

A Frio

• Para não alterar muito a morfologia bacteriana ou quando há

interesse de observar o aspecto citológico do material, como

exsudatos, sangue, líquor, etc., usa-se fixação a frio, cobrindo

o esfregaço com substâncias químicas:

- Mistura de álcool e acetona.

- Formol.

- Solução de cloreto de mercúrio, etc.

3. Coloração propriamente dita: seguir as instruções do método de coloração a

ser usado. Nos casos em que se queira observar apenas a presença de bactérias

ou conhecer a sua morfologia ou grupamento, recorre-se à COLORAÇÃO

SIMPLES, onde se usa um corante qualquer: azul de metileno, fucsina, violeta de

genciana, etc.

43

Coloração Simples

Técnica

1. Cobrir o esfregaço com o corante e deixar agir um minuto;

2. Lavar com água;

3. Secar.

Examinar no MO com a objetiva de 100x em imersão.

Coloração Composta ou Diferencial

Nestas colorações participam fundamentalmente 4 componentes, cuja natureza

química varia com o método escolhido.

1. Corante principal: é o primeiro a ser empregado determinando a característica

tintorial (como por exemplo violeta de genciana na coloração Gram).

2. Mordente: é a substância que reforça a ação do corante principal (iodo no

Gram).

3. Diferenciador: é o elemento que descora seletivamente as bactérias (álcool no

Gram).

4. Corante secundário ou de fundo: é o que cora os elementos descorados pelo

diferenciador (fucsina no Gram). O corante de fundo tem que ter cor contrastante

com o corante principal.

A coloração diferencial universalmente aceita, e usada em todos os laboratórios

de bacteriologia, é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois

grandes grupos:

1) Gram positivas.

2) Gram negativa.

A propriedade tintorial revelada pelo Gram está relacionada à composição

química da parede celular bacteriana.

44

COLORAÇÃO DE GRAM

Técnica

1. Cobrir o esfregaço com Violeta de Genciana e deixar agir durante 1 minuto.

2. Derramar o corante e cobrir com lugol, 1 minuto.

3. Lavar com água.

4. Descorar pelo álcool (tempo crítico) aproximadamente 15 segundos.

5. Lavar com água.

6. Cobrir com fucsina de Ziehl diluída 1:10, durante 30 segundos.

7. Lavar com água.

8. Secar.

Observação: existem diversas modificações do método de Gram. Alguns laboratórios

substituem a Violeta de Genciana (penta e hexametil pararosanilina) por Cristal Violeta

(hexametilpararosanilina) que tem poder corante superior.

As bactérias submetidas ao método de Gram comportam-se da seguinte maneira:

(Fonte: Tortora, 2005)

Etapa Gram Gram

Até a 3a etapa

Após a 5a etapa

Após a 7a etapa

Violeta

Violeta

Violeta

Violeta

Incolor

Vermelha

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GRAM – GRAM + Microscopia: Rosa Microscopia: Roxo Possui uma parede celular mais diversificada, sem lipoteicoato

Possui filamentos de teicoato, ligados à muranato

± 1-2 camadas de peptídeoglicano (5-10%) (+ FINAS)

15 a 20 camadas de peptideoglicano (90%) (+ ESPESSAS)

Mais lipídeo (20%) e muitos aa Tem pouco lipídeo (2%) e poucos aa Possui uma 2ª membrana ancorada às camadas de peptideoglicano (chamada membrana externa) externa à parede celular

Tem adjacente à membrana plasmática uma parede celular

Formam ESFEROPLASTOS: quando a bactéria perde a parece celular. Quando restam partes da PC, em local e condições adequadas, essa PC pode ser refazer.

Formam PROTOPLASTOS: é a membrana de uma bactéria gram +. Se perdê-la, não consegue refazê-la. Porém sobrevive só com o protoplasto.

Mais polissacarídeos e presença de lipídeo A formando os lipopolissacarídeos (LPS***)

Menos polissacarídeos

CORRELAÇÕES CLÍNICAS: Fonte: Robbins, 2005

*** LPS: são pirogênios exógenos (geram calor) – No organismo humano, podem ser um dos produtores de febre. Quando os macrófagos fagocitam os produtos bacterianos, estimulam leucócitos. Esses leucócitos estimulados liberam os pirogênios endógenos Interleucina 1 (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF). Esses mediadores estimulam a ativação das integrinas dos neutrófilos no endotélio para que eles migrem, via rolamento, para o tecido conjuntivo em combate às bactérias patogênicas. Além disso, a Il-1 e o TNF estimulam a produção de PGE-2 (prostaglandina E2) no hipotálamo, que controla a temperatura corporal via AMPc. Uma vez que o TNF e a IL-1 estão elevados, o sono aumenta e o apetite diminui, como acontece na gripe por exemplo. Por fim o hipotálamo aumenta a temperatura corporal, ativando proteínas do choque térmico. Tais proteínas proteínas aumentam a atividade os linfocitária. Ou seja, a elevação da temperatura do corpo está relacionada a melhorar a resposta imune do indivíduo em resposta a bactérias patogênicas. Detalhes serão vistos na disciplina de Patologia Médica Molecular (BP334).

* Espaço periplásmico: é o espaço entre as camadas de peptideoglicano. É um importante local de produção de enzimas, entre elas a β-LACTAMASE. Uma enzima muito importante, pois ela influencia na terapêutica antibiótica. β-lactâmicos são uma classe de antibióticos, diga-se de passagem, os antibióticos mais utilizados no tratamento de infecções (leia-se penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, etc). Esses antibióticos são assim chamados porque em sua composição têm um anel beta-lactâmico. Essas bactérias que produzem β-

46

lactamases, são capazes de destruir esse anel dos antibióticos por hidrólise, deixando o mecanismo de ação antimicrobiano inativo. Ou seja, É UM IMPORTANTE MECANISMO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS! As principais bactérias que a produzem são os estafilococos (Staphylococcus aureus principalmente), Haemophilus influenzae, Moraxella e a maioria dos BGNs intestinais como a Escherichia coli. Estreptococos geralmente não são capazes de produzir β-lactamases. No entanto, em uma infecção tipo tonsilite por Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta hemolítico do grupo A de Lancefield produtor de estreptolisina), por exemplo: esta bactéria não produz β-lactamases, mas algumas bactérias da microbiota residente as produzem. Essas enzimas degradam o fármaco que iria matar a bactéria causadora da infecção e o medicamento acaba falhando. Por isso, muitas vezes, mesmo para infecções estreptocóccicas, deve ser prescrever um antibiótico JUNTO COM UM INIBIDOR DAS BETA LACTAMASES. Até porque clinicamente não se sabe se trata-se de uma infecção por estafilococos, estreptococos, Haemophilus, Moraxella, etc. Prescreve-se um antibiótico β-lactâmico com um inibidor de β-lactamases que faz inibição enzimática e deixa essas penicilinases sem atividade catalítica. Ex: Clavulanato, Sulbactam, etc. Eles inibem as β-lactamases e deixam o antibiótico agir (penicilina). Além disso, muitas vezes, a própria bactéria causadora da infecção pode ser produtora dessas enzimas. Medicamentos com inibidores de β-lactamases: � Amoxicilina + Clavulanato de Potássio (Clavulin®). Antibiótico de primeira escolha para infecções de vias aéreas superiores. O clavulanato inibe as beta-lactamases e a amoxicilina, uma vez que não será destruída pela ação dessas enzimas, dará cabo das bactérias. Há vários esquemas de posologia que serão vistos nas disciplinas clínicas. � Amoxicilina + Sulbactam (Trifamox IBL®) Mecanismo de ação dos B-lactâmicos: Inibição da síntese de peptideoglicano. Existem enzimas responsáveis pela síntese de peptideoglicano, as PBP (Penicillium Binding Protein), são transpeptidases e carboxipeptidases, proteínas fixadoras de penicilina. O mecanismo é simples, esses antibióticos inibem essas enzimas (que geralmente se localizam na superfície externa da MP), deixando a parede celular frouxa. Mas, além disso, esses antimicrobianos fazem a inativação dos inibidores das enzimas autolíticas na PC.

Exemplos de bactérias Gram positivas e Gram negativas mais comuns:

Cocos Gram positivos Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterococcus,

Sarcina

Cocos Gram negativos Neisseria (gonorrhoeae e meningitidis), Moraxella, Veillonella

Bacilos Gram positivos Bacillus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Listeria

Bacilos Gram negativos Enterobacteriaceae (Salmonella, Shigella, Escherichia coli,

Proteus, etc), Bordetella, Brucella, Pseudomonas, Alcaligenes

O comportamento tintorial frente ao Gram está relacionado intimamente a outras

propriedades das bactérias. De tal modo que, ao verificarmos a Gram positividade ou Gram

negatividade, teremos informações referentes à natureza química da parede celular e do

seu comportamento frente aos agentes antimicrobianos (antibióticos, corantes, etc.).

47

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN: A Evidenciação de Bacilos Álcool-Ácido

Resistentes (BAARs)

Certas bactérias, como o bacilo da tuberculose e da hanseníase, dificilmente tomam

as cores da anilina, mas uma vez coradas por técnicas apropriadas fixam fortemente o

corante, a ponto de resistir à ação de descorantes como o álcool e ácidos minerais fortes e

diluídos. Daí o uso corrente do método de Ziehl-Neelsen ou de suas numerosas

modificações para identificação das bactérias, que assim se comportam e por isso são

chamadas Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR).

Para vencer a resistência à coloração, aumenta-se a concentração do ácido fênico

(mordente) da solução corante, prolonga-se a exposição ao corante (5 a 10 minutos) e

aplica-se o calor (aquecimento) durante o tempo de coloração.

No descoramento são usados o álcool e soluções de ácidos minerais, tais como o

ácido nítrico, sulfúrico ou clorídrico.

O fenômeno de ácido-álcool resistência é atribuído à presença de um alto teor de

lipídeos, sobretudo na parede celular, que se opõe à penetração do corante.

Composição dos Reativos Usados no Ziehl-Neelsen

• Fucsina fenicada

� Fucsina básica 0,3 g

� Álcool 95o 10 mL

� Fenol fundido 5 mL

� Água destilada 95 mL

Observação: em outras colorações usa-se o fenol aproximadamente em

quantidade 5 vezes maior.

• Diferenciador

� Álcool etílico 95o 99 mL

� Ácido clorídrico 1 mL

• Corante de fundo

� Solução de azul de metileno.

48

Técnica

1. Fixar o esfregaço pelo calor.

2. Cobrir com fucsina de Ziehl e aquecer até o desprendimento de vapores, a partir

deste momento, contar 5 minutos. Não ferver nem deixar secar. Quando cessar a

emissão de vapores, aquecer a lâmina novamente.

3. Lavar com água.

4. Descorar com álcool ácido, até não sair mais o corante.

5. Lavar com água.

6. Corar com azul de metileno, 1 minuto.

7. Lavar, secar.

Os bacilos álcool-ácido resistentes aparecem em cor vermelha, cor da fucsina, e

os outros elementos coram-se em azul, cor do azul de metileno (no caso do

escarro: cocos, outros bacilos, leucócitos, células epiteliais, filamentos de muco,

etc.).

COLORAÇÕES DE ESPIROQUETAS

Os espiroquetas são microrganismos muito delgados (a maioria tem cerca de 0,2 µm

de espessura), helicoidais, de corpo flexuoso e deformável durante o movimento. A maior

parte cora-se com dificuldade, devido à natureza lipídica das estruturas mais superficiais:

são microrganismos delicados que perdem a morfologia se forem fixados pelo calor numa

preparação microscópica. Por estas razões, para observá-los, as técnicas mais comuns são

as seguintes:

1. Exame a fresco em campo escuro.

2. Coloração negativa com tinta-da-China (método de Burri).

3. Métodos de impregnação pela prata: Fontana-Tribondeau, Morosov, etc.

4. Método de Giemsa.

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Coloração Negativa (Método de Burri)

São preparações com tinta-da-China (Nanquim) ou Nigrosina. Usada para

evidenciar: espiroquetas, bacilo diftérico, associação fuso-espiralar ou cápsulas bacterianas.

Uma das maneiras de preparar a lâmina para coloração negativa segue esta técnica:

1. Colocar o material a examinar sobre a lâmina;

2. Gotejar tinta-da-China;

3. Usando outra lâmina (não esborcinada), reunir os dois materiais e inclinando-a

num ângulo de ± 40o, estender sobre a primeira lâmina, à maneira de esfregaços

de sangue.

4. Deixar secar.

Examinar em imersão.

Os elementos (bactérias) aparecerão como se apresentam em natureza, isto é,

hialinas, incolores, contrastando com o fundo escuro formado pela tinta-da-China.

É um método que deforma em menor grau a célula bacteriana, uma vez que não

usa fixação pelo calor, corantes, diferenciadores, etc., que possam desidratá-la

ou deformá-la.

Fontana-Tribondeau (Impregnação pela Prata)

Método tradicional para a identificação de espiroquetas como o Treponema palidum.

Composição dos reativos no método de Fontana:

Fixador (Líquido de Ruge) � Ácido acético – 1 mL

� Formalina – 2 mL

� Água destilada – 100 mL

Mordente � Tanino – 5g

� Água fenicada a 1% – 100 mL

Solução impregnadora � Nitrato de prata amoniacal

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Processo

1. Secar o esfregaço ao ar.

2. Cobrir com líquido de Ruge e deixar agir por 1 minuto.

3. Lavar com água.

4. Cobrir com solução de tanino fenicado, aquecendo a lâmina até a emissão de

vapores, durante 1 minuto.

5. Lavar com água.

6. Cobrir com solução de nitrato de prata e aquecer até a emissão de vapores

durante ½ minuto.

7. Lavar e secar ao ar.

As bactérias aparecem de cor marrom e o fundo da lâmina amarelo.

COLORAÇÃO DE GRANULAÇÕES METACROMÁTICAS

As granulações metacromáticas são as que tratadas por certos corantes, apresentam

o fenômeno de metacromasia, isto é, tomam uma cor diferente da do corante.

São também chamadas de granulações de volutina ou de Babes-Ernst; são

encontradas em determinadas bactérias como: Spirillum volutans, bacilo diftérico, difteróide

e lactobacilo. Para evidenciá-las, usam-se métodos de coloração especiais. Exemplo:

método de Neisser, método de Albert Laybourn, os quais empregam corantes

metacromáticos.

Método de Albert Laybourn

Reativos da Coloração de Laybourn

Solução de Laybourn � Azul de toluidina

� Verde malaquita

� Ácido acético glacial

� Álcool a 95%

� Água destilada

Mordente � Lugol forte

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Técnica

1. Fixar o esfregaço pelo calor.

2. Corar com solução de Laybourn por 3 a 5 minutos.

3. Derramar o corante e cobrir com lugol por 1 minuto.

4. Lavar com água.

5. Secar.

Examinar em imersão.

As bactérias aparecem coradas de verde-claro e as granulações ficam escuras

(quase negras).

Observação: o corante metacromático, neste método, é o azul de toluidina.

52

CAPÍTULO 6CAPÍTULO 6CAPÍTULO 6CAPÍTULO 6: : : : MEIOS DE CULTURA

O conjunto de substâncias nutritivas em que se cultivam os microrganismos em

laboratório chama-se meio de cultura. A composição varia ao infinito. Os meios de cultura

microbiológicos consistem em uma mistura de substâncias nutrientes mais ou menos

complexa, dependendo das exigências nutritivas da espécie em estudo. As exigências são

decorrentes do maior ou menor poder de síntese da espécie. Alguns meios compõem-se

apenas de soluções de sais inorgânicos, outros se preparam com ingredientes complexos

como extratos de tecidos ou órgãos de animais. Outros consistem em tecidos vivos (cultivo

de tecidos) usados para Rickettsia e vírus.

Os meios de cultura podem ser divididos em diversos grupos de acordo com a

procedência, consistência, composição e finalidade.

QUANTO À PROCEDÊNCIA

Naturais São usadas substâncias assim como elas se apresentam na natureza ou

apenas com pequenas modificações, como cocção.

Exemplos: suco de tomate, batata, leite.

Artificiais São preparados no laboratório, pela mistura de diversas substâncias.

Exemplos: caldo simples, água peptonada.

QUANTO À CONSISTÊNCIA

Sólidos

Semi-sólidos

Xaroposos

Líquidos

A solidificação geralmente é feita acrescentando o ágar aos meios líquidos.

Aumentando ou diminuído a porcentagem do ágar, obtemos a variação da consistência de

acordo com a necessidade.

O ágar é extraído de algas marinhas (gênero Gelidium é uma delas) de natureza

química polissacarídica (D-galactose e L-galactose).

É um solidificante ideal porque:

53

1. Não é metabolizado pelas bactérias de interesse médico (apenas algumas

espécies marinhas o digerem).

2. Uma vez na consistência de gel, só se liquefaz à temperatura de 100oC (próprio

até para o cultivo de termófilas = 65oC a 70oC).

3. uma vez liquefeito, vai solidificar apenas ao redor de 45oC, fato que se aproveita

para cultivar bactérias incorporadas ao meio de cultura a esta temperatura. Em

seguida deixa-se solidificar (semeadura de Pour-Plate).

Outras substâncias usadas para solidificar os meios de cultura são:

a) Gelatina.

b) Sílica-gel.

a) A gelatina é obtida a partir de osseína, uma proteína rica em aminoácidos.

Apresenta a desvantagem de ser hidrolisada por algumas bactérias, com o

que perde sua qualidade de gel. Também porque à temperatura de 36oC

(temperatura própria para o cultivo da maioria das bactérias de interesse

médico) ela apresenta-se líquida.

b) A sílica-gel é obtida pela ação de HCl sobre silicato de sódio, formando ácido

silícico. Tem a vantagem de apresentar composição química definida, não

possuir nenhum elemento nutritivo, ideal para solidificar os meios sintéticos.

QUANTO À COMPOSIÇÃO

Simples São destinados ao cultivo de germes pouco exigentes ou servem de base

para outros meios.

Exemplos: solução aquosa de sais minerais, caldo simples, água peptonada,

gelose simples.

Enriquecidos São meios adicionados de substâncias altamente nutritivas, como proteínas

termocoaguláveis (sangue, plasma sanguíneo, líquido de ascite),

aminoácidos, extratos de órgãos de mamíferos, proteína da soja, etc.

Exemplos: ágar sangue e ágar soro. Usados no cultivo de bactérias

exigentes.

54

QUANTO À FINALIDADE

Seletivos A adição de certas substâncias químicas, ao meio de cultura, inibe

o crescimento de algumas bactérias, possibilitando o

desenvolvimento de outras. O cristal violeta na concentração de

1:20.000, inibe a proliferação de germes Gram positivos, sem

afetar os Gram negativos. A penicilina e outros antibióticos são

usados com a mesma finalidade. Os meios seletivos são sólidos.

Diferenciais São aqueles que permitem a diferenciação dos germes que neles

crescem, pela mudança da cor das colônias ou do meio de cultura,

pela reação com produtos do metabolismo.

Seletivos-Diferenciais São os que simultaneamente selecionam e diferenciam as

espécies. Exemplo: meio de Teague, MacConckey, Chapmann e

SS.

De Enriquecimento São os meios líquidos ou xaroposos que favorecem a proliferação

dos germes, facilitando o seu posterior isolamento em meio sólido.

São usados quando as bactérias que se deseja isolar, estejam em

quantidade muito pequena ou quando a microbiota de

acompanhamento seja muito rica. Neste último caso, costuma-se

adicionar substâncias impedientes ao meio, de modo que na

cultura prevalecerá o germe que se deseja isolar.

Meios Sintéticos São meios de composição química bem definida, constituídos de

solução de sais minerais ou orgânicos, aminoácidos, hidratos de

carbono e vitaminas.

Sobre a composição, preparo e ajuste de pH de meios de cultura, consultar

Diagnóstico Microbiológico (6a edição) 2001, de Konemann e colaboradores.

55

CAPÍTULO 7CAPÍTULO 7CAPÍTULO 7CAPÍTULO 7: : : : ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Técnicas assépticas de semeaduras para o isolamento e estudo das bactérias.

Objetivos

1. Treinar o aluno na manipulação dos meios de cultura, em condições de assepsia.

2. Executar semeaduras em meios sólidos e líquidos.

3. Semear o material em estudo (patológico ou não) para obter o isolamento da

bactéria em cultura pura, cujas propriedades servirão para caracterização e

posterior identificação.

Introdução

Em microbiologia nada pode ser feito antes de isolar a bactéria em cultura pura, ou

seja, a cultura deve ser de uma única espécie. Só então é que se pode caracterizá-la.

O cultivo de bactérias requer técnicas assépticas adequadas, para evitar

contaminações. Para isso devem ser observados os seguintes cuidados:

• Os tubos e placas estéreis ou com material em estudo somente devem ser

abertos próximos a uma chama onde se forma uma área estéril (ou se usar

câmara asséptica).

• Os procedimentos devem ser feitos de preferência por trás da chama.

• As alças ou agulhas devem ser flambadas imediatamente antes e após o uso

(após o uso, evitar o aquecimento brusco para evitar os aerossóis). As alças

devem ser levadas ao rubro em posição vertical em relação à chama de gás ou

lâmpada de álcool.

• As bocas de tubos, frascos, pipetas, etc., são flambadas ligeiramente antes e

após a transferência de material.

• Nunca abrir os tubos ou frascos na posição vertical. Para semeadura em meios

líquidos, inclinar o tubo em um ângulo de aproximadamente 40o. O tubo com

meio sólido, deixar na horizontal.

56

Isolamento em Placas

O isolamento em placas é o mais usado para obter cultura pura de amostras que

contenham população mista. Com semeadura por esgotamento (para descarregar a alça),

faz-se estrias superficiais de lado a lado da placa.

Cuidados

1. Ocupar toda a superfície do meio de cultura;

2. Não passar 2 vezes no mesmo local (salvo em semeaduras que

serão explicadas a seguir);

3. As estrias não devem ser muito próximas nem muito distantes

uma da outra (o objetivo é conseguir colônias isoladas).

Uma das maneiras corretas de semear Maneiras incorretas de semear

Crescimento confluente

Colônias isoladas

Desperdício de meio de cultura sem

conseguir culturas isoladas

Estrias muito apertadas, dão crescimento

confluente

Quando se tem material muito rico em bactérias (verificar pela bacterioscopia), pode-

se fazer estrias em quadrantes, flambando a alça na última estria do quadrante

anteriormente semeado.

Esgotamento Ponto de recarregamento

Na semeadura por estrias haverá crescimento confluente na área de esgotamento e

nas primeiras estrias. Em seguida aparece um grande número de colônias isoladas, muito

57

próximas umas das outras e de tamanho pequeno. Só no final haverá espaçamento maior

entre as colônias e estas terão o tamanho característico da espécie.

Inicialmente o crescimento é exponencial em relação ao tempo. Logo após,

entretanto, a ordem de crescimento se torna muito complexa, devido à proximidade das

células acumuladas. Esta proximidade cria uma situação que pode ser chamada

“aglomeração fisiológica” na qual as células competem entre si pelos nutrientes disponíveis

e afetam-se mutuamente pelo acúmulo de produtos residuais.

O crescimento em colônias é afetado não só pelas interações celulares dentro de

cada colônia, mas também por interações entre colônias vizinhas, conforme explicado

anteriormente.

Para a próxima etapa de identificação, vai se preferir as colônias bem separadas,

presumindo-se que são formadas por descendentes de uma única célula, portanto

constituindo cultura pura.

Existem diversas maneiras de fazer estrias, dependendo da preferência ou

habilidade do laboratorista. O importante é que no final se consiga colônias isoladas.

Observação: cultura pura é a condição indispensável para caracterização e

identificação de bactérias.

Identificação de Bactérias

Objetivos

1. Familiarizar o aluno com a seqüência de etapas para conseguir caracterizar e

identificar a bactéria para fins de diagnóstico.

2. Conhecer os princípios das provas bioquímicas diferenciais utilizadas na

caracterização.

3. Executar técnicas e interpretar resultados.

A identificação fundamenta-se na observação de um complexo conjunto de

caracteres. É necessária a análise de todos os aspectos: morfologia celular, morfologia

colonial, atividades fisiológicas relacionadas com os diversos metabolismos de carboidratos,

proteínas, etc. (são as provas bioquímicas) e estrutura antigênica (reação antígeno-

anticorpo). A investigação de somente um tipo dessas características raramente é suficiente

para identificar a espécie.

58

CAPÍTULO 8CAPÍTULO 8CAPÍTULO 8CAPÍTULO 8: : : : PROVAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIAIS

Através das provas bioquímicas verificam-se as transformações que ocorrem num

substrato conhecido, pela ação das enzimas bacterianas. Cada microrganismo possui um

sistema enzimático específico. Com auxílio de indicadores observa-se se o substrato foi

degradado, de que maneira ou se não o foi.

As provas bioquímicas baseiam-se no metabolismo de:

1) Carboidratos (fermentação de glucose, lactose, etc.).

2) Nitrogenados protéicos (indol).

3) Nitrogenados não protéicos (urease).

Entre outras.

Para realizar as provas bioquímicas usam-se meios de cultura contendo meio

nutritivo básico, acrescido do substrato a ser ensaiado. Mesmo que a bactéria não utilize o

substrato testado, ela crescerá a custa do meio básico.

Os sistemas de provas bioquímicas tornaram-se cada vez mais sofisticados na

atualidade.

A quantidade de provas depende da espécie a caracterizar. Algumas so

caracterizadas com menos de 10 provas, outras exigem dezenas delas.

As provas bioquímicas que vão ser executadas em sala de aula prática são: provas

de fermentação da glicose, lactose, sacarose e manitol, prova do indol, citratase, gás

sulfídrico (H2S), urease, vermelho de metila, Voges-Proskauer, gelatinase, nitratase e

mobilidade.

Provas de Fermentação

Fermentação da Glucose

Fermentação da Lactose

Fermentação da Sacarose

Fermentação do Manitol

A aparência dos 4 tubos é igual, levam a identificação das letras, G, L, S e M,

respectivamente.

Cada um destes substratos é misturado a meio nutritivo básico, de acordo com a

seguinte fórmula:

59

� Caldo simples 1000 mL

� Solução de carboidrato a 10% 100 mL

� Vermelho de fenol (indicador de pH) 2 mg

Dentro do tubo com meio de cultura há um tubo pequeno, de boca para baixo

(tubinho de Durham) que vai servir para captar os gases que se formam na decomposição

do carboidrato, em casos que a bactéria elaborar a enzima formiase e que vai desdobrar o

ácido fórmico (metanóico) em H2 e CO2.

O FORMIASE H – C H2 + CO2 OH

Os seguintes casos podem ser observados:

1) Cor vermelha (inicial) = reação negativa.

2) Cor amarela = reação positiva.

3) Cor amarela com gás = reação positiva com gás.

A notação usada para reações:

Reação negativa = - ou 0 (zero).

Reação positiva = + ou A (ácido).

Reação positiva com gás = + ou AG (ácido e gás).

PROVA DO INDOL (Derivados Protéicos)

Meio de cultivo:

• Água peptonada de fórmula:

� Peptona (triptofano) 10g

� Água 1000 mL

O triptofano quando metabolizado por desamimação pela enzima triptofanase, libera

indol livre (benzil pirrol), ácido pirúvico e NH3.

Uma das técnicas de verificar a presença do indol é extraí-lo da fase aquosa por

meio de éter e evidenciá-lo por meio do reativo de Ehrlich.

TRIPTOFANASE TRIPTOFANO INDOL + NH4

+ +

60

Técnica

1) Agitar a cultura com éter (na proporção de 3:1).

2) Deixar em repouso para estratificar as camadas.

3) Pelas paredes do tubo inclinado, gotejar o reativo de Ehrlich até formar camada

visível.

Resultado

Cor vermelha imediata: prova + POSITIVO

Cor amarela: prova - NEGATIVO

O princípio ativo do reativo de Ehrlich é: paradimetilaminobenzaldeido.

PROVA DA CITRATASE (Bactérias que usam Citrato como fonte de Carbono)

O meio de cultura usado é o de Kirsh-Koser, cuja fórmula é:

� Fosfato de sódio amoniacal

� Fosfato monopotássico

� Sulfato de magnésio

� Citrato de sódio

� Água

Nota-se, pela composição, que a única fonte de C é o citrato. Os outros componentes

são sais inorgânicos. Só vai proliferar a bactéria que produzir a enzima citratase, que

degrada o citrato, liberando o C.

Resultado

Turbidez: prova positiva

Limpidez: prova negativa

61

PROVA DO GÁS SULFÍDRICO – H2S

O meio de cultivo para esta prova contém composto sulfurado (cisteína, metionina ou

tiossulfato) e um indicador de reação (sal de metal pesado: ferro, chumbo, etc.).

O substrato sulfurado vai ser hidrolisado pela enzima dessulfidrilase, liberando S na

forma de H2S. A seqüência de etapas que conduzem à produção e detecção do H2S é a

seguinte:

1. Liberação do S a partir do composto sulfurado;

2. Acoplamento do S (S-2) com o íon H (H+) para formar H2S;

3. Detecção do H2S pelos sais de metais pesados é na forma de sulfeto do metal

pesado que é preto.

Prova positiva = meio de cultivo enegrecido.

PROVA DA UREASE

O meio de cultura contém, além da uréia, um indicador de pH, azul de bromotimol. A

urease é uma enzima que desdobra a uréia com liberação de amônia e dióxido de carbono.

A uréia é uma diamida do ácido carbônico cuja fórmula é:

Uréia

A urease hidrolisa a uréia de acordo com a reação:

A amônia reage em solução para formar carbonato de amônio, resultando a

alcalinização do meio observada pelo indicador de pH.

Prova positiva = cor azul intensa.

O gênero Proteus hidrolisa rapidamente a uréia de 1 a 2h ou até 24h.

O gênero Klebsiella é urease tardia, pode demorar de 3 a 4 dias para positivar.

62

PROVA DE VM (VERMELHO DE METILA) E VP (VOGES-PROSKAUER)

Ambas são realizadas no meio de Clark-Lubs, cujo substrato a testar é a glicose.

Por estas provas evidenciamos duas maneiras de decomposição da glicose:

1) A partir do ácido pirúvico há formação de ácidos orgânicos fortes (ácido acético,

ácido láctico, ácido fórmico) provocando uma queda acentuada do pH do meio

(<4,5).

2) Ácido pirúvico é decomposto em acetil-metil-carbinol ou acetoína e pequena

quantidade de ácidos orgânicos fortes. A acetoína é neutra e os ácidos formados

não baixam muito o pH, ficando em torno de 6 a 6,5.

A acidez forte do primeiro caso é verificada pela prova de VM.

A presença de acetil-metil-carbinol é detectada pela prova de VP.

Glucose Ácido fórmico � H2 + CO2 Succinato Acetil-CoA � Acetato Lactato acetil-metil-carbinol

Muitas bactérias (incluindo todas as enterobactérias) produzem a fermentação ácida

mista, com produção de diferentes quantidades e tipos de ácido de acordo com a

composição enzimática da bactéria. Exemplo: Escherichia coli produz grandes quantidades

de ácidos. Enterobacter produz grande quantidade de acetoína e pequena quantidade de

ácidos.

Técnica de VM

No meio cultivado Clark-Lubs colocar 5 gotas do vermelho de metila.

Interpretação: coloração vermelha = positiva;

coloração amarela = negativa.

Observação: o vermelho de metila é um indicador de pH com a zona de viragem

entre 6 e 4,4 (6 – amarelo; 4,4 – vermelho).

PIRUVATO

63

Técnica de VP

Ao Clark-Lubs juntar o reativo de Barrit:

d) Alfa-naftol a 5% em álcool absoluto.

e) Solução aquosa de KOH a 40%.

Colocar 6 gotas de alfa-naftol e 4 gotas de KOH. Agitar para expor o meio de cultura

ao contato com o O2 do ar.

Observação: o alfa-naftol é catalisador.

A reação se processa assim:

acetoína + O2 + KOH + alfa-naftol diacetila + O2 + KOH

complexo colorido vermelho

A reação é lenta, de algumas horas. É acelerada pelo catalisador alfa-naftol que se

acrescenta à reação, dando resultado em 10 minutos.

Resultado: Coloração vermelha = prova positiva.

PROVA DA GELATINASE

O meio de cultura usado é acrescido de gelatina. Algumas bactérias decompõem a

gelatina, que perde a qualidade de gel.

Após o cultivo, ao tirar da estufa a 37oC o meio de cultivo apresenta-se líquido. Para

saber se a gelatina foi hidrolisada, coloca-se o tubo na geladeira por alguns minutos. Se o

meio solidificou é porque a gelatina está intacta. Se permanecer líquido é sinal de

degradação da gelatina.

Resultado: Meio liquefeito = prova positiva;

Meio solidificado = prova negativa.

PROVA DA NITRATASE OU REDUÇÃO DO NITRATO (NO3-)

O termo redução de nitratos inclui todos os processos pelos quais o nitrato

desaparece do meio de cultura, pela ação das enzimas bacterianas, aparecendo o

nitrogênio sob forma menos oxidada.

64

Na maioria das espécies essa redução não prossegue além do estágio de nitritos:

NO3 + 2e- + 2H ⇒⇒⇒⇒ NO2 + H2O

Às vezes, no entanto, a redução progride até a formação de amônia e nitrogênio

molecular. Os nitratos são aceptores de H.

NO3 ⇒⇒⇒⇒ NO2 ⇒⇒⇒⇒ NO ⇒⇒⇒⇒ NH3 ⇒⇒⇒⇒ N����

Reativos usados: reativo de Griess-Ilosva A e B.

f) A – solução de ácido sulfanílico.

g) B – solução de alfa-naftil-amina.

Observação: o reativo de Griess-Ilosva só produz coloração vermelha em presença

de nitritos.

Técnica

1) Colocar no meio cultivado 5 gotas da solução A;

2) Colocar 5 gotas da solução B.

Observação: não agitar, a cor é fugaz.

Resultados

1) Cor vermelha = prova positiva. A cor vermelha é produzida pelo diazônio

vermelho: p-sulfobenzeno-azo-alfa-naftilamina;

2) Cor inalterada = prova positiva ou negativa. Neste caso faz-se a contra prova que

consiste em colocar uma pitada de Zn metálico em pó. Agitar. O pó de Zn reduz

rapidamente o NO3 a NO2. Se após o Zn aparecer coloração vermelha, a prova

da nitratase é negativa.

RESUMO

Cor vermelha Prova positiva 1a etapa

Incolor Prova positiva ou negativa

65

Cor vermelha Prova negativa 2a etapa (após o Zn)

Incolor Prova positiva

PROVA DA MOBILIDADE

A mobilidade bacteriana, além de preparações a fresco, pode ser observada através

de cultivo.

Meio de cultura: gelose semi-sólida distribuída em tubo (coluna alta).

Semeadura: picada superficial (cerca de 1mm).

Resultado: as bactérias móveis dão crescimento difuso para dentro do meio de

cultura. As imóveis terão crescimento confinado ao ponto de inoculação.

Esquema da Prova da Mobilidade (Vista Lateral)

Prova positiva

Prova negativa

Na página 66, consta uma tabela parcial, simplificada, com algumas provas

bioquímicas e respectivos resultados para bacilos Gram negativos.

66

67

Estas são algumas das provas feitas com o substrato colocado separadamente em

tubos de cultivo individuais. Existem, no entanto, meios que são compostos por diversos

substratos num único tubo:

1) Ágar – ferro Kligler (KIA) = glicose, lactose, H2S.

2) Ágar – tríplice açúcar (TSI) = glucose, sacarose, lactose e H2S.

3) Baracchini = glucose, lactose, sacarose, uréia e H2S.

4) Rugai modificado (IAL) = indol, sacarose, fenilalanina, glucose, H2S, uréia, lisina,

motilidade.

Detalhes de composição e interpretação dos resultados do meio Baracchini serão

dados no diagnóstico das infecções intestinais.

Além das provas bioquímicas, descritas acima, existem inúmeras outras e a escolha

vai depender do microrganismo a identificar e da disponibilidade de meios de cultura no

laboratório. Também serão levados em consideração os seus custos e a complexidade dos

testes.

Observação: existem disponíveis no comércio os chamados Sistemas Compactos de

identificação de bactérias. As vantagens destes sistemas são:

1. Longo prazo de validez dos meios de cultura, até um ano, o que não ocorre com

os meios convencionais.

2. Precisam de pouco espaço para armazenamento e incubação.

3. Características de crescimento facilmente observáveis.

4. Com o registro dos resultados e programas de computação, a identificação torna-

se fácil e precisa.

Entre as desvantagens podem-se citar os custos elevados quando forem

necessárias dez ou mais provas diferenciais.

Além disso, alguns microbiologistas empregam um número mínimo de provas na

identificação de certas bactérias que apresentam aspectos coloniais e bacterioscópicos

altamente característicos, já no isolamento primário. Por exemplo: alguns bacilos Gram

negativos fermentadores de lactose podem ser identificados com poucas provas

bioquímicas, como a Escherichia coli.

Ademais, uma identificação correta não depende, algumas vezes, apenas das provas

bioquímicas diferenciais (como nos Sistemas Compactos). Estas devem somar-se às

características das colônias, quanto ao tamanho, cor, textura, formato, reação hemolítica,

etc., à propriedade tintorial pelo Gram, morfologia da célula bacteriana e grupamento e às

reações sorológicas, para a identificação final confiável, como por exemplo, na identificação

da Salmonella.

68

Aparelhos automatizados. Os laboratórios de grande porte onde, por exemplo, são

feitos, em média, 150 culturas de urina por dia, têm o seu trabalho facilitado pelos aparelhos

automatizados. Estes podem revelar, em algumas horas (6 a 12h), o biotipo da bactéria

isolada e o antibiograma, saindo o resultado no impresso computadorizado.

Longe de desaprovar os progressos da tecnologia moderna, que é prática e

indispensável atualmente, e não fazendo apologia das técnicas convencionais, precisamos

admitir que os futuros bacteriologistas não terão a satisfação de conhecer o âmago da

bactéria, as características de seus componentes celulares, variando com as condições que

se lhe oferece. As suas mutações, as surpresas com o surgimento de resistência a um

antibiótico. Conhecerão apenas os biotipos das bactérias, fornecidas pelos cálculos

eletrônicos e impressos computadorizados.

Fleming, ao observar a ação inibidora de um fungo contaminante sobre os

estafilococos em isolamento numa singela placa de Petri, descobriu a penicilina que

revolucionou a medicina. Não a teria descoberto, talvez, se estivesse usando os métodos

sofisticados e apenas apertando os botões de um computador.

69

CAPÍTULO 9CAPÍTULO 9CAPÍTULO 9CAPÍTULO 9: : : : MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO

HUMANO

Objetivos

1. Demonstrar a presença de bactérias de diversas espécies, existentes sobre a

pele e na fossa nasal;

2. Alertar para a necessidade dos cuidados higiênicos para evitar a propagação de

bactérias, principalmente em ambientes hospitalares;

3. Atentar para os dados do exame laboratorial bacteriológico, em cujo resultado

possa constar a presença de microbiota normal, para não incorrer em erros de

interpretação.

Introdução

O termo “microbiota normal” refere-se aos microrganismos presentes regularmente

em determinados locais do corpo. Se removidos, prontamente se recompõe. É a também

chamada microbiota residente. De 10 a 20% das pessoas normais da comunidade extra

hospitalar, são portadoras de Staphylococcus aureus, em concentração elevada, na

nasofaringe. Esse estado de portador assintomático – que pode ser persistente, intermitente

ou transitório, pode alcançar 60 a 90% das pessoas em atividades hospitalares. Os surtos

ocasionais devidos ao Staphylococcus aureus, principalmente em enfermarias re recém

natos, podem ser rastreados e relacionados com a pele e fossas nasais das pessoas que

trabalham nestes locais.

Há também a microbiota transitória, que pode ser constituída por microrganismos

não patogênicos (de baixo potencial patogênico) ou alto potencial patogênico e que habitam

a pele e mucosas por horas, dias ou semanas.

A microbiota residente é benéfica quando evita a colonização pelas patogênicas, por

diversos mecanismos: competição por substâncias nutritivas, inibição por produtos

metabólicos tóxicos, competição por receptores das células do hospedeiro, etc.

A microbiota normal também pode provocar doenças nos seguintes casos:

1. Quando deslocada do seu ambiente para outros órgãos ou tecidos. Exemplo:

Streptococcus do grupo viridans inócuo na orofaringe, causa endocardite quando

se instala no coração.

2. Provocando enfermidades em pessoas debilitadas ou imunodeprimidas.

70

A PELE

A pele possui uma microbiota residente bem definida. Porém, pela sua exposição ao

meio ambiente, tem facilidade de apresentar a microbiota transitória. O microrganismo

predominante é o Staphylococcus epidermidis, com cerca de 103 a 104/cm2 de pele. A

maioria está localizada no extrato córneo, outros habitam folículos pilosos e atuam como

reservatório para restabelecimento após a lavagem.

TRATO RESPIRATÓRIO

Grande número de bactérias coloniza as fossas nasais, garganta e boca. Mas os

brônquios inferiores e os alvéolos contêm poucos ou nenhum microrganismo.

OROFARINGE

Cerca de 50% da microbiota da garganta é constituída por ESTREPTOCOCOS:

Streptococcus do grupo viridans (Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis,

Streptococcus mitis, Streptococcus mutans) e o Streptococcus pyogenes, Neisseria sp.

não patogênica ou patogênica, Haemophilus influenzae, Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus aureus, fusobactérias, lactobacilos, formas onduladas, etc.

MICROBIOTA NORMAL DA PELE

Staphylococcus epidermidis

Corynebacterium sp.

Pseudomonas aeruginosa

Micrococcus

Streptococcus do grupo viridans

Enterococcus

Staphylococcus aureus

Mycobacterium “não patogênico" (em regiões ricas

em secreções sebáceas)

71

“A cavidade bucal apresenta uma das mais concentradas e variadas populações

microbianas (29 espécies) e cuja localização principal está no dorso da língua, sulco

gengival e placa dentária. A contagem bacteriana em material da língua apresenta números

que variam de 43 milhões a 5,5 bilhões por ml de saliva. Do sulco gengival e da placa a

quantidade é pelo menos 100 vezes maior, aproximadamente 200 bilhões por grama. Os

estreptococos constituem o grupo mais numeroso, a metade das viáveis.” (Microbiologia

Oral, Burnet, Sherp, Schuster – 4a edição).

MUCOSA NASAL

A mucosa nasal é habitada por estreptococos e estafilococos, destes o mais

importante é o Staphylococcus aureus. O Staphylococcus aureus pode ser disseminado

causando doenças em hospitais: em enfermarias de recém-nascidos, de queimados, de

imunodeprimidos e dos submetidos à cirurgia.

TRATO GASTROINTESTINAL (TGI)

No estômago existem poucos microrganismos devido ao baixo pH. Em situações

patogênicas se encontra o Helicobacter pylori. O intestino delgado alberga pequeno número

de estreptococos, lactobacilos e Candida albicans. O cólon possui grande quantidade de

bactérias, cerca de 1011/g, aproximadamente 20% das fezes é constituído por bactérias, com

predominância de anaeróbios. As bactérias mais numerosas são: bacteróides, coliformes,

estreptococos, lactobacilos, clostrídeos, Pseudomonas, etc.

MICROBIOTA NORMAL DA MUCOSA NASAL

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aureus

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus do grupo viridans

Neisseria sp.

Haemophilus sp.

72

TRATO GÊNITO-URINÁRIO (TGU)

Microbiota vaginal: lactobacilos e menos freqüentemente Escherichia coli,

Enterobacter, Streptococcus agalactiae.

Bexiga: a urina na bexiga é estéril em pessoas sãs, mas ao passar pela porção final

da uretra, pode se contaminar com Staphylococcus epidermidis, coliformes, difteróides e

estreptococos não hemolíticos.

* Staphylococcus saprophyticus faz infecção em TGU inferior em mulheres jovens.

A área em torno da uretra masculina e feminina pode apresentar Mycobacterium

smegmatis (BAAR).

A candidíase torna-se uma das doenças que mais acomente mulheres em idade fértil

no mundo atual. A vagina é uma região favorável ao crescimento de microrganismos, como

a Candida albicans, o Thichomonas vaginalis e os bacilos de Doderlëin (gram positivos).

PRÁTICA

Evidenciação da presença de bactérias na pele e mucosa nasal.

O meio de cultura, usado para o isolamento primário em nossa aula prática, será o

Ágar-sangue em placas de Petri.

1o dia

Para coletar o material da pele do queixo, testa, aba do nariz e fossa nasal, usar

swab ou zaragatoa, atritando a área em estudo (individualmente em cada área). Em seguida

deslizar o swab em estrias na superfície do meio de cultura, ocupando toda a área da placa.

Mãos

Com um pincel, dividir o fundo da placa em 4 partes. Marcar as partes com letras

para identificar a área semeada:

S = sujo.

L = lavado.

E = escovado.

D = com degermante.

73

1. Com o dedo indicador (sem lavar) fazer estrias diretamente sobre o meio na parte

S.

2. Em seguida, lavar as mãos com sabão normalmente. Não enxugar. Com o

mesmo dedo fazer estrias na parte L.

3. Ensaboar as mãos e escovar os dedos. Enxaguar. Não enxugar e passar na

parte E.

4. A seguir passar um anti-séptico disponível. Enxaguar. Fazer estrias sobre a parte

D.

Colocar as placas semeadas na estufa a 37oC.

Representação esquemática da lavagem das mãos

Lavagem com água e sabão

Escovação

Degermante e água

Recolonização

Recolonização (após horas)

2o dia

1. Retirar as placas da estufa e observar o crescimento. Verificar a quantidade de

colônias em cada área. Anotar.

2. Estudar as características das colônias. Anotar.

3. Fazer bacterioscopia pelo método de Gram dos diferentes tipos de colônias.

Anotar. Na placa semeada com os dedos notar onde houver maior crescimento

de bactérias. Justificar.

4. Comparar com o resultado dos colegas e fazer um levantamento da bactéria

predominante.

74

5. Se houver crescimento de colônias com características de estafilococos, ou seja:

de 1 a 3 mm de diâmetro, brancas ou amarelas, opacas, brilhantes, convexas

altas, circulares, bordas lisas e superfície lisa, prosseguir com a caracterização

utilizando as provas de Identificação Presuntiva dos estafilococos de interesse

clínico.

3333oooo dia dia dia dia: : : : Identificação Presuntiva de Estafilococos da Pele e Mucosa Nasal

Sabemos que à microscopia simples, não conseguimos na maioria das vezes fazer o

diagnóstico da espécie da bactéria. No máximo descobrimos o gênero e muitas vezes só o tipo

bacteriano (ex: BGN).

No caso dos estafilococos, à microscopia, nós damos o diagnóstico de Staphylococcus sp.

Teremos que partir para as provas bioquímicas para diferenciar a espécie. Para ter certeza de

que estamos trabalhando com uma colônia de estafilococos da placa de ágar (sem fazer microscopia)

faremos a prova da catalase.

1ª PROVA: CATALASE

Os estafilococos têm a capacidade de degradar peróxido de hidrogênio, pois eles

produzem a enzima catalase.

H2O2 � H2O + ½ O2 (via catalase – processo enzimático)

A prova é simples: pingamos em uma lâmina em cima da colônia, água oxigenada a

3% (que contém H2O2 e água comum). Se borbulhar (liberar O2) é porque a colônia produz

catalase, algo que estreptococo NÃO faz.

Fonte: Google

75

Esta prova diferencia os estafilococos de outros cocos Gram positivos, como os

estreptococos.

CATALASE + � ESTAFILO

CATALASE - � ESTREPTO ou outro tipo de coco.

2ª PROVA: PLASMOCOAGULASE

Usaremos agora só as colônias CATALASE +, para seguirmos na identificação de

estafilococos. Em tubo de ensaio com plasma de coelho, mergulharemos as colônias das

amostras. Se ocorrer um precipitado "coagulado", dizemos que a prova é coagulase

positiva. Mas por que isso acontece?

O Staphylococcus aureus produz uma enzima chamada coagulase. Ela converte o

fibrinogênio em fibrina seguindo a cascata da coagulação, para fazer uma cápsula fibrosa

em torno das colônias no nosso organismo (ela usa fibrinogênio do plasma). Digamos que

seria uma colônia encapsulada, que estaria mais protegida contra as defesas do nosso

corpo e os antibióticos. Esses são os chamados abscessos. São galerias de bactérias e

exsudato, coleções de infecção e inflamação aguda, geralmente no tecido subcutâneo.

Fonte: Profa Alessandra Daur

Dentre o grupo dos estafilococos de interesse médico, quem a produz coagulase é

somente o S. aureus. Por isso precisamos saber se nossa colônia em questão produz

fibrina. Como no plasma de coelho também há fibrinogênio, a reação que ocorrerá é a

mesma. Portanto, basta semear a colônia no plasma de coelho e encubar à 37ºC. Depois de

24h veremos se há precipitado ou não.

76

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Quando se evidencia a presença de um abscesso em um paciente, que bactéria sempre devemos incluir no grupo de agentes etiológicos suspeitos?

Procedimentos

Num tubo estéril colocar:

� 0,5 mL de plasma sanguíneo diluído a 1/5.

� Coletar a colônia em estudo e emulsionar no plasma.

� Incubar em estufa a 37oC.

� Observar a formação de coágulo de ½ em ½ hora durante as primeiras 4 horas.

Se não houver formação de coágulo, deixar na estufa até 24 h para fazer a leitura.

Observação: algumas técnicas recomendam usar o plasma sem diluição. Neste caso o

coágulo formado é mais consistente.

Resultados

PLASMOCOAGULASE + � Staphylococcus aureus (DIAGNÓSTICO DEFINITIVO)

PLASMOCOAGULASE - � ENPC (Estafilococos não produtores de coagulase)

3ª PROVA: NOVOBIOCINA

É um antibiótico. Ele vai testar a sensibilidade dos ENPC para fazer a diferenciação

via halo de inibição. Semeia-se a colônia de ENPC em uma nova placa de ágar sangue e

coloca-se um disco de novobiocina no centro. Incuba-se. Se houver um halo de inibição (>

que 14mm), dizemos que a bactéria é sensível à novobiocina. Se não houver, ela é

resistente. Atualmente são conhecidas outras espécies de ENPC que também são

resistentes à novobiocina, mas não de interesse médico tão importante.

Resultados

RESISTENTE: Staphylococcus saprophyticus

SENSÍVEL: Staphylococcus epidermidis

77

Fonte: Google

RESUMO:

Catalase + � estafilo � Plasmocoagulase + � Staphylococcus aureus

Plasmocoagulase - � ENPC � Novobiocina S � S. epidermidis

R � S. saprophyticus

Catalase - � estrepto ou outro coco

PROVA DO MANITOL (ALTERNATIVA)

Semear o estafilococo em tubo (caldo) ou placa (ágar) com manitol e indicador de pH

vermelho de fenol. Colocar na estufa a 36oC. Após 24h fazer a leitura. A decomposição do

manitol acidifica o meio de cultura, produzindo a mudança da cor do indicador de vermelho

para amarelo.

• Cultura amarela = positiva.

• Cultura vermelha = negativa.

78

Para diferenciar as três principais espécies, pode se utilizar o seguinte esquema:

DIFERENCIAÇÃO DAS TRÊS ESPÉCIES DE Staphylococcus

Coagulase Manitol Novobiocina

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus saprophyticus

+

-

-

+

-

- (v)

Sensível

Sensível

Resistente

v = 11 a 89% positivos.

ÁGAR SANGUE

Meio diferencial e não selietivo (muito enriquecido, uma vez que possui proteínas e

outros substratos provenientes do sangue). A bactéria que crescer pode apresentar

hemólise do sangue ou não. No caso de hemólise total, vai haver destruição dos glóbulos

vermelhos aparecendo um halo claro ao redor das colônias.

Composição do ASA: gelose simples acrescida de 5 a 10% de sangue desfibrinado

de carneiro.

MEIO DE MANITOL-HIPERTÔNICO (CHAPMAN)

� Extrato de carne 1 g

� Peptona 10 g

� NaCl 75 g

� Manitol 10 g

� Ágar 15 g

� Vermelho de fenol 0,025 g

� Água 1000 mL

É um meio seletivo e diferencial.

Seletivo: pela concentração de 7,5% de NaCl permitindo o crescimento de poucas

bactérias, entre elas o estafilococo (os meios comuns contêm em geral 0,5% de NaCl).

79

CAPÍTULO 10CAPÍTULO 10CAPÍTULO 10CAPÍTULO 10:::: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ATRAVÉS

DO ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DOS AGENTES

ETIOLÓGICOS DAS INFECÇÕES

Neste capítulo abordaremos os possíveis tipos de microrganismos que podem ser

agentes etiológicos das mais diversas infecções. Para isto, dividiremos o conteúdo

didaticamente de acordo com os locais de acometimento mais comuns no ser humano.

PORÇÕES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS

Estafilococos, Estreptococos e Pseudomonas sp.

Objetivos

1) Familiarizar o aluno com as técnicas da coleta adequada do material patológico,

a fim de evitar contaminantes, facilitando o isolamento do agente efetivo da

infecção.

2) No futuro, como clínico solicitante do exame laboratorial, deverá orientar o

paciente quanto à maneira correta de coletar a amostra, de conservá-la e

transportá-la ao laboratório de análises.

“O médico deve dominar os conhecimentos que lhe permitam escolher e indicar a

realização de exames complementares específicos, relativos à hipótese

diagnóstica formulada a partir de dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais

inespecíficos. Cabe-lhe também orientar a colheita dos materiais adequados para

o exame e saber interpretar com rigor e segurança os resultados fornecidos pelo

laboratório.” (Dr. Paulo Kiyoshi e Dr. Luis Parellada Ruiz, Doenças

Transmissíveis, capítulo 10 – pág. 115).

3) Acompanhar a seqüência dos exames laboratoriais bacteriológicos necessários

na identificação do agente para fins de diagnóstico e tratamento.

80

Introdução

Algumas doenças bacterianas podem ser diagnosticadas presuntivamente, lançando

mão de dados epidemiológicos e clínicos (como sinais e sintomas típicos ou

patognomônicos) que podem por si só, algumas vezes, fazer o diagnóstico sem necessitar

do exame microbiológico. Exemplos disso são: o tétano, a difteria, a coqueluche, a amidalite

purulenta bacteriana, escarlatina e furunculose. No entanto, existe um número grande de

doenças que necessitam exames laboratoriais para confirmar a suspeita clínica.

As infecções são causadas por diversas bactérias. As mais comuns são

estafilococos e estreptococos, bactérias cuja ação promove a formação de exsudato ou

derrame inflamatório que contém grandes quantidades de componentes celulares do

hospedeiro. Esse exsudato é descrito como purulento. No processo patológico

desenvolvido, identificado como infecção bacteriana piogênica, o tipo celular

predominante de células é NEUTRÓFILO (devido a liberação de quimiocinas, IL-1 e TNF

pelos macrófagos, ativando as integrinas dos neutrófilos circulantes, características da

inflamação aguda). Além do Staphylococcus aureus e do Streptococcus pyogenes, as outras

bactérias mais freqüentemente encontradas nas infecções são: Enterococcus sp.,

Pseudomonas e Enterobactérias (Escherichia coli, Enterobacter, Proteus).

Como já referido acima, o quadro clínico de determinadas infecções, como as

piodermites causadas por estafilococos, não necessitam habitualmente de confirmação por

exames laboratoriais. O exame laboratorial, no entanto, é indispensável quando houver

necessidade da avaliação da resistência do estafilococo aos antimicrobianos.

Fonte: Robbins, 2005

81

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Há dois tipos de secreções patológicas: o exsudato e o transudato. Pus é sinônimo de exsudato purulento. Ambos são secreções liberadas como resposta pelo nosso organismo. Exsudato: cor opaca, muitas proteínas, muitos leucócitos, muita desidrogenase lática (LDH, uma enzima que converte o lactato em piruvato e vice versa, além de ser uma enzima gluconeogênica). Uma característica muito importante é a presença de POUCA GLUCOSE. Uma vez que há presença de bactérias, a glucose estará diminuída. Ela é o principal carboidrato utilizado no metabolismo bacteriano, e uma das enzimas que participa desse processo é a LDH. Os leucócitos presentes estão promovendo uma resposta imunológica imediata frente aos microrganismos. O principal deles nesse caso é o neutrófilo, que é a primeira linha de defesa do organismo e vem da fase de rolamento sobre o endotélio capilar, como será detalhado na disciplina de Patologia Médica Molecular (BP334). Para caracterizar um exsudato tem que haver mais de 3g/dL de proteína, mais de 103 leucócitos/µL, mais de 200UI de LDH e menos de 45mg/dL de glucose. Transudato: geralmente são líquidos cavitários (pleural, peritoneal, pericárdico, ascítico, líquor), de característica transparente, poucas proteínas, poucas células, pouca LDH e TAXAS NORMAIS DE GLUCOSE. Isso se deve à ausência de bactérias nesse líquido. Ocorre em abdome ascítico (hepatopata), derrame pericárdico, pleural, edema agudo de pulmão e por aí vai. Eles vêm geralmente devido a uma obstrução no fluxo venoso. Quando há um líquido suspeito, vindo de uma cirurgia, de uma punção pleural, de cavidades diversas, para caracterizar se o líquido é um exsudato ou um transudato o exame que é feito no Brasil é a CULTURA (nos mais diferentes meios sólidos e líquidos), para pesquisar se há presença de microrganismos. Os exames bioquímicos como glucose e LDH são utilizados em secreções mais “nobres”, como o líquor (para caracterizar uma meningite, por exemplo). Além da microbiologia, os líquidos de cavidades devem ser encaminhados à Anatomia Patológica para averiguar a presença de células neoplásicas por exame de citologia oncótica (o líquido pode ter se acumulado devido a uma metástase).

Coleta do material

A coleta correta do material é a etapa mais importante para o estudo do agente

etiológico e deve ser precedida dos seguintes cuidados:

a) Uma quantidade insuficiente de material dificulta os procedimentos laboratoriais,

prejudicando a identificação.

b) O isolamento de contaminante pode levar a uma terapia incorreta, ou mesmo

prejudicial, porque ele pode apresentar um padrão diferente de sensibilidade aos

antimicrobianos do que o agente efetivo da infecção.

c) A coleta deve ser feita antes da antibioticoterapia.

Nas infecções, a coleta varia com a forma clínica e a localização do processo, que

pode ser superficial ou profundo.

82

Em localização profunda estão a osteomielite, meningite, sinusite, promiosite,

infecções nas articulações e outras coleções fechadas de pus.

Nestes recorre-se à punção aspirativa do exsudato purulento com seringa e agulha

estéreis. O local da punção deve ser rigorosamente descontaminado com sabão cirúrgico ou

outro anti-séptico adequado.

Nas endocardites e septicemia coleta-se o sangue para hemocultura.

Lesões superficiais

As infecções de pele geralmente causadas pelos estafilococos são: a foliculite, a

furunculose e o impetigo. A foliculite é uma pústula mais superficial (em “cabeça de prego”),

de característica purulenta, que acomete o folículo piloso. A furunculose é uma infecção

mais profunda na derme, envolvendo o folículo piloso, que muitas vezes adquire a

característica nodular com muita hiperemia ativa (pústula interna). O estafilococo

estabelece-se em um folículo piloso, produzindo necrose tecidual com acúmulo de células

inflamatórias. A bactéria elabora a enzima coagulase que forma coágulo (fibrina) em torno

da lesão e dentro dos linfáticos, resultando numa parede que delimita o processo. No centro

da lesão ocorre liquefação do tecido necrótico e o abscesso “aponta” na direção de menor

resistência. A parede de fibrina evita a propagação dos estafilococos e não deve ser

rompida por manipulação ou trauma, sob o risco de disseminar a infecção (por analogia,

evitar espremer “espinha”).

Se por um lado a parede de fibrina evita a disseminação do estafilococo, por outro

lado dificulta o acesso de antibióticos e elementos sanguíneos de defesa.

Observação: uma vez drenado o pus, a lesão cicatriza rapidamente.

Coleta em lesões superficiais

Nas formas superficiais, tais como furúnculo (ou outras piodermites: impetigo, ectima,

etc.) segue-se o seguinte esquema, observando rigorosa assepsia:

1) Descontaminar a superfície do abscesso com o auxílio de uma gaze estéril,

embebida em anti-séptico ou salina estéril.

2) Secar com gaze estéril.

3) Com um objeto perfurocortante (agulha, lanceta, etc., estéreis) levantar a afastar

a película ou crosta superficial.

83

4) Coletar o material purulento da profundidade da lesão com swab (ou aspirar com

seringa) tendo o cuidado de não tocar as bordas da pele adjacente.

Observação: em caso de lesões abertas, remover a secreção superficial com gaze

estéril com salina, para eliminar os contaminantes.

Exame laboratorial

O material enviado ao laboratório será submetido aos seguintes procedimentos:

1) Bacterioscopia.

2) Cultivo.

3) Identificação.

4) Teste de Sensibilidade aos Antibióticos (TSA).

Observação: o médico deve comunicar ao laboratório através da requisição dos

exames, se suspeita de microrganismos menos freqüentes, que exijam técnicas próprias de

microscopia e cultivo.

Bacterioscopia

Rotineiramente a bacterioscopia é feita pelo método de Gram (triagem), revelando a

presença, o tipo morfológico e propriedade tintorial da bactéria.

Cultivo

Na nossa aula prática o cultivo é feito em dois meios e visando apenas as bactérias

aeróbias e anaeróbias facultativas.

1) Ágar-sangue.

2) Teague (EMB) ou MacConkey.

Onde vamos cercar as possibilidades de isolar estafilococo, estreptococo e qualquer

bacilo Gram negativo pouco exigente (Pseudomonas, enterobactérias) ou exigente como o

Haemophilus.

No Ágar-sangue: Vão crescer estafilococos, estreptococos e bacilos (exigentes e

não exigentes).

No Teague/MacConkey: Vão crescer bacilos Gram negativos (BGN) pouco

exigentes.

84

Procedimentos

Meios de cultivo Dia

Teague ou MacConkey Ágar-sangue

1o dia Semear por estrias na superfície do

meio. Semear por estrias na superfície do meio.

2o dia

1. Fazer Gram

2. Repicar para gelose inclinada,

em tubos separados as L+ e L-

3. Incubar a 35oC ± 1oC.

1. Fazer Gram.

2. Fazer catalase.

a) Se a catalase por positiva, repicar para

tubo contendo plasma de coelho. Incubar

a 35oC ± 1oC.

b) Se a catalase for negativa, proceder a

identificação para estreptococos, segundo

o tipo de hemólise observada.

3o dia Semear em diversos meios para

provas bioquímicas.

a) Interpretar a coagulase. Se negativa,

prosseguir a identificação de outras

espécies de estafilococos.

b) Realizar provas de identificação para

estreptococos.

4o dia

Interpretar as provas bioquímicas e

consultar tabelas para identificação

do bacilo Gram negativo (BGN).

Interpretar provas adicionais para ENPC.

Pseudomonas sp. (Bacilo Piociânico)

É freqüente o encontro de Pseudomonas sp. em infecções. Cerca de 70% destas

são produzidas por Pseudomonas aeruginosa. As espécies (mais de 100) são diferenciadas

por provas bioquímicas (pois é um bacilo gram negativo que não se diferencia dos demais

BGNs à microscopia simples).

A característica marcante da Pseudomonas aeruginosa (88% delas) é a produção de

pigmento azul-esverdeado, chamado piocianina, deixando os meios de cultura claros e o

pus com esta coloração. A cultura geralmente apresenta odor perfumado de essência barata

de uva (trimetilamina). Em geral, o odor do material infectado é muito fétido e ruim.

85

A Pseudomonas aeruginosa é ubiquitária: cresce em solo, água, vegetais e,

obviamente, em tecidos orgânicos. O homem alberga na pele, garganta (5% de pessoas

normais) e fezes. Ela é tão pouco exigente que cresce até em água mineral.

É uma bactéria oportunista, podendo causar várias doenças. São freqüentes as

infecções em queimaduras e feridas cirúrgicas. Faz uma lesão em pele chamada de ectima

gangrenosa (de odor muito fétido). Após procedimentos com cateteres urinários, punções

lombares, cirurgias oculares, cardíacas, etc. Pode causar infecções graves, especialmente e

em pessoas hospitalizadas, onde a mortalidade pode chegar a 50%. Imunocomprometidos

também são alvos preferenciais.

Entre os fatores de virulência destaca-se a toxina A, que bloqueia a síntese protéica

das células do hospedeiro (à semelhança da exotoxina do bacilo diftérico).

Nas infecções por Pseudomonas, o clínico sempre pede antibiograma, visto que ela

apresenta resistência a muitos antibióticos, tais como: vários betalactâmicos, cloranfenicol e

tetraciclinas.

É sensível apenas à polimixina, gentamicina, amicacina e algumas penicilinas semi-

sintéticas (carbenicilina). Com exceção da polimixina, a bactéria pode adquirir resistência

aos antimicrobianos citados por mutação ou aquisição de plasmídios de resistência.

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Na clínica médica de rotina, é um agente que sempre deve ser considerado em

infecções intestinais e do trato gênito urinário feminino, além de feridas cirúrgicas. A droga de escolha mais adequada é o ciprofloxacino, uma fluoroquinolona de 2ª

geração. Este fármaco é citado muitas vezes como quinolona anti-pseudomonas pelos livros de clínica médica como “Harrison, Tratado de Medicina Interna 2006”, bem como nas publicações mais atuais. Pode ser utilizado, inclusive, em pneumonias causadas por Pseudomonas aeruginosa (pós confirmação bacterioscópica), de acordo com os critérios adotados pelas disciplinas clínicas de Pneumologia e Otorrinolaringologia do ciclo profissionalizante do curso de Medicina. * Ciprofloxacino NUNCA é medicamento de primeira escolha (terapia empírica) para pneumonias, uma vez que é uma droga pouco eficaz contra germes gram positivos como pneumococo (o agente etiológico mais comum das pneumonias bacterianas). Fluoroquinolonas de 3ª geração em diante (levofloxacino, moxifloxacino e gemifloxacino) são drogas mais apropriadas para infecções pulmonares.

Identificação dos Bacilos Não Fermentadores – BÑF

86

Pacientes imunodeprimidos são muito suscetíveis à infecção por este grupo de

bactérias. O isolamento de bacilo não fermentador de sítios anatômicos originalmente

estéreis é forte indicador de ser este o responsável pela infecção.

Nos casos de locais não estéreis, como secreção de ferida cirúrgica, pode ser

apenas contaminante e não o causador da infecção.

Os BÑF podem ser isolados de infecções urinárias, secreções de ferimentos e

hemoculturas.

Entre as bactérias não fermentadoras mais freqüentemente isoladas das infecções

estão:

• Pseudomonas aeruginosa 70-75%

• Acinetobacter baumanii 25%

• Outras Pseudomonas 5%

As Pseudomonas utilizam os carboidratos por via oxidativa. Para verificar este tipo

de metabolismo usa-se meios de cultura especiais. Hugh e Leifson foram os primeiros a

idealizar um meio de cultivo que chamaram de Oxidação-Fermentação (O-F).

O meio de O-F de Hugh e Leifson contém 0,2% de peptona para 1% do carboidrato

testado, diferente da relação 2:1 dos meios usuais para fermentação.

A acidez produzida pelas bactérias oxidativas é muito pequena e não deve ser

neutralizada pelos produtos de decomposição da peptona, razão da proporção 0,2% da

peptona para 1% do carboidrato.

A prova é realizada em dois tubos para cada açúcar: um com óleo mineral e outro

sem óleo na superfície.

Os bacilos oxidativos produzem ácido somente no meio exposto ao ar.

Os bacilos fermentadores produzem ácido em ambos os tubos.

Os bacilos não sacarolíticos não produzem alteração em nenhum dos tubos.

Exemplo: Pseudomonas = metabolismo oxidativo

Alcalígenes = não sacarolítico

Para maiores detalhes da identificação dos bacilos oxidativos consultar: Diagnóstico Microbiológico, de Konemann

e colaboradores.

Meios de cultura usados nesta aula prática

Ágar sangue: Ver página 78

87

Teague (EMB / HHT / TEA)

Também chamado de Holt-Harris-Teague (HHT) ou ágar eosina-azul de metileno =

EMB (“Eosin Methilene Blue”). Alguns autores descrevem pequenas diferenças entre a

composição do EMB e do TEA. No entanto, a finalidade desses meios no laboratório é a

mesma.

Composição:

Ágar simples 100 mL

Lactose 10 mL

Solução de eosina 2% 2 mL

Solução de azul de metileno 0,5% 2 mL

É um meio seletivo-diferencial para Bacilos Gram negativos (BGN) não exigentes.

Seletivo: pelos corantes que inibem o crescimento da maior parte das bactérias

Gram positivas.

Diferencial: pela decomposição ou não da lactose evidenciada pela cor das colônias

(os corantes funcionam como identificadores de pH).

LACTOSE POSITIVA (L+)

Os fermentadores de Lactose.

Colônias:

1) Cor vermelha opaca;

2) Cor vermelha com ponto central preto;

3) Secas com brilho metálico.

Observação: podem crescer colônias intermediárias destes tipos.

LACTOSE NEGATIVA (L-)

Os não fermentadores de Lactose.

Colônias:

� Vermelhas claras transparentes.

88

Observação: embora existam muitos meios de cultura seletivos e diferenciais para

enterobactérias e mesmo havendo diferenças quanto à capacidade de inibição de bactérias

indesejáveis, os bacteriologistas dão preferência àqueles que lhes oferecem dados mais

visíveis. Por exemplo, o brilho metálico das colônias no Teague, ajuda na identificação da

Escherichia coli, apesar de não lhe ser específico.

OROFARINGE

Estreptococos, Haemophilus, Moraxella e Corynebacterium

A microbiota da orofaringe é constituída principalmente por ESTREPTOCOCOS

(50% da população total bacteriana). Exemplos são os estreptococos do grupo viridante

(Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis), Streptococcus

pneumoniae (PNEUMOCOCO), Streptococcus pyogenes, Neisseria sp., Haemophilus sp.,

Staphylococcus epidermidis, bacilos pseudodiftéricos (Corynebacterium

pseudodiphetheriticum ou Corynebacterium hofmanni) e outros.

Com isto chamando-se a atenção para dificuldade de isolamento do agente real da

infecção da orofaringe como, por exemplo, pelo estreptococo e bacilo diftérico.

Faringite Estreptocóccica

Quase 70% das dores de garganta agudas são causadas por vírus. A dor é devido à

infecção demasiada da mucosa ou da própria resposta inflamatória do organismo. Os

principais vírus que podem causar faringites são os adenovírus (tipos 3, 4, 7, 14 e 21),

rinovírus, coronavírus, influenza, parainfluenza, citomagalovírus (CMV), Esptain-Barr (EBV),

Herpes vírus tipo 1 e coxsackie A.

As infecções virais serão vistas mais adiante. Neste capítulo, abordaremos as

faringoamigdalites (faringites e tonsilites são os termos mais apropriados pela nômina

anatômica atual) bacterianas.

A infecção mais freqüente do trato respiratório superior manifesta-se sob a forma de

faringite e tonsilite (amigdalite) causada por Streptococcus pyogenes (ESTREPTOCOCO

BETA HEMOLÍTICO DO GRUPO A DE LANCEFIELD) = angina estreptocócica (90%). É

uma infecção que requer atenção especial, visto que, além de disseminar-se a outros locais

causando sinusite, otite, mastoidite e vias aéreas inferiores provocando broncopneumonias,

89

pneumonias e empiema (pus no espaço pleural), ainda pode provocar seqüelas graves pós-

estreptocócicas como Febre Reumática e Glomerulonefrite Aguda (GNA).

As características clínicas são semelhantes ao Haemophilus e à Moraxella. Nas

tonsilas palatinas existem as criptas amigdalianas, que são invaginações da mucosa,

aumentando a superfície da tonsila, promovendo uma maior exposição de epítopos aos

nódulos linfáticos confuentes que existem subjacentes à mucosa. Nessas criptas não há

drenagem de ductos das glândulas salivares menores, portanto ali o acúmulo de material é

facilitado. Durante uma tonsilite, além da presença de febre na maioria dos casos, acumula-

se exsudato purulento nessas regiões, dando o aspecto de placas amarelo-esbranquiçadas

sobre as tonsilas. Essas placas são facilmente removidas com swab e esse é o material que

se utiliza para fazer semeadura em ágar sangue.

Fonte: Rubin, 2006

90

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Streptococcus pyogenes, “um mal que deve ser cortado pela raiz”

Na parte externa da parede celular de algumas cepas da espécie do estreptococo beta hemolítico, há uma proteína chamada de proteína M (uma proteína que inclusive, degrada o fator C3b e não deixa a cascata do sistema complemento agir). O sistema imunológico acaba por dar cabo da bactéria produzindo anticorpos contra essa proteína. Porém, essa proteína é muito parecida com proteínas do organismo humano, que estão principalmente na membrana basal do glomérulo renal, nas válvulas cardíacas, etc. Uma vez desenvolvidos anticorpos pelos linfócitos B contra essas proteínas dos estreptococos, o organismo entra em uma operação de auto-ataque, destruindo nossas próprias células e membranas (complexos imunes), causando cardiopatia reumática e glomerulonefrite pós-estreptocóccica, por exemplo. Muitas vezes o paciente necessita de prótese valvar (tamanho é o estrago) nos casos de valvulopatia severa e transplante renal nos casos mais intensos de glomerulonefrite não tratada. Os aspectos morfológicos destas lesões serão abordados com detalhes na disciplina de Anatomia Patológica (MP313).

A esse fenômeno pós-estreptocóccico dá-se o nome de febre reumática (cepas que produzem estreptolisina O). Por isso é importante sempre tratar as faringoamigdalites com antibióticos mesmo dos casos mais brandos e silenciosos, antes do desenvolvimento destes anticorpos. Até porque nunca se sabe ao certo qual a espécie de bactéria envolvida na infecção, quanto mais a cepa (se é resistente ou não). Enfim, as manifestações pós estreptocóccicas de uma infecção mal tratada fazem parte de uma doença reumática, imunológica, que ataca, depois de um tempo, tecidos sadios com complexos imunes (reação de hipersensibilidade tipo III). Esse assunto será abordado com detalhes em seminários promovidos pela disciplina de Imunologia Médica Aplicada (BP333).

Além disso, o Streptococcus pyogenes tem uma enzima chamada peptidade do C5a, que degrada o C5a, impedindo um via do sistema complemento, e por conseqüência a quimiotaxia de neutrófilos. Também produz hialuronidase, uma enzima que destrói o hialuronato do tecido conjuntivo e contribui para uma permeabilidade mais fácil nos tecidos sadios. Para diagnóstico de febre reumática, usam-se os critérios de Jones, como visto nas aulas teóricas desta disciplina. Para a terapia antimicrobiana, o antibiótico de escolha é a amoxicilina. Pode ser administrada sozinha ou associada a um bloqueador de β-lactamases, uma vez que várias espécies da microbiota normal produzem tais enzimas. Além disso, o quadro clínico se assemelha a infecções por Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis, microrganismos potencialmente produtores dessas pelicilinases. Streptococcus pyogenes e as infecções hospitalares Além de ser um potente causador de infecções do trato respiratório, o estreptococo beta hemolítico ainda pode desencadear infecções hospitalares severas, de difícil controle que muitas vezes levam o paciente inevitavelmente ao óbito. Um exemplo disso é a Fasciite Necrotizante. Uma doença maligna que pode ocorrer em feridas cirúrgicas. É conhecida como “doença da bactéria carnívora”, pois o paciente relata muitas vezes que sente que está sendo “comido vivo”. E o quadro clínico comprova isso, com muitas áreas infectadas, necroses extensas, tecidos putrefados e exsudato intenso. A taxa de letalidade é relativamente alta, uma vez que a carga bacteriana já está tão elevada que os antibióticos, mesmo os de maior eficácia, não conseguem eliminar a infecção. Além disso, os tecidos necrosados produzem muitas toxinas pelo

91

metabolismo desorganizado, e quando esse material atinge o sangue pode gerar estragos bem maiores.

Os microrganismos mais comuns além do S. pyogenes são o Haemophilus

influenzae e a Moraxella catarrhalis.

O Haemophilus influenzae é um coco-bacilo gram negativo. “Haemophilus” significa

“Gosta de sangue” e o nome “influenzae” foi dado porque originalmente se pensava que

causasse gripe, mas agora se sabe que é um invasor secundário do trato respiratório. Há

seis sorotipos (a-f), distinguíveis sorologicamente pela cápsula polissacarídica, ou por PCR.

O meio de cultura mais adequado é o ágar chocolate em microaerofilia (alta

sensibilidade). No entanto, o meio específico para o hemófilos é o ágar Mueller-Hinton (alta

especifidade). O meio de Hitchens-Pike também pode ser utilizado.

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

As cepas não encapsuladas do Haemophilus influenzae geralmente fazem parte da

microbiota normal da orofaringe. O tipo b (encapsulado) é muito menos comum em microbiota normal e é o principal sorogrupo causador de infecções. Acomete muito as crianças, principalmente lactentes e pré-escolares. Crianças até 2-3 anos de idade não são capazes de fabricar tais anticorpos, pois essa resposta depende de alguns linfócitos T que o timo ainda não foi capaz de fabricar. Além de faringites e tonsilites, o H. influenzae é um potente causador de pneumonias (2º agente mais comum), sinusites, otites, artrite séptica, bronquites, meningite (em casos mais severos quando há bacteremia), além de ser o principal agente etiológico da epiglotite. Há vacina e é eficaz, ministrada obrigatoriamente pelo calendário de vacianação brasileiro em três doses, aos 2, 4 e 6 meses de idade.

Sempre suspeitar de infecção por H. influenzae em crianças com sinais clínicos. 15 a 20% das cepas patogênicas do Haemophilus influenzae produzem β-lactamases, portanto a terapia sem bloqueador dessas enzimas pode ser ineficaz.

A Moraxella catarrhalis (originalmente denominada Branhamella catarrhalis) hoje é

considerada uma causa crescente de faringites e pneumonias, sobretudo em pacientes com

carcinoma de pulmão ou doença pulmonar de base. Não se sabe ao certo o porquê, mas

epidemiologicamente, os pacientes mais acometidos por essa espécie são usuários crônicos

de álcool. São diplococos gram negativos (às vezes chamadas de cocos ovais), oxidase

positiva e catalase positiva. Apresentam bom crescimento em ágar sangue e ágar chocolate.

Há um meio com alta especificidade, o ágar DNase (azul de toluidina).

92

Outros tipos de Faringites

Angina de Vicent (Angina de Plaut-Vincent)

Outra infecção na forma de tonsilite úlcero-membranosa é a chamada Angina de

Plaut-Vincent. É causada pela associação fusoespirilar (Treponema vincentii e

Fusobacterium nucleatum).

O quadro clínico, diferente das demais bactérias, sugere muito a origem etiológica da

infecção. As tonsilas palatinas e os pilares faríngeos adquirem úlceras em forma de

verdadeiros “buracos”.

Difteria Faríngea

A difteria que se caracteriza por inflamação da garganta (angina diftérica) onde as

tonsilas palatinas, os pilares anteriores e a úvula se recobrem com exsudato

pseudomembranoso. É uma infecção muito grave, mais comum entre o primeiro e o sétimo

ano de vida, causada por cepas do Corynebacterium diphteriae (também chamado de bacilo

diftérico ou bacilo de Klebs-Loeffler). Esta bactéria produz uma endotoxina (responsável

pelos fenômenos locais da doença) e uma exotoxina (extracelular) que se introduzir na

corrente circulatória provocando febre (baixa), pulso rápido, palidez e adinamia (falta de

disposição). Pode causar obstrução respiratória fatal (crupe), quando atinge a traquéia

(tosse estridante), com roquidão e voz velada.

A principal diferença para uma faringoamigdalite comum é o aspecto de falsa

membrana que recobre as tonsilas, diferente das infecções estreptocóccicas onde há placas

purulentas nas criptas. Essa pseudomembrana não é facilmente removida com swab. O

diagnóstico é confirmado pelo exame bacterioscópico direto e pela cultura dos exsudatos

faríngeos, ou até mesmo um fragmento da pseudomembrana.

Além da faringe, o bacilo diftérico pode colonizar a laringe, as fossas nasais, ouvidos

e, ocasionalmente, o trato genital e a pele.

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Identificação Presuntiva dos Estreptococos

Classificação

A classificação para um estudo preliminar dos estreptococos baseia-se no

crescimento (comportamento) em placa ágar-sangue, onde se diferenciam em quatro tipos,

segundo a hemólise que produzem. É a classificação de Schottmüller-Brown. Ou seja, pelo

PADRÃO DE HEMÓLISE EM ÁGAR SANGUE.

1) Tipo α (alfa) � produz em torno das colônias um halo verde de hemólise

parcial (transformação da hemoglobina em substância semelhante à biliverdina).

Produzida por estreptococos conhecidos como do grupo viridans.

2) Tipo β (beta) � produz um halo de hemólise total.

3) Tipo α1 (alfa-primo) � intermediário entre os precedentes, de difícil observação.

4) Tipo γ (gama) � ou inerte que não altera o sangue (espécies não hemolíticas).

Fonte: Profª Alessandra Daur

Ao isolar cocos Gram positivos da lesão, deve-se fazer a prova da catalase (que

deve ser negativa) para o início da caracterização do estreptococo.

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Prova de Optoquina

Aplica-se para as colônias alfa hemolíticas. Se sensível, o diagnóstico é de

Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Se resistente, devem-se fazer todos os testes

para gama hemólise.

Semear a bactéria em ágar-sangue e colocar um disco de optoquina. Incubar 24h em

tensão de CO2. A bactéria é sensível se apresentar um halo de inibição ≥ 14 mm.

Fonte: Profa Alessandra Daur

Prova de Bacitracina

Ela diferencia as colônias beta hemolíticas em grupo A e B de Lancefield. Se for

sensível, o diagnóstico é de Streptococcus pyogenes. Se for resistente, há necessidade de

se fazer a prova de Camp Test.

Semear a bactéria em ágar-sangue e colocar o disco de bacitracina (0,04 µg).

Incubar 24h a 35oC. A presença de halo de inibição de qualquer tamanho, indica

sensibilidade. (para auxílio no diagnóstico dos estreptococos β-hemolítico pode se utilizar

disco de Sulfametoxazol-trimetropim).

Fonte: Profª Alessandra Daur

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Prova de Camp-Test (C-T)

Em linha, uma amostra semeada de Staphylococcus aureus também beta hemolítico.

Semear linhas perpendiculares à linha de S. aureus, porém sem contato físico de uma linha

com a outra. Se ocorrer hemólise intensificada em forma de flecha (hemólise intensificada),

diagnostica-se Streptococcus agalactiae.

A atividade hemolítica do estafilococo é intensificada pelo fator extracelular do

estreptococo do grupo B, denominado fator Camp. A zona de intensificação da lise assume

forma semelhante à ponta de flecha, na intersecção das duas estrias.

Fonte: Profª Alessandra Daur

Prova de tolerância ao sal (MTS)

� Para Gama hemólise fazer prova de tolerância ao sal.

Se positivo � Enterococcus sp.

Se negativa, fazer a prova da Bile-escurina.

Semear a bactéria em caldo MTS (NaCl 6,5%). Incubar 24h a 35oC. a turvação do

meio e/ou a viragem do indicador de pH para amarelo indica positividade à prova (tolerância

do microrganismo à alta concentração de NaCl 6,5%).

Prova de Bile-esculina (Besc)

Cultivar a bactéria na superfície do �gar e incubar 24h a 35oC. Microrganismos Besc

positivos crescem em presença de 40% de bile e hidrolisam a esculina, formando um

precipitado negro em 2/3 ou mais do ágar inoculado.

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Bile esculina + � Estreptococos do grupo D

Bile esculina - � Estreptococos do grupo Viridans

CLASSIFICAÇÃO DE LANCEFIELD (Muito importante)

A classificação de Lancefield é baseada nas características antigênicas de um

polissacarídeo, carboidrato C, localizado na parede celular. Nesta classificação os

estreptococos são designados pelas letras maiúsculas do alfabeto: de A a V.

O Streptococcus pyogenes é do grupo A. Produz β hemólise.

O Streptococcus agalactiae é do grupo B. Produz β hemólise.

Pesquisa do estreptococo

Cuidados na Coleta

1. Cuidar para que as paredes laterais da boca, língua e gengivas não sejam

tocadas, com isto evitando a contaminação pela microbiota normal. Por exemplo,

pelos estreptococos enverdescentes e ENPC. Em culturas da orofaringe o

resultado positivo para estas bactérias não deve ser valorizado. Neste sentido, foi

dada ênfase especial no capítulo que trata da microbiota normal do corpo

humano, para não haver dificuldade na interpretação do exame bacteriológico

enviado pelo laboratório.

2. Coletar as amostras antes da antibioticoterapia, evitando os resultados falso-

negativos.

3. Caso haja demora entre a coleta do material e o seu processamento no

laboratório, é indicada a utilização de um meio de cultura de transporte, como por

exemplo, o meio de Stuart.

4. Para facilitar o isolamento de Streptococcus pyogenes, usar meio de

enriquecimento, como por exemplo, o meio de Hitchens-Pike.

(A descrição destes dois meios encontra-se no final deste capítulo).

97

Coleta do material da garganta

Orientar o paciente a abrir a boca e falar um “aaaa” demorado que abre a garganta e

ergue a úvula. Pressionar para imobilizar a língua com um abaixador de língua e com auxílio

de um swab (zaragatoa), deslizar em movimentos suaves na faringe posterior, tonsilas ou

fossa tonsilar, tocando os pontos de pus ou placas (alguns recomendam removê-las e

coletar material que estava por baixo delas).

Na falta destas lesões, passar o swab nas partes hiperemiadas.

Exames

Do material obtido procede-se ao exame:

1) Bacterioscópico (pelo Gram);

2) Cultivo em meios enriquecidos como ágar-sangue. O estreptococo não cresce

em meios simples.

Bacterioscopia

Na bacterioscopia pelo Gram, observar a morfologia celular, grupamento típico e a

Gram positividade.

Cultivo

1o dia

O cultivo é feito em ágar-sangue semeando com o swab numa pequena área da

placa (1/5). Em seguida, com o auxílio de alça metálica, tocar a área semeada com swab e

puxar várias estrias. Desta maneira consegue-se melhor isolamento.

Semeadura com swab

Stabs

98

Ainda com a alça, fazer cortes curtos e profundos, os “stabs”, num ângulo

aproximado de 40o para introduzir os estreptococos abaixo da superfície do meio de cultura

e evidenciar a hemólise pela estreptolisina O que é oxigênio instável. Nos cortes cria-se

atmosfera de relativa anaerobiose.

Observações a respeito da hemólise

O estreptococo produz duas hemolisinas:

1) Estreptolisina O = oxigênio sensível;

2) Estreptolisina S = oxigênio estável.

Cerca de 2% do Streptococcus pyogenes produz apenas a estreptolisina O. Para

surpreender estas linhagens faz-se os stabs para obter hemólise em anaerobiose, pois em

aerobiose não produzem hemólise, perdendo-se um diagnóstico importante para

Streptococcus pyogenes.

2o dia

No segundo dia, observar o crescimento no ágar-sangue. O estreptococo cresce

dando colônias pequenas, puntiformes, delimitadas, bordas lisas. Observar a hemólise:

• Fazer Gram das colônias β hemolíticas.

• Semear a colônia β hemolítica para o teste da Bacitracina.

Técnica e recomendações:

1. Testar apenas amostras β hemolíticas, visto que, alguns estreptococos alfa-

hemolíticos são também sensíveis a 0,04 µg.

2. Se o laboratório usar apenas o teste da Bacitracina para identificar o

Streptococcus pyogenes, isto deve constar no laudo enviado ao médico:

“Streptococcus beta-hemolítico do grupo A, pelo teste da bacitracina”.

Portanto, a sensibilidade à Bacitracina não é um diagnóstico definitivo do

Streptococcus pyogenes. Teste definitivo é a aglutinação com o soro

específico anticarboidrato C, numa reação Ag-Ac.

99

3o dia

Observar a sensibilidade à Bacitracina. Qualquer halo de inibição dá positividade.

Cerca de 85% de Streptococcus pyogenes são sensíveis a 0,04 µg de bacitracina.

Microbiologia Trabulsi – 2a edição. Pág. 115. Dr. Luiz Rachid Trabulsi, Prof. Titular

de Microbiologia da Escola Paulista de Medicina – São Paulo.

“É de importância fundamental que tanto o bacteriologista como o clínico

compreenda o pouco valor da identificação dos estreptococos, somente pela atividade

hemolítica. Está bem demonstrado que os estreptococos beta-hemolíticos (além do Grupo

A) podem ser isolados, com freqüência, da garganta, particularmente os dos grupos C, B e

G. Conforme é sabido, as infecções por estes estreptococos não são seguidas de febre

reumática e glomerulonefrite, não requerendo assim os cuidados terapêuticos exigidos pelas

infecções provocadas pelo Streptococcus pyogenes”.

“Outro aspecto importante do diagnóstico, refere-se ao fato de que 10 a 20% dos

indivíduos normais podem albergar Streptococcus pyogenes na garganta. Por esta razão, o

isolamento de uma amostra de Streptococcus pyogenes de um paciente com faringite, poder

ser mera coincidência. A responsabilidade do germe pelo processo infeccioso terá que ser

determinada tendo-se em conta as manifestações clínicas do paciente e de maneira mais

segura, pela pesquisa de anticorpos séricos 2 a 3 semanas após o início da doença.”

Observação: outros patógenos serão pesquisados, quando requisitado por médico,

por exemplo: Neisseria gonorrhoeae, em faringites em pacientes que praticam sexo oral

sem preservativo, Haemophilus influenzae em laringites, etc.

Angina de Plaut-Vincent

Esta angina pode ser diagnosticada com segurança pelo exame bacterioscópico.

O exame bacterioscópico é feito pelo método de Gram ou Giemsa, revelando a

presença de bacilos fusiformes e espiroquetas (associação fusoespirilar) que são o

Fusobacterium nucleatum (fusiformes) e o Treponema vincentii, ambos Gram negativos.

Fusiforme: 4 a 8 µm de comprimento.

Treponema: 10 a 20 µm de comprimento.

O cultivo, se necessário, é feito em anaerobiose.

100

Difteria

Coleta do material

No caso da difteria da orofaringe, de acordo com o Manual de Procedimentos

Básicos, recomenda-se coletar o material com quatro swabs: dois da garganta (G1 e G2) e

dois da região nasofaringea (N1 e N2).

Dois swabs, N1 e G1, são utilizados para exame bacterioscópico e outros dois

destinados ao cultivo.

Bacterioscopia

Os esfregaços são corados pelo Gram e Laybourn (bacilo verde claro).

Gram: o bacilo diftérico aparece Gram positivo com extremidades dilatadas.

Laybourn: revela as granulações metacromáticas (azuis) no interiordo bacilo.

O bacilo diftérico tem tendência ao pleomorfismo apresentando formas em clava,

piriforme, fusiforme e em halter. Os agrupamentos dos bacilos são peculiares, seja

formando paliçada ou formando ângulos V, L, Y, que em conjunto tem aparência de letras

chinesas.

A morfologia típica é observada melhor quando se usa a coloração negativa com

tinta-da-china.

A bacterioscopia tem pequeno valor diagnóstico, sendo apenas um teste

presuntivo. Visto que os bacilos pseudodiftéricos (Corynebacterium hofmanii, também

chamado Corynebacterium pseudodiphtheriticum) que fazem parte da microbiota normal da

orofaringe, têm a mesma morfologia e a mesma propriedade tintorial.

“No diagnóstico da difteria, o exame bacterioscópico de esfregaços corados pelo

Gram ou por outros processos como os usados para granulações metacromáticas, não têm

valor diagnóstico. O bacilo diftérico tem as mesmas características que as outras

corinebactérias que fazem parte da microbiota normal da garganta. Provavelmente as

manifestações clínicas apresentadas pelo paciente são mais úteis para o diagnóstico

etiológico do que um exame bacterioscópico. Infelizmente este conceito não é

suficientemente difundido e por esta razão é freqüente em nosso meio, o médico solicitar

uma bacterioscopia de secreção de garganta, quando suspeita de difteria”. (Microbiologia

Trabulsi. Dr. Luiz Rachid Trabulsi, 2a edição, pág. 129)

101

O tratamento com antitoxina (soro antidiftérico) deve ser uma decisão clínica, tão

logo se suspeite de difteria com base nos sintomas apresentados.

O diagnóstico laboratorial completo terá valor retrospectivo na confirmação do

diagnóstico clínico e como ponto de partida às medidas profiláticas, a fim de evitar a

propagação da difteria aos familiares e à comunidade (escola).

Cultivo

O cultivo é feito em meio de Loeffler (soro sanguíneo coagulado).

Neste meio o bacilo diftérico apresenta colônias após um período curto de

incubação, 8 a 10h. Outras bactérias como estafilococos, estreptococos, neisserias, cuja

fase-lag é mais demorada, não crescem com igual rapidez.

Do cultivo é feita nova bacterioscopia. Caso sejam encontrados caracteres morfo-

tintoriais do bacilo diftérico será, mesmo assim, um teste positivo de probabilidade.

Para as provas seguintes: bioquímicas e de virulência, recomenda-se reisolamento

em placas.

O diagnóstico de certeza é dado somente pelas provas da produção de toxina pelo

bacilo diftérico.

Observação: o bacilo diftérico somente produz toxina quando lisogenizado por

bacteriófagos contendo o gene tox. O vírus integra o seu DNA ao cromossomo bacteriano e

a toxina é sintetizada. O Corynebacterium diphtheriae que não é lisogenizado não produz

toxina e não é patogênico, no máximo produz manifestações clínicas discretas e localizadas.

O teste de certeza pode ser realizado de duas maneiras:

1) In vitro.

2) In vivo.

In vitro

Teste in vitro pode ser feito por imunodifusão radial = IDR (como recomendado pelo

prof. Dr. Luiz Carlos Duarte Formiga – Divisão Nacional de Laboratórios de Saúde Pública e

utilizado no Lacen).

102

Técnica

Em placas contendo meio de cultura acrescido de soro antidiftérico, semear a

bactéria suspeita isolada em forma de “spots” de aproximadamente 4mm de diâmetro.

Incubar.

Se o bacilo produzir a toxina, ela se difundirá no meio e reagirá com o soro

antidiftérico. Haverá reação Ag–Ac, que se manifesta como precipitação em torno da

colônia. Outro método é o teste de Elek, fundamentando-se no mesmo princípio.

Técnica

Numa placa com meio transparente colocar uma tira de papel de filtro impregnada

com soro antidiftérico. Semear o bacilo suspeito perpendicularmente ao papel. Se houver

produção de toxina, após 48h desenvolve-se uma linha branca de precipitação na bissetriz

do ângulo entre a tira e semeadura.

Teste de IDR (hemodifusão radial – Ag-Ac) Teste de Elek (tem anti-soro)

In vivo

O teste de virulência in vivo é feito em cobaia inoculando o bacilo suspeito e

observando a ação da toxina. Esses testes não são usados por questões bioéticas.

Resumo dos testes

Segundo Otto Bier:

1) Diagnóstico de possibilidade - pelo exame bacterioscópico;

2) Diagnóstico de probabilidade - cultura em meios adequados;

3) Diagnóstico de certeza - mais demorado, porém o único seguro, que

determina a virulência (testes in vivo e in vitro).

103

104

Meios de Cultura

Meio de Stuart

É utilizado para transportar amostras para culturas de cocos Gram positivos e bacilos

Gram negativos, mantendo as bactérias viáveis por 24h (tempo de segurança) ou 48h, até

que sejam semeadas em meios específicos para crescimento.

O meio de Stuart pode ser líquido ou semi-sólido.

Fórmula do meio de Stuart (semi-sólido)

• Cloreto de sódio 3 g

• Cloreto de potássio 0,2 g

• Fosfato dissódico 1,15 g

• Fosfato monossódico 0,2 g

• Tioglicolato de sódio 1 g

• Cloreto de cálcio 1% aquoso 10 g

• Cloreto de magnésio 10% aquoso 10 g

• Ágar 4 g

• Água destilada 1 L

É uma solução tampão, não contendo carboidratos, peptonas ou outras substâncias

nutritivas de crescimento. O meio apenas preserva a viabilidade das bactérias durante o

transporte, sem multiplicação significativa dos microrganismos. O tioglicolato de sódio

funciona como agente redutor, para melhorar o isolamento dos anaeróbios e a pequena

quantidade de ágar fornece consistência semi-sólida, evitando oxigenação e o

extravasamento durante o transporte.

Meio de Hitchens-Pike

Meio de enriquecimento para estreptococos – consistência xaroposa.

Fórmula

• Infuso de coração bovino 1 L

• Peptona 10 g

• NaCl 5 g

• Ágar 1 g

• Solução aquosa de azida sódica, NaN (1:1.000) 40 mL

• Solução aquosa de cristal violeta (1:25.000) 12,5 mL

105

O cristal violeta impede o crescimento dos outros cocos Gram positivos e a azida

sódica inibe a microbiota Gram negativa.

O crescimento de estreptococos no meio Hitchens-Pike, tem semelhança com

estalactites, formando filamentos que pendem da superfície do meio.

CLASSIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS ESPÉCIES DE ESTREPTOCOCOS

PATOGÊNICAS PARA O SER HUMANO

GRUPO PRINCIPAIS ESPÉCIES

PADRÃO DE HEMÓLISE HABITAT PRINCIPAIS

DOENÇAS

A S. pyogenes Beta Orofaringe Pele

Faringites, tonsilites,

piodermites, escarlatina.

B S. agalactiae Beta

(Alfa, Gama) Nasofaringe

TGU

Sepse neonatal, meningites,

infecção puerperal, ITU, etc.

C S. equi Beta

(Alfa, Gama)

Nasofaringe Pele

TGU e TGI

Infecções de pele, endocardites,

faringites

G S. canis Beta

(Alfa, Gama)

NasofaringePele

TGU e TGI

Infecções de pele, endocardites,

faringites Enterococos:

E. faecalis E. faecium

Gama (Alfa, Beta) TGU e TGI ITU, peritonite,

endocardite D

Não enterococos:

S. bovis

Beta (Alfa, Gama) TGI ITU

Endocardite

F S. anginosus Beta

(Alfa, Gama) Orofaringe, TGU e TGI

Sinusite Meningite

H S. sanguis Alfa

(Beta, Gama) Orofaringe e

TGI Abscesso cerebral,

pneumonias

K S. salivaris Gama (Alfa) Orofaringe Endocardite

Grupo Viridans: S. mitis

S. mutans Alfa Orofaringe Endocartite, cárie

NÃO GRUPAVEIS Outros:

S. pneumoniae Alfa

Boca, faringe e traquéia

Pneumonia, otite média, sinusite,

endocardite.

ESTREPTOCOCOS ANAERÓBIOS

Vários, incluíndo o

Peptostreptococo

Gama (Beta, Alfa)

Orofaringe, TGU e TGI

Sinusite, pneumonia, abscesso

pulmonar e cerebral

106

TRATO GÊNITO URINÁRIO (TGU)

Os agentes etiológicos mais freqüentes das infecções do aparelho urinário são:

1) Enterobactérias: Escherichia coli (90% dos casos)

Klebsiella

Proteus

2) Pseudomonas aeruginosa

3) Enterococcus

4) Staphylococcus aureus

5) Staphylococcus saprophyticus (este é considerado atualmente o principal agente

de infecção urinária em mulheres jovens).

O material para o diagnóstico laboratorial é a urina.

Amostras de urina são submetidas à cultura, quando existe suspeita de infecção do

trato urinário, para controle de tratamento ou em pacientes assintomáticos com alto risco de

infecção.

Coleta de urina

De preferência coletar a primeira urina da manhã, em frasco estéril, tampa de rosca e

boca larga. Outras amostras também podem ser obtidas, desde que o paciente retenha a

urina no mínimo por 2 a 3 horas antes da coleta.

Após a higienização da região genital, desprezar o 1o jato e coletar o jato médio da

urina. O restante da micção não deve ser utilizado.

Em crianças com fraldas ou em pacientes que não têm controle de micção, devem-

se usar coletores próprios de urina, fornecidos pelo Laboratório de Análises Clínicas. Pode

ser adquirido em farmácias.

1) Fazer anti-sepsia rigorosa do períneo, coxas, nádegas e abdômen.

2) Enxugar com gaze estéril.

3) Aplicar o coletor autocolante.

4) A seguir observar se há quantidade suficiente de urina para o exame. Caso não

houver micção em uma hora, trocar o coletor por um novo, fazendo uma nova

assepsia.

107

UROCULTURA

É um exame QUANTITATIVO. Para evitar a multiplicação das bactérias na urina

coletada, o exame laboratorial deve ser feito o mais rapidamente possível (dentro de uma

hora após a coleta), caso contrário, pode se manter o material à temperatura de geladeira,

não mais que cinco horas.

Diagnóstico bacteriológico

Uma vez no laboratório o exame segue as seguintes etapas:

1) Bacterioscopia (Gram) do sedimento.

2) Cultivo da urina.

3) Contagem de colônias (bactérias ou contagem de UFC = unidades formadoras de

colônias).

4) Antibiograma.

Descrição dos procedimentos

1o dia

1) Centrifugar a urina em um tubo coberto com cápsula de papel alumínio.

2) Derramar o sobrenadante e do sedimento, fazer coloração de Gram para

observar a presença ou ausência de leucócitos e bactérias.

Cultivo da urina homogeneizada

Mergulhar uma alça de platina na urina e semear por estriais superficiais em placa de

Teague e ágar sangue.

Incubar a 37oC.

108

Contagem bacteriana (contagem de colônias) – UFC

A técnica de contagem em placa é baseada no princípio de que cada célula

bacteriana quando cultivada em meio sólido ao se multiplicar forma uma massa

macroscópica que é a colônia. Somente serve para contagem de viáveis. A contagem pode

ser feita das seguintes maneiras:

1. Com alça calibrada.

2. Por diluições.

3. Lâmino-cultivo.

Contagem com alça (é a mais utilizada)

Para a contagem semiquantitativa usa-se alça metálica calibrada de 0,01 ou

0,001mL.

1) Imergir a alça, de forma vertical, em urina homogeneizada e semear uma única

estria central em placa de Teague e Ágar-sangue.

2) Em seguida, estria-se perpendicularmente à primeira linha semeada, a fim de

espalhar ao máximo o material.

Esquema da Contagem Bacteriana Com Alça

1. Esgotamento

(Inoculação primária)

2. Estriamento

2o dia

Do Teague (EMB). Observar as características coloniais.

1. Se for um bacilo L+, realizar o teste IMVIC. IMVIC é uma série bioquímica

simplificada para caracterizar as bactérias do grupo coliforme.

I = Indol V = Voges-Proskauer

M = Vermelho de Metila C = Citratase

2. Se for um bacilo L-, fazer a série completa de provas bioquímicas.

109

I M V C

Escherichia coli + + - -

Enterobacter - - + + móvel

Klebsiella - - + + (urease tardia) imóvel

Citrobacter + + - +

Do crescimento em ágar sangue fazer Gram. Se houver crescimento de estafilococos

ou estreptococos, caracterizá-los como nos capítulos precedentes.

Contagem das colônias

• Contagem de colônias (UFC) por alça calibrada.

O número de colônias é multiplicado por 100 se a alça utilizada for de 0,01 e por

1.000 se a alça utilizada for de 0,001.

Exemplo: colônias contadas = 40.

1) Alça 0,01 � 40 x 100 = 4.000 col/mL urina;

2) Alça 0,001 � 40 x 1.000 = 40.000 col/mL urina.

O resultado é dado pelo laboratório usando potenciação, para evitar os números com

muitos zeros. Exemplos:

• 90.000 = 9x104 col/mL ou UFC/mL

• 9.000 = 9x103 col/mL ou UFC/mL

• 100 = 102 col/mL ou UFC/mL

• 45.000 = 4,5x104 col/mL ou UFC/mL

• 100.000 = 105 col/mL ou UFC/mL

• Mais de 100.000 = superior a 105 col/mL ou UFC/mL

3o dia

• Leitura do IMVIC e das provas bioquímicas do BGN, se lactose negativa (L-).

• Leitura das características do estafilococo e estreptococo.

O Esquema de Urocultura está apresentado na página 109.

110

111

Interpretação dos resultados das análises de urina relacionados com sintomatologia

clínica

Contagem

bacteriana

Leucócitos Sintomas Como reportar o

resultado

Comentários

A A Não houve

crescimento de MO.

Não existe infecção urinária.

P A Não houve

crescimento de MO.

Piúria asséptica causada por

desidratação / inflamação.

Sem

crescimento

P P Não houve

crescimento de MO.

Provável uretrite ou paciente

sob uso de antibióticos.

A A Identificação do MO. Provável contaminação ou

colonização.

P A Identificação do MO. Bacteriúria assintomática.

Tratamento prévio com

antibióticos.

< 105

UFC/mL

P P Identificação do MO

e antibiograma.

Bacteriúria sintomática.

A A Identificação do MO

e antibiograma. *

Bacteriúria assintomática

(gravidez ou paciente idoso).

Contaminação (crescimento de

várias espécies de MO).

A P Identificação do MO

e antibiograma. *

Cistite, pielonefrite.

Bacteriúria sem piúria.

P A Identificação do MO

e antibiograma. *

Bacteriúria assintomática

(gravidez ou paciente idoso).

> 105

UFC/mL

P P Identificação do MO

e antibiograma. *

Cistite, pielonefrite.

112

Legenda: Sintomatologia P = presença de disúria e/ou freqüência urinária

A = ausência de disúria e/ou freqüência urinária

Leucócitos A = < 10/campo

P = ≥ 10/campo

MO = microrganismo

* = se houver crescimento de mais de uma espécie de MO, considerar a

predominante.

113

INTESTINAIS

Diversos são os agentes que podem causar doenças diarréicas e entre eles as

bactérias.

As fezes devem ser coletadas no início da diarréia, para a pesquisa do patógeno.

As diarréias agudas podem ser divididas em dois grupos:

1) Sanguinolenta.

2) Diarréia não sanguinolenta.

A diarréia sanguinolenta é causada por bactérias invasivas e produtoras de

citotoxinas que invadem ou destroem as células epiteliais do intestino. As evacuações são

sanguinolentas e pouco volumosas. Ao exame microscópico observa-se a presença de

muitos leucócitos.

A diarréia não sanguinolenta é causada por bactérias produtoras de enterotoxinas.

Estas bactérias aderem à mucosa intestinal sem interferir na integridade das células

epiteliais. As fezes ficam liquefeitas, de volume grande e evacuações freqüentes. Há

ausência de leucócitos no exame microscópico das fezes.

As bactérias enteropatogênicas pesquisadas de rotina em coprocultura são:

Salmonella, Shigella e Escherichia coli invasora e Escherichia coli enteropatogênica

clássica. Outras bactéria como a Yersinia enterocolitica, vibriões (Vibrio cholerae, Vibrio

parahemolyticus e Campylobacter jejuni), Clostridium (Clostridium difficile e Clostridium

perfringens) e Staphylococcus aureus são pesquisados somente em situações especiais e

quando solicitado pelo médico.

Cultura de Fezes

1o dia

1) Semear uma alçada de fezes ou swab anal, por estrias superficiais, em meio de

Teague ou SS.

2) Semear 3 a 4 alçadas das fezes em um caldo de enriquecimento (caldo GN,

tetrationato ou selenito)

3) Incubar o Teague e SS (ágar Salmonella-Shigella) a 35oC ± 1oC por 24 horas e

caldo de enriquecimento a 35oC ± 1oC, sendo que o período de incubação varia

de acordo com o caldo utilizado, sendo respectivamente:

114

GN – 4 a 6 horas

Selenito – 8 a 12 horas

Tetrationato – 12 a 24 horas

O enriquecimento é necessário para recuperação e isolamento da Shigella e

Salmonella, pois quando estas bactérias estão presentes em pequena

quantidade podem ser prejudicadas pela competição com a microbiota intestinal.

4) Repicar do caldo de enriquecimento para uma placa de SS ou XLD (Xilose,

Lisina, Desoxicolato).

2o dia

1) Observar o crescimento nas placas de Teague. Repicar as colônias suspeitas do

Teague e SS para os tubos contendo EPM e MILI, conforme esquema abaixo. A

inoculação em EPM é feita com agulha por picada profunda e, sem recarregar a

agulha, fazer estriais superficiais na parte inclinada do meio. O meio de MILI deve

ser semeado fazendo-se uma picada central próxima ao fundo do tubo.

Esquema da Inoculação Com Agulha Por Picada Profunda

Vista Lateral Vista Anterior

EPM

EPM

115

3o dia

1) Realizar a leitura do EPM/MILI.

2) Se houver suspeita de algum patógeno significativo, realizar provas bioquímicas

complementares (se necessário) e soroaglutinação específica.

3) Do SS, que veio do enriquecimento, semear as colônias claras no Baracchini.

EPM – Cor original: verde

Verde acastanhado – LTD positivo

Bolhas de ar – gás positivo 6

Amarelo – glicose positivo

Azulado – uréia positiva Preto – H2S positivo

MILI – Cor original: roxa

Formação de anel vermelho ao adicionar o

reativo de Kovacs – indol positivo

Formação de anel amarelo ao adicionar o

reativo de Kovacs – indol negativo

Turvação ao redor da linha de inoculação -

motilidade positiva

Amarelo – lisina negativa

Qualquer cor diferente do amarelo -

lisina positiva

116

Enteropatógenos

O fluxograma de triagem para enteropatógenos em Coprocultura após o cultivo em

MILI e EPM encontra-se demosntrado na página 123.

Teste de Identificação Sorológica

O teste é feito por aglutinação rápida em lâmina, misturando 1 gota do anti-soro e 1

gota da suspensão bacteriana a identificar.

A Salmonella possui antígenos somáticos O e antígenos flagelares H. Os antígenos

flagelares podem pertencer a fase 1 ou fase 2 (Salmonelas difásicas).

Uma primeira orientação é obtida com misturas de soros O (polivalentes O) e soros

H (polivalentes H), antes de utilizar os soros monoespecíficos.

Técnica

1. Sobre uma lâmina colocar uma gota de soro polivalente O e 1 gota de suspensão

bacteriana a identificar.

2. Misturar com alça até ficar com aparência homogênea.

3. Com movimentos basculantes contínuos, promover maior contato entre o soro e

as bactérias. Caso haja especificidade, ocorre reação Ag-Ac que se manifesta

pelo fenômeno da aglutinação.

Em seguida repetir a mesma técnica usando o soro polivalente H.

Ambas as aglutinações, O e H, têm que dar positivas. A aglutinação H forma flocos

grandes e frouxos; a aglutinação O forma grumos miúdos e compactos.

Em seguida fazer aglutinação com soros monoespecíficos: somáticos e flagelares.

Iniciar com soros correspondentes às salmonelas que mais comumente se isolam na

região. No nosso meio, a mais freqüente é a Salmonella typhimurium. Caso haja aglutinação

com todos os soros que correspondem à fórmula antigênica de Salmonella typhimurium, fica

comprovada a sua identificação.

117

Observação: a identificação sorológica de todas as salmonelas (mais de 2200

sorotipos) só pode ser feita em Laboratórios de Referência. Os laboratórios clínicos dispõem

apenas dos soros das salmonelas mais freqüentemente isoladas.

Grupo Sorotipo Antígeno O Fase 1 Fase 2 A S. paratyphi – A 1, 2, 12 a - B S. paratyphi – B

S. schwarzerngrund S. salinatis S. saint-paul S. reading S. kaapstad S. chester S. derby S. agona S. california S. typhimurium S. agama S. bredeney

1, 4, 5, 12 1, 4, 12, 27 4, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 4, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 12 4, 12 1, 4, 5, 12 4, 12 1, 4, 12, 27

b d d, e, h e, h e, h e, h e, h f, g f, g, s g, m, t i i l, v

1, 2 1, 7 d, e, n, z15 1, 2 1, 5 1, 7 e, n, x 1, 2 - - 1, 2 1, 6 1, 7

C1 S. oslo S. paratyphi – C S. cholerae-suis S. birkenhead S. livingstone S. norvich S. montevideo S. oranienburg S. thompson S. infantis S. inganda S. tennessee S. decatur

6, 7 6, 7 (Vi) 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7 6, 7

a c c c d e, h g, m, p, s m, t k r z10 z29 c

1, 5 1, 5 1, 5 1, 6 1, w 1, 6 - - 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5

C2 S. belem S. muechen S. newport S. tokodari S. bonariensis S. lichtfield

6, 8 6, 8 6, 8 6, 8 6, 8 6, 8

c d e, h i i l, v

e, n, x 1, 2 1, 2 1, 5 e, n, x 1, 2

C3 S. haardt S. kentucky

8 8, 20

k l

1, 5 z6

C4 S. eimsbuettel 6, 7, 14 d 1, w D S. sendai

S. typhi S. enteritidis S. dublin S. panama S. gallinarum

1, 9, 12 9, 12 (Vi) 1, 9, 12 1, 9, 12 (Vi) 1, 9, 12 1, 9, 12

a d g, m g, p l, v -

1, 5 - 1, 7 - 1, 5 -

E S. butantan S. anatum S. maleagridis S. nchanga

3, 10 3, 10 3, 10 3, 10

b e, h e, h l, w

1, 5 1, 6 1, w 1, 2

118

Shigella

Possui 4 espécies, cada espécie com diversos sorotipos. As espécies:

� Shigella dysenteriae

� Shigella flexneri

� Shigella boydii

� Shigella sonnei

A Shigella é imóvel. É caracterizada somente pelo antígeno O (é desprovida de

antígenos H e K).

Técnica

O teste de aglutinação segue a técnica anterior.

Escherichia coli

A principal bactéria da microbiota intestinal é a Escherichia coli. Há 167 sorogrupos e

desde 60 existem em humanos: 25 microbiota normal; 35 patogênicas. As não patogênicas

podem causar infecção urinária e meningite.

As Escherichia coli patogênicas são distribuídas em 5 sorogrupos:

EPEC – enteropatogênica clássica

ETEC – toxigênica

EIEC – invasiva

EHEC – hemorrágica

EAEC – aderente

EPEC não produz nenhuma toxina, mas destrói microvilosidades (adesão-aplainamento) por

fímbrias formadoras de feixes, intimina e seu receptor, uma proteína translocase.

ETEC possui fatores de colonização (adesinas fimbriais) – ligam a bactéria a sítios

esfecificos na superfície celular dos enterócitos. Produzem poderosas enterotoxinas

codificadas por plasmídeos – LT (termolábil) ou ST (termoestável). LT atua na adenilato

ciclase e a ST na guanilato ciclase (aumenta assim aprodução de fluidos e causa diarréia).

119

EHEC - Hemorrágica. Produz uma toxina verotoxina (que é idêntica à toxina Shigalike da

Shigella). Ela se fixa na mucosa do intestino grosso pelo processo de adesão aplainamento,

igual à EPEC. A verotoxina atinge as células epiteliais e causa diarréia. Duas conseqüências

são: a colite hemorrágica e a síndrome hemolítica urêmica.

EIEC se liga especificamente à mucosa do intestino grosso – utiliza genes associados a

plasmídeos, penetram nas células do epitélio intestinal por endocitose. No interior das

células, lisam o vacúolo endocítico, multiplicam-se e disseminam-se para as células

adjacentes, provocando destruição tecidual, inflamação, necrose e ulceração. Isso faz

aparecer sangue e muco nas fezes.

EAEC – liga-se às células na cultura de tecido. Faz que nem tijolo empilhado. Atuam no

intestino delgado e fazem diarréia persistente, principalmente em crianças. Tem muitas

fímbrias que foram transcritas a partir de genes plasmidianos. Produz toxinas termolábeis.

* Testes específicos são necessários para identificar cepas de E. coli patogênicas

Por fazer parte da microbiota normal intestinal, a bioquímica e a sorologia se fazem

necessárias. PCR pode ser utilizada, mas é uma técnica muito cara (diagnóstico molecular).

* E. coli possui os antígenos O, K e H – a partir deles fazemos a diferenciação das cepas de

E. coli – para fazer a diferenciação de qualquer cepa de Escherichia coli, utilizamos a

sorologia por meio desses três antígenos.

Sorogrupos de Escherichia coli associados a infecções humanas

Infecção Sorogrupo O Observações

26, 55, 86, 111, 114, 119,

125, 126, 128, 142, 158

EPEC (associados somente

com diarréia infantil)

28, 29, 112, 124, 136,

143, 144, 152, 164, 167

EIEC (associados com

disenteria bacilar)

6, 8, 15, 20, 25, 63,

78, 115, 128, 148

ETEC

Intestinal

26, 157 EHEC (associados com a

colite hemorrágica)

120

Urinária 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9,

11, 22, 25, 62, 75

Meningite do recém-nascido 1, 6, 7, 16, 18, 83

Bacteremia 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9,

11, 18, 22, 25, 76

Membros da microbiota

normal dos intestinos

A Escherichia coli possui antígenos O, K e H, existem 171 antígenos O, 100

antígenos K e 57 antígenos H. A fórmula antigênica da Escherichia coli é representada por

números arábicos colocados após as letras. Exemplo: O26:K60:H11.

Aglutinação: as técnicas de aglutinação são feitas como nas anteriormente citadas,

geralmente aglutinando-se com o soro anti-O.

Após a conclusão dos testes, o laboratório envia ao médico o resultado.

Exemplos conforme o resultado obtido:

1. Coprocultura positiva para Salmonella sp. Ou citar o sorotipo quando efetuadas

as tipagens sorológicas completas.

2. Coprocultura positiva para Shigella flexnerii.

3. Coprocultura positiva para Escherichia coli enteropatogênica clássica.

4. Coprocultura negativa para bactérias enteropatogênicas (citar as bactérias

pesquisadas)

Observação final: as provas bioquímicas são insuficientes para a identificação das

enterobactérias patogênicas. A identificação só é completa após os testes sorológicos.

Meios de cultura usados nesta prática

Meio SS

Seletivo diferencial. SS – iniciais de Salmonella e Shigella.

Fórmula:

� Lactose: é diferencial;

� Vermelho neutro: indicador de pH;

� Verde brilhante: seletivo, inibe a maior parte das bactérias Gram positivas;

� Sais biliares: favorecem a Salmonella, inibem coliformes e Gram positivas;

� Hipossulfito de sódio: inibe outros Gram negativos;

121

� Cloreto férrico;

� Ágar simples.

O meio SS é muito seletivo, a ponto de não ser aconselhado por microbiologistas de

renome. É formulado para prejudicar a maior parte das Gram negativas, inclusive os

coliformes, pelas altas concentrações de sais biliares (8,5 g/L – os outros meios têm 1,5 g/L)

e altas concentrações de citrato de sódio.

MEIO DE CULTURA

FINALIDADE DO MEIO ASPECTO DAS COLÔNIAS

SUSPEITAS

PROCEDIMENTO DE

IDENTIFICAÇÃO

MC

Isolamento de entero-

bactérias.

Inibe CGPs.

Crescem BGNs

somente

Lactose negativa (transparente ou

sem cor): suspeita de Salmonella

spp., Shigella spp. e algumas E. coli

invasoras.

Lactose positiva (co de rosa):

suspeita de E. coli

Rugai e

sorotipagem

EBM

TEA

HHT

Isolamento de entero-

bactérias.

Inibe CGPs.

Crescem BGNs

somente

Transparentes ou roxo claro: suspeita

de Salmonella spp.

Roxo escuro com brilho metálico:

suspeita de E. coli

Rugai e

sorotipagem

HE

Seletivo para

Salmonella e Shigella.

Contém indicador da

produção de H2S (ácido

sulfídrico)

Azul ou verde azulado: suspeita de

Salmonella spp. (com ou sem centro

negro), Shigella spp.

Amarela: suspeita de E. coli

Rugai e

sorotipagem

SS

Seletivo para

Salmonella spp. Pode

inibir Shigella spp.

Contém indicador da

produção de H2S

Incolor (com ou sem centro negro):

suspeita de Salmonella spp.

Incolor: suspeita de Shigella spp.

Colônias negras: suspeita de

Salmonella spp.

Colônias cor de rosa: suspeita de E.

coli

Rugai e

sorotipagem

VB

Seletivo para

Salmonella spp.

Vermelha, rosa forte ou translúcida

circundadas de vermelho: suspeita de

Salmonella spp.

Amarela: suspeita de Klebsiella spp.

Rugai e

sorotipagem

Fonte: Opustil et al, 2002

122

EPM (Escola Paulista de Medicina)

Este meio trata-se de uma modificação do meio de Rugai e Araújo pela retirada da

sacarose e da prova do indol.

Neste tubo pode ser lido:

� Desaminação do L–triptofano.

� Fermentação da glucose.

� Produção de gás pela fermentação da glucose.

� Produção de H2S.

� Hidrólise da uréia pela enzima urease.

MILI (Motilidade, Indol e Lisina)

É um meio semi-sólido onde pode ser lido:

� Motilidade.

� Descarboxilação da lisina.

� Produção de indol a partir de triptofano.

GN Broth (Bacilo Gram Negativo – Caldo)

� Triptose 20g

� Dextrose 1g

� D-manitol 2g

� Citrato de sódio 5g

� Desoxicolato de Na 0,5g

� Fosfato de potássio 4g

� Fosfato monopotássico 1,5g

� NaCl 5g

P/ 1000mL de H2O.

123

124

MEIO BARACCHINI

Este meio permite observar a decomposição de três açúcares: glucose, lactose e

sacarose, além da produção ou não de urease, H2S, gás e indol. É um meio que promove

sete provas bioquímicas em uma só.

1) Extrato de carne

2) Triptose

3) NaCl

4) Tiossulfato de Sódio

5) Sulfato Ferroso

6) Glucose, Lactose e Sacarose

7) Uréia

8) Vermelho de Fenol

9) Azul de Timol

Composição deste meio de

cultura

10) Ágar

É importante estabelecer a proporção de glucose de 1:10 em relação a cada um dos

demais carboidratos. O meio sólido é distribuído para apresentar uma base em coluna alta

de aproximadamente 3cm de altura e o ápice inclinado do mesmo comprimento que a base,

em forma de bisel. As bactérias inoculadas no fundo vão ter uma relativa anaerobiose.

ASPECTO DIAGNÓSTICO

1. Base amarela, sem gás, com

enegrecimento e com o ápice vermelho. Salmonella typhi

2. Base amarela, com gás, com

enegrecimento e com o ápice vermelho.

Salmonella arizona, Salmonella sp.

Citrobacter sp.

3. Base amarela, sem gás e ápice vermelho. Shigella sp.

4. Base violeta, com ou sem enegrecimento

e com o ápice violeta. Proteus sp.

5. Base amarela, com gás, com ou sem

enegrecimento e com o ápice amarelo.

Escherichia sp., Klebsiella sp.,

Enterobacter sp.

6. Base e ápice vermelhos. Pseudomonas aeruginosa

7. Base amarela, sem gás, ápice amarelo ou

amarelo avermelhado. Bactérias Gram Positivas

125

Resultados

Relacionados apenas com a decomposição de açúcares (não considerando a uréase

e o H2S), temos três resultados:

CASO 1 CASO 2 CASO 3

Base alcalina

Ápice alcalino

Não fermentadora

Base ácida

Ápice ácido

Fermentadora de

lactose e sacarose

Inicial

Ápice e base ácidos

Não fermenta

lactose

Fermenta glucose

Posterior

Base ácida

(amarela)

Ápice vermelho

CASO 1: Quando a bactéria é incapaz de fermentar qualquer açúcar testado. A base e o

ápice conservam a cor vermelha inicial (pH alcalino).

CASO 2: Quando a bactéria é fermentadora de glucose e sacarose ou lactose. Há produção

de ácidos. A base e ápice apresentam cor amarela (pH abaixo de 6,0).

CASO 3: Ilustra o metabolismo inicial e a transformação posterior definitiva.

Inicial: A base e o ápice aparecem amarelos indicando acidificação (fermentação de

glucose).

Posterior: A superfície do bisel gradualmente volve ao pH alcalino (meio vermelho inicial),

ao transformarem aminas a partir da descarboxilação oxidativa do O2 do ar (no fundo do

tubo, onde não existe o O2, a decomposição dos peptídeos é quase nula). A bactéria é não

fermentadora de lactose e fermentadora de glucose. A glucose em pequenas quantidades

nesse meio (1:10) em relação aos outros carboidratos, produz pequenas quantidades de

ácidos, os quais são facilmente neutralizados pelas aminas alcalinas. Devido à maior

proporção, a lactose ou a sacarose, se fermentadas, produziriam pequenas quantidades de

ácidos, e que as aminas formadas não conseguiriam neutralizar.

126

FEBRE TIFÓIDE E PARATIFÓIDE

A febre entérica é adquirida através da ingestão de água ou alimentos contaminados

com material fecal. No prazo de 10 ou 14 dias após a ingestão dos bacilos aparece febre,

que aumenta gradualmente, com queixas inespecíficas de cefaléia, mialgias, mal-estar e

anorexia. Estes sintomas persistem por uma semana ou mais e são seguidos de sintomas

gastro-intestinais.

Agente etiológico:

Febre Tifóide ���� Salmonella typhi

Febre Paratifóide ���� Salmonella paratyphi A, Salmonella schottmuelleri (antiga

Salmonella paratyphi B) e Salmonella hirschfeldii.

O diagnóstico laboratorial é feito por duas provas:

1) Hemocultura � diagnóstico direto;

2) Reação de soro-aglutinação � Reação de Widal (diagnóstico indireto).

Períodos da doença e as porcentagens de positividade

Primeira semana = hemocultura (80 a 100% de positivo), Widal (10%).

Segunda semana = hemocultura (75%), Widal (75%).

Terceira semana = Reação de Widal (100%), hemocultura (40%).

CORRELAÇÕES CLÍNICAS: Como quase sempre o paciente chega ao serviço de saúde logo na primeira semana, quase sempre o exame a ser feito é a hemocultura. No entanto, pode haver casos isolados e será a anamnese que nos guiará a qual exame deverá ser feito. “Há quanto tempo o(a) senhor(a) está com essa febre?” NA PRIMEIRA SEMANA: FAZER HEMOCULTURA NA SEGUNDA SEMANA: INDIFERENTE NA TERCEIRA SEMANA: FAZER WIDAL

127

Incubação

Invasão

ativa e

Bacteremia

ACME

Fonte: Rubin, 2006

Observação: como nem sempre o paciente sabe especificar o início da doença, alguns

clínicos recomendam realizar ambas as provas simultaneamente, independente do período

da infecção, para obter maior probabilidade diagnóstica.

128

Quarta semana (fase de convalescença) = realiza-se a Coprocultura-Teste de

libertação. A coprocultura não tem por objetivo o diagnóstico da doença e sim para confirmar

o estado de portador, em virtude da infecção crônica da vesícula biliar em alguns pacientes.

O portador elimina a Salmonella através das fezes podendo propagar a doença. Para

comprovar que o paciente não alberga a Salmonella é preciso fazer três coproculturas de

três evacuações consecutivas. As três devem ser negativas.

Muitos livros de microbiologia citam o caso de uma cozinheira americana que

trabalhou para oito famílias durante oito anos e foi a fonte de contaminação de sete

epidemias de Febre Tifóide com mais de duzentos casos. Foi por isso chamada de Mary

Typhoid.

Hemocultura

É o cultivo do sangue do paciente em meios adequados. No caso da Salmonella

pode se usar o caldo bileado.

O sangue é obtido por punção da veia usando seringa e agulha. Extraído o sangue,

trocar a agulha e inocular no frasco com meio de cultivo, perfurando a tampa de borracha (o

diafragma de borracha, como nos frascos de penicilina).

Pode-se usar também um sistema fechado, que consiste num frasco com meio de

cultura e vácuo. Puncionar a veia com a agulha do próprio sistema e o sangue é aspirado

diretamente para o frasco.

Em ambos os casos, o local da punção deve ser rigorosamente descontaminado.

Recomenda-se fazer:

1) Lavagem com sabão medicinal.

2) Enxaguar com água estéril.

3) Aplicar álcool iodado a 1%.

4) Passar álcool 70% para retirar o iodo.

Após a anti-sepsia não palpar a veia com os dedos.

Período da coleta

Recomenda-se a coleta de sangue imediatamente antes do pico febril, porque é o

período de maior concentração de bactérias circulantes. Mas como o pico febril geralmente

129

não pode ser previsto, é aconselhada a coleta de duas amostras com uma hora de

diferença.

Normalmente recomenda-se colher 2 amostras em crianças, 3 em adultos que não

estejam em tratamento e 4 a 6 amostras, na vigência do tratamento com antibióticos.

Nos casos de estado febril agudo em que haja a necessidade de terapia imediata,

realizam-se duas coletas, uma em cada braço.

Volume do sangue a cultivar

Para hemocultura de adultos, retira-se 10 mL de sangue, visto que o número de

bactérias circulantes é pequeno, de 10 a 20 bactérias por mL. Em crianças de até um ano,

colher de 1 a 5 mL.

Proporção: semear em meios de cultura guardando a proporção de 1 para 10, a

diluição necessária para preservar, in vitro, um microrganismo da ação bactericida do

sangue.

Uso de antibióticos

Se o paciente estiver usando antibióticos, o fato deve constar na requisição do

exame dando o nome do medicamento. Se for penicilina, neutraliza-se a sua ação,

acrescentando penicilinase ao meio de cultura (50 u%). Se forem sulfamídicos, acrescenta-

se ácido p-amino-benzóico (5 mg%).

Alguns meios para hemocultura disponíveis no comércio contêm anticoagulante

polianetol-sulfonato de sódio (PSS) que, além de evitar a coagulação do sangue, inibe a

ação do complemento, lisozima, fagocitose e inativa aminoglicosidios.

Observação: quando há suspeita de que a septicemia é causada por Neisseria

gonorrhoeae, Neisseria meningitidis e Gardnerella vaginalis não se deve usar este

anticoagulante, porque ele inibe o crescimento destes agentes.

Cultivo

Os frascos com o sangue devem ser incubados a 37oC e observados durante vários

dias (para Listeria, até 30 dias). Devido ao pequeno número de microrganismos, o

130

crescimento é lento. O crescimento é percebido pela turvação do meio. Nesta ocasião, tirar

uma pequena porção da cultura e fazer:

• Bacterioscopia pelo Gram.

• Isolamento em placas para caracterização.

O resultado de Gram é enviado ao clínico para orientação preliminar. Por exemplo:

Hemocultura positiva para bacilos Gram negativos após cinco dias de incubação.

Caracterização bioquímica em andamento.

Um vez identificada a bactéria, manda-se o resultado definitivo ao médico.

Reação de Widal

A Reação de Widal é uma soro-aglutinação e pesquisa anticorpos anti-salmonela, no

sangue do paciente, dirigida contra os antígenos O e antígenos H.

Para que a Reação de Widal tenha valor diagnóstico é necessário titular os

anticorpos presentes, visto que eles existem em pequenas quantidades em sangue de

pessoas normais.

Para detalhes técnicos e interpretação de resultados da Reação de Widal, consultar

Microbiologia e Imunologia de Otto Bier, pág. 635 a 642, edição 1990.

131

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS (TSA)

São testes utilizados para observar a resistência ou sensibilidade aos

antimicrobianos de bactérias isoladas de amostras clínicas representativas de um processo

infeccioso, cuja sensibilidade não é previsível.

1) Por diluição do antibiótico

2) Por difusão do antibiótico

Diluição

O teste da diluição em caldo é empregado para determinação da Concentração

Inibitória Mínima (CIM) que é dada pela quantidade da droga no tubo onde não houver mais

crescimento (a quantidade é expressa em mcg/mL).

Exemplo:

30 mcg/mL 15 mcg/mL 7,5 mcg/mL 3,75 mcg/mL 1,88 mcg/mL 0,94 mcg/mL

Nos tubos são colocadas quantidades conhecidas e decrescentes do antimicrobiano

e quantidades fixas de bactérias em todos os tubos. Portanto temos:

a) Quantidades variáveis do antimicrobiano;

b) Quantidades constantes de bactérias.

Após incubação, observar os tubos com crescimento revelado pela turbidez. No

exemplo acima houve crescimento nos três tubos da direita. Já o tubo com 7,5 mcg não

apresentou turbidez. O CIM deste antibiótico é = 7,5 mcg/mL.

Este método, fornecendo dados quantitativos, é sempre usado em situações onde o

método de difusão fornece dados inseguros. Também quando os pacientes não respondem

132

a uma terapêutica aparentemente adequada ou então que apresentam recidivas no curso do

tratamento.

Difusão

O segundo método, o Teste de Sensibilidade aos Antibióticos (TSA) ou antibiograma,

baseia-se na capacidade, apresentada pelo antibiótico, de se difundir no meio de cultura

sólido.

As técnicas variam, podendo-se usar: comprimidos, escavações nas quais se coloca

o antibiótico, mas a mais usada em Laboratórios de Análises Clínicas é a técnica de difusão

do disco (confete) de papel de filtro, embebido em antibiótico. É o método de Kirby-Bauer

que é prático, seguro, barato e de fácil execução. Há vantagem também na apresentação do

resultado em três níveis: sensível, intermediário (ou pouco sensível) e resistente, o que

permite correlação com os dados de CIM e os níveis antimicrobianos a nível de sangue e

urina, com a dosagem habitual do antibiótico prescrito.

O método de Kirby-Bauer foi padronizado para patógenos de crescimento rápido,

como enterobactérias, Staphylococcus aureus e Pseudomonas. Para outros microrganismos

ainda são feitas investigações para efeito de padronização.

A padronização requer os seguintes cuidados relacionados aos meios de cultura:

1) pH 7,3 a 7,4.

2) Espessura uniforme de 4 mm com superfície perfeitamente plana.

3) As placas não devem ter umidade excessiva na superfície do meio e na tampa.

4) O meio deve ser recente (não ressecado).

Cuidados com o inóculo

A suspensão bacteriana deve ter turvação idêntica ao tubo no 5 do padrão de sulfato

de bário (escala de Mac Farland – 0,5 mL de BaCl 1% + 99,5 mL de H2SO4 a 1%). A

variação da concentração do inóculo pode resultar em erros superiores a 50%.

133

Cuidados com os discos de papel de filtro

1) Devem ser conservados a 4oC (ou menos), em frascos originais.

2) Antes de usar, retirar da geladeira ou freezer e usar somente quando os frascos

atingiram a temperatura ambiente, para evitar gotas de condensação.

1o dia

Semeadura em placa

1) Mergulhar um swab estéril no inóculo a testar. Retirar o excesso do líquido

pressionando-o contra a parede interna do tubo.

2) Deslizar o swab sobre a superfície em todas as direções (semeadura em massa),

observando que não fique nem uma área sem semear.

Aplicação dos discos

1) Com cuidados de assepsia, os discos podem ser aplicados manualmente (com

auxílio de pinça estéril) ou por dispositivos mecânicos simples ou múltiplos. Os

discos podem ser individuais ou polidiscos. Os polidiscos são usados em

laboratórios de rotina grande.

Ligações inertes

Discos impregnados

A placa é de diâmetro grande, de 15 cm aproximadamente.

134

Há economia de tempo e trabalho visto que se coloca o polidisco de uma só vez.

No exemplo acima o polidisco tem 13 antibióticos.

No caso dos discos individuais deve se respeitar o espaçamento entre eles de 3

cm e 2 cm entre o disco e a borda da placa. No centro da placa colocar os

antibióticos com menor poder de difusão: polimixina, bacitracina e vancomicina.

Usar um antibiótico de cada grupo. São recomendados meios de cultura

especiais para antibióticos pouco solúveis em água.

2) Após colocar o disco, fazer uma pressão leve com a pinça para deixá-lo aderido à

superfície do meio.

3) Inverter a placa e incubar a 37oC.

2o dia

1) Observar o crescimento que deve ser semiconfluente. Colônias isoladas, muito

separadas, indicam quantidade insuficiente de bactérias.

2) Medir com régua milimetrada o diâmetro da zona de inibição de crescimento ao

redor do disco (inclusive o disco).

3) Crescimento de colônias isoladas dentro do halo indica presença de mutantes

resistentes ou contaminantes (cultura mista).

Observar a variação, na “Tabela de Agentes Antimicrobianos Sugeridos para Uso

Rotineiro em Antibiograma” e “Tabela de Interpretação de Diâmetro dos Halos de

Inibição”, do halo de inibição em relação ao antimicrobiano e a bactéria testada (as tabelas

estão nas páginas seguintes).

135

Interpretação do Diâmetro dos Halos de Inibição Antimicrobiano Potência do

disco Diâmetro do halo de inibição (mm)

Resistente Intermediário Sensível Amicacina 30 mcg ≤ 14 15 – 16 ≥ 17 Ampicilina (...) Gram-negativos entéricos (...) Estafilococos (...) Haemophilus sp. (...) Enterococo (...) Estreptococo (S. bovis) (...) Listeria monocytogenes

10 mcg 10 mcg 10 mcg 10 mcg 10 mcg 10 mcg

≤ 11 ≤ 28 ≤ 19 ≤ 16 ≤ 21 ≤ 19

12 – 13

- - -

22 – 29 -

≥ 14 ≥ 29 ≥ 30 ≥ 19 ≥ 30 ≥ 20

Carbecilina (...) Pseudomonas (...) Gram-negativos entéricos

100 mcg ≤ 13 ≤ 17

14 – 16 18 – 22

≥ 17 ≥ 23

Cefotaxima Cefoxitina Ceftazidima Ceftriaxona Cefalotina Cloranfenicol Clindamicina ou Lincomicina Eritromicina Fosfomicina Gentamicina Imipenem Metilmicina

30 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 2 mcg 15 mcg 50 mcg 10 mcg 10 mcg 30 mcg

≤ 14 ≤ 14 ≤ 14 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 13 ≤ 13 ≤ 12 ≤ 13 ≤ 12

15 – 22 15 – 17 15 – 17 14 – 20 15 – 17 13 – 17 15 – 20 14 – 22 14 – 22 13 – 14 14 – 15 13 – 14

≥ 23 ≥ 18 ≥ 18 ≥ 21 ≥ 18 ≥ 18 ≥ 21 ≥ 23 ≥ 17 ≥ 15 ≥ 16 ≥ 15

Oxacilina (...) Estafilococos (...) Pneumococos quando sensíveis à penicilina G

1 mcg 1 mcg

≤ 10 ≤ 19

11 – 12

-

≥ 13 ≥ 20

Penicilina G (...) Estafilococos (...) N. gonorrhoae (...) Enterococos (E. faecalis) (...) L. monocytogenes (...) S. bovis

10 unidades 10 unidades 10 unidades 10 unidades 10 unidades

≤ 28 ≤ 19 ≤ 14 ≤ 19 ≤ 19

- - - -

20 – 27

≥ 29 ≥ 20 ≥ 15 ≥ 20 ≥ 28

Rifampicina Tetraciclina Tobramicina Trimetoprim / sulfametoxazol Vancomicina

30 mcg 30 mcg 10 mcg

1,25/23,75 mcg 30 mcg

≤ 16 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 10 ≤ 9

17 – 19 15 – 18 13 – 14 11 – 15 10 – 11

≥ 20 ≥ 19 ≥ 15 ≥ 20 ≥ 28

Antimicrobianos específicos para infecções urinárias

Ácido pipemídico Ácido nalidixo Nitrofurantoína Norfloxacina Sulmamídicos

20 mcg 30 mcg

300 mcg 10 mcg

250 a 300 mcg

≤ 13 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 12

14 – 18 14 – 18 15 – 16 13 – 16 13 – 16

≥ 19 ≥ 19 ≥ 17 ≥ 17 ≥ 17

Drogas para Germes Urinários

136

CAPÍTULO 11CAPÍTULO 11CAPÍTULO 11CAPÍTULO 11:::: DOENÇAS SEXUALMENTE TRASMISSÍVEIS

PRINCIPAIS AGENTES ETIOLÓGICOS:

Cancro mole/cancróide � Haemophilus ducreyi

Gonorréia � Neisseria gonorrhoeae

Linfogranuloma venéreo (LGV) � Clamydia trachomatis

Sífilis � Treponema pallidum

Outras: Gardnerella vaginallis, Mycoplasma hominis, Ureoplasma urealyticum,

Calymmatobacterium granulomatis, Candida albicans, Herpes vírus e o protozoário flagelado

Trichomonas vaginalis, o qual vocês verão com detalhes na Parasitologia Médica (BP331).

Atualmente o número de doenças transmitidas pelo contato sexual aumentou (ver

tabela). Há as que são causadas por vírus: Herpes, hepatites, AIDS. Infecções por

bactérias: Salmonella, Shigella, Campylobacter. A Entamoeba histolytica, Giardia e

Enterobius são transmitidas após o contato bucolingual-anal.

O aumento das DST foi devido a mudanças do comportamento sexual, ligado a

diversos fatores, entre os quais:

• Maior liberdade sexual.

• Início precoce da atividade sexual.

• Multiplicidade de parceiros.

• Maior expressão social feminina

Doenças infecciosas e infestações transmitidas por contato sexual Tipo de Agente Agente Específico Doença ou Síndrome

Vírus

Citomegalovírus Vírus da hepatite A Vírus da hepatite B Vírus do herpes simples tipo 2 Vírus da imunodeficiência humana Vírus do molusco contagioso Vírus do papiloma genital

Citomegalovirose Hepatite A Hepatite B Herpes simples genital AIDS Molusco contagioso Condiloma acuminado

137

Bactérias

Calymmatobacterium granulomatis Campylobacter sp. Chlamydia trachomatis Gardnerella vaginalis Hemophilus ducreyi Mycoplasma hominis Neisseria gonorrhoeae Salmonella sp. Shigella sp. Treponema pallidum Ureaplasma urealyticum

Granuloma inguinal ou donovanose Enterite e enterocolite Uretrite, epidimite, proctite e linfogranuloma venéreo (no sexo masculino). Cervicite, endometrite, salpingite, bartolinite, síndrome uretral, proctite, peri-hepatite e linfogranuloma venéreo (no sexo feminino) Vaginite Cancro mole ou cancróide Salpingite, febre pós-abortamento, febre puerperal e pielonefrite Gonorréia (uretrite e outras síndromes) Salmonelose Shigelose Sífilis Uretrite, uretroprostatite e corioamnionite

Fungo Candida albicans Vulvovaginite e balanopostite

Protozoários Entamoeba histolytica Giardia lamblia Trichomonas vaginalis

Amebíase intestinal Giardíase Vulvovaginite e uretrite

Helmintos Enterobius vermicularis Enterobíase

Artrópodes Phthirus pubis Sarcoptes scabiei

Ptiríase ou pediculose pubiana Escabiose

SÍFILIS

Sífilis ou lues é causada por Treponema pallidum, geralmente, transmitida

sexualmente ou em relações muito íntimas. Mais raramente pode ser adquirida por

transfusão de sangue, acidentes de laboratório ou por via placentária.

O treponema penetra através de mucosas íntegras ou em efrações da pele. A

umidade favorece a instalação.

A sífilis é uma doença de evolução lenta e pode ser dividida em quatro fases:

Fase da Doença Caracterização

1 – Sífilis Primária Cancro duro

2 – Sífilis Secundária Roséolas

3 – Sífilis Latente Sem sintomas ou sinais

4 – Sífilis Terciária Sífilis cardiovascular ou neurossífilis (demência)

138

1. Sífilis Primária

Aparece de 2 a 6 semanas após o contágio e se manifesta com o aparecimento de

uma lesão chamada cancro duro ou protosifiloma. É uma lesão de 1 a 2 cm de diâmetro,

geralmente circular e única, bordas endurecidas (daí o nome) e elevadas, indolor e de fundo

liso com cor avermelhada. Cobre-se facilmente com secreção purulenta devido à infecção

por contaminantes. As localizações mais freqüentes são: pênis, vulva, parede vaginal, canal

endocervical e em menor freqüência no ânus, reto e na cavidade oral (faringe e tonsilas). O

cancro duro cura espontaneamente ao fim de 1 a 3 meses.

Fonte: Netter, 2006 Fonte: Rubin, 2006

2. Sífilis Secundária

O Treponema pallidum dissemina-se a partir da lesão inicial e pode acometer vários

órgãos e tecidos. Na pele aparecem manchas eritematosas chamadas roséolas sifilíticas

(principalmente no tronco). Na mucosa bucal a lesão tem semelhança com a afta e é rica em

treponemas. Podem aparecer lesões nas amígdalas, mucosa retal, vulva, prepúcio e reação

139

ganglionar. Além destas lesões, pode haver envolvimento de órgãos internos (nefrite,

hepatite, meningite, etc.).

Em pacientes não tratados, as lesões e os sintomas desaparecem após 1 a 3 meses.

Fonte: Mims, 2005

3. Sífilis Latente

Segue-se a sífilis latente que é assintomática, apenas revelada em provas

sorológicas. Esta fase pode durar de 1 a 30 anos.

4. Sífilis Terciária

É quando o caráter de infecção já é neurológico e cardiovascular. Pode ocorrer

aortite sifilítica, que é um tipo de endarterite obliterante dos vasa vasorum (os microvasos

que nutrem os leiomiócitos da túnica média dos grandes vasos, como foi visto em Histologia

I), pode ocorrer um aneurisma sifilítico e outras lesões que serão discutidas na disciplina de

Anatomia Patológica (MP313). Além disso, pode ocorrer neurossífilis lesando meninges,

córtex cerebral, medula e pares cranianos, e a sífilis terciária benigna (surgimento de uma

goma em qualquer órgão).

5. Sífilis congênita

É quando a sífilis é transmitida in utero, da mãe infectada para o feto, com

disseminação nos tecidos fetais, havendo proliferação e posterior resposta inflamatória.

Pode se apresentar de maneira assintomática, ou sintomas inespecíficos como rinite. Em

alguns casos dá-se origem à tríade de Hutchinson, que é um diagnóstico patognomônico da

sífilis congênita.

140

Tríade de Hutchinson

- queratite parenquimatosa com conseqüente cegueira

- hipocusia (surdez) vestibular (labiríntica)

- dentes ebtalhados semi lunarmente (o destista pode fazer o diagnóstico)

Resumo:

Fonte: Rubin, 2006 Fonte: Robbins, 2005

Diagnóstico Laboratorial

O diagnóstico laboratorial depende da fase da doença:

Sífilis Primária Diagnóstico direto – bacterioscopia para revelar

a presença do agente causador.

Sífilis

Secundária

Latente

Terciária

Diagnóstico indireto pela pesquisa de

anticorpos no sangue do paciente, através de

provas sorológicas.

Observação: em certas ocasiões, os clínicos requisitam bacterioscopia de lesões

secundárias de sífilis, principalmente de mucosas e em material ganglionar. Como também

alguns solicitam exame sorológico em sífilis primária, visto que esta fase pode durar até 3

meses e já após a segunda semana começam a surgir anticorpos específicos.

141

Coleta do material para bacterioscopia

1. Limpar a superfície da lesão com gaze embebida em solução salina estéril, para

remover os contaminantes.

2. Secar com gaze estéril.

3. Fazer pressão leve na base endurecida e coletar a serosidade que poreja da

lesão, utilizando alça metálica, tubo capilar ou fazendo um “imprint” com a própria

lâmina.

A bacterioscopia pode ser feita por diversos métodos:

a. Campo escuro (95% de positividade);

b. Coloração negativa;

c. Fontana-Tribondeau;

d. Imunofluorescência direta.

Campo escuro

É o método de escolha, de grande sensibilidade e uma positividade ao redor de 95%.

Técnica

Imediatamente após coletar a serosidade, cobrir com lamínula e observar. Os

treponemas medem de 6 a 10 µm de comprimento e 0,2 µm de espessura, apresentam

espiras apertadas, regulares e numerosas (de 10 a 14). Em campo escuro aparecem

apresentando grande mobilidade. Deve-se ter o cuidado de não confundir com outro

espiroqueta, o Treponema refringens, habitante freqüente da genitália. Encontrado em

lesões sifilíticas secundariamente infectadas e também em lesões genitais não luéticas.

Com experiência percebem-se logo as diferenças: o Treponema refringens é mais

refringente (daí o nome), mais calibroso, tem espiras mais abertas e menos numerosas. Em

lesões bucais, as formas espiraladas, como o Treponema microdentium, de morfologia

muito semelhante ao Treponema pallidum pode ocasionar resultados falso-positivos. O uso

de drogas antitreponêmicas locais ou sistêmicas ou o material coletado em lesões antigas,

podem dar resultados falso-negativos.

142

Técnica de Fontana-Tribondeau

Apesar de menos sensível e mais trabalhoso que a pesquisa direta em campo

escuro, o método de Fontana é usado principalmente em laboratórios clínicos de pequeno

porte que não dispõem de microscópios de campo escuro.

Observação: não se usa o Gram para evidenciar o Treponema pallidum por três

motivos:

1. Cora-se mal pelos corantes de anilina, devido a composição em lipídios.

2. Mesmo se corasse, não seria observado, pois seu calibre é de 0,2 µm, limite de

visibilidade em MO.

3. É muito frágil e não suportaria a fixação pelo calor usado no Gram.

Imunofluorescência Direta

Na imunofluorescência direta são usados anticorpos específicos conjugados com

fluoresceína. Há formação de reação Ag-Ac, Ag (bactéria) com anticorpo correspondente e o

Treponema aparece fluorescente, quando observado ao microscópio de luz ultravileta.

Reações Sorológicas

A partir da fase secundária da sífilis, são feitos exames sorológicos. O material é o

sangue do paciente.

Após a assepsia do local, coletar o sangue e deixar coagular. O soro sobrenadante é

submetido a diversos exames, visando encontrar anticorpos contra o treponema. O

sorodiagnóstico é feito por dois tipos de reação:

1. Reações com antígenos não-treponêmicos;

2. Reações com antígenos treponêmicos.

1. O antígeno não treponêmico é a cardiolipina extraída de coração bovino. É usado

nas reações de floculação: Kahn, Kline, VDRL e outras. É usado também em

reação de Wassermann, por Fixação de Complemento.

Observação: os clínicos costumam solicitar a pesquisa de anticorpos sifilíticos

através de: Soro Lues. Neste caso o laboratório clínico só fará: Kahn, Kline e

VDRL. Caso haja interesse em outros métodos, deve constar na requisição.

2. O antígeno treponêmico é usado em várias reações, entre elas:

� TPI: Treponema pallidum Immobilization;

143

� FTA: Fluorescent Treponema Antibody.

� FTA-ABS: Fluorescent Treponema Antibody Absorved Test

Fonte: Mims, 2005

O TPI é muito específico, apresentando reação cruzada apenas com o

Treponema pertenue (bouba) e Treponema carateum (pinta). Mas não é muito

utilizado em laboratórios clínicos por ser caro e de difícil execução. Há

necessidade de manter o Treponema pallidum suficientemente patogênico em

inoculação em coelhos, que devem ser mantidos no biotério em temperaturas

próximas de 18oC.

Atualmente cada vez mais usado em laboratórios clínicos é o FTA-ABS, que é de

fácil execução e de grande sensibilidade e especificidade, uma vez que o soro

suspeito é absorvido com antígenos de treponemas não patogênicos (Treponema

de Reiter). O Treponema pallidum e o Treponema reiterii têm antígenos em

comum e geram a formação de anticorpos comuns. Mas cada um deles tem

antígenos próprios. Absorvidos os anticorpos comuns, ficam somente aqueles do

Treponema pallidum.

O FTA-ABS consiste em dois sistemas Ag-Ac.

Treponema pallidum

x

Anticorpo

Anticorpo (gamaglobulina)

x

Soro antiglobulina humana

(conjugado com fluoresceína)

144

Técnica

1. Sobre uma lâmina preparada com Treponema pallidum fixado é colocado o

soro suspeito absorvido.

2. Colocar o complexo soro antigamaglobulina humana + fluoresceína. Caso

haja anticorpos anti-sifilíticos, a antigamaglobulina reagirá com ele. Levada

ao microscópio de luz U.V. aparecerão os treponemas fluorescentes em caso

positivo.

Observação: o treponema pallidum não se cultiva em meios bacteriológicos

artificiais e nem em cultura de células.

Soro suspeito com Ac Treponema pallidum

Antigamablobulina com fluoresceína GONORRÉIA

Gonorréia ou blenorragia é causada pela Neisseria gonorrhoeae. A Neisseria é um

diplococo Gram negativo justaposto pela face plana ou côncava em forma de grão de café

ou dois rins justapostos. Fica alojado dentro de neutrófilos em secreção (ela consegue

entrar no PMN graças à proteína Rmp).

É de transmissão pela relação sexual. Acontece com maior freqüência nos

adolescentes e adultos jovens. A gonorréia é normalmente sintomática em homens e

geralmente assintomática em mulheres. As infecções do trato genital, anal, do reto e da

faringe atuam como fontes na propagação do gonococo. A manifestação na orofaringe

aparece em indivíduos que praticam sexo oral sem preservativo.

Os recém nascidos podem ser contaminados durante o parto ao atravessarem o

canal vaginal, e apresentar infecção ocular gonocócica, chamada oftalmia do neonato.

145

Transmissão

Não-sexual

a) Oftalmia neonatal

b) Vulvovaginite em

crianças

Gonococo �

mucosas

Homens (uretrite)

a) Cistite

b) Pielite

c) Proctite

d) Orquite

e) Epididimite

Transmissão

Sexual

Mulheres (cervicite)

a) Salpingite: podendo

esterilizar

b) Metrite: podendo

disseminar, causando

peritonite ou proctite

Quadro clínico

As manifestações ocorrem após 2 a 5 dias do contágio. Nos homens aparece fluxo

mucoporulento uretral abundante. Nas mulheres somente 10 a 20% apresentam quadro

clínico agudo, podendo aparecer vulvovaginite com secreção purulenta e abundante.

Geralmente os casos são de endocervicite. Se a gonorréia não for tratada nas 2 semanas

iniciais, haverá propagação da infecção em 50% dos casos masculinos, para glândulas

anexas causando epididimite, orquite, e a mais freqüente é a prostatite. Em mulheres a

propagação resultará em metrite e salpingite.

Podem ocorrer manifestações extragenitais como anorretite, artrite, meningite e

endocardite.

Fonte: Netter, 2006

146

Diagnóstico laboratorial: Bacterioscopia e Cultura

Coleta do material

Em homens:

O melhor material é a secreção uretral.

A coleta deve ser feita pela manhã, antes da primeira micção:

1. Limpar a secreção externa com gaze estéril embebida em salina.

2. Enxugar.

3. Introduzir um swab fino, 2 cm no canal uretral após a fossa navicular e absorver a

secreção.

Observação: pode-se coletar outros materiais como: urina (1o jato miccional),

esperma e líquido prostático.

Em mulheres:

Dar preferência à secreção do canal endocervical.

1. Após introduzir o especulo, limpar com gaze estéril a secreção da vagina e do

colo do útero.

2. Introduzir o swab no canal endocervical e absorver a secreção.

3. Retirar o swab com cuidado para não contaminar com bactérias da vagina.

Bacterioscopia pelo Gram

Tem valor diagnóstico somente em uretrites gonocócicas masculinas e nas

vulvovaginites agudas. Em todos os outros casos é necessário fazer a cultura de bactérias.

Na bacterioscopia aparecerão os gonococos na forma de diplococos Gram

negativos, intra e extracelulares.

Fonte: Tortora, 2005

147

Cultivo

O cultivo é feito de preferência no meio de cultura de Thayer-Martin Modificado

(TMM), que é um ágar chocolate acrescido de antibióticos: vancomicina, colistina, nistatina e

trimetoprim. Pode ser utilizado o ágar chocolate também.

Técnica (recomendada pelo Ministério da Saúde/PN-DST-AIDS) e seguida pelo Lacen:

1. Estriar o meio em forma de Z rolando o swab suavemente sobre a superfície.

2. Com alça de platina fazer estrias em sentido transversal ao Z.

3. Colocar uma tampa para baixo em uma lata que possa ser fechada

hermeticamente (lata de biscoitos).

4. No fundo da lata colocar uma mexa de algodão embebido em água para

preservar a umidade deste ambiente.

5. No fundo da lata ou sobre a placa, colocar uma vela e acendê-la.

6. Fechar a tampa e segurar.

7. A vela apaga quando o O2 fica exaurido, deixando uma atmosfera de

aproximadamente 5 a 10% de CO2, própria para a proliferação do gonococo.

8. Incubar com a lata em estufa a 35oC durante 48h.

O TMM é específico para cultura de gonococo. Após a incubação examinar as

colônias: gonococo cresce dando colônias brilhantes, mucóides e acinzentadas de tamanho

variável.

Fazer bacterioscopia pelo Gram: após a cultura aparecerão as formas de autólise: os

gonococos vão aparecer em formas atípicas como cocos intumescidos com fraco contorno e

palidamente coradas. A seguir realizar provas bioquímicas.

Liberação de Laudo

Negativo: não foram encontrados diplococos Gram negativos no exame

bacterioscópico. Cultura: não houve crescimento de Neisseria gonorrhoeae em meio de

Thayer-Martin após 48h de incubação.

Positivo: presença de numerosos (ou vários, ou alguns, ou raros) diplococos Gram

negativos intra e/ou extracelulares. Polimorfonucleares acima de 30 por campo; ou de 20 a

25 p/c; 5 a 10 p/c; abaixo de 5 p/c. Cultura: positiva para Neisseria gonorrhoeae.

148

URETRITES NÃO GONOCÓCICAS

As uretrites não gonocócicas são causadas por Chlamydia trachomatis, Gardnerella

vaginalis, Ureaplasma urealiticum, outras bactérias, protozoários e vírus.

No ser humano a uretrite por Chlamydia é a infecção mais comum.

LGV (Linfogranuloma Venéreo)

Agente etiológico: Clamydia trachomatis

Ocorre mais em homens. Infecção sistêmica acometendo tecido linfático. Primeiro

forma-se uma ulceração local formada por uma pápula ulcerada no local da inoculação.

Pode haver febre, cefaléia e mialgia. A Clamydia se oculta, mas forma infecções em

linfonodos inguinais, causando edema. A partir da circulação linfática, ela pode se

disseminar para outros órgãos. Pode fazer hepatite, proctite (inflamação no ânus),

pneumonite, meningoencafalite, etc. Por via inguinal pode causar uretrite, epididimite,

ccervicite (do cérvix na mulher), bartolinite (uma inflamação nas glândulas de Barthollini, que

fazem lubrificação na vagina), salpingite (salpingite de tubas UTERINAS, não tubas

auditivas, “salpingus” vem de tuba) 15-20% dos pacientes que tem gonorréia, têm a

Clamydia também. É a maior causa de uretrite não gonocóccica.

Lembrando que clamídias são intracelulares obrigatórias, portanto, temos que coletar

a célula, não só a secreção. Tanto que se acreditava que as clamídias eram, na verdade,

vírus. Para cultivá-las precisamos utilizar meios de cultura que tenham células eucarióticas.

As lesões iniciais são mais freqüentes em sulco bálano prepucial e face interna dos

pequenos lábios. Faz adenopatia inguinal unilateral. Abscessos (pontos de flutuação)

fistulizam e disseminam para o resto do organismo via linfática. Há material purulento

espesso.

Não confundir com Dovanose (granuloma inguinal) causada pelo Calymmatobacterium

granulomatis

149

Fonte: Netter, 2006 Fonte: Mims, 2005

Há 3 fases:

Primária: Pápulas nos órgãos genitais

Secundária: Manifestações sistêmicas

Terciária: Fibrose, drenagem linfática inapropriada.

Alguns pesquisadores (Belle Grayston, 1986) afirmam que no sexo masculino, a

uretrite por Chlamydia e 2,5 vezes mais freqüente do que a uretrite gonocócica. Outros

dados mais recentes apresentam a Chlamydia como responsável por 50% das uretrites.

Nos homens a uretrite por clamídia apresenta quadro clínico semelhante à uretrite

gonocócica, embora a secreção uretral seja mais moderada ou escassa e menos purulenta,

sendo mais aquosa ou mucóide.

O período de incubação é de duas a três semanas, enquanto o do gonococo é de 2 a

7 dias.

As complicações podem aparecer em tempo variável, podendo ser graves. A mais

importante no homem é quando acomete a próstata e às vezes as vesículas seminais,

levando à infertilidade.

Nas mulheres pode infectar útero, trompa e ovários.

As clamídias são organismos cocóides, imóveis, sendo parasitas intracelulares

obrigatórios. Duplicam-se no citoplasma das células do hospedeiro, formando inclusões

características. Estas inclusões podem ser observadas ao microscópio, utilizando coloração

de Giemsa ou usando anticorpos específicos conjugados com fluoresceína.

Devido o seu parasitismo obrigatório, não é possível cultivá-la em meios artificiais.

Só se cultivam em sistemas vivos: saco vitelino de ovos embrionados, cultura de tecidos,

mas as mais usadas são as células Hela e células McCoy.

150

CANCRO MOLE (CANCRÓIDE)

Agente etiológico: Haemophilus ducreyi

Meio de cultura: ágar chocolate em microaerofilia, para a cultura é feito o esfregaço das

células e/ou aspirado de linfonodos (onde o Haemophilus pode se alojar).

Manifestam-se como úlceras genitais DOLOROSAS. (o cancro da sífilis NÃO é doloroso)

Fonte: Netter, 2006 Fonte: Google Imagens

VAGINOSE BACTERIANA

Esta doença, também conhecida como vaginite anaeróbia, ainda não foi claramente

definida. A sintomatologia típica é queixa de mau odor, muitas vezes associado ao aumento

do fluido vaginal, freqüentemente mais notado após a menstruação ou coito.

Às vezes a paciente pode se queixar de prurido vulvar ou erupção perivulvar. O pH

vaginal geralmente é maior que 4,5. O principal agente etiológico envolvido é a Gardnerella

vaginalis. Uma das características marcantes da secreção de vaginose bacteriana à

microscopia óptica é a presença de clue cells (células epiteliais da vagina cobertas de

bactérias).

Clue-cells Fonte: Google Imagens

151

Exame laboratorial

A microscopia do exsudato vaginal pelo Gram, mostra células-chave (células

epiteliais cobertas por um grande número de cocobacilos Gram-variáveis) com pequeno

número de leucócitos polimorfonucleares e número diminuído de lactobacilos.

A cultura não é muito utilizada.

Patogenicidade

A patogenicidade da Gardnerella vaginalis ainda não foi estabelecida. É considerada

por alguns pesquisadores como resultado do desequilíbrio entre a microbiota vaginal

normal, com a relação sinérgica entre o número aumentado de Gardnerella e anaeróbios.

O microrganismo é raramente encontrado em homens.

CANDIDÍASE

A infecção por Candida albicans é a infecção fúngica mais comum na prática genito-

urinária.

A candidíase pode ser transmitida ou exacerbada pela relação sexual, mas a maioria

das infecções (particularmente em mulheres) resultam de auto-inoculação do reto.

Os sintomas podem ser causados por hipersensibilidade ou infecção. No primeiro

caso as manifestações microbiológicas são negativas.

Na prática médica a doença pode se manifestar com sintomas em apenas um dos

parceiros, mas é essencial examinar e tratar o parceiro assintomático para reduzir a chance

de reinfecção.

Mais detalhes: ver páginas 189 a 192.

Exame laboratorial

O exame laboratorial é feito pela demonstração do agente causador por microscopia

pelo Gram ou Preparação a Fresco.

A cultura pode ser feita no Meio de Sabouraud.

152

CAPÍTULO 12CAPÍTULO 12CAPÍTULO 12CAPÍTULO 12: : : : MICOBACTERIOSES

Micobactérias são assim classificadas por terem sua parede celular diferente das

demais bactérias. São bacilos retos ou um pouco curvados, imóveis e dispostos na forma de

paliçada ou de globias. Sua classificação é de bacilo pela forma e micobactéria pela

bioquímica da parede. O micolato é o principal componente da parede celular, a qual é

denominada de "cerosa" pelo Robbins. Esse ânion é quem dá a esses microrganismos a

característica de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). Ou seja, não se coram

facilmente pelo Gram, uma vez que eles retêm os corantes quando tratados com álcool e

ácido, tornandos-os fracamente positivos neste método.

Principais espécies de interesse médico:

� Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae

Outras espécies: Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, etc.

TUBERCULOSE (TB)

A tuberculose é uma doença extremamente contagiosa. Causa grande mortalidade

no mundo inteiro, como três milhões por ano. Registram-se atualmente cerca de 5 milhões

de casos, sendo que este número tem crescido. A tuberculose é um grave problema de

153

saúde pública, visto que cada tuberculoso pode disseminar o bacilo no convívio familiar e

social.

Apesar de se conhecer o agente causador, a maneira de transmissão e o tratamento

adequado, a tuberculose é um problema preocupante.

A tuberculose humana é causada também pelo Mycobacterium bovis e outras

espécies (ver tabela).

Espécies de micobactérias de maior significado clínico

Espécie Grupos de Runyon Significado clínico

M. ulcerans

M. tuberculosis

M. bovis

Sempre patogênicas

M. marinum

M. kansasii

I (fotocromógenas) Geralmente patogênicas

M. scrofulaceum

M. xenopi

II (escotocromógenas) Geralmente patogênicas

M. avium

M. intracellulare

III (não-cromógenas) Geralmente patogênicas

M. fortuitum

M. smegmatis

IV (rápidos crescedores) Geralmente não-patogênicas

Transmissão: doença inflamatória infecciosa, de caráter contagioso, que evolui por surtos,

sendo o acometimento pulmonar a maior causa de morbidade e mortalidade .

Contágio: aquisição de bacilos através do contato direto com os portadores da doença

(perdigotos), através do uso de utensílios contaminados (fômites), também através de

permanência contínua e prolongada em meio ambiente contaminado. Aerossóis

respiratórios são a principal forma de disseminação, pois ela é uma bactéria aeróbia e tem

tropismo por alvéolos. Desta forma, as pessoas cujo escarro possui BAARs visíveis à

microscopia são consideradas portadoras da micobactéria.

Fatores predisponentes: doenças ou condições debilitantes. Essas pessoas são

enquadradas dentro de grupos de risco: marginalizados, tóxico-dependentes, idosos, HIV+,

transplantados, portadores de IRC, câncer, etilistas, diabéticos, portadores de neoplasias,

grupos socialmente desfavorecidos, desnutridos e emigrantes. Há a TB gastrointestinal

(Mycobacterium bovis), a aquisição do bacilo se faz pela ingestão de leite não-pasteurizado.

154

Fisiopatologia:

Inalação do BAAR via aerossóis � alvéolo

Primeiras semanas: a infecção primária ocorre no pulmão (lembre-se de que o hospedeiro

ainda não tem resistência).

As micobactérias são fagocitadas pelos macrófagos alveolares.

Fonte: Fernando Bortolozzi Fonte: Netter, 2005 (Fisiologia)

Macrófago alveolar

Dentro dos macrófagos, os BAAR têm dois destinos:

1) Serem mortos e eliminados.

2) Continuarem resistentes e fazerem lise dos macrófagos. Os macrófagos liberam

quimiocinas e fazem quimiotaxia de neutrófilos e monócitos circulantes (circulo vicioso).

� O Mycobacterium tuberculosis possui uma cápsula de composição lipoprotéica que

interfere na fusão deste microrganismo com os fagolisossomos dos macrófagos alveolares.

Isso possibilita a sobrevida dos BAAR no interior destas células, se não houver o correto

direcionamento da ação enzimática dos macrófagos pelas linfocinas.

As quimiciocinas se ligam na α-hélice dos receptores transmembrânicos dos

monócitos e neutrófilos. Isso ativa a cascata das integrinas e provocam alterações no

citoesqueleto, promovendo a migração destas células para os tecidos.

155

Há Reação de Hipersensibilidade tipo IV (Tardia) � macrófagos cercam o bacilo e

formam o ganuloma (um tipo de inflamação crônica). A Imunologia Médica (BP333)

explicará os mecanismos imunológicos da hipersensibilidade e a Patologia Médica

Molecular (BP334) mostra os mecanismos deste tipo de inflamação crônica.

Tentemos entender: de um lado os macrófagos ativados estão tentando conter a infecção e

do outro eles provocam dano tecidual nos órgãos infectados (liberam EROs).

� EROs é uma sigla que quer dizer espécies reativas de oxigênio. São radicais livres.

Geralmente são produzidos dentro de fagócitos como neutrófilos e macrófagos. Essas

células os produzem no intuito de dar cabo das bactérias patogênicas.

Nos pulmões, esse processo leva a cavitações e a disseminação de bactérias.

Posteriormente há fibrose extensa e isso pode ser demonstrado em radiografias do tórax.

(Aspecto radiográfico típico da tuberculose, o pulmão "em cavernas" na radiografia que será

visto nas aulas de propedêutica).

O Mycobacterium tuberculosis promove a formação de um granuloma "imunológico"

(o termo imunológico é utilizado pela presença de linfócitos na lesão). Células gigantes e

células epitelióides são os tipos celulares mais comuns encontrados nesses granulomas. As

mononucleadas, porém aumentadas são as epitelióides. Elas são derivadas de macrófagos

ativados pelas citocinas. Estas células secretam continuamente TNF, fazendo com que o

processo inflamatório continue. As células polinucleadas são as células gigantes do tipo

Langerhans (originadas pela fusão de vários macrófagos).

Célula gigante típica de granulomas

Fonte: Junqueira, 2004 (Histologia Básica)

156

O Granuloma

Granuloma é um tipo de inflamação crônica, que tenta conter a propagação de algo

que o organismo não conseguiu dar cabo. Também é o padrão da resposta de

hiperssensibilidade tipo IV. Esse tipo de resposta imune será abordado nas aulas de

Imunologia Médica (BP333), bem como haverá um seminário específico para a

imunopatogênese desta doença.

A Histologia de um Granuloma Tuberculoso

Uma área central de necrose caseosa (núcleo semi-sólido macio), circundada por

uma outra área cheia de macrófagos, células epitelióides e células gigantes. Adjacente a

essa coroa existe uma bainha de linfócitos T e mais externamente uma deposição fibrosa,

com fibroblastos e formação de colágeno tipo I (está começando a ser formada a tríplice

hélice do pró-colágeno. Uma vez empacotado pelo complexo de Golgi, esse colágeno fica

mais denso e delimita os granulomas). Se a pessoa infectada for incapaz de produzir uma

resposta imunológica adequada, o granuloma é bem menos organizado e pode consistir

apenas em um agregado de macrófagos, sem arquitetura clássica das células gigantes. Ou

seja, a anatomia patológica pode sugerir por si só um quadro de imunocomprometimento

(suspeitar de HIV e correlacionar sempre com a história clínica do paciente).

Histologia do granuloma

157

Necrose caseosa: a área central necrosada adquire um aspecto de queijo branco (do latim

caseum).

Necrose é a morte celular forçada, quando a célula atinge o ponto de não-retorno. Quando

uma célula não tem mais suprimento de O2, alimento, eletrólitos, substratos, etc. Isso ocorre

nas isquemias prolongas, por exemplo. Isquemia é o bloqueio na condução do sangue para

uma certa região do corpo. Como não tem sangue, também não terá mais oxigênio nem

suprimento para as células.

Granulomas à microscopia óptica (isso será visto com detalhes na Anatomia Patológica)

Fonte: Bogliolo, 2006 Fonte: Rubin, 2006

Complexo de Ghon

Complexo de Ghon é um nome que damos a um quadro na TB. E isso explica o

porquê da imunidade na tuberculose é do tipo celular. A própria formação do granuloma

explica que a imunidade é celular.

158

As células T sensibilizadas liberam linfocinas (linfocina é uma citocina que recebe

esse nome porque veio do linfócito). Na verdade o próprio granuloma explica isso, uma vez

que o organismo não consegue dar conta de matar o BAAR.

Resumo:

Complexo de Ghon = granulomas no pulmão + linfonodos hilares e mediastínicos

comprometidos.

Complexo de Ghon

Formas clínicas:

Tuberculose Primária: Complexo de Ghon

Tuberculose Primária progressiva:

Uma pequena porção de microrganismos fica viável por anos. A tuberculose

pulmonar primária progressiva é uma evolução alternativa menos comum, na qual a

resposta imunológica não consegue controlar a multiplicação dos BAAR da tuberculose. A

infecção toma esse curso em menos de 10% dos adultos normais, mas é comum nas

crianças com menos de 5 anos de idade e em pacientes com imunidade suprimida ou

prejudicada. O foco de Ghon no pulmão aumenta e pode mesmo erodir dentro da árvore

brônquica. Os linfonodos hilares e mediastínicos acometidos também aumentam, às vezes

comprimindo os brônquios a ponto de produzir atelectasias do pulmão distal; o colabamento

do lobo médio ("síndrome do lobo médio") é uma conseqüência comum dessa compressão.

159

Em alguns casos, os linfonodos infectados erodem em uma via respiratória, disseminando

microrganismo pelos pulmões (pneumonia tuberculosa).

Tuberculose Secundária:

Esse estágio é quando há reativação da TB pulmonar primária ou uma nova infecção

em hospedeiro previamente sensibilizado por TB primária. Ocorre uma resposta imune

celular após um intervalo latente e essa resposta provoca a formação de muitos granulomas

e necrose tissular extensa. Os segmentos apical e posterior dos lobos superiores são mais

comumente acometidos. Desenvolve-se uma lesão mal definida, fibrótica e difusa, que exibe

áreas focais de necrose caseosa. É a TB cavitária. A parede da cavidade é feita de uma

membrana interna delgada, cinza, que compreende núcleos necróticos moles, uma zona

média de tecido de granulação e uma borda colagenosa. A luz é preenchida de material

caseoso contendo BAAR. A cavidade tuberculosa em geral comunica-se livremente com um

brônquio, e a liberação do material infeccioso para as vias aéreas serve para disseminar a

infecção no pulmão. É a reativação da região de granulomas.

Disseminação bronquial

Tuberculose Miliar:

A infecção localiza-se em disseminadas regiões produzindo lesões nodulares

amarelas (granulomas tuberculosos), pequenas e múltiplas em vários órgãos. O termo miliar

é usado porque tem aparência amarela (como milho). Pulmões, linfonodos, rins, supra-

renais, fígado, baço e medula óssea são locais comuns de lesões miliares. Resulta da

disseminação hematogênica dos BAAR, em geral de TB pulmonar secundária, mas muitas

vezes de TB pulmonar primária ou de outros locais. A lesão progressiva pode atingir as

meninges e provocar meningite tuberculosa.

160

Disseminação hematogênica e TB miliar

Fonte: Rubin, 2006

161

Revisando:

Fonte: Robbins, 2005

Exame Físico da TB Pulmonar

- Sibilos e Roncos

- Diminui murmúrio vesicular

- Broncofonia (pelo derrame pleural)

- Sopro anafórico

- Hepatoesplenomegalia

Diagnóstico Laboratorial

Material: de acordo com a localização.

Pulmonar: 1 – Escarro.

2 – Conteúdo gástrico.

162

3 – Lavado gástrico.

4 – Lavado brônquico.

Renal: Urina.

Meningite: Líquido cefalorraquiano.

Óssea / ganglionar: Punção.

Observação:

� Descontaminar: escarro, urina, pus de abscessos fistulizados.

� Não precisa descontaminar: líquor, derrame peritoneal, derrame articular, líquido

pleural (colheita asséptica, frasco estéril).

Diagnóstico Laboratorial

Direto (bacterioscopia) 1. Bacterioscopia: Ziehl-Neelsen, antes e

após homogeneização.

2. Cultura: Löewenstein-Jensen (30 dias).

3. Inoculação: cobaia, coelho.

Indireto 1. Sorológico: hemaglutinação, fixação do

complemento.

2. Alérgico: intradermorreação com PPD

pela técnica de Mantoux ou outras.

A localização mais freqüente é a tuberculose pulmonar. O material a coletar é o

escarro. Quando este resultar negativo, podem-se usar outros materiais conforme citado.

Coleta do material

1. Recolher o escarro em frasco limpo. Orientar o paciente que recolha material da

expectoração e não a saliva.

2. Levar ao laboratório. No laboratório o escarro será submetido a uma

bacterioscopia pelo método de Ziehl-Neelsen.

Técnica

1. Depositar a parte do escarro de preferência mais purulenta ou sanguinolenta e

distribuir uniformemente.

163

2. Secar.

3. Fixar na chama.

4. Corar pelo método de Ziehl-Neelsen. Em caso positivo, aparecerão os BAAR em

vermelho em maior ou menor quantidade.

BACILOSCOPIA DO ESCARRO

A colocaração de rotina é o Zeihl Neelsen. À microscopia ópica, apresentam-se

como bacilos retos ou ligeiramente curvados, isolados ou dispostos em grupos irregulares

ou paliçada. Paliçada é uma disposição como se fosse um muro.

Fonte: Robbins, 2005

Paliçadas do Mycobacterium tuberculosis observadas ao MO em escarro de paciente.

Resultado Quantitativo

No escarro é necessário usar a contagem de maneira sistemática anotando-se o

número de campos examinados e a quantidade de bactérias. Considerado como exame

básico obrigatório em todos os laboratórios de análises clínicas, que fazem rotina

bacteriológica para diagnóstico e controle de tratamento. As lâminas, mais de uma, devem

ser examinadas exaustivamente; em caso de não aparecer os BAAR, examinar no mínimo

400 campos microscópicos em cada lâmina (segundo a recomendação do Instituto Pasteur,

referência internacional em tuberculose).

Segundo a OMS, temos os resultados da seguinte maneira:

164

- Nenhum BAAR em 100 campos examinados. + Menos de 1 BAAR por campo, em 100 campos examinados.

++ De 1 a 10 BAAR por campo, em 50 campos examinados. +++ Mais de 10 BAAR por campo, em 20 campos examinados.

Com o resultado quantitativo, o clínico pode avaliar o resultado do tratamento

adequado ou em caso que os bacilos não estejam diminuindo, mudar o esquema da

terapêutica.

Quando o resultado direto do escarro der negativo, pode se recorrer à chamada

homogeneização. Existem diversos materiais usados para esta finalidade, como: tratar com

KOH ou ácidos diluídos ou trifosfato de sódio, uns mais agressivos, outros menos. Estes

produtos vão fluidificar o escarro dissolvendo a mucosidade. Centrifugado em seguida,

concentra as bactérias antes presas na viscosidade do muco. Ao mesmo tempo serve para

descontaminar o escarro, rico em microbiota contaminante. Do sedimento faz-se nova

bacterioscopia pelo Ziehl-Neelsen, em caso negativo, utilizar o restante do sedimento para

cultura. Persistindo suspeita clínica, solicitar novas amostras de escarro.

Cultivo

O cultivo é feito em meios especiais como o de Löewenstein-Jensen enriquecido com

lipídeos. Fechar o tubo com parafina para evitar a ressecação do meio que vai ficar

incubado a 37oC de 30 a 60 dias.

O bacilo da tuberculose é de crescimento lento; o tempo de geração é de mais ou

menos 20h.

O clínico pode requisitar o antibiograma caso haja resistência do bacilo aos

medicamentos prescritos.

Meio de cultura: Lowenstein-Jensen

Fonte: Profª Alessandra Daur

165

O meio Bactec consegue promover crescimento do bacilo da tuberculose dentro de

15 dias e pode ser uma revolução no cultivo desta espécie para diagnóstico. Isso será

discutido na disciplina clínica de Pneumologia.

4) Teste PPD cutâneo

Para identificar M. tuberculosis quando a bacterioscopia deu negativa.

TA (tuberculina antiga) � reação cutânea em TB

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

DIFERENCIAR HIPERSENSIBILIDADE TUBERCULÍNICA DE HIPERSENSIBILIDADE GRANULOMATOSA (BP333). Será que o indivíduo já não foi vacinado com a BCG?

O PPD mais serve para ver como está a imunidade do paciente frente ao bacilo do que como um método de diagnóstico propriamente dito.

É bom lembrar que ele só dará positivo num período de 4 (às vezes até 6) semanas semanas após a infecção do bacilo. É feito uma inoculação do Mycobacterium bovis atenuado na pele, e aguarda-se 48-72h para ver se tem endurecimento local e eritema.

Tratamento da Tuberculose: terapia RIP

Rifampicina

Isoniazida

Pirazinamida Fonte: Robbins, 2005

166

HANSENÍASE (Mal de Hansen)

É uma doença crônica conhecida desde a mais remota antiguidade. Estudada

exaustivamente durante muito tempo, ainda assim pouco se sabe sobre o período de

incubação e maneira de transmissão.

O bacilo causador, Mycobacterium leprae, não é cultivável em meios bacteriológicos

ou culturas celulares. Ele é um agente monoxeno. Outros mamíferos têm o BAAR, mas não

o manifestam.

Em patogenicidade experimental em homens, as tentativas resultaram infrutíferas.

Em animais de laboratório, há descrições de multiplicação do bacilo de Hansen em

camundongos, tatus e primatas.

Transmissão: aglomerações excessivas e falta de higiene. Contato direto e inoculação de

aerossóis. A exposição prolongada a uma fonte infectada é necessária para ocorrer

transmissão. Acredita-se que para contrair a doença tenha que se ter uma predisposição

genética.

As características clínicas da hanseníase dependem de resposta celular.

O Mycobacterium leprae cresce dentro de outras células

Especialmente histiócitos (histiócitos são aqueles macrófagos não ativados que

residem no tecido conjuntivo e ficam esperando algo para algum dia fagocitar, bem como os

macrófagos não ativados da pele chamam-se células de Langerhans, os do SNC de

micróglia, os do fígado de células de Kupffer, os do tecido conjuntivo normal chamam-se

histiócitos.

Há dois tipos de Hanseníase. Na verdade o agente etiológico é sempre o mesmo, o

Mycobacterium leprae. Mas há dois tipos de manisfestações clínicas, e sim, são detectáveis

clinicamente.

Hanseníase tuberculóide (TT): lesões eritematosas com áreas anestesiadas na face,

tronco e extremidades.. Espessamento palpável dos nervos periféricos (o BAAR se

multiplica nas bainhas dos nervos periféricos) O indivíduo tem resposta alérgica exagerada

167

e tem maior predisposição a outras infecções bacterianas. Há intensa resposta da

imunidade celular. Há formação de granulomas na derme, por isso, tuberculóide.

Fonte: Mims, 2005

Hanseníase lepromatosa (LL): Tem envolvimente extenso da pele. Há perda parcial das

sobrancelhas (um sinal clínico importantíssimo e PATOGNOMÔNICO da hanseníase,

chama-se MADAROSE), espessamento e dilatação das narinas, orelhas e bochechas,

resultando na aparência típica leonina. Há destruição do septo nasal e a parede nasal fica

rica em bactérias. Nessa fase, a resposta imune celular é fraca. No exame, os BAAR

tornam-se extracelulares e agrupam-se em globias.

Com o tempo, pode haver destruição intensa das estruturas faciais, nervos

periféricos, o que, pela conseqüente falta de sensibilidade, leva a traumatismos repetitivos

em mãos e pés, com conseqüente infecção bacteriana secundária. SECREÇÕES

(PRINCIPALMENTE NASAIS) DE PACIECTES COM HANSENÍASE LEPROMATOSA SÃO

INFECTANTES (HÁ GLOBIAS).

Fonte: Profª Alessandra Daur Fonte: Anatomia Patológica do HC

168

Diagnóstico Laboratorial

� Mycobacterium leprae não cresce em nenhum meio de cultura.

� Cresce em temperaturas menores do que 37°C, por isso sua preferência por habitar a

pele e a linfa (tecidos periféricos que têm temperaturas mais baixas).

� O crescimento é lento, pode levar até anos para que ocorram as manifestações clínicas.

O diagnóstico laboratorial é feito praticamente pela bacterioscopia, por Ziehl-Neelsen

em material coletado das lesões ou da serosidade da pele; eventualmente poderão ser

usadas provas sorológicas.

Técnica de Wade (para coleta de linfa cutânea)

Local da coleta:

a) 2 lóbulos da orelha;

b) 2 cotovelos.

1. Fazer assepsia do local com álcool iodado. Fazer isquemia com auxílio de pinça

ou dedos para evitar o fluxo de sangue.

2. Com o bisturi, fazer cortes na pele, de aproximadamente de 5 mm de

comprimento e 2 mm de profundidade e recolher a serosidade (linfa) sobre uma

lâmina nova. A linfa será coletada dos quatro locais uma ao lado da outra sobre a

mesma lâmina.

3. Identificar os esfregaços e a lâmina.

4. Secar os esfregaços ao ar.

5. Fixar na chama.

LD LE CD CE

6. Corar pelo método de Ziehl-Neelsen.

Leitura: os bacilos aparecerão em vermelho, isolados e formando grupamentos

chamados globias, que são características do Mycobacterium leprae.

169

À microscopia são vistos BAAR em forma de globias.

Fonte: Profª Alessandra Daur

Fernando Bortolozzi

Fonte: Tortora, 2005

Histologia dos Tipos Clínicos de Hanseníase

Fonte: Rubin, 2006

170

CAPÍTULO 13:CAPÍTULO 13:CAPÍTULO 13:CAPÍTULO 13: LEPTOSPIROSE

AGENTES ETIOLÓGICOS

O gênero Leptospira, em meio ao mundo contemporâneo das técnicas de Biologia

Molecular, já foi classificado em 18 genomoespécies (só distinguidas por PCR).

Classicamente, esse gênero possuía apenas duas espécies: a L. interrogans e a L. biflexa,

distinguidas fenotipicamente. A espécie patogênica era a Leptospira interrogans e a

saprófita, a Leptospira biflexa. No entanto alguns conceitos estão mudando.

As duas espécies juntas apresentam aproximadamente 260 sorovares (cepas –

aglutinação com soro anti-sorovares conhecidos). E estas cepas podem ser classificadas

por biologia molecular (genótipo) e por sorologia (fenótipo). Sorologicamente, estes

sorovares se agrupam em aproximadamente 27 sorogrupos (24 sorogrupos patogênicos e 3

sorogrupos saprófitas). Sorogrupos relacionam a relação antigênica entre os sorovares. A

Biologia Molecular classifica o gênero Leptospira em 16 a 18 espécies genômicas (não só

as duas espécies clássicas da imunologia), há uma classificação mais detalhada). Destas 18

genomoespécies, dez são constituídas por sorovares patogênicos, seis com sorovares

saprofitas e duas com sorovares patogênicos e saprófitas.

Fonte: Google Imagens

171

No entanto, de uma maneira geral, os microbiologistas ainda denominam a

Leptospira interrogans como agente etiológico da leptospirose, uma vez que as técnicas de

PCR ainda são relativamente novas.

Os microrganismos do gênero Leptospira são espiroquetas finas e móveis, muito

espiraladas, com 5-20 µm de comprimento. Apresentam um movimento rotacional ativo e

possuem dois flagelos internos (periplasmáticos), que se originam em cada extremidade da

bactéria (isto permite que ela escave tecidos do hospedeito). São aeróbios obrigatórios e

necessitam de ácidos graxos de cadeia longa para sua nutrição. Eles não se coram

adequadamente pelos corantes de rotina e necessitam de microscopia de campo escuro, ou

impregnação pela prata (Fontana Trebondeau), para sua visualização ao MO.

As extremidades da Leptospira interrogans curvam-se no formato de um "ponto de

interrogação", por isso seu nome.

Classificação Molecular: 18 espécies genômicas � 10 com sorovares patogênicos 06 com sorovares saprófitas 02 com patogênicos e saprófitas

Classificação Sorológica: 24 sorogrupos patogênicos 03 sorogrupos saprófitas (+ de 260 sorovares)

172

Estas bactérias necessitam de condições e meios especiais (meio Fletcher) para que

haja crescimento, podendo ser necessárias várias semanas para que a cultura se torne

positiva (o período de multiplicação é de aproximadamente 12 horas).

As espiroquetas morrem com exposição ao ressecamento, ao calor ou a detergentes

e desinfetantes, mas permanecem viáveis por várias semanas na água alcalina e no solo

úmido. Os meios de cultura utilizados são os meios de Fletcher.

EPIDEMIOLOGIA

A leptospirose é uma (antropo)zoonose importante, de distribuição mundial. É

também uma doença infecciosa emergente que ocorre em surtos. A notificação ao Ministério

da Saúde é compulsória, no entanto, ela está entre as doenças comuns e disseminadas

mais mal diagnosticadas que existem.

O microrganismo acomete cerca de 160 espécies de mamíferos. Os roedores, em

particular os ratos, são os reservatórios naturais mais importantes. Outros animais

silvestres, pecuários e domésticos também fazem parte dessa lista. A relação é harmônica

do tipo mutualismo, a Leptospira sobrevive por anos nos túbulos contorcidos proximais

destes animais. No entanto, estes mamíferos desenvolvem infecção renal crônica

assintomática (e não tem grande número de bactérias na urina).

173

A Leptospira é um ser euribionte, encontrado em todos os estados do Brasil, assim

como na Ásia, América Central, no restante da América do Sul e nos EUA.

Em 2006 no Brasil houve 4308 casos reportados (272 no Paraná), dos quais 401

foram a óbito (taxa de mortalidade de 0,093).

TRANSMISSÃO

É importante lembrar que cada sorovar tem ser mamífero hospedeiro próprio, ou

seja, o homem é um hospedeiro acidental. Exemplos são os sorovares

icterohaemorrhagiae/copenhageni de ratos, grippotyphosa de ratazanas, hardjo de bovinos,

canicola de cães, pomona de porcos, etc.

Os humanos são infectados pela ingestão ou exposição à água ou alimentos

contaminados. As bactérias, auxiliadas por sua motilidade, penetram através de abrasões

da pele ou mucosas íntegras, de modo que a infecção pode ser adquirida quando o

indivíduo nada, trabalha ou brinca em água contaminada. Portanto, mineradores,

fazendeiros, etc., apresentam risco elevado de contaminação (isso também explica o porquê

da maior prevalência do sexo masculino, 87% do total de casos). Ou seja, ela pode,

inclusive, ser considerada uma doença ocupacional, uma vez que a contaminação está

ligada ao trabalho do paciente. Certos grupos ocupacionais correm risco particularmente

elevado; nesses grupos estão incluídos veterinários, agricultores, trabalhadores com água

de esgoto, empregados de abatedouros e trabalhadores da indústria pesqueira. Esses

indivíduos podem adquirir leptospirose por exposição direta ou contato com água e solo

contaminados.

A contaminação pode suceder o contato direto com urina, sangue ou tecidos de um

animal infectado, ou após a exposição a um ambiente contaminado. A Leptospira é

excretada na urina humana, mas a transmissão interpessoal é rara. No entanto, a bactéria

sobrevive por meses em água doce, sendo esta um importante veículo de transmissão.

As epidemias de leptospirose podem resultar da exposição prolongada a águas de

enchentes contaminadas pela urina de animais, principalmente em grandes centros urbanos

onde há esgoto a céu aberto, grande número de bueiros e outros habitats de roedores.

No globo, a região em que mais ocorre leptospirose é entre os trópicos, próximo ao

Equador. O clima e as precárias condições de higiene favorecem a sobrevida do patógeno.

Em muitos países em desenvolvimento, a leptospirose ainda representa um problema

174

subestimado. Dados confiáveis da morbidade e da mortalidade da leptospirose começaram

gradualmente a aparecer.

A leptospirose também foi reconhecida em cidades do interior semi-abandonadas,

onde a população de ratos está se expandindo.

Além disso, pessoas que praticam natação em rios, canoagem, windsurf, esqui

aquático, etc. Microgotículas de água que contenham a bactéria podem ser ingeridas ou a

bactéria entrar por escoriações da pele.

A leptospirose também pode ser enquadrada entre as "doenças do viajante",

principalmente quando o destino são os países tropicais. A maioria dos casos ocorre

durante o verão e outono nos países ocidentais e durante a estação chuvosa nos trópicos.

Em resumo, a leptospirose é uma patologia intimamente associada a condições

sócio-econômicas, de imensa importância em saúde pública, pois está associada com

higiene, maus hábitos de vida, etc.

FATORES DE PATOGENICIDADE

A Leptospira penetra em pele com abrasões e nas membranas mucosas integras

(principalmente conjuntiva e revestimentos da orofaringe e nasofaringe), uma vez que essa

bactéria possui dois flagelos periplasmáticos em suas extremindades, que facilitam a sua

introdução no hospedeiro (movimento "saca-rolha"). Ela então se dissemina através da

corrente sangüínea (leptospiremia) e disseminação para todos os órgãos. A multiplicação

ocorre no sangue e nos tecidos e a bactéria pode ser isolada no sangue e no LCR nos

primeiros 4-10 dias da doença.

Além disso, esse microrganismo secreta hialuronidade, uma enzima que destrói as

moléculas de ácido hialurônico e outras glicosaminoglicanas da matriz intersticial do tecido

conjuntivo da derme e de submucosas, facilitando a introdução do patógeno. Enzimas

lipolíticas também fazem parte do arsenal de patogenicidade da Leptospira, destruindo

ácidos graxos insaturados da epiderme.

175

FISIOPATOLOGIA

O mecanismo ainda não está totalmente elucidado. A bactéria pode penetrar por

pele, mucosas, penetração em boca, faringe e esôfago durante a ingestão de água, etc.

É importante salientar que quem causa o efeito patológico são os anticorpos e a

reação inflamatória, e não o microrganismo em si. Isso pode explicar porque algumas cepas

não são patogênicas. O sorovar patogênico libera o antígeno de membrana na circulação

desencadeando a reação inflamatória. As cepas saprófitas permanecem com os antígenos

ligados à parede celular bacteriana.

As lesões causadas pela Leptospira são causadas em virtude de seus efeitos diretos,

como motilidade, quimiotaxia e patogenicidade, mas principalmente da resposta imune do

hospedeiro. Cepas virulentas exibem quimiotaxia, o que facilita a mobilidade e produz várias

enzimas citotóxicas.

A lipoproteína LipL32, por exemplo, causa hemólise, aumenta a expressão de

quimiocinas e do fator NFkB. A proteína de membrana OmpL1 e a esfingomielinase H são

citotóxicas, produzindo poros nas membranas celulares. Glicoproteínas, a proteína LigA

(immunoglobulin-like) e as proteínas fibronectiba-ligantes auxiliam a invasão dos tecidos

176

pela bactéria, por facilitarem sua adesão com a pele e mucosas, ou dos neutrófilos com o

endotélio.

O papel da resposta imune do hospedeiro durante a infecção ainda é obscuro. Além

de ser responsável pela imunidade, essa resposta está envolvida na formação da uveíte e

talvez das lesões pulmonares. A resposta humoral é, sem dúvidas, uma grande vilã nesse

quadro patológico. No entanto, grandes bacteremias podem ocorrem mesmo quando haja

um grande título de anticorpos circulantes.

A reação imunológica acaba por ocasionar uma reação de hipersensibilidade tipo III,

gerando complexos imunes. Esses complexos são responsáveis pela lesão endotelial e

consequentemente pela hemorragia. A vasculite é responsável pelas manifestações mais

importantes da doença. Os órgãos alvos preferenciais da leptospirose são os rins, o fígado e

os pulmões.

SINTOMATOLOGIA

É importante procurar obter uma história de exposição a materiais contaminados.

Obtêm-se avidências sorológicas de infecção inaparente pregressa em 15-40% dos

indivíduos expostos, mas que não adoeceram. Ou seja, são assintomáticos.

Nos casos de quem apresenta sintomatologia, esta pode se apresentar de maneira

leve (mais de 90% dos casos), às vezes grave e fatal em alguns casos (menos que 1%). A

sintomatologia não está relacionada ao sorogrupo que o paciente esteja portando.

O período de incubação varia de 2 a 20 dias, sendo a mais comum entre o 7º e o 14º

dia pós-exposição. Tipicamente, a fase leptospirêmica aguda é seguida de uma fase

leptospirúrica imune. A distinção entre a primeira e a segunda fase nem sempre é clara, e os

casos mais leves nem sempre incluem a segunda fase. Por esses achados, classificamos a

leptospirose como uma doença bifásica.

Na fase anictérica, a leptospirose pode se apresentar semelhantemente a uma gripe,

com febre, calafrios, cefaléia intensa, náuseas, vômitos e mialgia. A miagia afeta

principalmente as panturrilhas, o dorso e o abdome. Em alguns casos pode haver irritação

da garganta, exantema, comprometimento pulmonar com tosse, dor torácica e hemoptise. O

achado clínico mais comum nessa fase é a febre junto à sufusão conjuntival.

A maioria dos pacientes se torna assintomática em aproximadamente uma semana.

O início da segunda fase, a imune, coincide com o surgimento dos anticorpos na circulação

sangüínea. Nessa fase, as mialgias e a febre têm intensidade menor. Pode ocorrer

177

meningite asséptica nessa fase, principalmente em crianças. Embora não mais que 15% dos

pacientes exibam sinais e sintomas de meningite, muitos exibem pleocitose no LCR, o qual

desaparece após duas semanas. Irite, iridociclite e coriorretinite são complicações tardias

que podem ocorrer e persistir por vários anos. Em alguns casos, podem ser perceptíveis já

na terceira semana da doença.

A Síndrome de Weil é a forma mais grave da leptospirose, sendo caracterizada por

icterícia, disfunção renal, diátese hemorrágica e taxa de letalidade de 5 a 15%. O início da

doença é semelhante ao da leptospirose de grau leve, no entanto, após 4 a 9 dias, a

icterícia surge junto à vasculite a disfunção renal. A pele fica com uma tonalidade laranja e

nesse estágio geralmente ocorre necrose hepática com hepatomegalia perceptível à

palpação profunda do hipocôndrio esquerdo. No rim, a hipovolemia e a diminuição da

perfusão renal contribuem para o desenvolvimento de necrose tubular aguda, com oligúria

ou anúria. Às vezes a diálise se faz necessária.

Com freqüência ocorre comprometimento pulmonar, com achados clínicos já

relatados anteriormente. Observam-se manifestações hemorrágicas na síndrome de Weil:

epistaxe, petéquias, púrpuras e equimoses.

Durante a leptospirose grave, descreveram-se rabdomiólise, hemólise (pela

lipoproteína LipL32), miocardite, pericardite, insuficiência cardíaca congestiva, choque

cardiogênico, síndrome da agústia respiratória do adulto, pancreatite necrosante e falência

de múltiplos órgãos.

TRATAMENTO

A terapia antimicrobiana é indicada para as formas mais graves da doença. Na forma

leve a terapêutica ainda é discutida. O tratamento pode, inclusive, ser iniciado após os

primeiros quatro dias da doença. Ainda há uma boa resposta dos indivíduos tratados com

beta lactâmicos. Na forma leve, os antibióticos de escolha são a doxicilina e a ampicilina.

Nos casos de leptospirose moderada a grave, usa-se amoxicilina via oral ou penicilina G

intramuscular. Não é necessário introduzir antibiótico associado aos bloqueadores de beta

lactamases, uma vez que a Leptospira interrogans não tem potencial para produção desta

enzima.

178

CAPÍTULO 14CAPÍTULO 14CAPÍTULO 14CAPÍTULO 14:::: OS FUNGOS E AS MICOSES

CARACTERÍSTICAS GERAIS

� São seres eucariontes, uni ou pluricelulares (99% são pluri)

� SEM CLOROFILA e HETERÓTROFOS

� FUNGOS NÃO FORMAM TECIDOS VERDADEIROS (no máximo formam hifas)

� Aproximam-se muito mais do Reino Animmalia do que do Reino Plantae:

• Armazenam GLICOGÊNIO

• Parede celular de QUITINA

� A digestão pode ser extracorpórea, por meio de enzimas no substrado.

� Seres UBIQUITÁRIOS: vivem em qualquer lugar que tenha matéria orgânica em

decomposição (ex: tecidos necrosados). Podem ser aeróbios e anaeróbios.

Exemplos: Mofos, bolores, fermentos, levedos, leveduras, cogumentos, etc.

MODOS DE VIDA

Sapróbios: obtem seus alimentos decompondo organismos mortos. Vivem sobre a matéria

orgânica.

Mutualistas: sem grande importância médica. São os liquens (cianobactéria + fungo) e

micorrizas (fungo + raiz de fanerógama).

Predadores: capturam pequenos animais.

Parasitas: obtém alimentos de organismos vivos.

Ex: Candida albicans, Trycophyton sp.

TIPOS BÁSICOS DE FUNGOS

1. BOLORES

- Macroscopicamente aspecto pulvurulento, cotonoso (de “cotton”, algodão em inglês),

plumoso. ASPECTO SECO

Exemplos: Penicillium sp., Aspergillus sp.

179

Fonte: Koneman, 2001

2. LEVEDURAS – Formato esférico, oval, tem parede dupla ao MO.

Aspecto macroscópico cremoso, pastoso, gelatinoso. ASPECTO ÚMIDO

Exemplos: Cryptococcus neoformans, Candida albicans.

Fonte: Koneman, 2001 Fonte: Mims, 2005

3. DIMÓRFICOS – podem ser bolores e leveduras, depende da condição do ambiente

(umidade, temperatura). Causam doenças endêmicas e são potentes patógenos em

indivíduos imunocomprometidos (principalmente doenças pulmonares).

Ex: Histoplasma capsulatum, Paracocciodioides brasiliensis

Histoplasma capsulatum Fonte: Google Imagens

180

Fonte: Mims, 2005

HIFAS: Nos bolores, encontramos um corpo formado por HIFAS (filamentos

multinucleados), não por tecidos. As hifas são pequenos filamentos secos que

correspondem ao corpo do fungo, denominado MICÉLIO. Micélio é o coletivo de hifas.

Fonte: Material didático do Grupo Positivo

181

Há dois tipos de micélio: o vegetativo (hifas que adentram nos tecidos ou substrato

em busca de alimento) e o reprodutivo, em que as hifas têm a função de propagação e dão

origem aos esporos. O reprodutivo chama-se de corpo de frutificação e geralmente são os

que ficam pra fora da pele nas lesões cutâneas.

Fonte: Grupo Positivo

REPRODUÇÃO DOS FUNGOS

A reprodução pode ser assexuada, por brotamento, como nas formas unicelulares

(Candida albicans e Paracocciodioides brasiliensis quando se apresenta como levedura) ou

por fragmentação do micélio nas pluricelulares (Aspergillus sp.). A reprodução sexuada

envolve a união de hifas gaméticas com a formação do zigoto.

O principal meio de reprodução é a formação de ESPOROS. Podem ser móveis

(zoósporos) ou imóveis (aplanósporos) que são transportados pelo vento (fungos do ar). As

estruturas que produzem os esporos são denominadas esporângios.

Fonte: Grupo Positivo

CONÍDIO = reprodução por brotamento

ESPORO = reprodução sexuada

182

CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS

1) Mixomicetos: Fungos gelatinosos que habitam ambiente úmido e sombrio. Em

certas fases da vida se assemelham aos protozoários (emitem pseudópodos). Pode

ser formado por células uninucleadas ou se assemelhar a um plasmódio

(polinucleado). Não possui parede celular, apenas uma membrana flexível. Deslizam

sobre o solo e englobam partículas orgânicas, além de bactérias e outros fungos.

Fonte: Corel Shock Photos

2) Eumicetos: "fungos verdadeiros". Divididos em grupos:

a) Zigomicetos ou ficomicetos: Fungos primitivos constituídos por hifas não septadas.

Reproduzem-se por alternância de gerações Geralmente são decompositores, no

entanto algumas espécies podem parasitar plantas e animais.

Ex: bolor preto do pão (Mucor sp.)

b) Oomicetos: Engloba fungos unicelulares até micélios filamentosos. Podem se

alimentar de matéria orgânica em decomposição (Saprolegnia sp.). Alguns são

parasitas de vegetais (Phytophthora infestans, que causa ferrugem ou requeima no

tubérculo de batata). Reproduzem-se assexuadamente por zoósporos flagelados e

sexuadamente por gametas distintos. Podem ser formar em garrafas plásticas de

água mineral quando o recipiente for reutilizado diversas vezes. Próximo ao gargalo

e à tampa podem se formar colônias pretas de oomicetos.

c) Ascomicetos: constituídos por hifas septadas. Seus esporos chamam-se

ascósporos e são produzidos por esporângios em forma de um pequeno saco,

denominados ascos. Nos unicelulares, a reprodução pode ocorrer por brotamento.

Ex: levêdos, Penicillium sp., Aspergillus sp., Saccaromyces cervisiae (fermento da

cerveja, do vinho e do pão), Claviceps purpurea (Esporão do centeio, de onde vem a

ergotamina). Os ascomicetos também são os fungos que se cultivam no interior dos

183

guarda-roupas, principalmente no vestuário de inverno, causando o odor forte típico,

que em muitos casos pode desencadear asma alérgica por reação de

hiperssensibilidade tipo I (anafilática).

Fonte: Fernando Bortolozzi

Aspergillus sp. Penicillium sp.

d) Basidiomicetos: São os fungos mais conhecidos (cogumelos) e os mais evoluídos.

São pluricelulares e constituídos por hifas septadas. Formam esporos

(basidiósporos) que se fixam externamente em estruturas chamadas basídios. O

corpo de frutificação chama-se basidiocarpo (chapéu). Podem ser encontrados em

tronco de árvores, solos úmidos, plantas e em matéria orgânica. Alguns são

parasitas de vegetais. Exemplos: cogumelos e orelhas de pau, Agaricus campestris

(champignon), Amanita muscarina.

Fonte: Google Imagens

e) Deuteromicetos: os fungos de maior importância MÉDICA. Os chamados fungos

"imperfeitos", não apresentam fase sexuada no ciclo reprodutivo. A maioria é

patogênica ao ser humano. Ex: maioria das micoses, Candida albicans,

Cryptococcus neoformans, Trycophyton sp. (que causa as frieiras).

� Fotos na seção de micoses.

� O maior organismo do planeta é um fungo! Pertence ao gênero Armillariella e é

encontrado nos EUA, cobrindo uma área de 1,5 x 105 m2.

184

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

� Ergotamina é um alcalóide. Alcalóides são uma classe de medicamentos, utilizados nas crises agudas de enxaquecas, por inativar os receptores de dopamina. São agonistas α-adrenérgicos nos vasos sangüíneos, que fazem vasocontrição. No entanto, em outros locais a ergotamina é um antagonista parcial de serotonina – a 5-hidroxi-triptamina (5-HT). A ergotamina é a matéria prima do LSD. � O Claviceps purpurea infecta plantações de cereais e pode ser responsável por casos ocasionais de envenenamento em seres humanos que consumiram aquele cereal. Essa espécie também produz outros alcalóides como a ergometrina, que é utilizada para evitar hemorragia pós-parto; a metisergida, que trata a síndrome carcinóide; e a bromocriptina, que é utilizada no Parkinson e em distúrbios endócrinos. � Fungos que produzem drogas alucinógenas (possuem muitos alcalóides): Amanita muscarina (age nos receptores muscarínicos), Conocybe sp. e Psilocybe sp. Podem gerar micotoxicose em humanos.

FUNGOS E MEDICINA

� Aproximadamente 106 espécies patogênicas.

� Os fungos patogênicos podem ser classificados com base nas suas formas de

crescimento ou no tipo de infecção que causam.

� Micotoxicose: NÃO é sinônimo de micose. Micose é infecção por fungo; micotoxicose é

ingestão e/ou inalação de fungo que produz produtos tóxicos ao organismo humano (ex:

alcalóides), gerando um quadro de intoxicação por substâncias orgânicas.

� Doenças de Hipersensibilidade: Respostas alérgicas que certas pessoas têm quando

vestem um casaco que estava há muito tempo guardado no armário (ascomicetos), por

exemplo. Neste caso, o fungo não se desenvolve nos tecidos. As manifestações patológicas

ocorrem em virtude da produção de imunoglobulinas pelos linfócitos B sensibilizados. Essas

reações alérgicas por esporos fúngicos (os imunógenos em questão) se enquadram nas

185

reações de hipersensibilidade tipo I (anafilaxia), vistas na disciplina Imunologia Médica

(BP333).

Exemplos de anafilaxia por fungos: renite alérgica, asma brônquica, alveolite, etc.

Tipos de Micoses

1) SUPERFICIAIS: Colonizam as camadas mais superficias da pele (córnea e lúcida),

incluindo os pêlos. Provocam alterações de importância estética.

a) Ptiríase Versicolor: Seu agente etiológico é a Malassezia furfur. Caracteriza-se por

lesões acrômicas ou hiperpigmentadas, de bordos delimitados, localizadas no couro

cabeludo, tórax, abdome, pescoço e face, principalmente. O tratamento pode ser feito com

sulfeto de selênio.

b) Tinha Nigra: O agente etiológico é a Exophiala werneckii, um fungo dimórfico que

produz melanina, conferindo uma coloração marrom à lesão. É normalmente assintomática,

e as manifestações clínicas, quando existem, consistem em lesões maculares bem

demarcadas (manchas pigmentadas na pele), que são elevadas acima da superfície. As

lesões são observadas com maior freqüência em palmas das mãos e plantas dos pés.

c) Piedra: Há dois tipos de Piedra – a Piedra Branca e a Piedra Negra.

A Piedra Negra é uma infecção nodular dos fios de cabelo causada pela Piedraia hortae.

A Piedra Branca é decorrente da infecção por Trichosporon beigelii, manifesta-se na forma

de nódulos amarelados, maiores e de consistência mais mole nos pêlos (axilares, púbicos,

barba e cabelos). O tratamento consiste na remoção dos pêlos e aplicação de antifúngicos

tópicos. Muitas vezes estas duas doenças estão associadas à falta de higiene do paciente.

2) CUTÂNEAS: Localizam-se mais profundamente na epiderme (camada granulosa e

basal), incluindo doenças invasivas de pêlos e unhas. São as DERMATOMICOSES, por

isso, os fungos etiológicos são denominados DERMATÓFITOS (que vivem às custas da

queratina da pele e das unhas) e por espécies do gênero Candida.

186

Dermatófitos: Pertencem principalmente a três gêneros.

GÊNEROS ESPÉCIES

Trichophyton

T. rubrum

T. mentagrophytes

Microsporum

M. canis

M. gypseum

Epidermophyton E. floccosum

As manifestações clínicas dos dermatófitos são também conhecidas como tinha ou

tinea. O termo tinha (ou “tinea”) origina-se do Latim e significa “verme” ou “traça”. A adição

do outro termo indica o local anatômico afestado.

� Tinha pedis: Micoses dos pés (frieiras, pé-de-atleta).

� Tinha capitis: Micoses do couro cabeludo (pode causar alopecia).

� Tinha manus: Micoses nas mãos.

� Tinha unguium: Micoses nas unhas (ONICOMICOSE). Crescem em baixo das unhas.

� Tinha corporis: Micoses generalizadas no corpo.

O tratamento consiste na utilização de derivaros imidazólicos como o cetoconazol, o

miconazol, o fluconazol e principalmente o Itraconazol.

b) Dermatomicoses por Candida sp.: Ocorrem principalmente pela contaminação com

Candida albicans. Podem determinar lesões de pele, pêlos, unhas e mucosas de indivíduos

que apresentam fatores predisponentes como obesidade, diabetes meliltus, uso prolongado

de antibióticos ou glicocorticóides e indivíduos que manuseiam muita água.

Fonte: Mims, 2005

Candida em pele

187

As lesões mais freqüentes são em unhas e espaços interdigitais das mãos. A lesão

que se encontra ao redor do leito ungueal (paroniquia) também é comum. A paroníquia é

uma tumefação anormal ao redor das unhas que pode ser causada por diversos agentes,

como o Staphylococcus aureus. Isso será visto na disciplina de Propedêutica Médica II.

3) SUBCUTÂNEAS: Os fungos que provocam micoses subcutâneas normalmente residem

no solo e na vegetação. Penetram na pele ou tecido subcutâneo por inoculação traumática

com material contaminado. Em geral as lesões tornam-se granulomatosas (reação de

hipersensibilidade tipo IV) e propagam-se lentamente a partir da área de implantação. São

infecções que afetam a derme, tecidos subcutâneos, músculos e fáscias. Podem ser

doenças ocupacionais por causa do tipo de trauma. Ex: cortadores de coco. TEM QUE

HAVER TRAUMA CUTÂNEO PARA ATINGUIR A DERME (TECIDO CONJUNTIVO).

a) Esporotricose: É uma infecção crônica caracterizada por lesões nodulares e ulcerativas

(local correto para a coleta do material para exame microscópico) que se desenvolve ao

longo dos vasos linfáticos. Os nódulos amolecem, rompem-se e liberam exsudato purulento.

É também conhecida como Doença do Jardineiro e do Floricultor (é uma doença

ocupacional).

O agente etiológico é o fungo Sporothrix schenckii. É um fungo saprófito encontrado

no solo, nas roseiras, nos arbustos, em cascas de árvore e nas briófitas. A infecção

acontece mediante a um traumatismo. Surge como uma pequena pápula ou nódulo

subcutâneo que se desenvolve entre 1 semana e 6 meses. Posteriormente atinge as

cadeias linfáticas.

Outras formas raras de esporotricose incluem solução saturada de iodeto de

potássio, itraconazol e os demais derivados imidazólicos. Quando a infecção assume

caráter sistêmico, o tratamento é intrahospitalar com Anfotericina B.

Fonte: Mims, 2005

188

b) Cromoblastomicose (cromomicose): Crescimento de nódulos verrucosos que

aparecem nos locais de inoculação. Com o tempo assume o aspecto de couve flor. Os

pontos enegrecidos são os locais certos para a coleta do material para exame.

O agente etiológico predominante no Brasil é a Fonsecaea pedrosoi. Mas há outras

espécies que podem provocar a cromoblastomicose: Phialophora verrucosa, Rhinocladiella

aquaspersa, Fonsecaea compacta e Cladosporidium carrionii. Esses microrganismos

habitam o solo e coletivamente são denomindos fungos dematiáceos, com parede celular

melaninizada.

É uma doença comum em trabalhadores rurais, principalmente nas áreas

descobertas do corpo.

O tratamento consiste na cauterização e na remoção cirúrgica das lesões inicias. Já

na doença avançada, torna-se necessário o uso de quimioterápicos.

Existem outras micoses subcutâneas, porém de incidência muito baixa, entre elas a

Feo-Hifomicose, o Micetoma Eumicótico, a Zigomicose, a Lobomicose e a Rinosporidiose.

4) SISTÊMICAS: Todos os fungos que causam infecções sistêmicas são DIMÓRFICOS. Em

meios de cultura simples (entre 24 e 28°C) e na natureza formam colônias micelianas

formadas por hifas (bolores). Nos tecidos e nos meios de cultura especiais (entre 35 e

37°C), desenvolvem a forma de leveduras, que é a forma parasitária. Localizam-se

principalmente nos órgãos internos e vísceras podendo abranger muitos tecidos diferentes.

Há preferência pelos pulmões.

a) Paracoccidioidomicose (blastomicose Sul-Americana ou Micose de Lutz-Splendore

Almeida): O agente etiológico é o fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis.

Aspectos Clínicos:

� Aspecto radiográfico do pulmão em asa de borboleta

� Presença de vesículas no sulco gengival (muitas vezes o diagnóstico é feito pelo

cirurgião-dentista e o paciente chega ao médico por encaminhamento)

� O 1º órgão de acometimento é o pulmão; o 2º órgão é a mucosa bucal. Muitas vezes

lesões na boca aparecem antes (até dois anos) das manifestações pulmonares.

� É a única micose pulmonar que atinge o imunocompetente

� Na prática clínica a paracoccidioidomicose é chamada de PCM

189

� Além do pulmão, pode fazer lesão osteolítica, disseminar-se para o SNC, órgãos genitais,

TGI. Às vezes o cirurgião encontra ao fazer uma laparotomia.

� A infecção pode resultar tanto da inoculação de estruturas do fungo consideradas

infectantes, como a reativação de algum foco pré-existente.

� O número de homens afetados é desproporcional ao número de mulheres (9:1). Esta

diferença foi atribuída a fatores de alto risco, doença subjacente, desnutrição e diferenças

hormonais.

� Pneumonia por Paracoccidioides brasiliensis é muito difícil de tratar. O tratamento

consiste no uso prolongado de Itraconazol, algumas vezes associado a Sulfametoxazol e

Trimetropim (Bactrim®).

5) OPORTUNISTAS: Números fungos foram identificados como agnetes etiológicos de

infecções oportunistas. Muitas vezes ocorre em ambientes hospitalares. Pacientes

transplantados, usuários crônicos de glicocorticóides e HIV positivos merecem atenção

especial nesses casos, uma vez que a cura torna-se muito dificultada.

a) Candidíase, candidose e Candida sp.

A Candida sp. é o patógeno fúngico mais comum do paciente imunocompetente. É

uma levedura oportunista em uma variedade de pacientes e em vários sítios do corpo. No

intestino ela atua como agente de microbiota normal.

A espécie mais comum, epidemiologicamente, é a Candida albicans. Essa levedura

gera diversos tipos de quadros clínicos como “candidíase bucal” e “candidíase vaginal”. Hoje

em dia estes termos não são mais utilizados pela nômina anatômica moderna. Usa-se o

termo CANDIDOSE para manifestações na cavidade bucal e o termo CANDIDÍASE para as

demais infecções por Candida sp. Além disso, pode provocar alterações cutâneas,

gastrointestinais e endocardites, particularmente em usuários de drogas ilícitas.

Fonte: Koneman, 2001

Candida sp.

190

A candidose pode ser encontrada em uma variedade de pacientes

imunocomprometidos, pessoas com uso de próteses odontológicas mal adaptadas,

portadores de diabetes mellitus, em tratamento com antibióticos de largo espectro, usuários

crônicos de glicocorticóides, xerostomia (hipoprodução de saliva) entre outros. A

manifestação mais freqüente se dá por meio de placas esbranquiçadas (forma

pseudomembranosa) de fácil destaque com o auxílio de um algodão, principalmente em

dorso de língua e palato duro. Há também a forma eritematosa, que se manifesta por meio

de lesões hiperemiadas. O tratamento pode ser feito com o uso tópico de nistatina,

anfotericina e derivados imidazólicos. Se o paciente for imunocomprometido e/ou a infecção

já tiver adquirido caráter mais invasivo, deve se apelar para o uso de antifúngicos

sistêmicos.

* Causas comuns xerostomia: pacientes que fazem quimioterapia (que destrói grândulas

salivares colateralmente) e usuários de antidepressivos como inibidores da recaptação de

serotonina (5-HT). Esses pacientes são fortes candidatos a possuiem candidose.

Aspecto pseudomembranosos em palato duro Pseudohifas e leveduras

Fonte: Rubin, 2006

A candidíase vaginal é uma das doenças que mais comumente acometem mulheres

jovens, principalmente em países de clima tropical como o Brasil. Esta patologia pode,

inclusive, ser enquadrada dentro do grupo das DSTs, uma vez que o contato sexual é uma

das formas mais comuns de contágio. O homem tem a Candida albicans na microbiota

normal peniana, portanto uma atividade sexual sem preservativo faria com que a mulher

191

entrasse em contato direto com a levedura. Se ela estiver em uma queda imunológica pode

desenvolver a doença, bem como cultivá-la, fazendo sexo repetidamente com o mesmo

parceiro (portador). Salienta-se também que as pessoas que fazem sexo oral sem proteção

estão sujeitas a contraírem candidose por entrarem em contato com a microbiota normal do

pênis. É imprescindível que o tratamento seja feito com o casal, ambos devem prosseguir

com a terapia até a erradicação das leveduras.

Outra fonte de contágio são os fômites contaminados (toalhas, roupas íntimas,

acessórios diversos, etc.). O compartilhamento deste tipo de material pode acarretar um

intercâmbio de espécies de Candida sp., ou mesmo de diferentes cepas de Candida

albicans, geralndo infecções com mecanismos mais resistentes.

Fonte: Netter, 2006

A candidíase mucocutânea é uma manifestação rara e não invasiva, embora

persistente, das membranas mucosas dos cabelos, da pele e das unhas. Em crianças, com

defeito específico de células T, podem se tornar alérgicoa à Candida, tendo que fazer uso

de antifúngicos intermitentes.

A candidíase gastrointestinal é encontrada em pacientes que passaram por cirurgia

gástrica ou abdominal (ex: cirurgia de redução de estômago), ou em pacientes que têm

neoplasias. O microrganismo pode atravessar a parede intestinal e disseminar-se a partir de

um foco gastrointestinal. O diagnóstico in vivo é difícil, e cerca de 25% dos pacientes não

apresentam sintomas nos etágios iniciais da doença. Se ocorrer disseminação a partir do

intestino, as hemoculturas podem se tornar positivas e antígenos de Candida podem ser

detectáveis no soro. A terapia fungicida deve ser iniciada precocemente em pacientes com

suspeita de infecção, mas a doença disseminada é frequentemente fatal.

192

A candidíase disseminada é provavelmente adiquirida via TGI, mas também pode se

originar de infecções relacionadas a cateteres intravasculares. Pacientes com linfomas e

leucemia correm maior risco. A disseminação hematológica alcança quase todos os órgãos.

Infecções nos olhos (endoftalmia) e da pele (lesões mucocutâneas nodulares) são

importantes porque fornecem evidências para o diagnóstico, sem as quais os sintomas

inespecíficos de febre e choque séptico dificultam o diagnóstico precoce. Pacientes

imunocomprometidos, por vezes, recebem terapia antifúngica empírica se apresentam febre

e falham em responder aos agentes antibacterianos de largo espectro.

Hoje em dia há aumento da resistência aos antifúngicos para tratar as espécies de

cândidas. A Candida albicans responde bem aos derivados imidazólicos como o

cetoconazol e fluconazol. No entanto, está aumentando gradativamente as infecções pelas

Candida não-albicans, e estas espécies possuem mecanismos de defesa bem mais

resistentes. O fluconazol apresenta atividade muito reduzida contra essas espécies, fazendo

com que os pacientes sejam obrigados a usarem o Itraconazol via oral por longos períodos.

A anfotericina B também é um antifúngico com boa atividade contra as cândidas, porém ela

tem muitos efeitos colaterais e seu uso na prática médica é mais reservado.

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

A secreção da candidíase é diferente das demais secreções infecciosas da vagina. O aspecto pseudomembranoso da cândida se manifesta como placas brancas facilmente destacáveis com auxílio de algodão, sem odor fétido. As demais secreções como a do Trichomonas vaginalis, das vaginites e vaginoses bacterianas são verde-amareladas (exsudato purulento), viscosas e geralmente de odor fétido.

Fonte: Netter, 2006

Colo uterino: Candida spp. Colo uterino: Trichomonas vaginalis, gonococo, Gardnerella vaginalis e Chlamydia trachomatis

193

b) Criptococose

O agente etiológico é o Cryptococcus neoformans. Um fungo leveduriforme que

possui uma cápsula espessa de polissacarídeos complexos ao redor de sua parede celular.

É um microrganismo euribionte, uma vez que o criptococo é transmitido pelas fezes dos

pombos. Curitiba é certamente uma cidade com uma população densa dessas aves,

portanto é uma importante questão de saúde pública que merece atenção especial.

No pombo o fungo é inativo, pois a cápsula de carboidrato não se desenvolve no

interior da ave. Quando a levedura chega ao organismo humano, a cápsula se desenvolve a

partir dos carboidratos do nosso metabolismo (é um fator de patogenicidade, junto a

produção de melanina e enzimas). Por fim, e o fungo adquire sua verdadeira forma ativa e

infectante. A inoculação geralmente é pulmonar e assintomática. Esse fungo tem tropismo

pelo SNC (vem dos pulmões por via hematogênica). Pode fazer meningite criprocóccica

quando atinge as meninges. Acredita-se que o criptococo possa atravessar a barreira

hematoencefálica via infecção de monócitos e/ou células endoteliais. Essa forma de

meningite é responsável pela morte de muitos pacientes com AIDS e outros

imunocomprometidos na imunidade celular. A resposta imunológica do hospedeiro se faz

pela ativação dos linfócitos CD4 e produção de IFNγ.

No entanto alguns pacientes imunocompetentes são acometidos também, porém

numa porcentagem bem menor e com sintomas mais brandos, além de terem uma cura

mais rápida e eficaz.

Nos casos de meningite criptocóccica, a levedura pode ser demonstrada no líquido

cérebro-espinhal. A identificação também pode ser feita pela detecção do antígeno no teste

de aglutinação em látex, usando látex recoberto com anticorpos específicos.

O tratamento engloba uma combinação entre anfotericina B e flucitosina, e pode ser

monitorado pela queda na concentração de antígenos no LCE. O prognóstico varia muito de

acordo com a doença de base do paciente; nos pacientes severamente

imunocomprometidos, a mortalidade gira em torno de 50%. Nos pacientes com AIDS é

praticamente impossível erradicar o microrganismo, mesmo com a terapia intensiva.

Pacientes com leucemia, linfomas, LES, linfoma de Hodgkin ou sarcoidose merecem

atenção especial também.

Inalação � pulmões � meningite via hematogênica � SNC

194

Fonte: Mims, 2005

Cryptococcus neoformans e a cápsula de carboidratos

c) Histoplasmose: Doença das Cavernas, Doença dos Espeleólogos

O agente etiológico é o fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. Este fungo cresce

em áreas contaminadas com excretas de morcegos e aves. Embora as aves não sejam

infectadas, ocorre infecção natural nos morcegos. O fungo pode ser encontrado em porões,

áreas escuras, torre de igreja, etc

A doença ocorre no mundo todo. Na maioria dos casos é assintomática. Nos casos

sintomáticos observam-se sintomas clínicos de pneumonia aguda, seguidos com menor

freqüência de doença disseminada progressiva.

Os esporos ou fragmentos de hifas são aspirados nos alvéolos e estes são

fagocitadas pelos macrófagos alveolares e em seguida convertidos em leveduras (são

capazes de se replicar dentro dos macrófagos). Nos imunocompetentes os macrófagos

controlam a infecção eliminando as hifas. No imunocomprometido a infecção prossegue.

Com o tempo ocorre dissiminação linfática. Trata-se de um fungo altamente

infeccioso que causa infecção pulmonar aguda, porém benigna em pessoas saudáveis.

Culturas de sangue, de medula, de escarro e de LCR podem conter Histoplasma no

paciente suspeito, mas a biópsia e o exame histológico da medula, fígado e de linfonódos

são, muitas vezes, necessários para chegar a um diagnóstico definitivo.

Fonte: Robbins, 2005

Histoplasma capsulatum colonizando linfonodo de paciente imunocomprometido

195

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Além do Histoplasma capsulatum, quais outros agentes etiológicos de infecções também são parasitas intracelulares de macrófagos?

c) Aspergilose

O Aspergillus sp. é ubiquitário no meio ambiente e faz parte da microbiota normal do

organismo humano. Seus esporos são regularmente inalados sem conseqüências danosas.

É um gênero que contém várias espécies, das quais a que merece maior destaque é o

Aspergillus fumigatus, que pode provocar diversas manifestações patológicas, tais como:

- Aspergilose broncopulmonar alérgica, que, como seu nome sugere, é uma resposta

alérgica à presença do antígeno. Aspergillus nos pulmões podem desencadear um processo

de hipersensibilidade tipo I e culminar em asma brônquica. O mecanismo da asma será

abordado em seminários da disciplina de Imunologia Médica (BP333).

- Aspergiloma em pacientes com cavidades pulmonares preexistentes (ex: seqüela de TB)

ou distúrbios pulmonares crônicos. O fungo coloniza a cavidade e cresce para produzir uma

massa de hifas em forma esférica, a qual é denominada aspergiloma. Esses fungos não

invadem os tecidos pulmonares, porém o tamanho do aspergiloma pode desencadear

dificuldade respiratória.

- Doença disseminada no paciente imunocomprometido quando o fungo invade a partir dos

pulmões.

A aspergilose invasiva geralmente é fatal no imunocomprometido, pois os pacientes

são neutropênicos (com poucos neutrófilos circulantes). As hifas deste fungo, quando

crescem, destroem alvéolos e septos alveolares. O crescimento das hifas é em ângulo de

45º, o que acaba por destruir a arquitetura pulmonar.

Fonte: Mims, 2005

196

d) Pneumocistose

O Pneumocystis jiroveci (antigamente chamado de Pneumocystis carinii) é um fungo

atípico, comumente encontrado em seres humanos normais e roedores. A infecção é

transmitida por meio de gotículas respiratórias (aerossóis). A doença ocorre em indivíduos

debilitados e imunodeficientes. Antes do advento da terapia antiretroviral altamente ativa, a

terapia HAART (que será discutida nos seminários de Imunologia Médica), uma alta

proporção dos pacientes com AIDS desenvolvia pneumonia por pneumocistos, podendo ser

fatal. Apenas causa doença sintomática em pessoas com a imunidade celular deficiente.

O Pneumocystis sp. ocorre em uma forma trófica, com até 5 µm de diâmetro, na

forma de esporocistos e reservatórios de esporos. Os esporos são liberados quando estes

reservatórios se rompem. A doença está associada a uma pneumonite instesticial, com

infiltração de plasmócitos. Já foram relatadas infecções em locais diferentes que não o

pulmão.

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Fazem pneumonia: Pneumocystis, Histoplasma, Aspergillus, Candida e

Paracococcidioides, este último, também em imunocompetentes. Para tratar, pneumonia fúngica é o pior tipo de pneumonia que existe. As bacterianas são infinitamente mais fáceis de curar com os antimicrobianos. A classe de drogas de primeira escolha em pneumonia bacteria são as quinolonas de 3ª, 4ª e 5a geração (levofloxacino, moxifloxacino e gemifloxacino respectivamente). A tigeciclina é uma alternativa em teste. Nos casos de pneumonias fúngicas, os fármacos de escolha ainda são os derivados imidazólicos tradicionaos de grande abrangência (Itraconazol). A anfotericina B pode ser uma arma de retaguarda. No entanto, a partir de 2007 surgiram novas drogas triazólicas no mercado farmacêutico que prometem dar uma nova abordagem ao tratamento dessas pneumonias. O voriconazol e o posoconazol são exemplos delas. Todavia, o tratamento com esses antifúngicos é de custo muito elevado e não pode ser bancado pela grande maioria dos pacientes. Paciente portador de pneumonia fúngica deve necessáriamente ser submetido a exames para investigação de imunossupressão, incluindo o anti-HIV (ELISA-Western Blot). Pneumonia em paciente idoso: investigar infecção por fungos. Em especial o Aspergillus fumigatus. As drogas referidas como glicocorticóides são a dexametasona, a betametasona, a prednisona, a mimetasona, a predinisolona, etc. Essas drogas mimetizam a atividade catalítica dos glicocorticosteróides produzidos pelos espongiócitos da camada fasciculada do córtex da glândula adrenal. São muito utilizados no tratamento das doenças auto-imunes. Seus efeitos são antiinflamatórios e imunossupressores. Antiinflamatórios por fazerem inibição da enzima fosfolipase A2, assim interferindo no metabolismo do ácido aracdônico, como foi visto nas aulas de Patologia Médica Molecular (BP334). E imunossupressores

197

porque essas drogas interferem na ação do IFNγ nos macrófagos, suprimindo sua atividade como célula apresentadora de antígeno e silenciando a transcrição dos genes do MHC. Assim, toda a atividade imunológica do indivíduo estará comprometida enquanto ele estiver fazendo o uso deste medicamento. Haverá uma aula teórica dentro da disciplina de Imunologia Médica (BP333) para abordar este tema. Para pensar: O tratamento das hepatites virais, como a hepatite B é feito com altas doses de IFN (interferon). Na sua prática clínica, chega a você, médico, um paciente portador de HBV com um quadro de esteatose avançada. Porém, ele é portador de artrite reumatóide (uma das doenças auto-imunes que é tratada com glicocorticóides). Com base no mecanismo de ação descrito acima e aprofundado nas aulas de Imunologia Médica, você prescreveria o uso prolongado de IFN para este paciente? Por quê?

Drogas Antifúngicas

A base do tratamento delas é inibir a síntese do esgosterol da membrana celular

do fungo. Porém, esse ergosterol é muito parecido com a nossa molécula do colesterol. Por

sinal, ele tem a mesma função do colesterol nas membranas celulares animais. A droga se

confunde e destrói ambos os lipídeos. Por isso dizemos que os antifúngicos atingem tanto o

hospedeiro como o fungo.

Principais grupos de drogas:

1) Agentes poliênicos – Anfotericina B

Mecanismo de ação: liga-se ao ergosterol da MP do fungo.

Efeitos colaterais: hipotensão, dor abdominal, reações alérgicas, anemias, lesão renal.

Padrão ouro para cândida, ao lado do Itraconazol.

Também usada no tratamento de Leishmanioses.

CURIOSIDADE, MAS IMPORTANTÍSSIMO: Anfotericina B não pode, em hipótese alguma,

ser administrada em pacientes que fazem uso de digitálicos cardíacos (digoxina), pois

potencializa a ação e pode causar intoxicação digitálica. NÃO MATEM SEUS PACIENTES!

2) Nistatina

Mecanismo de ação: impede a ligação ao ergosterol da MP fúngica.

198

3) Flucitosina

Mecanismo de ação: inibição da síntese de ácidos nucléicos, porém sua toxicidade é

seletiva. Pode ser utilizada no tratamento da candidíase sistêmica.

Efeitos colaterais: depressão da medula óssea, anemias e discrasias sangüíneas.

4) Derivados azólicos: Cetoconazol, Miconazol, Clotrimazol, Fluconazol, Itraconazol

Mecanismo de ação: inibição da síntese de ergosterol

5) Novas drogas triazólicas: voriconazol e posaconazol (um dos antifúngicos mais fortes

que existem). São muito caros. Terapia para 5 dias: R$3.000,00 (em 2007).

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

� Efeito colateral dos antifúngicos: quase todos eles deixam resíduos metabólicos na cavidade bucal, fazendo com que o paciente sinta um gosto amargo de metal durante o tratamento (o que às vezes dificulta a adesão ao mesmo). � São medicamentos que em geral têm melhor absorção em pH ácido. Portanto é bom recomentar o paciente tomar o medicamento junto às refeições, ou com refrigerante do tipo cola. � O que é o trocisco?

199

CAPÍTULO 15:CAPÍTULO 15:CAPÍTULO 15:CAPÍTULO 15: HERPES-VÍRUS

HHV-1 ou HSV-1: Herpes Simplex Vírus 1 (Herpes bucal – não é oral)

HHV-2 ou HSV-2: Herpes Simplex Vírus 2 (Herpes Genital - hoje em dia 1 e 2 estão em

conflito no sítio por causa do sexo oral). Pode fazer carcinoma genital.

HHV-3 ou VZV: Varicela Zoster Vírus

HHV-4 ou EBV: Epstein-Barr Vírus (Mononucleose infecciosa)

HHV-5 ou CMV: Citomegalovírus (Mononucleose também, de maneira siminar)

HHV-6: Causa roséola infanto

HHV-7

HHV-8: Pode causar o Sarcoma de Kaposi

EBV e CMV – Muito comuns e importantes.

Eles causam a mononucleose infecciosa (esse termo é mais usado para o EBV), conhecida

também como doença do beijo (também mais usado para o EBV). Ela é transmitida

beijando, via saliva.

O CMV também pode ser transmitido pelo sangue, urina, sêmen e secreções cervicais. É o

maior herpes vírus humano e só tem um sorotipo. O nome refere-se a inclusões

intranucleares que são respostas características desse patógeno.

Fonte: Fernando Bortolozzi

Doença de inclusão citomegálica em pulmão de perinato. Comparar o tamanho desta célula

setada com as demais. CitoMEGALOvírus.

200

A infecção pelo CMV geralmente é assintomática. Uma infecção muitas vezes

silenciosa do trato respiratório superior. Dissemina-se via linfócitos e monócitos (os

MONOMORFONUCLEARES, MMN) e envolve linfonodos e baço (defesa secundária e

terciária). O vírus condiciona-se a células epiteliais, glândulas salivares, túbulos renais, colo

uterino, testículos e epidídimo. Há febre e letargia.

Esses vírus "escapam" das defesas imunológicas. São alvos ruins para as células T

citotóxicas por interferirem no transporte de moléculas do MHC-I e induzem a transcrição de

genes que codificam receptores Fc, e estes são expressos nas células infectadas.

EBV – Epstein Barr Vírus

- É transmitido pela saliva. Conhecida como a DOENÇA DO BEIJO.

- Só tem um sorogrupo. Antigenicamente diferente do CMV.

- Utilizados no diagnóstico: o capsídeo viral (VCA), os antígenos precoces (EA) que são

produzidos antes da síntese do DNA viral e os antígenos nucleares associados ao EBV

(EBNA), que estão no núcleo das células infectadas.

ANTICORPOS HETEROFÍLOS

O EBV se multiplica nos linfócitos B (eles tem na membrana um receptor, o C3d

(CD21), que se liga ao vírus). Os linfócitos T respondem imunologicamente às células B

infectadas (aumentanto cerca de 50 vezes em número) e aparecem no sangue periférico

como "linfócitos atípicos do EBV". Essa doença é uma verdadeira "guerra civil imunológica".

Digamos que as células T não se habituam com as células B infectadas em fazem um

confronto por meio de citocinas. E essas citocinas das células é quem causam os sintomas

da doença, semelhante aos estragos que as armas bélicas fazem numa região onde está

tendo uma guerra. Os linfócitos T em guerra são denominados de células de Downey.

Esses linfócitos B infectados são estimulados a diferenciar-se e produzir

anticorpos (ativação policlonal das células B, O QUE É RESPONSÁVEL PELA FORMAÇÃO

DOS ANTICORPOS HETERÓFILOS DO EBV – reação com eritrócitos de carneiro ou de

cavalo). Auto anticorpos também são produzidos, como o IgM para eritrócitos (crio-

aglutininas).

201

Linfócitos atípicos do EBV Fonte: Robbins, 2005 Fonte: Mims, 2005

� Os anticorpos heterofilos são detectados pela Reação de Paul Bunnel (>40 é positivo;

<40 é negativo)

� Esses anticorpos podem aparecer na mononucleose infecciosa (+++), na doença do soro

(+++) e mesmo em indivíduos normais (+).

� O médico deverá pedir IgM contra o capsídeo viral para o diagnóstico, bem como o IgG.

Hemograma é útil por causa da formação dos linfócitos atípicos.

� Outros achados clínicos incluem a esplenomegalia, hepatomegalia e linfadenopatia.

� Não há antiviral eficaz contra o EBV, o que faz com que a doença siga seu curso

autolimitado em pacientes sadios e não-imunocomprometidos. Autolimitada é uma doença

que se cura sem intervenção medicamentos. Ex: gripe, varicela.

NEOPLASIAS INDUZIDAS PELO EBV

� Linfoma de Burkitt: só o EBV não consegue fazer o linfoma. Ele se associa com

algumas espécies de Plasmodium sp. como o Plasmodium falciparum ou o Plasmodium

infantum, enfraquecendo o controle das células T e talvez causando ativação policlonal das

células B, tornando-as suceptíveis a maior formação neoplásica. O DNA e o RNA transcritos

são encontrados nas células tumorais, que também mostram uma translocação dos

oncogenes myc no cromossomo 8 para o locus da cadeia pesada da imunoglobulina

localizada no cromossomo 14.

202

Fonte: Robbins, 2005 Fonte: Robbins, 2005

Resultado =

Fonte: Bogliolo, 2006 Fonte: Mims, 2005

203

� Carcinoma Naso-Faringeal: O DNA do EBV é detectável nas células tumorais, e um co-

carcinógeno, possivelmente de nitrosaminas ingeridas com peixes em conserva. Fatores

genéticos do hospedeiro que controlam o HLA (“human leucocyte antigen”) e a resposta

imune podem ser fatores de suceptibilidade.

� HHV-2 faz carcinoma genital e HHV-8 faz Sarcoma de Kaposi.

CORRELAÇÕES CLÍNICAS:

Antes de chegar a estas aberrações, temos como obrigação fazer o diagnóstico. Boa anamnese e bom exame físico são essenciais.

Fonte: Mims, 2005

À esquerda, a MEMBRANA nas tonsilas palatinas ocasionada pelo EBV; à direita, as placas proporcionadas pelo já conhecido de vocês, Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta hemolítico do grupo A de Lancefield), entre outros agentes. Vão prescrever antibióticos para qual dos dois quadros mesmo? Clínica sem diferenciação: � Infecções por Streptococcus pyogenes / Haemophilus influenzae / Moraxella catarrhalis

Fonte: Fernando Bortolozzi

204

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS PARA ATUALIZAÇÃO

DO MATERIAL EM 2008

• MIMS, C. et al.; Microbiologia Médica, editora Elsevier, 3ª edição, 2005.

• MURRAY, P. R. et al.; Microbiologia Médica, editora Elsevier, 5ª edição, 2006.

• TORTORA, G. J. et al.; Microbiologia, editora Artmed, 8ª edição, 2005.

• OPLUSTIL, C. P. et al.; Procedimentos Básicos em Microbiologia Médica, editora

Sarvier, 2002.

• ROBBINS et al.; Patologia, editora Elsevier, 7ª edição, 2005.

• RUBIN, E. et al.; Patologia, editora Guanabara Koogan, 4ª edição, 2006.

• BRASILEIRO FILHO, G.; Bogliolo Patologia, editora Guanabara Koogan, 7ª edição,

2006.

• HARRISON et al.; Medicina Interna, editora Mc Graw Hill, 16ª edição, 2006.

• LOPES, A. C.; Tratado de Clínica Médica, editora Roca, 2006.

• ABBAS, K. A. et al; Imunologia, editora Elsevier, 6ª edição, 2008.

• ROITT, I. et al.; Imunologia, editora Manole, 6ª edição, 2003.

• PORTO, C. C.; Semiologia Médica, editora Guanabara Koogan, 5ª edição, 2005.

• BUJA, L. M.; KRUEGER, G. R. F.; Atlas de Patologia Humana de Netter, 1ª edição,

editora Artmed, 2006.

• KONEMAN, E. W. et al; Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição, 2008.

• Material Didático do Grupo Positivo

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS PARA CONFECÇÃO DA

APOSTILA ANTIGA

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4 AMATO, V.; BALDY, J.L.S. 1991. Doenças Transmissíveis 3 ed., Sarvier.

5 MIMS, C.A.; PLAIFAIR, J.H.L.; ROITT, I.M.; WAKELIN, D.; WILLIAMS, R. 1993. Medical

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7 PELCZAR, M.J.; REID, D.; CHAN, E.C.S. 1981. Microbiologia Volume II, Mac Graw Hill

do Brasil.

8 SOARES, J.B.; CASIMIRO, A.R.S.; AGUIAR, L.M.B.A. 1987. Microbiologia Básica,

Universidade Federal do Ceará.

9 TRABULSI, L.R. 1981. Microbiologia das Infecções Intestinais, Atheneu.

10 BURNETT, G.W.; SHERP, H.W.; SCHUSTER, G.S. 1978. Microbiologia Oral e

Doenças Infecciosas, 4 ed., Guanabara Koogan.

11 RUBIN, E.; FARBER, J.L. 1988. Patologia, Interlivros.

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13 SOUNIS, E. 1989. Curso Prático de Microbiologia, Atheneu, São Paulo.

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16 MINISTÉRIO DA SAÚDE: Técnicas para Coleta de Secreções, Programa Nacional de

Doenças Sexualmente Transmissíveis/AIDS. 1997. Brasília.

17 MINISTÉRIO DA SAÚDE: Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia

Clínica para Controle de Infecção Hospitalar, Secretaria de Assistência à Saúde,

Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis/AIDS. 1997. Brasília.

18 MINISTÉRIO DA SAÚDE: Técnica de Coloração de Gram, Secretaria de Assistência à

Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis/AIDS. 1997.

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20 KONEMAN, ELMER, W. et. al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology,

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22 OPLUSTIL, CARMEN PAZ e col. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica,

São Paulo, Sarvier. 2000.